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專利名稱：：治療肺癌的方法
技術領域：
：本發明涉及肺癌的治療。
背景技術：
：表皮生長因子受體(EGFR)在來源于各種組織的實體癌的生長中具有重要的作用，并且在被調查的40%到80。/。的非小細胞肺癌中過表達(SalomonDS,etal"Crit.Rev.Oncol.Hematol.1995;19:183-232;和MendelsohnJ,etal.，Oncogene2000;19:6550-65)。EGFR的過表達也與肺癌患者的預后不良相關(SelvaggiG，etal,,Ann.Oncol.2004;15:28-32)。吉非替尼(Gefitinib)(易瑞莎(Iressa)，ZD1839)是一種口服的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，該酶是參與癌細胞的擴散、浸潤和存活的EGFR信號通路中的關鍵酶(WakelingAE,etal.，CancerRes2002;62:5749-54)。在針對使用鉑制劑化療未見效的進行性非小細胞肺癌患者的臨床試驗中，吉非替尼已經展示出了有效的抗腫瘤效果(FukuokaM,etal.,J.Clin.Oncol.2003;21:2237-46.;KimYH,etal.,Clin.CancerRes.2004;10:7311-7)。基于這些發現，在包括日本、澳大利亞和美國在內的幾個國家已經使用吉非替尼來治療晚期非小細胞肺癌。在曰本，自從該藥得到批準之后，已經用其治療了大約37,000例患有晚期非小細胞肺癌的患者(EvansTL.Oncologist2004;9:232-8)。雖然吉非替尼對于那些日本人患者中的很多人能有效地改善預后和QOL,但是這些患者中的60%沒有顯示出癥狀上的改善。不僅如此，5.4%的患者已經患有嚴重的吉非替尼誘導的急性間質性肺病(TakanoT，etal.,LungCancer2004;45:93-104)。因此，需要提供一種指標，使醫師能夠選擇吉非替尼能夠起作用的患者。然而，到目前為止，在包括體內EGFR突變在內的已凈皮4企-險的因素中，無一能夠確定患者對吉非替尼施用的應答性(從疾病控制或者改善存活率方面看)。具體地，目前沒有已知的指標能夠準確地區分對吉非替尼應答性低的患者和對吉非替尼有應答的患者。有報道稱，可以基于存在EGFR突變來預計有可能對吉非替尼有部分應答(PR)的患者。然而，無法明確地顯示維持狀況穩定的患者能夠獲得延長生存的效果(LynchTJ,etal.，N.Engl.J.Med.2004;350:2129-39.;PaezJGetal.，Science2004;304:1497-500.;PaoW，etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2004;101:13306-ll.;TokumoM，etal.,Clin.CancerRes.2005;11:1167-73.;MitsudomiT,etal.，J.Clin,Oncol.2005;23:2513-20)。近來，通過對在晚期非小細胞肺癌中表達的基因的表達信息的統計分析，鑒定出了與對吉非替尼的應答相關的十二個基因。而且，已經提出了基于基因的表達水平的吉非替尼應答評分系統，其中在對吉非替尼施用有部分應答(PR)的患者群和進展性疾病(PD)的患者群之間，該基因的表達有極大的不同(KakiuchiS，etal.,Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43.;WO2005/49829)。專利文獻1:WO2005/49829非專利文獻1:KakiuchiS,etal.，Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43.
發明內容本發明所要解決的問題本發明的一個目的是提供用于肺癌治療的新技術。具體地，提供用于區別對于以吉非替尼為代表的erbB受體抑制劑有反應的肺癌患者和對該抑制劑顯示出較低反應的肺癌患者的技術，使人們能夠對預期有反應的患者施用erbB受體抑制劑。可選地，本發明優選的實施方案提供能夠高靈敏地檢測對于erbB受體抑制劑應答性較低的患者的技術。解決問題的方法基于吉非替尼反應的計分系統得到的預測結果(KakiuchiS,"a/.，Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43.;WO2005/49829)在所有追加檢查的病例(PR和PD)中與吉非替尼的臨床應答性是一致的。此外，該系統可以將病況穩定(SD)的患者群區分成兩組一組患者的腫瘤能夠長時間地維持在穩定狀態下，另一組則不能。然而，對表達譜或者突變的分析需要通過活檢或者手術獲得臨床樣本。事實上，對于晚期非小細胞肺癌的病例通常不實施活檢或者手術。因此，從患者獲得用于評分必須的樣品是困難的。因此，吉非替尼反應評分系統是難于應用到臨床上的方法。因此，急需開發能夠通過使用血清學標志預測肺癌對于吉非替尼治療是敏感性還是抗性的方法。作為向該目標邁出的一步，通過上文提及的cDNA微陣列分析，發現兩種EGFR配體的編碼基因在來源于對吉非替尼無應答的患者的腫瘤組織中是過表達的，這兩種配體為雙調蛋白(下文中稱為AREG)和轉化生長因子a(TGF-a,下文中稱為TGFA)(KakiuchiS,Wa/.，HumMolGenet2004;13:3029-43)。也已經指出了利用血清中TGFA水平作為針對吉非替尼應答性的預測指示劑的可能性(WO2005/49829)。雖然如此，當僅使用血中TGFA水平作為指標時，有超過一半的無應答患者不能從有應答患者中區分出來。具體地，基于血中TGFA水平被判方面，基于血中TGFA水平被判定為陰性的患者中，也包括很多對于吉非替尼低應答的患者。就是說，血中TGFA水平是顯示高特異度的指標，但是從靈敏度上來看，當檢測對于吉非替尼應答性較低的患者時仍有提升的空間。'因此，需要能夠準確區分吉非替尼有應答的患者和無應答的患者的方法。更具體地說，本發明的目的是提高對于吉非替尼應答性低的患者的檢測的靈敏度。使用血中的物質作為指標來對吉非替尼應答性進行預測具有如下的優點易于收集待測樣品(血液)例如，對于患者而言，與活檢樣品或者手術切除癌組織相比，收集血液樣品顯然具有更少的負擔(更少侵害)；以及易于進行定量檢測血液中的標志物的優點包括能夠使用諸如免疫檢測方法這樣的簡單的方法來對該標志物進行快速、定量的分析。然而，血液中的TGFA---"種已知的用于預測對于吉非替尼應答性的標志物，以檢測對吉非替尼應答性較低的患者的靈敏度的角度來說，仍有提升的空間。檢測靈敏度，意思是具有待檢表型(即"低應答性"表型)的患者的檢測靈敏度。換句話說，特定血液標志物的"檢測靈敏度"，可以看成通過使用血液標志物作為指標的預測方法所發現的患者數占具有待測表型的患者之總數的比例。或者，可以將其考慮為基于該血液標志物的測定值能夠發現目標患者的概率。因此，當檢測靈敏度較低時，遺漏掉具有待測表型的患者的可能性就較高。應該被檢測到但是卻被遺漏的患者，在統計學上稱為假陰性。血液中標志物的檢測靈敏度是統計學計算出的數值。通常，從統計學上來說，在檢測靈敏度和假陽性率之間有一種權衡取舍的關系(tradeoff)。例如，可以通過設定較低的截斷(cutoff)值來增加檢測靈敏度。然而，當截斷值設定得較低時，不僅檢測靈敏度會增加，噪音(假陽性)也會增加。此處，噪音與"有應答性的患者"相對應。換句話說，這意味著實際上有應答性而卻被判定為應答性低患者的患者數會增加。這樣，如果截斷值降低，通常不可避免地會降低預測精度。因此，用于檢測特定表型的標志物的檢測靈敏度，是該標志物的固有的統計學數值。本發明人以提高基于血液中TGFA水平來預測應答性的方法的檢測靈敏度為目的進行了深入研究。結果，本發明人發現，使用TGFA和雙調蛋白(AREG)這兩種標志物的血液水平作為指標，與單獨使用血液中TGFA來預測相比，可以極大地提高檢測靈敏度，并因此完成了本發明。具體地，本發明涉及下面所述的檢測針對肺癌治療劑應答性的方法、基于該檢測的方法的治療肺癌的方法以及用于該纟企測方法的試劑或者試劑盒。治療肺癌的方法，該方法包括對血液AREG濃度與標準值相比較4氐的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。治療肺癌的方法，該方法包括對血液中AREG濃度或者血液中TGFA濃度與標準值相比較低，或者兩者的濃度都與標準值相比較低的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。[2]所述的治療肺癌的方法，該方法包括對血液AREG濃度或者血液TGFA濃度與標準值相比較低的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。[l]所述的治療肺癌的方法，其中該erbB受體抑制劑是選自由吉非替尼、埃羅替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib組成的組中的任意化合物。