專利名稱：一種人羊膜間充質干細胞的分離純化及鑒定方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種人羊膜間充質干細胞的分離、純化及鑒定方法。
背景技術：
人羊膜間充質干細胞(human amniotic mesenchymal stem cells, hAMSCs)發源于胚胎早期的胚外中胚層，具有與骨髓間充質干細胞相似的表型，如表達SSEA-4、0CT-4、 CD29、CD44、CD73、CD90、CD166 及波形蛋白，而不表達 CD34、CD45、CD80、CD86 及 HLA-DR ；具有多系分化潛能，在適宜誘導條件下可分化成肝細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞心肌細胞、、胰島細胞、神經元樣細胞等；具有來源廣泛，取材方便、無侵入性傷害、不牽涉醫學倫理問題等優勢，因此，hAMSCs作為供體細胞資源在再生醫學領域具有廣泛的應用前景。此外， MSCs還具有免疫調節作用，在器官移植、血液系統疾病和自身免疫性疾病的臨床治療領域顯現出優于傳統治療的獨特價值。hAMSCs的制備過程涉及hAMSCs的分離、純化、鑒定、體外培養擴增等技術環節。目前關于hAMSCs的分離、純化、鑒定尚無統一方案。hAMSCs的分離方法有胰蛋白酶-膠原酶液化、膠原酶-中性蛋白酶、羊膜片貼壁培養分離等方法，酶消化法相對簡便，而貼壁培養分離較為煩瑣且收率不高。各家在采用胰蛋白酶-膠原酶液化法分離hAMSCs時所用胰蛋白酶和膠原酶的濃度、消化溫度、消化時間等條件各不相同，分離效果(收率)存在較大差異， 迄今尚無具有統計學意義的每份人羊膜的hAMSCs收率數據。hAMSCs的純化方法多采用原始分離樣品貼壁培養。hAMSCs的鑒定主要根據其表型特征通過高能量流式細胞術、免疫組織化學染色、免疫熒光檢測hAMCs標志物，如⑶14丄擬9、⑶；34、⑶44、、⑶45、⑶90、HLA_DR、 SSEA-4、0CT-4等；少數采用逆轉錄一聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測其相關基因及全能性相關基因表達，如 LEFTYA、Cripto、Sox2、Nanog、0ct-4、ACTG2、ACTA2、MMP2 等。目前不僅缺乏統一的hAMSCs鑒定標準，而且存在諸多問題①受檢樣品不一致，原代和傳代細胞的表型標志不盡相同；②hAMCs與羊膜上皮細胞的陽性標志物有交叉，如⑶44、⑶90、SSEA-4 、0CT-4等，陰性標志物也有交叉如⑶14、⑶34、⑶45、HLA-DR等，單憑這些標志物的檢測不能區分hAMCs與羊膜上皮細胞；③有的檢測方法如原位免疫組織化學染色和免疫熒光染色不能反映細胞群體的標志特征，有的檢測方法如PCR較為繁瑣且成本較高。鑒于上述存在的問題，本發明提供了一種人羊膜間充質干細胞的分離、純化及鑒定方法，是一種高豐度、高純度、高活力的分離方法、簡便而明確的鑒定指標和適宜的體外擴增培養方案。
發明內容
本發明解決的技術問題是現有技術存在的問題，本發明提供了一種高收率、高純度、高活力的人羊膜間充質干細胞分離、純化方法以及簡便、準確的人羊膜間充質干細胞鑒定方法。
本發明采用的技術方案為
本發明的人羊膜間充質干細胞的分離，包括以下步驟
第一，無菌采集人足月剖宮產胎盤，機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hank’ s液沖洗數次以清除殘留血跡，將羊膜剪成碎片；
第二，羊膜碎片加入含EDTA的胰蛋白酶消化溶液旋轉消化10分鐘，棄上清；重新加入消化液，旋轉消化棄上清，留取未消化的羊膜碎片；
第三，D-Hank’ s液沖洗未消化的羊膜碎片，加入含有DNase I的膠原酶，旋轉消化至組織完全消化，300目鋼網過濾，收集細胞濾液，離心，收集細胞沉淀，得到原始的人羊膜間充質干細胞；
第四，將分離的原始的人羊膜間充質干細胞重新懸浮于LG-DMEM培養基(購自Gibco 公司，貨號31600-0 )中，將細胞密度接種于6孔培養板，置于CO2培養箱培養，在倒置顯微鏡下除去完全未貼壁生長的羊膜上皮細胞，第3天更換新的培養基；待細胞匯合度達 8(Γ90%后，用胰蛋白酶一EDTA溶液消化，加入培養基終止胰蛋白酶作用，離心棄上清，細胞沉淀用培養基重新懸浮，以1X107/L的細胞密度傳代。本發明的人羊膜間充質干細胞的鑒定方法，包括以下步驟
第一，免疫細胞化學染色人羊膜間充質干細胞爬片用PBS緩沖液漂洗，多聚甲醛固定，PBS漂洗，Triton-XlOO作用15 20 min, H2O2滅活內源性過氧化物酶，PBS漂洗，加正常羊血清封閉，滴加波形蛋白抗體或鼠抗人CK19抗體室溫孵育，PBS漂洗，滴加鼠兔通用型二抗室溫孵育，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察，陰性對照組用PBS替代一抗；
