一組特異識別宋內氏志賀氏菌的寡核苷酸適配子的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一組特異性識別宋內氏志賀氏菌的寡核苷酸適配子Sp1、Sp20，是通過Cell-SELEX技術以完整的宋內氏志賀氏菌細胞作為靶標對體外合成的隨機單鏈寡核苷酸文庫進行篩選、擴增、酶切、測序、親和力和特異性分析得到的，屬于食品安全分子生物領域。篩選獲得的適配子具有高親和性和特異性、性質穩定、體外合成方便且成本低等特點，能通過標記功能基團或熒光染料運用于食品中宋內氏志賀氏菌的檢測，為現今依賴抗體的檢測方法提供了新的選擇。
【專利說明】-組特異識別宋內氏志賀氏菌的寡核苷酸適配子
【技術領域】
[0001] 本發明涉及食品安全生物【技術領域】，特別涉及到利用分子生物學技術中的SELEX 技術（指數富集的配體系統進化技術）篩選一組與宋內氏志賀氏菌高特異親和的寡核苷酸 適配子，為該核酸適配子在檢測食品中宋內氏志賀氏菌的應用提供科學依據和理論基礎。
【背景技術】
[0002] 志賀氏菌是一種具有高度傳染性和危害嚴重的革蘭氏陰性腸道致病菌。在發展中 國家，由志賀氏菌引起細菌性痢疾的重大衛生事件時常發生，尤其夏秋兩季最為常見，每年 約有1. 6億個感染病例，約100萬死于細菌性痢疾。志賀氏菌主要是經口感染，色拉、生的 蔬菜、奶和奶制品、禽、水果、飲水、面包制品等易被污染。志賀氏菌能分泌強烈的內毒素和 夕卜毒素，引起發冷、發熱、腹瀉、里急后重、排粘液膿血樣大便、神志障礙、甚至中毒性休克等 癥狀。而宋內氏志賀氏菌是志賀氏菌中對外界環境抵抗力最強，分布較廣的一類菌型，因此 建立快速、靈敏、準確地檢測宋內氏志賀氏菌的檢測方法至關重要。
[0003] 現今，用于宋內氏志賀氏菌的檢測包括傳統的生物學檢測、分子生物檢測、免疫學 檢測方法。傳統的細菌培養和生化鑒定耗時，操作繁瑣；分子生物學檢測比如PCR方法雖 然快速、準確，但是易受操作條件影響其特異性；免疫學檢測具有特異性強、準確、靈敏的特 點，但制備特異性抗體的過程耗時復雜，制備出的抗體也易受溫度等環境因素的影響。
[0004] 適配子是通過SELEX技術從體外合成的隨機寡核苷酸單鏈文庫中篩選而得，能夠 以特定的結構與靶標高特異親和的一段較短的單鏈DNA序列或RNA序列。如今，適配子已經 廣泛地應用于如靶標檢測、酶抑制，受體調節和藥物傳遞等各種領域。適配子相比抗體表現 出極大的優勢，除了具有較高的特異親和性；適配子篩選完全在體外進行，篩選周期短，合 成方便且成本低，同時易標記一些功能基團和報告分子；適配子變性與復性可逆且速度快， 穩定好，受環境條件影響小，可長期保存。隨著SELEX技術的不斷完善進步，適配子已經廣 泛用于不同的靶標，如小分子物質（有機染料，金屬，藥物，氨基酸，核苷酸和肽等）、蛋白質 (包括酶、抗體、基因調控因子，以及外源凝集素）、腫瘤細胞、病毒和致病菌等。Cell-SELEX 篩選是一種基于完整細菌細胞為靶物質的篩選方法，將細菌懸浮液通過離心沉淀從而分離 出結合和未結合的寡核苷酸分子。近幾年，已成功米用Cell-SELEX技術篩選出大腸桿菌、 沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等細菌的適配子，基于Cell-SELEX技術篩選病 原致病菌、腫瘤細胞等細胞的適配子已經成為當前的研究熱點。
[0005] 本發明以引起腸道傳染病的宋內氏志賀氏菌為靶標，采用Cell-SELEX技術篩選 出宋內氏志賀氏菌的高特異親和的適配子，穩定性高、合成方便、易標記功能基團和報告分 子，將廣泛應用于食品中宋內氏志賀氏菌的快速檢測。
【發明內容】
[0006] 本發明目的在于提供一種微生物的分子生物學檢測方法，特別涉及一種利用適配 子技術快速、準確檢測宋內氏志賀氏菌的方法。