治療肺癌的方法，該方法包括對血液AREG濃度與標準值相比較低的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。治療肺癌的方法，該方法包括對血液中AREG濃度或者血液中TGFA濃度或者兩者的濃度都與標準值相比較低的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。[2]所述的治療肺癌的方法，該方法包括對血液AREG濃度或者血液TGFA濃度與標準值相比較低的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。[l]所述的治療肺癌的方法，其中該erbB受體抑制劑是選自由吉非替尼、埃羅替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib組成的組中的任意化合物。—種肺癌治療劑，該治療劑含有作為活性成分的erbB受體抑制劑，供施用于血液AREG濃度與標準值相比較低的患者。—種肺癌治療劑，該治療劑含有作為活性成分的erbB受體抑制劑，供施用于血液AREG濃度和血液TGFA濃度與標準值相比均較低的患者。[5]或[6]所述的肺癌治療劑,其中該erbB受體抑制劑是選自由吉非替尼、埃羅替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib組成的組中的任意化合物。erbB受體抑制劑在制備肺癌治療劑中的用途，所述治療劑供施用于血液AREG濃度和血液TGFA濃度與標準值相比均較低的患者。[9]治療肺癌用試劑盒，該試劑盒包括以下組件(1)含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑；以及(2)記載下列內容的說明書血液AREG濃度與標準值相比較高的患者對于含有針對erbB受體抑制劑的抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性較低。[9]所述的治療肺癌用試劑盒，該試劑盒還包括以下成分(3)記載下列內容的說明書血液TGFA濃度與標準值相比較高的患者對于含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性較低。檢查對于肺癌治療劑的應答性的方法，其中該肺癌治療劑含有erbB受體抑制劑作為活性成分，其中該方法包括以下步驟(1)測量肺癌患者的血液樣品中的AREG濃度；以及(2)當AREG濃度與標準值相比較高時，確定該患者對于含有erbB受體抑制劑肺癌作為活性成分的肺癌治療劑的應答性較低。[ll]所述的檢查方法，該方法還包括以下步驟(1)測量肺癌患者的血液樣品中的TGFA濃度；以及(2)當AREG濃度或者TGFA濃度高于標準值或者此二者的濃度均高于標準值時，確定該患者對于含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性較低。[ll]所述的方法，其中當AREG濃度或者TGFA濃度相比于標準值較高時，確定該患者對于含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性較低。[ll]所述的檢查方法，該方法包括使用免疫測定來測量血液樣品中AREG濃度。—種檢查試劑盒，用于檢查針對含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性，其中該試劑盒包括以下組件i.用于測量AREG血液濃皮的免疫測定試劑；以及ii.AREG的陽性對照。[15]所述的檢查試劑盒，該試劑盒還包括以下組件iii.用于測量TGFA的血液濃度的免疫測定試劑；以及iv.TGFA的陽性對照。[16]所述的檢查試劑盒，其中陽性對照樣品含有AREG和TGFA。[18][17]所述的檢查試劑盒，其中作為陽性對照的樣品是液體。發明的效果本發明提供了基于血液標志物來預測針對erbB受體抑制劑的應答性的方法。使用血液作為樣品，可以方便經濟地測定血液標志物。也可以通過諸如免疫測定這樣的技術來對這些標志物進行定量評價。此外，在本發明中，除了已知的標志物TGFA以外，通過使用AREG作為第二標志物極大地提高了針對應答性低的患者的檢測靈敏度。而且，本發明提供了治療肺癌的方法，其中該方法包括對利用本發明預測了對于erbB受體抑制劑有應答的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。erbB受體抑制劑包括吉非替尼等物質。人們認為，吉非替尼這種藥物，最好是選擇期待對其盡可能有應答性的患者加以施用。本發明能夠高靈敏度地檢出低應答性的患者，并且能夠對預期有應答的患者進行特異的選擇。這樣，可能極大地促進使用吉非替尼等erbB受體抑制劑的肺癌治療方法的療效。本發明也可以預防對不能期待有應答的患者施用藥物所伴隨的非必要副作用的不利。由不能期待有療效的藥物所引起的副作用會嚴重損害患者的生活質量(QOL)。通常，以施用藥物為首，疾病治療措施都伴隨著不同程度的副作用的風險。因此，醫療處理的基本規則，是斟酌副作用的風險和預期的療效，選擇可以相信能夠獲得最大療效的治療方法。不能預期具有療效的醫療行為不應選擇。因此，預測低應答性的患者的能力將會促使肺癌患者生活質量的提高。TGFA和AREG都是EGFR配體，已經發現在肺癌組織中其表達水平與針對吉非替尼的應答性相關。而且，已經發現TGFA的血液水平與針對吉非替尼的應答性相關。然而，還沒有報道稱AREG的血液水平可以作為針對erbB受體抑制劑的應答性的預測標志物。此外，發現將TGFA和AREG相結合的預測結果，與單獨使用TGFA來進行預測相比，極大地促進了對于低應答性患者的檢測靈敏度，該發現超出了預期。具體地，結合使用AREG可以檢測到50%或者更多的使用血液TGFA預測所不能檢測到的患者。換句話說，超過一半的被TGFA檢測所遺漏但實際上具有低應答性的患者，能夠通過測量AREG而被重新檢出。更具體的說，例如，以下實施例的數據顯示出對于TGFA和AREG檢測靈敏度分別為43.3%和40%。該結果表明通過4企測這些標志物可以發現40%的低應答性的患者。本發明人更加詳細的分析了每位TGFA陽性的患者和AREG陽性的患者。他們發現二者并不完全重疊。就是說，通過使用兩種標志物TGFA和AREG作為指標，二者互相補償來發現分別使用單一標志物時被遺漏的患者。其結果是，分別單獨使用一種標志物時被遺漏的患者中，有50%或者更多最終可以被重新檢出。此外，在本發明優選的實施方案中，可以將PD病例與PR或者SD患者區分開來。相反，公知的分析EGFR突變的方法能夠挑選出PR患者，但是使用該方法幾乎不可能識別出SD患者。這是本發明重要的優點。圖1顯示的是對50位接受吉非替尼治療的NSCLC患者血清中雙調蛋白(AREG;A)和TGFA(TGFA;B)的濃度ELISA檢測的結果。八例是PR，十二例是SD，30例是PD。水平線表示截斷水平；濃度高于該線標記為陽性，而濃度低于該線則標記為陰性。圖2顯示的是表示靈敏度和假陽性比例的ROC曲線，其中該曲線是通過對50位接受吉非替尼治療的患者的血清雙調蛋白濃度(A)或者血清TGFA濃度(B)使用不同截斷值來預測性診斷腫瘤減小的效果獲得的。圖3顯示的是對50位接受吉非替尼治療的患者的腫瘤特異存活率進行Kaplan-Meier分析的結果，該分析是按照血清雙調蛋白濃度(A)或者血清TGFA濃度(B)的陽性或者陰性濃度進行的。利用時序檢驗(log-ranktest)計算了這些組之間的差異。實施發明的最佳方式已經發現屬于erbB家族的酪氨酸激酶受體與細胞生長和癌細胞的存活有著密切的聯系。該類受體的已知例子包括erbB2、erbB3、erbB4或者EGFR(KlapperLN.efa/.,Adv.CancerRes.2000,77:25-79)。在高水平表達這些受體的癌癥中，觀察到趨于高活性和預后不良的趨勢。相反，發現了通過抑制erbB的表達和或者活性可以抑制細胞的生長(Mendelsohn"a/.，Oncogene2000，19,6550-65)。基于這些發現，進行了屬于erbB家族的酪氨酸激酶受體抑制劑的作為抗癌劑的開發。吉非替尼就是通過如此過程發現的化合物。在本發明中，erbB受體抑制劑指具有抑制屬于erbB家族的酪氨酸激酶受體活性的作用的化合物。因此，例如，本發明的erbB受體抑制劑包括針對erbB2、erbB3、erbB4或者EGFR的活性的抑制劑。erbB受體抑制劑可以是特異針對具體受體起作用的化合物或者針對很多受體起作用的化合物。在本發明中，對受體活性的抑制指對于通過結合配體將信號轉導到細胞的受體的功能的任意階段的抑制。因此，抑制受體和配體之間結合的拮抗劑是典型的erbB受體抑制劑。或者，erbB受體抑制劑也包括對信號轉導中必需的酪氨酸激酶活性具有抑制活性的化合物。例如，吉非替尼經口服施用，在體內通過阻遏經由EGFR受體的信號轉導來抑制癌細胞的生長。更具體地說，例如，如以下所述的化合物可指明是本發明的erbB受體抑制劑。也可以將這些化合物以藥學上可接受的鹽的形式施用。在本發明中優選的erbB受體抑制劑是吉非替尼。