第二，流式細胞術分析調整人羊膜間充質干細胞密度為IX 106/ml，每管200 ？ L細胞懸液，共3管，分別加入各20 L熒光標記單抗Q^9-PE+CD44-FITC、CD34-PE+CD45-FITC 和⑶166-PE，混勻，室溫避光孵育，每管加2 ml含1 g/L Ni^3的磷酸鹽緩沖液，混勻，離心棄上清，振蕩懸浮細胞，每管加入10 g/L多聚甲醛300 ？ L，混勻，用流式細胞儀檢測，用Cell Quest軟件進行采集分析，用小鼠IgG-FITC或IgG-PE作為同型對照。結合免疫細胞化學染色和流式細胞術分析結果，hAMSCs的鑒定標志為波形蛋白陽性，CK19陰性，CD29, CD44、和CD166均陽性，CD34和CD45均陰性。本發明達到的有益效果
(1)本發明人羊膜間充質干細胞的分離的有益效果從羊膜分離的原代hAMSCs數> 6X IO7 /份，通過原代培養細胞數可擴增12倍，這樣的細胞產率已能滿足臨床細胞治療的需用量。(理論上，一個成熟的完整人羊膜含有4X IO8個hAMSCs)
(2)本發明人羊膜間充質干細胞的純化的有益效果所獲的hAMSCs其純度>99%，用臺盼藍染色其活細胞率達98% ；如果不經過貼壁生長培養純化步驟，其純度則不到85%，更重要的是純度低的樣品將大大影響后續實驗及實驗結果的評價。(3)本發明人羊膜間充質干細胞的鑒定方法的有益效果①原代分離樣品因受消化酶的影響可能致表面標志丟失，而用第2代hAMSCs作為鑒定樣品更能準確反映hAMSCs 的表型特征；②通過免疫細胞化學染色波形蛋白和CK19，可鑒別hAMSCs和羊膜上皮細胞； ③我們通過流式細胞術反復檢測證明hAMSCs穩定表達⑶29、⑶44、和⑶166，而不表達 ⑶34和⑶45，該表型譜可作為鑒定hAMSCs的表型，不必過多檢測其它表面標志；④本鑒定方案方法簡便、準確。
具體實施例方式實施例1
本發明的人羊膜間充質干細胞的分離，包括以下步驟
第一，無菌采集人足月剖宮產胎盤，機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hank’ s液沖洗數次以清除殘留血跡，將羊膜剪成2mmX2mm大小的碎片；
第二，羊膜碎片加入含0. 02%EDTA的0. 05%胰蛋白酶消化溶液，于37° C，200轉/分旋轉消化10分鐘，棄上清；重新加入消化液，于37° C，200轉/分旋轉消化30分鐘，棄上清，留取未消化的羊膜碎片；
第三，D-Hank，s液沖洗未消化的羊膜碎片，加入含有0.075 mg/ml DNase I的0.75 mg/ ml的膠原酶，于37° C，200轉/分旋轉消化約2 h至組織完全消化，300目鋼網過濾，收集細胞濾液，1500轉/分，離心10分鐘，收集細胞沉淀即原始hAMSCs，本次從羊膜分離的原代 hAMSCs 數達 6. 7 X IO7 / 份；
第四，將分離的原始MMSCs重新懸浮于LG-DMEM培養基中(含10% FBS、10 μ g/ml bFGF、55 μ mol/L 2-巰基乙醇，100 U/ml 青霉素和 100 mg/ml 鏈霉素)，以 1. 25X 105/ml 的細胞密度接種于6孔培養板，置于37° C、飽和濕度、體積分數為5%ω2的(X)2培養箱培養 36 48小時，在倒置顯微鏡下除去完全未貼壁生長的羊膜上皮細胞，這一點非常重要。第 3天更換新的培養基。待細胞匯合度達80 90%后，用0. 25%胰蛋白酶一0. 02% EDTA溶液于 37° C消化纊3分鐘，加入培養基終止胰蛋白酶作用，1000轉/分，離心5分鐘，棄上清， 細胞沉淀用培養基重新懸浮，以1 X 107L的細胞密度傳代。所獲的hAMSCs其純度為99. 2% (根據波形蛋白陽性率判定)，用臺盼藍染色其活細胞率為98. 5%。通過原代培養可擴增12 倍，產生的hAMSCs數達8 X IO8。實施例2
本發明的人羊膜間充質干細胞的鑒定方法，包括以下步驟
第一，免疫細胞化學染色hAMSCs爬片用PBS緩沖液漂洗，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗，0. 3%Triton_X100作用15 20 min, 3%H202滅活內源性過氧化物酶10 min， PBS漂洗，加正常羊血清封閉30 min，滴加波形蛋白抗體或鼠抗人CK19抗體室溫孵育1 h， PBS漂洗，滴加鼠兔通用型二抗室溫孵育1 h，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察。陰性對照組用PBS替代一抗。結果應為hAMSCs表達波形蛋白，而不表達上皮細胞標志CK19，以此可排除分離hAMSCs過程中是否有羊膜上皮細胞的混雜，同時可判斷所分離的hAMSCs的純度；