[0007] 本發明方法利用指數級富集配體的系統進化技術（SELEX技術），以宋內氏志賀氏 菌完整的菌細胞為靶標，篩選獲得2條與靶細胞高親和性特異結合的適配子Spl、Sp20,可 以通過熒光基團標記方法將獲得的適配子轉為報告適配子，用于食品中宋內氏志賀氏菌的 檢測，達到快速、準確診斷的目的。
[0008] 本發明的優點：
[0009] (1)與抗體相比，適配子可在體外篩選，篩選周期短，合成方便，易標記各種功能基 團和報告分子，性質穩定，可長期保存使用。
[0010] (2)該組序列是從結構顯著、與宋內氏志賀氏菌結合具有不同親和力的9條適配 子序列中選取出的親和力和特異性均較強的一組適配子序列，能夠特異識別宋內氏志賀氏 菌。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1是宋內氏志賀氏菌9個適配子家族代表性序列的二級結構圖譜。
[0012] 圖2是宋內氏志賀氏菌適配子Spl、Sp20、Sp22、Sp23親和力飽和結合曲線。
[0013] 圖3是宋內氏志賀氏菌適配子5?1、5?20、5?22、5?23的特異性圖。
[0014] 表1是宋內氏志賀氏菌適配子解離常數。
【具體實施方式】：
[0015] 下面是通過Cell-SELEX技術篩選高特異親和的宋內氏志賀氏菌核酸適配子及其 快速檢出宋內氏志賀氏菌方面的應用。
[0016] 1、合成隨機單鏈DNA文庫和引物（IDT公司合成）
[0017] 隨機單鏈 DNA 文庫：5，-TGAGCCCAAGCCCTGGTATG-N40-GGCAGGTCTACTTTGGGAT C-3'，構建了長度為80nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為40個堿基的隨 機序列，庫容量達到1014以上；上游引物：5' -TGAGCCCAAGCCCTGGTATG-3' ^端磷酸化 下游引物：5' -(phosphateXATCCCAAAGTAGACCTGCCHV，將隨機ssDNA文庫和兩種引物 均用TE緩沖液配制成100 μ mol/L貯存液-20°C貯存備用。
[0018] 2、篩選所用宋內氏志賀氏菌的獲取與處理
[0019] LB液體培養基培養宋內氏志賀氏菌，37°C搖床過夜培養。LOX IO8CfVmL濃度的 菌液lmL，在4°C，3500rpm下離心3min，棄上清，用結合緩沖液BB (50nM Tric-HCl，5nMKCl, IOOnM NaCl，InM MgCl2, PH = 7. 4)沖洗兩次，洗去培養基成分，置4°C環境儲存備用。
[0020] 3、Cell-SELEX技術篩選適配子
[0021] 第一輪篩選時，反應體系為600 μ L，取2nmol擴增后的隨機ssDNA文庫加入BB緩 沖液于95°C變性lOmin，立即0°C冷卻lOmin，再加入處理好的菌細胞離心管內。為降低結合 背景，體系中再加入10倍于隨機ssDNA文庫摩爾數的0. 5% BSA溶液和tRNA，于37°C孵育 lh。孵育后更換離心管，以除去與離心管壁結合的ssDNA，然后在4°C，5000rpm離心5min， 棄上清，去除未結合或結合不緊密的ssDNA。隨后用BB結合緩沖液清洗2次，懸于100 μ L 1\?〇?緩沖液中，在951：變性10111丨11，01：立即冷卻10111丨11，再經41：，5000印111離心5111丨11解 離下結合的ssDNA，吸取上清即為第一輪篩選所得的ssDNA適配子，并以此為模板進行PCR 擴增。