吉非替尼^(3-氯-4-氟苯基)-7-曱氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺；N—(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-methoxy-6-(3-morpholinopropoxy)quinazolin-4-amine)(吉非替尼；ZD1839,美國化學文摘登入號碼184475-25-2，產品名"易瑞莎，，，Woodburn,J.R.,da/.:Proc.Am.Assoc.CancerRes.,38,633Abs4251,1997;Pharmacol.Ther.,1999,82，241-250)埃羅替尼(Erlotinib):N-(3-乙炔苯基)-6，7-雙(2-曱氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺；N-(3畫ethynylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)quinazolin-4-amine(i矣羅替尼，OSI-774,美國化學文摘登入號碼183319-69-9,產品名"特羅凱"(Tarceva)WO99/55683)研發代碼PKI-166:4-[(lR)-l-苯乙氨基]-6-(4-羥苯基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶；(PKI-166,WO97/02266)4響[(1R)-1-phenylethylamino]-6-(4-hydroxyphenyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine培利替尼(Pelitinib):2-丁烯酰胺，N-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基)-4-(二甲氨基)-,(2E)-;2-Butenamide，N-(4-((3-chloro-4-fluorophenyl)amino)-3-cyano-7-ethoxy-6畫quinolinyl)-4陽(dimethylamino)-,(2E)-(培利替尼；EKB-569,美國化學文摘登入號碼257933-82-7,TorranceCJ，da/"NatureMed.2000，6，1024-1028,US6002008)拉巾白替尼(Lapatinib):N-(3-氯-4-(((3-氟代芐基)曱基)氧)苯基)-6-(5-(((2-(曱磺酰)乙基)氨基)曱基)-2-呋喃基)-4-喹唑啉胺；N-(3-chloro-4畫(((3畫fluorobenzyl)oxy)phenyl)隱6-(5-(((2-methylsulfonyl)ethyl)amino)methyl)-2-furyl)-4畫quinazolinamine(拉巾白替尼，GW572016，美國化學文摘登入號碼231277-92-2，WO99/35146,WO01/04111)Carlotinib:2-丙烯酰胺，N-(l((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-(3-(4-嗎啉基)丙氧基)-6-p奎唑淋基)；2-Propenamide,N隱(4-((3-chloro-4-fluorophenyl)amino)-7-(3-(4畫morpholinyl)propoxy)-6-quinazolinyl)(Canertinib;CI-1033，美國化學文摘登入號碼289499-45-2,SmaillJB，"a/.，J.Med.Chem.1999,42,1803-15,WO00/31048)患者的腫瘤通常，若通過施用含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑，能夠確認構成需要治療的癌病灶的腫瘤退縮，則認為該患者對于該治療劑有應答。相反，當施用該治療劑之后不能確認其腫瘤退縮，則認為該患者無應答。已經確立了用來比較應答性程度的一些標準。本發明中的應答性可以基于，例如，針對這些已知抗癌劑的應答性的比較標準來力口以確定。在二十世紀七十年代，國際抗癌聯盟(UICC)提出了用于評估抗癌劑的有效性的標準(Eur.J.Cancer13:89_94,19")。世界衛生組織(WHO)也建議使用該評級系統(WHOoffsetPublicationNo.48,1979)。WHO的該評級系統是代表性的應答性判定標準(MillerAB"a/.,Cancer1981;47:207-14)。此后，有人指出了WHO指導方針的一些問題，即將患者錯誤地判定為PD的病例。因此，西南腫瘤學研究組(SouthwestOcologyGroup,SWOG)等研究組制定出了新的指導方針(GreenSandWeissGR.,Invest.NewDrugs1992;10:239-53)。在由Green和Weiss制定的指導方針中，主要的修訂是關于PD的標準。基于這些標準，新近完成了RECIST(實體瘤組靈敏度評價標準)指導方針，該方針是另一個代表性的靈敏度評價標準(TherasseP，da/.,J.Natl,Cancer.Ins.2000,Vol.92,No.3,205-16)。WHO指導方針和RECIST指導方針之間主要的區別在于測定腫瘤尺寸的方法。在WHO指導方針中，基于腫瘤體積的和(二維信息)的變化來確定抗癌劑的有效性。另一方面，在RECIST指導方針中，基于腫瘤最大直徑的和(一維信息)的變化來確定有效性。將這些指導方針總結在1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>I(條件是PD在病變增大之前沒有被判斷為CR、PR或者SD)CR:完全應答PR:部分應答SD:病況穩、定；也記載為無變化NCPD:進展性疾病實際上，除了基于腫瘤尺寸的變化的有效性標準以外，這些指導方針還指出了對于確定療效必需的多個注意事項，諸如以下這些。無論如何，所屬領域的技術人員可以基于這樣已知的指導方針客觀地確定患者對于特定抗癌劑的應答性。統計學標準腫瘤組織的測定方法的標準腫瘤標志物的測定組織學檢查記錄檢查結果的方法非目標組織的評價通過使用例如以肺癌組織中幾個標志物的表達水平作為指標的評分系統，可以極其準確地預測肺癌患者對于含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性(KakiuchiS，aa/.，Hum.Mol.Genet2004;13:3029-43.;WO2005/49829)。然而，肺癌組織并不是很容易采集的樣本。此外，需要費時、復雜的分析技術來定量確定肺癌組織中多個基因的表達水平。因此，在這些報道中，考察了應答性與血液TGFA濃度之間的關聯性。通過血液TGFA濃度的檢測顯示，可以對低應答性的患者進行一定程度的篩查。然而，其檢測靈敏度低于50%。本發明人展示了通過使用血液AREG濃度作為指標，可以以高檢測靈敏度發現低應答性的患者，并因此完成了本發明。本發明涉及治療肺癌的方法，該方法包含對血液AREG濃度與標準值相比較低的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。在本發明中，血液(血中)濃度是指在校正了全血中所含血細胞的體積之后存在于血液中的物質的濃度。全血中所含血細胞的體積的百分比在不同個體間差別很大。例如，紅細胞在全血中的百分比在男性和女性之間的差異很大。此外，也不能忽略個體之間的差異。因此，根據血細胞體積的百分比不同，包含血細胞成分在內的全血中物質的表觀濃度變化很大。例如，即使血清中的濃度相同，含有大量的血細胞成分的樣品的測定值會低于含有少量的血細胞成分的樣品的測定值。因此，為了比較血成分的測定值，通常使用針對血細胞體積進行了校正的值。例如，可以通過使用通過從全血中分離血細胞的方法獲得的血清或者血漿作為測定血成分的樣品，來獲得排除血細胞體積干擾的測定值。因此，本發明中的血液濃度通常可以作為血清或者血漿中的濃度來確定。或者，可以在測定全血中濃度之后校正血細胞體積的影響。測定全血樣品中血細胞所占體積的方法是已知的。在本發明中，通過與標準值的比較，將血液AREG濃度與針對erbB受體抑制劑的應答性相關聯。標準值是作為確定受試者是否有應答的判定標準的數值。標準值也稱為截斷值。在本發明中，將血液AREG濃度高的患者確定為針對erbB受體抑制劑應答性低。通常，可以將能夠區分具有或者不具有待評定性狀的值用作標準(截斷)值。在本發明中，需要評定的性狀是針對erbB受體抑制劑的應答性。因此，將標準值與針對erbB受體抑制劑的應答性相關聯。具體地，本發明涉及治療肺癌的方法，該方法包括以下步驟(1)測定肺癌患者的血液AREG濃度；(2)將步驟(1)中測得的值與針對erbB受體抑制劑有應答性的患者的血液AREG濃度的測定值進行比較；并且(3)對如下所述的患者施用erbB受體抑制劑作為步驟(2)的結果，該患者在步驟(1)中的測定值與已經確認對erbB受體抑制劑有應答的患者的測定值處于相同水平。在本發明優選的實施方案中，在前述的步驟(3)中，例如，可以挑選預期被確定為CR或者PR的患者作為待施用erbB受體抑制劑的患者。具體地，才艮據本發明，可以避免對可能被確定為PD的患者施用erbB受體抑制劑，而與erbB受體抑制劑的施用無關。