第二，流式細胞術分析調整hAMSCs密度為IXlO6Ail，每管200 ？ L細胞懸液，共3 管，分別加入熒光標記單抗CD29-PE+CD44-FITC、CD34-PE+CD45-FITC和CD166-PE，每種抗體各20 L，混勻，室溫避光孵育25分鐘。每管加2 ml含1 g/L NaR的磷酸鹽緩沖液，混勻，1000轉/分離心5分鐘，棄上清，振蕩懸浮細胞。每管加入10 g/L多聚甲醛300 ？ L， 混勻，用流式細胞儀檢測，每一樣品采集細胞> 20 000個，用Cell Quest軟件進行采集分析，用小鼠IgG-FITC或IgG-PE作為同型對照。根據免疫細胞化學染色和流式細胞術分析結果，本次分離、純化的hAMSCs其波形蛋白陽性率為99. 2%,而CK19為陰性；⑶29、CD44、和CD166表達率分別為99. 5%,80. 1%和 92. 7%,而不表達⑶；34和CD45，可判定為hAMSCs。
權利要求
1.一種人羊膜間充質干細胞的分離純化方法，其特征在于包括以下步驟第一，無菌采集人足月剖宮產胎盤，機械法將羊膜從胎盤組織上剝離，用D-Hank’ s液沖洗數次以清除殘留血跡，將羊膜剪成碎片；第二，羊膜碎片加入含0. 02%EDTA的0. 05%胰蛋白酶消化溶液，于37° C，旋轉消化棄上清；重新加入消化液，于37° C旋轉消化棄上清，留取未消化的羊膜碎片；第三，D-Hank，s液沖洗未消化的羊膜碎片，加入含有0.075 mg/ml DNase I的0. 75 mg/ml的膠原酶，于37° C，旋轉消化約2 h至組織完全消化，300目鋼網過濾，收集細胞濾液，離心得到原始的人羊膜間充質干細胞；第四，將分離的原始的人羊膜間充質干細胞重新懸浮于LG-DMEM培養基中，將細胞密度接種于6孔培養板，置于(X)2培養箱培養，在倒置顯微鏡下除去完全未貼壁生長的羊膜上皮細胞，第3天更換新的培養基；待細胞匯合度達80、0%后，用胰蛋白酶一EDTA溶液消化， 加入培養基終止胰蛋白酶作用，離心棄上清，細胞沉淀用培養基重新懸浮，以1 X 107L的細胞密度傳代。
2.根據權利要求1所述的一種人羊膜間充質干細胞的分離純化方法得到的人羊膜間充質干細胞的鑒定方法，其特征在于包括以下步驟第一，免疫細胞化學染色人羊膜間充質干細胞爬片用PBS緩沖液漂洗，多聚甲醛固定，PBS漂洗，Triton-XlOO作用15 20 min, H2O2滅活內源性過氧化物酶，PBS漂洗，加正常羊血清封閉，滴加波形蛋白抗體或鼠抗人CK19抗體室溫孵育，PBS漂洗，滴加鼠兔通用型二抗室溫孵育，PBS漂洗，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察，陰性對照組用PBS替代一抗；第二，流式細胞術分析調整人羊膜間充質干細胞密度為IX 106/ml，每管200 ？ L細胞懸液，共3管，分別加入各20 L熒光標記單抗Q^9-PE+CD44-FITC、CD34-PE+CD45-FITC 和⑶166-PE，混勻，室溫避光孵育，每管加2 ml含1 g/L Ni^3的磷酸鹽緩沖液，混勻，離心棄上清，振蕩懸浮細胞，每管加入10 g/L多聚甲醛300 ？ L，混勻，用流式細胞儀檢測，用Cell Quest軟件進行采集分析，用小鼠IgG-FITC或IgG-PE作為同型對照。
全文摘要
本發明公開了一種人羊膜間充質干細胞的分離純化及鑒定方法，hAMSCs的分離方法為將人羊膜剪成碎片，用EDTA的胰蛋白酶，DNaseI的膠原酶分二步旋轉消化，用鋼網過濾，收集細胞濾液即為分離的原始hAMSCs；hAMSCs的純化方法是原始hAMSCs用LG-DMEM培養基置于CO2培養箱培養，在倒置顯微鏡下除去完全未貼壁生長的羊膜上皮細胞，第3天更換新的培養基，待細胞匯合度達80~90%后，用胰蛋白酶—EDTA溶液消化收集細胞即可獲得高純度的hAMSCs；hAMSCs的鑒定方法采用免疫細胞化學染色波形蛋白和CK19以鑒別hAMSCs和羊膜上皮細胞，采用流式細胞術檢測CD29、CD44、CD166、CD34和CD45的表達。本發明方法具有hAMSCs高收率、高活性、高純度優點，鑒定方法簡便、精準。
文檔編號G01N15/10GK102559586SQ20111040458
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者方寧, 陳代雄 申請人:遵義醫學院附屬醫院
專業數控銑床產品供應商
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