[0022] 50 μ L PCR 體系包括 2 μ L ssDNA 模版，1 μ L 上游引物（20 μ mol/L)，1 μ L 下游 引物（10ymol/L)，lyL dNTP(5mmol/L)，0.5yL Taq DNA 聚合酶（5U/yL)，5yL IXPCR Buffer，39. 5μ L超純水。熱循環參數為94°C變性5min，接著94°C變性45s，56°C退火45s， 72°C延伸45s，進行19輪循環，然后72°C延伸lmin，最后12°C冷卻2min。PCR產物采用8% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，采用Gelred染色后置于紫外光下驗證PCR產物dsDNA大小為 80bp。最后PCR產物采用酚一氯仿方法提純。
[0023] 為獲得下一輪篩選ssDNA文庫，PCR產物dsDNA采用Lambda核酸外切酶酶切Y 端磷酸基團修飾的DNA鏈。酶切在37°C反應30min，75°C下滅酶lOmin，再采用8%聚丙烯 酰胺變性凝膠電泳驗證酶切完全。酚一氯仿方法提純后的ssDNA用于第二輪篩選的文庫。 第二輪至第十二輪反應體系為350 μ L，其中隨機ssDNA文庫為lOOpmol。篩選每增加一輪， 加入BSA和tRNA溶液的摩爾數增大一倍，直至增大至8倍。為提高篩選適配子的特異性， 每三輪采用痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌進行 反篩。
[0024] 4、克隆和測序
[0025] 將第十二輪篩選得到ssDNA適配子的PCR擴增產物送上海生工生物工程有限公司 進行DNA序列測定，獲得30條適配子序列。
[0026] 5、適配子序列結構分析
[0027] 采用DNAMAN和RNA Structure 4. 6軟件分別分析30條序列的同源性信息和二級 結構（說明書附圖1所示）。結合兩種軟件分析結果將序列分為9個家族，從每個家族中選 出1條結構穩定，能級較低的序列共9條，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成5' 端標記FAM的適配子，用于親和力和特異性分析。
[0028] 6、適配子與宋內氏志賀氏菌親和力和特異性測定
[0029] 6. 1適配子親和力分析
[0030] 將合成的9條適配子用TE緩沖液配稀釋配制成10 μ mol/L溶液，貯存在-20°C 下備用。采用BD FACS Cal ibur流式細胞分析儀分析9條適配子的親和性。取不 同體積的1〇μ mol/L適配子加入500μ L BB結合緩沖液中稀釋為不同的濃度梯度 (10, 20, 50, 75, 100, 150, 200nmol/L)，于 95°C變性 10min，立即(TC冷卻 10min。將適配子溶 液加入處理好的1X108個宋內氏志賀氏菌細胞中，在37°C下緩慢振蕩孵育lh。然后用BB 緩沖液清洗，重懸于500 μ L BB緩沖液后進行流式細胞分析。流式細胞分析中先調節空白 樣品（未加適配子）的熒光強度，然后在相同參數下測定樣品的前向散射、側向散射和熒光 強度。樣品的熒光強度百分比表征親和性大小，利用Sigma Plot 11.0軟件計算各適配子 的解離常數Kd值如下表1所示，并繪制其飽和結合曲線（說明書附圖2所示）。
[0031] 表 1
[0032]
【權利要求】
1. 一組特異性識別宋內氏志賀氏菌的寡核苷酸適配子，其特征在于寡核苷酸適配子序 列如序列表中序列1，2所示的序列。
2. 如權利要求1中所述的寡核苷酸適配子在檢測食品中宋內氏志賀氏菌方面的應用。
【文檔編號】G01N15/14GK104278036SQ201410524006
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月8日 優先權日:2014年10月8日
【發明者】王周平, 鞏文慧, 段諾, 吳世嘉, 夏雨, 馬小媛, 郭曉飛 申請人:江南大學
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