此處所提及的CR、PR、SD以及PD可以例如基于以下的標準來確定。此外，按照前述的WHO或者Green等或者RECIST指導方針的標準來確定CR、PR、SD和PD的判定標準。完全應答(CR):在間隔至少28天實施的兩次治療中^皮評價為CR的患者；部分應答(PR):在間隔至少28天實施的兩次治療中被評價為出現PR頁或者有更好的效果的患者；病況穩定(SD):在間隔至少28天實施的兩次治療中被判斷為出現SD或者有更好的效果，且不是CR或者PR的患者。最初的SD評價是在開始給藥治療之后28天或者在其更晚的時間進行的腫瘤評價時間點進行的；進展性疾病(PD):在開始給藥治療以后28天的第一次腫瘤評價時間點或者在此之前被確定為PD的患者。在本發明中，例如可以通過前述步驟(2)和(3)來挑選血液AREG濃度與標準值相比較低的患者。具體地，首先將需要測定應答性的患者(受試者)的AREG值與對erbB受體抑制劑有應答性的患者(對照)的血液AREG濃度進行比較。如果受試者的測定值與對照水平相同，那么這表明受試者是前述的血液AREG濃度與標準值相比較低的患者。在本發明優選的實施方案中，對erbB受體抑制劑有應答性的患者包括被判定為CR或者PR的患者。應答性低的患者包括被判定為PD的患者。AREG的血液濃度處于相同水平可以利用統計學比較來揭示。例如，可以測定4艮多對erbB受體抑制劑有應答的患者的血液AREG濃度，從統計學上確定標準的血液AREG濃度。當能夠聚集統計學上充分的群體時，經常將以平均值為中心兩側二倍于標準差(S.D.)的范圍內的值作為標準值使用。因此，可以4吏用對應于平均值+2xS.D.的值作為標準值。用這種方法確定的標準值理論上包括90%的確定為CR或者PR的患者。或者，對于實際上已經施用erbB受體抑制劑的患者，可以按照上述的標準來確定應答性，并且可以基于其血液AREG濃度設定標準值。通常地，以這種方法設定的標準值，是在能夠滿足使假陽性率最小化，且使檢測靈敏度最大化的條件的范圍內挑選的。在此處，假陽性比例是指在CR或PR患者中^^判定為血液AREG濃度高于標準值的患者所占的百分比。相反地，在CR或PR患者中被判定為血液AREG濃度與標準值相比較低的患者所占的比例就是特異度。也就是說，假陽性比例和特異度的和永遠是1。檢測靈敏度是指在被確定為應答性的人群中，在所有的PD患者中被判定為血液AREG濃度高于標準值的患者所占的百分比。此夕卜，在本發明中，P日性預測率(positivepredictivevalue)是指血液AREG濃度高于標準值的患者中SD或者PD患者所占的百分比。相反地，陰性預測值是指血液AREG濃度與標準值相比較低的患者中CR或者PR患者所占的百分比。在表2中對這些值之間的關系進行了總結。如下面的關系所示，評價對于應答性的預測準確性的指標一一靈敏度、特異度、陽性預測率和陰性預測率中的每一個，都依賴于判斷血液AREG濃度水平的標準值的不同而變化。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如已經提到過的一樣，標準值通常設定為使得假陽性率低而靈敏度高。然而，從以上的關系可以很明確的看出，在假陽性率和靈敏度之間有權衡取舍的關系。就是說，如果降低標準值，檢測靈敏度會上升。然而，這樣也會提高假陽性率，所以很難滿足"低假陽性率"的條件。考慮到這樣的情況，例如可以挑選能給出如下的預期結果的數值作為本發明中優選的標準值使得假陽性率為50%或更低的標準值(就是說，使得特異度為50%或者更高的標準值)使得靈敏度不低于20%的標準值在本發明中，可以使用ROC曲線來設定標準值。受者操作特征(receiveroperatingcharacteristic,ROC)曲線是在縱軸上顯示檢測靈敏度并且在橫軸上顯示假陽性率(即"l-特異度")的圖。在本發明中，可以通過連續地改變用于確定血液AREG濃度是高還是低的標準值，將此時靈敏度對假陽性率的比例的變化進行作圖得到ROC曲線。用于獲得ROC曲線的"標準值"是統計分析臨時使用的數值。通常使用于獲得ROC曲線的"標準值"在能夠覆蓋所有可選標準值的范圍內連續變化。例如，可以使標準值在所分析的人群中的測定的AREG的最小值和最大4直之間變化。基于獲得的ROC曲線，可以在能夠滿足上述條件的范圍內挑選出適合本發明中使用的標準值。或者，可以通過使標準值在含有絕大多數測定的AREG值的范圍內變化，作出ROC曲線，基于該曲線挑選出標準值。更具體地說，例如，在由本發明人所分析的患者群中截斷值、假陽性率以及靈敏度之間的關系可總結如下。可以通過在圖中對以下的值進行作圖得到圖2的ROC曲線。AREG截斷值(pg/mL)假陽性率；靈敏度5050%;73.3%7030%;53.5%8025%;43.3%8510%;40%9010%;36.7%93.8戰36.7%9510%;36,7%10010%;33.3%110戰26.7%1305%;23.3%1505%;23.3%155.2195%;20%TGFA截斷值(pg/mL)假陽性率；靈敏度1050%;70%1145%;70%1245%;66,7%1335%;63.3%13,535%;600/01430%;53.3%14.525%;50%1515%;46.7%15.510%;43.3%1610%;43.3%175%;36.7%185%;33.3%195%;30%20100/"43.3%215%;20%因此，基于ROC曲線，產生50%或者更低的假陽性率以及20%或者更高的靈敏度的標準值的范圍是從56.306pg/mL到155.219pg/mL。或者，可將陽性預測率和陰性預測率作為指標，采用滿足如下條件的標準值。產生60%或者更高的陽性預測率的標準值產生40%或者更高的陰性預測率的標準值在本發明中，可以從以治療肺癌為目的已經施用erbB受體抑制劑的患者中挑選出需要測量其血液AREG濃度以便確定標準值的患者。erbB受體抑制劑已知有許多市售的，或者也有已經開始用于臨床試驗的藥劑。因此，可以在獲得正在施用這樣的藥劑的患者的同意之后收集其血液樣品。此外，通過將血液AREG濃度與所收集的血液樣品來源的患者的療效關聯起來，按照諸如以上描述的方法來設定標準值。檢測其血液AREG濃度用于設定標準值的患者優選是這樣的患者群，其被認為是代表了應該接受本發明的治療的患者群。更具體地說，例如，在本發明的治療方法中，在選擇應該施用erbB受體抑制劑的患者時，除了血液AREG濃度之外，還可以參照血液TGFA濃度。更具體地，本發明涉及治療肺癌的方法，其中所述方法包括對血液AREG濃度或者血液TGFA濃度與標準值相比較低，或者二者濃度均與標準值相比較低的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。或者，本發明涉及治療肺癌的方法，其中所述方法包括對血液AREG濃度或者血液TGFA濃度與標準值相比較低的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。或者，本發明涉及肺癌的治療劑，該治療劑含有作為活性成分的erbB受體抑制劑，供施用于血液AREG濃度與標準值相比較低的肺癌患者。如已經提到過的一樣，通過結合測得的血液AREG濃度以及血液TGFA濃度的值，可以更高的靈敏度檢出針對erbB受體抑制劑的應答性低的患者。更具體地說，在本發明中，作為含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的施用對象的患者，優選的是血液AREG和TGFA二者的測定值均低于截斷值的患者。因此，本發明提供含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑，該治療劑供施用于血液AREG濃度和血液TGFA濃度均與標準值相比較低的肺癌患者。此外，本發明涉及erbB受體抑制劑在制備肺癌治療劑中的用途，所述治療劑供施用于血液AREG濃度與標準值相比較低的肺癌患者。更進一步地，本發明也涉及利用erbB受體抑制劑在制備肺癌治療劑中的用途，所述治療劑供施用于血液AREG濃度和血液TGFA濃度與標準值相比均較低的肺癌患者。本發明中的肺癌治療劑中的活性成分是erbB受體抑制劑。優選的erbB受體抑制劑是吉非替尼、埃羅替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib。已知可以利用血液TGFA濃度來預測對于erbB受體抑制劑的應答性。本發明進一步顯示，通過以新的方式組合AREG測定值評價，可以得到比基于單獨測量TGFA或者AREG進行的應答性預測更高的預測精度。更具體地，本發明提供治療肺癌的方法，該方法是通過使用TGFA和AREG這兩種因子作為指標來預測針對erbB受體抑制劑的應答性。或者，本發明提供肺癌治療劑，所述治療劑供施用于已經基于其TGFA和AREG的血液濃度進行過篩選的特定的肺癌患者。具體地，例如，；險測受試者血液中TGFA和AREG兩種因子，當其中任一個超過其分別的標準值時，則顯示該受試者對于erbB受體抑制劑是無應答性的。換句話說，基于本發明，可以確定TGFA和AREG的血液濃皮與標準值相比都較低的肺癌患者對erbB受體抑制劑是有應答的。與基于單獨檢測TGFA的結果的評價相比，本發明能夠極大地提高對于erbB受體抑制劑無應答的患者的檢測靈敏度。在這樣的提高的背后，是TGFA陽性的患者群和AREG陽性的患者群并不完全重疊的事實。以下對其進行更加詳盡的描述首先，在TGFA值的測定結果與標準值相比較低(對于erbB受體抑制劑有應答性)的患者中，有一定百分比的患者事實上是無應答性的。這些患者被視為TGFA假陰性患者。通過結合基于TGFA的評價和基于AREG的評價，可以從TGFA假陰性的患者中發現AREG水平高于標準值的患者。也就是說，使用本發明，可以從由于低血液TGFA濃度而被錯誤地評價為"有應答性"的患者中發現實際上無應答性的患者。以這樣的方式，本發明提高了對于erbB受體抑制劑無應答的患者的檢測靈敏度。通常，雖然簡單地結合多種標志物的評價結果能夠增加檢測靈敏度，但是這樣經常同時導致特異度的降低。然而，通過確定靈敏度和特異度之間的最佳平衡，本發明已經闡明了能夠增加檢測靈敏度而不損失特異度的特有組合。在本發明中，可以對TGFA和AREG值都不超過標準值的患者施用erbB受體抑制劑。通過挑選兩個值均不超過標準值的患者，能夠增加有應答性的患者的比例。在本發明中，為了綜合地考慮TGFA的測定結果，例如，可以測定TGFA的濃度然后與標準值進行比較，就像上述將測定的AREG值與標準的AREG值之間進行比較一樣。例如，已經有關于測量血液TGFA濃度并且將其與標準值進行比較的報道(KakiuchiS，etal.，Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43.;WO2005/49829)。也已經有市售的針對TGFA的ELISA試劑盒。這些公開發表的已知報道中描述的方法可以應用在本發明的使用erbB受體抑制劑治療肺癌的方法中。本發明中所測定的血液中的AREG(雙調蛋白)是一種蛋白質，又稱為許旺氏細胞瘤來源的生長因子。編碼AREG的基因是國立衛生研究院哺乳動物基因采集(MGC)計劃所分離的超過15000個基因中的一個(StrausbergRL，etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2002Dec24;99(26):16899-903)。認為AREG是一種自分泌生長因子，是表皮生長因子家族中的一員。具體地，該因子結合EGF/TGF-a受體并且造成細胞生長。另一方面，也已知該因子具有針對特定高惡性上皮癌細胞系的生長抑制作用。"可以通過任何能夠對蛋白定量的方法來測定血液中的AREG。例如，可以使用免疫測定、液相色譜、表面等離子體共振(SPR)或者質譜作為蛋白定'量的方法。在質譜中，可以使用合適的內標物來對蛋白進行定量。可以使用同位素標記的AREG等物質作為內標物。可以通過血液AREG和內標物的峰強度來確定血液AREG濃度。通常，對于蛋白質譜來說，可以使用基質輔助激光解吸/離子化方法(MALDI)。使用質譜或者液相色譜的分析方法可以同時分析AREG和TGFA。免疫測定是在本發明中優選的測定AREG的方法。AREG的氨基酸序列是眾所周知的(GenbankAccessionNumberBC009799)。AREG的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，其編碼cDNA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。因此，所屬領域的技術人員可以通過基于AREG的氨基酸序列合成的必要的免疫原來制備抗體。可以使用多肽合成儀簡便地合成作為免疫原的肽。可以通過將該合成的肽與載體蛋白連接制備免疫原。可以4吏用鑰孔血藍蛋白(Keyholelimpethemocyanin)、月幾紅蛋白、白蛋白等的物質作為載體蛋白。優選的載體蛋白包括KLH和牛血清白蛋白等。通常使用馬來酰亞胺苯曱酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯法(此后簡稱為MBS法)等方法來連接合成的肽和載體蛋白。具體地，將半胱氨酸導入到合成的肽中，然后按照MBS法使用半胱氨酸的SH基團將該肽交聯到KLH上。可以將該半胱氨酸殘基導入到該合成的肽的N末端或者C末端。或者，也可以通過基于AREG的核芬酸序歹寸(GenbankAccessionNumberBC009799)來獲得作為遺傳重組體的AREG。利用從AREG表達組織中制備的mRNA能夠克隆到含有必要核苷酸序列的DNA。也可以使用市售的cDNA文庫作為克隆的原始材料。可以使用所獲得的AREG的遺傳重組體，或其片段作為免疫原。在本發明中使用的用來獲得抗體的免疫原優選的是用這種方法表達的AREG重組體。或者，也可以使用市售AREG重組體(R&DSystems,ProductNo:262-AR-100)作為免疫原。將以此方法獲得的免疫原與合適的佐劑混合并用該混合物免疫動物。已知的佐劑包括弗氏完全佐劑(FCA)和不完全佐劑。以合適的間隔重復免疫直到確認抗體的滴度上升。對在本發明中所使用的免疫的動物沒有特殊的限制。具體地，可以使用小鼠，大鼠，兔子或諸如此類經常用于免疫的動物。當以單克隆抗體的形式獲得抗體時，可以使用有益于產生這些抗體的動物。例如，在小鼠中已知有多種用于細胞融合的骨髓瘤細胞系，并且已經發明出能夠以很高的概率產生雜交瘤的技術。因此，小鼠是用于獲得單克隆抗體進行免疫的優選的動物之一。治療并不局限于體外處理。也可以使用在體外免疫敏化經培養的免疫活性細胞的方法。對由這些方法獲得的抗體生成細胞進行轉化和克隆。用于轉化抗體生成細胞來獲得單克隆抗體的方法不局限于細胞融合。例如，通過病毒感染來獲得可克隆的轉化抹的方法是已知的。產生在本發明中所使用的單克隆抗體的雜交瘤可以基于其對AREG的應答性來篩選。具體地，首先通過使用針對作為抗原的AREG或其結構域肽的結合活性作為指標，來挑選抗體生成細胞。如果需要可以對通過這樣的篩選挑出的陽性克隆進行亞克隆。建立的雜交瘤在合適的條件下培養之后，收集產生的抗體來制備在本發明中所用的單克隆抗體。當該雜交瘤是同源雜交瘤時，可以通過將其接種到同基因動物的腹膜內來進行體內培養。在這樣的例子中，收集作為腹膜液的單克隆抗體。當使用異源雜交瘤時，可以利用棵鼠作為宿主進行體內培養。不但是體內培養，通常也通過給予適當的培養環境對雜交瘤進行體外培養。例如，通常使用諸如RPMI1640和DMEM這樣的基礎培養基作為雜交瘤的培養基。可以向這些培養基中加入動物血清等添加物以便維持高水平的抗體生產能力。當在體外培養雜交瘤時，可以收集作為培養上清的單克隆抗體。培養上清可以在培養終了時通過從細胞中分離來收集，或者，在使用應用空心纖維的培養裝置的情況下，可以在培養的同時連續地收獲培養上清。對于作為腹膜液或者培養上清收集的單克隆抗體，通過飽和硫酸銨沉淀分取其免疫球蛋白級分，然后利用包括凝膠過濾和離子交換色語法等分離步驟，制成用于本發明的單克隆抗體。而且，如果該單克隆抗體是IgG，基于蛋白A或者蛋白G的層析柱進行的親和色譜法的純化方法是非常有效的。另一方面，為了獲得作為多克隆抗體的用于本發明的抗體，可以從免疫后抗體滴度上升的個體中抽血并分離血清以獲得抗血清。通過已知的方法從抗血清中純化免疫球蛋白，可以制備用于本發明的抗體。如果在免疫球蛋白的純化中結合使用以AREG作為配體的免疫親和層析，則能夠獲得AREG特異的抗體。也可以組合以下的市售抗體并用于本發明的測定中。例如，就單克隆抗體而言，有諸如下列市售產品抗人源雙調蛋白抗體(R&DSystems,批號MAB262):該產品是使用大腸桿菌來源的AREG重組體作為免疫原獲得的、小鼠-小鼠雜交瘤來源的單克隆抗體。或者，就多克隆抗體而言，也有下列市售產品抗人源雙調蛋白抗體(R&DSystems,批號AB-262-NA):該產品是使用大腸桿菌來源的AREG重組體免疫山羊而獲得的多克隆抗體。生物素化的抗人源雙調蛋白抗體(R&DSystems,CatalogNo:BAF262):該產品是通過對使用大腸桿菌來源的AREG重組物免疫山羊所獲得的多克隆抗體進行生物素化獲得的。當使針對AREG的抗體與AREG接觸時，該抗體會通過抗原-抗體反應結合由抗體識別的抗原決定簇(表位)。可以使用多種免疫測定原理檢測抗體與抗原之間的結合。免疫測定可以大體分為異源分析方法和同源分析方法。為了維持免疫測定的高水平的靈敏度和特異度，優選使用單克隆抗體。以下將詳細描述本發明使用多種免疫測定形式來測定AREG的方法。首先，將描述使用異源免疫測定來測定AREG的方法。在異源免疫測定中，需要分別地測定AREG結合的抗體和AREG-未結合的抗體。為了促進分離，通常使用固定化的試劑。例如，首先制備固定了能夠識別AREG的抗體的固定相(固定化抗體)。使AREG結合于其上，然后進一步與標記過的第二抗體應答。從液相中分離固定相，然后，如果需要，對其進行洗滌，與AREG濃度成比例的一定量的第二抗體保留在固定相上。通過標記第二抗體，可以通過測定來自于該標記的信號來對AREG進行定量。可以使用任何使抗體與固定相結合的方法。例如，聚苯乙烯這樣的疏水材料能夠物理性地吸附抗體。或者，可以化學地將抗體結合到多種表面上具有功能基團的材料上。此外，通過配體的結合配偶體誘捕配體，可以'將標記了該配體的抗體結合到固定相上。結合配體及其結合配偶體的組合包括親合素-生物素組合等等。可以在與第二抗體反應的同時或者在該反應之后將固定相與抗體結合起來。同樣地，對第二抗體的標記不一定是直接的連接。更具體地說，也可能使用諸如抗體對抗體或者親和素對生物素這樣的結合反應進行間接標記。基于測定的已知其AREG濃度的標準樣品的信號強度來確定樣品的AREG濃度。用于上述的異源免疫測定的固定化抗體和第二抗體可以是任何抗體，只要該抗體能夠識別AREG，或者是含有其抗原結合位點的片段即可。因此，可以使用單克隆抗體、多克隆抗體或者兩者的混合物或者兩者的組合。當兩種抗體都是單克隆抗體時，優選的是能夠識別不同表位的單克隆抗體組合。由于抗體將待測定的抗原包夾，所以將這樣的異源免疫測定稱為夾心法。由于夾心法在測定的靈敏度和重現性方面比較突出，所以該方法是本發明中優選的測量原理之一。也可以將竟爭性抑制應答的原理應用于異源免疫測定。更具體地說，這些是基于樣品中的AREG會竟爭性抑制抗體與已知濃度的AREG的結合的現象的免疫測定。可以通過標記已知濃度的AREG并且測量與抗體反應(或者不反應)的AREG來確定樣品中AREG濃度。竟爭性應答系統是通過使已知濃度的抗原和樣品中的抗原同時與抗體反應而建立的。此外，如果使抗體與樣品中抗原反應之后與已知濃度的抗原進行反應，用抑制性反應系統進行分析是可能的。在兩類反應系統中，都可以通過將抗體或者用作試劑成分的已知濃度的抗原中的一者制備成標記成分，而將另一者制備成固定化試劑，來構建在操作性上更優良的反應系統。用于這樣的異源免疫測定的標記成分包括放射性同位素、熒光物質、發光物質、具有酶活性的物質、肉眼可見的物質以及可進行磁力觀察的物質。這些標志物的具體例子如下所示。具有酶活性的物質過氧化物酶，堿性磷酸酶，尿素酶、過氧化氫酶，葡萄糖氧化酶乳酸脫氫酶，或者淀粉酶，等等異硫氰酸熒光素，四曱基羅丹明異硫氰酸鹽，取代的羅丹明異硫氰酸鹽，二氯三嗪異硫氰酸鹽,等等放射性同位素氖，125i18)I，等等其中，以安全，操作性，靈敏度等方面的觀點來看，酶等非放射性標志物是更好的標志物。可以通過諸如高碘酸鹽方法或者馬來酰亞胺方法等已知方法將酶標志物連接到抗體或者AREG上。作為固定相，可以使用珠子、容器內壁、微顆粒、多孔載體、磁性顆粒或諸如此類的物質。可以使用諸如聚苯乙烯、聚碳酸鹽、聚乙烯基曱苯、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、尼龍、聚曱基丙烯酸酯、膠乳、明膠、瓊脂糖、玻璃、金屬、陶瓷等材料制成的固體來制備這些固定相。已經向其表面導入了用于化學性地結合抗體的功能基團的固體材料是已知的。可以將已知的連接方法用于固定相和抗體(或者抗原)，其中該方法包括諸如聚L-賴氨酸或者或者戊二醛處理這樣的化學鍵連，或者物理吸附。雖然本文舉例的所有異源免疫測定都需要從液相中分離固定相以及洗滌的步驟，但是可以使用免疫層析法(該方法是夾心法的變種)很方便地完成這些步驟。具體地，將固定化抗體固定在能夠通過毛細作用運輸樣品溶液的多孔載體上。然后通過毛細作用使含有混合了標記過的抗體的AREG的樣品通過該載體。在該通過過程中，AREG與標記過的抗體進4亍反應，然后當其接觸到固定化抗體時，會被捕獲到該位置。沒有與AREG反應的標記過的抗體不會被固定抗體捕獲，從而從中通過。其結果是，通過使用留在固定抗體的位置上的標記過的抗體的信號作為指標，能夠;險測到AREG的存在。如果將該標記過的抗體預先裝入到該多孔載體的上游，那么就可以很簡單的通過該樣品溶液的滴下來開始并完—成所有的反應，因此可以構建極其方便的反應系統。在免疫層析法中，可以結合能夠通過肉眼分辨的標記過的成分(諸如有顏色的顆粒)來構建不需要特別的讀數器的分析裝置。此外，在免疫層析法中可以對AREG檢測的靈敏度進行調整。例如，通過將檢測靈敏度調整到接近上部截斷值的數值，當信號超過截斷值時，可以檢測到上述的標記過的成分。通過使用該類裝置，可以很方便的確定受試者是陽性還是陰性。如果使該標記具有能夠被肉眼分辨的構成，只需要將血液樣品簡單地應用在免疫層析法的裝置上，就可以提供必要的檢測結果。已知有多種方法可以作為在免疫層析法中調節檢測靈敏度的方法。例如，可以將用于調節檢測靈敏度的第二固定化抗體配置在樣品上樣的位置和固定化抗體的位置之間(特開平6-341989)。當樣品從其上樣的位置移動到用于標記檢測的第一固定化抗體的位置的過程中，樣品中的AREG被第二固定化抗體所補足。在第二固定化抗體飽和之后，AREG能夠到達配置于第二固定化抗體下游的第一固定化抗體的位置。其結果是當樣品中所含的AREG的濃度高于一定濃度時，可以在第一固定化抗體的位置檢測到結合到標記過的抗體上的AREG。接下來，對同源免疫測定進行描述。同如上所述的需要分離反應溶液的異源免疫測定方法相比，通過同源分析方法也可以檢測AREG。同源免疫方法不需要從應答溶液中分離抗原-抗體反應產物就可以檢測該產物。代表性的同源分析方法是免疫沉淀反應，在該反應中通過檢測與抗原-抗體反應相關的沉淀產物來定量分析抗原性物質。免疫沉淀反應通常使用多克隆抗體。當使用單克隆抗體時，優選使用能夠結合AREG不同表位的多種類型的單克隆抗體。與免疫應答相伴隨的免疫沉淀反應的產物可以是肉眼可見的，或者可以通過光學測量將該產物轉化成數據。免疫顆粒凝集反應是通常的同源分析方法，該方法以抗原所致的抗體致敏微粒的凝集作為指標。如上述的免疫沉淀反應中，也可以像前述的免疫沉淀反應一樣，使用多克隆抗體或者多種類型的單克隆抗體的組合。可以通過多種抗體的混合物來對微粒進行抗體致敏，或者可以通過將分別使用每種抗體活化的微粒進行混合來制備該微粒。通過此種方法獲得的微粒當接觸AREG時可以產生基質樣(matrix-Hke)反應產物。可以檢測作為凝集的顆粒的應答產物。顆粒的凝集可以通過肉眼觀察，或者可以通過光學測量轉化成數據。基于能量轉移和酶引導(enzymechanneling)的免疫測定方法是已知的同源免疫測定的例子。在使用能量轉移的方法中，將具有供體/受體關系的不同的光學標記分別接到能夠識別抗原上靠近的表位的多種抗體上。當發生免疫反應時，它們相互接近從而發生能量轉移，其結果是產生熒光淬滅或者熒光波長的改變等信號。另一方面，酶引導是使用組合的酶作為能夠結合靠近的表位的抗體的標記，該組合之間的關系是一種酶的反應產物是另一種酶的底物。當由于免疫反應而使它們彼此靠近時，酶反應被增強，從而它們的結合可以作為酶反應速率的變化被檢測到。在本發明中，可以從患者體內抽取的血液制備用于檢測AREG的血液。優選的血液樣品是血清或血漿。可以在進行4企測之前對血清或者血漿樣品進行稀釋。或者，也可將全血作為檢測的樣品，并且對測定的值進行校正以便確定血清濃度。例如，可以通過確定在相同血液樣品中血細胞體積百分比來將全血中的濃度校正成血清中的濃度。本發明治療肺癌的方法可以治療多種類型的對erbB受體抑制劑有應答性的肺癌。優選地，本發明中的肺癌是非小細胞肺癌(NSCLC)。在本發明中，erbB受體抑制劑施用于已經確認了其血液中AREG濃度與標準值相比較低的患者。按照常規的治療方案來確定施用的erbB受體抑制劑。具體地，對于成人每天的劑量是例如，10到2000mg，通常20到1000mg,具體地50到700mg,更具體地100到700mg。例如，在現有的施用吉非替尼的標準治療方案中，對于成人(不考慮其性別和體重)每天的劑量是250mg。在本發明中，erbB受體抑制劑可以口服或者注射施用。注射施用的例子包括靜脈注射。癌的試劑盒。更具體地，本發明涉及一種用于治療肺癌的試劑盒，其包括以下組件(l)含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑；以及(2)記載下列內容的說明書血液AREG濃度高于標準值的患者對含有針對erbB受體抑制劑的抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑具有低應答性。本發明的治療試劑盒可能還包括以下組件(3)記載下列內容的說明書血液TGFA濃度相比于標準值較高的患者對于含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑具有低應答性。例如，本發明的肺癌治療用試劑盒包括含有以下(1)和(2)成分的肺癌治療用試劑盒(1)含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑；以及(2)說明文件，該說明文件說明不推薦對血液AREG或者TGFA濃度高于標準值的患者施用erbB受體抑制劑。或者，本發明的用于治療肺癌的試劑盒包括含有以下(1)和(2)成分的用于肺癌的治療試劑盒(1)針對肺癌的含有作為活性成分的erbB受體抑制劑治療劑；以及(2)記載下列內容的說明書可以向其血液AREG和TGFA濃度均不超過標準值的患者施用erbB受體抑制劑。除了涉及應該接受施用的患者的說明書外，本發明的治療肺癌用試劑盒的說明書可能包括對于使用以上的erbB受體抑制劑進行治療必需的各種信息。具體地，可能也包含諸如該藥物的作用機理，預期的副作用，該藥物的儲存條件，該藥物的生產日期，或者藥物的有效期等信息。本發明治療肺癌的方法包括對erbB受體抑制劑有應答性的患者施用該藥物。為了選擇對erbB受體抑制劑有應答性的患者，必須檢查肺癌患者對于該藥物的應答性。具體地，本發明提供用于檢測針對包含erbB受體抑制劑作為有效成分的肺癌治療劑的應答性的方法，其中該方法包括以下步驟(1)測定肺癌患者的血液樣品中的AREG濃度；以及(2)當AREG濃度與標準值相比較高時，確定患者對于含有erbB受體抑制劑治療劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性是低的。可以使用以下的步驟來實施本發明的對于肺癌治療劑應答性的檢測方法。具體地，本發明提供了用于檢測針對含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性的方法，該方法包括以下步驟(1)測定肺癌患者的血液樣品中的AREG濃度；(2)將步驟(l)中所測定的值與測定的對erbB受體抑制劑有應答性的患者的血液AREG濃度進行比較；并且(3)當步驟(2)中比較的結果顯示步驟(l)中所測定的值與確認了對erbB受體抑制劑有應答的患者的測定值處于同一水平時，則顯示該肺癌患者對erbB受體抑制劑是有應答性的。本發明用于檢測應答性的方法也可以包括以下步驟(1)測定肺癌患者的血液樣品中的TGFA濃度；以及(2)當AREG濃度或者TGFA濃度或者兩者濃度與標準值相比都較高時，斷定該患者對含有erbB受體抑制劑治療劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性是低的。和評價AREG測定值的方法中一樣，TGFA濃度可以通過以下的步驟進行比較(1)測定肺癌患者的血液樣品中的TGFA濃度；(2)將步驟(l)中所測定的值與測定的對erbB受體抑制劑有應答的患者的血液TGFA濃度進行比較；并且(3)當步驟(2)中的比較結果顯示在步驟(1)中所測定的值與確認了對erbB受體抑制劑有應答性的患者的測定值處于同一水平時，則顯示該肺癌患者對erbB受體抑制劑是有應答性的。在本發明的檢測應答性的方法中，可以通過上邊描述的方法來測定血液AREG濃度或者血液TGFA濃度。待與各個測定值比較的標準值或者對待比較的erbB受體抑制劑有應答性的患者的血液濃度，可以通過以上描述的方法設定。對AREG和/或TGFA的血液濃度的測定值進行評價，當其中一個或者兩個超過標準值時，則表明受試者對erbB受體抑制劑的應答性低。在本發明優選的實施方案中，當AREG或者TGFA中任意一個的血液濃度超過標準值時，則表明受試者對erbB受體抑制劑的應答性低。如已經提到過的一樣，在本發明的檢測方法中，可以使用確認了對erbB受體抑制劑有應答的患者的測定值作為標準值。可以將用于實施本發明的檢測針對含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑之應答性的方法的組件預先組合起來，作為用于檢查的試劑盒來提供。更具體地，本發明提供檢查含有erbB受體抑制劑治療劑作為活性成分的肺癌治療劑應答性的試劑盒，該試劑盒包括以下成分i.用于測定AREG血液濃度的免疫測定試劑；以及ii.AREG的陽性對照。本發明的試劑盒可以進一步包含以下的成分iii.用于測定TGFA血液濃度的免疫測定試劑；以及iv.TGFA的陽性對照。本發明的檢測試劑盒所包括的免疫測定試劑可以包括對于上述的多種免疫測定必要的試劑。具體地，用于免疫測定的試劑包括能夠識別待測物質的抗體。可以根據免疫測定的形式對抗體進行修飾。可以使用ELISA作為本發明優選的形式。例如，ELISA通常^f吏用固定在固定相上的第一抗體以及帶有標記的第二抗體。就是說，用于ELISA的免疫測定試劑可以包含固定化在固相載體上的第一抗體。可以使用微粒或者反應容器的內壁作為固定相載體。可以使用磁性顆粒作為微粒。經常使用諸如96孔微孔板這樣的多孔板作為反應容器。處理大量樣品的容器是已知的，該容器具有比96孔板更小體積更大密度的孔。在本發明中，可以使用這些反應容器的內壁作為固相載體。用于ELISA的免疫測定試劑可以進一步包含帶有標記的第二抗體。用于ELISA的第二抗體可能是直接或者間接與酶相連的抗體。將酶化學地連接到抗體上的方法是眾所周知的。例如，可以對免疫球蛋白進行酶切來獲得帶有可變區的片段。可以將雙功能接頭連接到通過將該片段上的-SS-鍵還原所形成的-SH基團上。通過將酶預連接到連接子上可以將該酶連接到抗體片段上。或者，可以將親和素-生物素等連接用于酶的間接連接上。就是說，通過向親和素連接的酶中加入生物素化的抗體可以將酶間接地連接到抗體上。而且，可以通過使用第三抗體將酶間接連接到第二抗體上，其中第三抗體是酶標記的能識別該第二抗體的抗體。作為標記抗體的酶，例如可以使用諸如以上指出的那些酶。本發明的試劑盒含有AREG的陽性對照。AREG陽性對照包括已經預先測定了濃度的AREG。在以上測定應答性的方法中，優選的濃度可以是，例如，設定為標準值的濃度。或者，可以組合具有更高濃度的陽性對照。在本發明中AREG陽性對照可能還包括預先測定過濃度的TGFA。本發明的陽性對照優選的是含有AREG和TGFA二者的陽性對照。在本發明中陽性對照優選的是液體形式。在本發明中使用液體樣品作為樣品。因此，用作對照的樣品也需要處于液體的形式。或者，可以在使用時用給定體積的液體溶解經干燥的陽性對照，來制備具有預先測定的濃度的對照。如果將溶解所需的一定體積的液體和干燥的陽性對照包裝在一起，那么用戶可以僅僅將二者混合就可獲得必需的陽性對照。用作陽性對照的AREG或者TGFA可以是天然蛋白或者重組蛋白。本發明的試劑盒不僅可以包含陽性對照，也可以包含陰性對照。使用陽性或者陰性對照可以確認通過免疫測定獲得的結果是正確的。下面，將基于實施例具體地描述本發明。實施例患者從2002年8月到2005年2月之間，50位患有進行性非小細胞肺癌的患者接受了吉非替尼(250mg/天)的治療，在此以前的化療對于這些患者沒有任何效果。試驗包含了下列患者患有局部晚期(IIIB期)以及轉移的(IV期)癌癥的患者，和對于一種或多種常規化療方法具有耐性、患有手術后復發的非小細胞肺癌的患者。測試受試者的標準與以前的報道中所描述的標準相同(KakiuchiS，etal.Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43)。概括地說，受試者是至少20歲的患者，一般狀態(PS)為0、1或者2,并且其肝或者腎功能沒有嚴重的異常情況。對患者持續進行治療直到患者由于疾病惡化、毒性不耐受、撤回用藥同意等原因而退出本研究。在施用吉非替尼前一周獲得血清并且將其儲存在-80。C。對50位患者的血清樣品進行了ELISA分析；從接受了作為最初治療的手術之后又接受了針對復發和化療抵抗的吉非替尼治療的13位患者(九位腺癌患者，三位鱗狀細胞癌患者以及一位腺鱗狀細胞癌患者)獲得了原發性非小細胞肺癌組織樣品，并用福爾馬林固定。所有臨床樣品的使用均基于患者的書面同意，并得到了研究倫理委員會的批準。在治療開始之后每四個星期都按照以前報道的標準對針對可評價損害的腫瘤客觀療效和進行了評估(KakiuchiS,etal.Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43)。治療四個月之后，4姿照以下的定義對治療進行了總體的評價完全應答(CR):在間隔至少28天實施的兩次治療中被評價為CR的患者；部分應答(PR):在間隔至少28天實施的兩次治療中#1評1介為PR或者更好的效果的患者；病況穩定(SD):在間隔至少28天實施的兩次治療中^皮評1介為SD或者更好的效果，且不是CR或者PR患者的患者。首次SD判定必須在開始藥物治療之后28天或者更長時間后的腫瘤評價時間點進行；進展性疾病(PD):在開始吉非替尼治療以后28天的第一次腫瘤評價點時或者在此之前被判定為PD的患者。ELISA如前所述(KakiuchiS,"a/.Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43.;IshikawaN,Wa/.Clin.CancerRes.2004;10:8363-70)利用市售ELISA試劑盒(TGFAELISAkit,R&DSystems,Minneapolis,MN)測量了血清TGFA值。對于血清中溶解的雙調蛋白的檢測，用lng/mL的第一抗體(抗雙調蛋白單克隆抗體，R&DSystems)包凈皮96孔《鼓量滴定4反(NalgeNuncInternational,Rochester,NY)過夜。然后對每個孔加入300^L含有1%BSA,5%蔗糖以及0.05%NaN3的PBS(pH7.4)封閉兩個小時，然后向每個孔內加入按照1:3的比例用含有10/。BSA的PBS(pH7.4)稀釋過的血清樣品，并將該4反靜置一l殳時間。用含有0.05%Tween20的PBS(pH7.4)洗滌之后，向每個孔中加入100ng/mL生物素標記的抗雙調蛋白的多克隆抗體(R&DSystems)并靜置兩小時，然后使用底物溶液(R&DSystems)與親和素標記的過氧化物酶(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)進4亍了反應。通過加入2N的硫酸終止顯色反應。使用光度計在450nm處測定顏色強度，使用的參考波長為630nm。使用重組雙調蛋白或者TGFA蛋白作為參考物質為每個平板繪制標準曲線。血清雙調蛋白和TGFA的最小檢測限分別是10.1pg/mL以及3.1pg/mL。從五位患有進行性非小細胞肺癌并且確認了其血清中的雙調蛋白/TGFA的患者獲得惡性胸腔積液，用該胸腔積液進行Western印跡和免疫沉淀分析，確認了這些商品化的抗雙調蛋白抗體和抗TGFA抗體能夠特異地檢測每種蛋白。EGFR突變在來自于十三位施用吉非替尼的非小細胞肺癌患者的切除的腫瘤組織中對EGFR外顯子18到21的突變進行了篩查(見下文)，該區域是報道過的突變的熱點區域(LynchTJ，"a/.N.Engl.J.Med.2004;350:2129-39.;PaezJG，a/.Science2004;304:1497-500.;PaoW，da/.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2004;101:13306.11.;TokumoM，da/.Clin.CancerRes.2005;11:1167-73.;MitsudomiT,"a/.J.Clin.Oncol.2005;23:2513-20;從p環到活化環，密碼子位置709-870)。通過以前報道過的方法提取了基因組DNA(DaigoY，aa/.，Am.J.Pathol.2001;158:1623-31)。概括地說，將腫瘤組織迅速的重懸到20pL含有10mmol/LTris-HCl(pH8.3)、2.5mmol/LMgCl2、50mmol/LKCl、0.45%NP40、0.45%Tween20以及O.lmg/mL蛋白酶K的緩沖液中，然后將該懸浮液在55°C靜置過夜。將該混合物煮沸十分鐘來使蛋白酶K失活，然后將其用于PCR。使用與在別處描述過的針對外顯子18到21的引物相同的引物(TokumoM,"a/.，Clin.CancerRes.2005;11:1167-73)實施了PCR直接測序。免疫組化和組織微陣列所用的樣品是來自于已經接受過手術的患者的449份福爾馬林固定的原發性癌組織樣品(285份腺癌，121份鱗狀細胞癌，28份肺大細胞癌以及15份腺鱗細胞癌)以及鄰近的正常肺組織樣品。將腺癌的組織學模式分成以下的亞型腺泡腺癌(acinaradenocarcinoma),乳頭腺癌(papillaryadenocarcinoma),細支氣管月巿泡癌(bronchiolo-alveolarcarcinoma),以及粘液形成的實體癌(solidcarcinomawithmucusformation)。按照國際抗癌聯盟(UnionInternationaleContreleCancer)的分級法確定了病J里期(TravisWD,da/.,3rded.NewYork:Springer-Verlag;1999)。使用該449份福爾馬林固定的原發性癌組織按照以前發表的方法實施了肺瘤組織微陣歹'J分析(IshikawaN，"a/"Clin.CancerRes.2004;10:8363-70)。為了觀察具有臨床病理差異性的臨床樣品中雙調蛋白和TGFA蛋白的水平，利用Envision+試劑盒/辣根過氧化物酶(HRP;DakoCytomation)對切片進4亍了染色。在封閉之后，使用以下的抗體來實施該試驗1:40稀釋的兔抗人雙調蛋白抗體(Ab-l，LabVisionCorp.,Fremont,CA)和1:80稀釋的小鼠單克隆抗TGFA抗體(Ab-2，OncogeneScience,Manhasset，NY)。使每個組織與作為第二抗體的HRP標記的抗兔或者抗小鼠IgG進行反應。加入顯色底物并利用蘇木精對標本進行復染。三位獨立的評價醫師在以前不知曉臨床數據的情況下，分別對雙調蛋白和TGFA的存在進行了半定量的評價。利用以下的標準對胞質染色的強度進行了打分O(無)，1+(卩日性)以及2+(強陽性)。也按照以前報道的方法確定了雙調蛋白的胞質、核、或胞質及核的染色模式(EbertM,etal.,CancerRes.1994;54:3959-62.;Bostwickda/.,Prostate2004;58:164-8)。統計分析為了比較患者的特性和療效，使用StatView統計程序(SAS，Cary,NC)進行了統計分析。使用Fisher檢驗(Fisher，stests)比較了包括血清中雙調蛋白和/或TGFA的有無在內的臨床病理學多樣性與對于吉非替尼的應答性之間的關系。使用Kaplan-Meier方法評估了腫瘤特異的存活率和95%置信區間(95%CI),并且使用時序檢驗(log-ranktest)評估了兩組之間的差異。通過采用步減(step-down)法的Cox比例風險回歸模型(Coxproportionalharzardregressionmodel)評估了與預后相關的風險因素。該評估的結果，滿足了比例風險假定；即，"僅有那些伴有統計學上顯著的單變量分析結果的變量也被包括在多變量分析之中"。消除變量的標準是似然比，該標準是基于最大部分似然法(對^^型的不匹配比例是P二0.05)。臨床信息對五十位滿足了特定條件的患者施用吉非替尼，劑量為每天250mg。患者的年齡中值為62歲(范圍為30到80歲)；36位患者為男性，14位患者為女性(表3)。表3A.NSCLC患者的特征與針對吉非替尼治療的應答性之間的關聯性<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>B.對于患有進行性NSCLC并接受吉非替尼治療的患者進行的Cov比例風險模型分析變量_風險比(95o/。CI)_P值單變量分析AREG(+/—)2.235(1.0504.761)0.037+TGFA(+/—)3.315(1.557—7.059)0.002+AREG或者TGFA(+/—)2.50(1.197—5.262)0.08+年齡(65^/<65)1.044(0.487—2.237)0.912性別(男性/女性)1.555(0.885-3.532)0.29組織學類型(其他/ADC+)1.6D(0.8484.013)0.309疾病階段(11舊/其他)1.088(0.445-2.706)0.8390一般狀態(2/0—1)6.707(2.544-17.682)0.001*吸煙史(吸煙者/從未吸煙)1.596(0.736-3.462)0.237多變量分析AREG(十/-)1.042(0.384—2.825)0.835TGFA(十/一)2.457(1.072—5.625)0.034+_體力狀態(2/0-1)_4.792(1.420—16.171)0.0〗2+_縮寫ADC，腺癌；SCC，鱗狀細胞癌；ASC，腺鱗細胞癌；NS,不顯著。*腺癌(ADC)對其他(SCC，鱗狀細胞癌;以及ASC，腺鱗細胞癌).**11舊對其他分類。***PS0-1對PS2。****事先化療0-1對其他療法。*****從未吸煙對其他。+P<0.05(Fisher才企-瞼)。NS:無明顯差別+ADC腺癌。P<0.05按照東部協作腫瘤研究組(ECOG)的一般狀態分類(PS)為0的有14位患者，為1的有26位患者，為2的有10位患者。有21位患者接受過至少兩種化療，34位接受過使用鉑制劑的化療。在研究開始時，32位患者目前(17)或者以前(15)吸煙。從組織學診斷的角度來看40人(80.0%)患有腺癌，7人(14.0%)患有鱗狀細胞癌，3人(6.0%)患有腺鱗細胞癌。在吉非替尼治療之后，八位患者被歸類為PR,沒有患者被歸類為CR;12位患者被歸類為SD，30位患者被歸類為PD。對于吉非替尼治療的應答率(CR+PR/CR+PR+SD+PD)為16.0%,疾病控制率(CR+PR+SD/CR+PR+SD+PD)為40.0°/。。在最后一名患者參與治療后超過了四個月的2005年7月作出了最終判斷。隨訪時間的中值是240天(范圍為33-1011天)。血清雙調蛋白/轉化生長因子a的濃度，臨床病理特征以及針對吉非替尼治療的應答性通過cDNA微陣列分析對接受了第二線到第七線的吉非替尼單一療法的進行性非小細胞肺癌患者的腫瘤中表達的基因進行檢查，結果發現在PD的病例中雙調蛋白和TGFA顯著地過表達，但是在PR的病例中幾乎無表達，(置換檢驗中的P值分別為9.3x10'12和0.0095;KakiuchiS，a"/.，Hum.Mol.Genet.2004;13:3029-43)。為了建立一種用于預測對于藥物應答性的常規應用、侵害性小的臨床測試方法，使用了兩種蛋白作為血清學標記。更具體地說，使用來自于接受了吉非替尼治療的50位不同的非小細胞肺癌患者的血清樣品進行了針對兩種蛋白的ELISA。基于每種蛋白的截斷值(雙調蛋白為93.8pg/mL,TGFA為15.6pg/mL)作出"陽性"或者"陰性"的判斷。通過制定ROC曲線設定了截斷值，該曲線是按照最佳診斷準確度以及區分疾病控制病例(PR+SD)與PD病例的似然比而制定的(圖2)。按照這些截斷值，在該50份血清樣品中，將14位患者(28.0%)的血清判斷為雙調蛋白陽性，15位患者(30.0%)的血清判斷為TGFA陽性(圖1)。如在表1中所示，對這群患者中血清雙調蛋白和TGFA的陽性度與吉非替尼治療之間的相關性進行了分析。在30位PD患者中，12份(40.0%)血清樣品是雙調蛋白陽性的，然而采集自疾病受到控制的(PR或者SD)患者的20份樣品中的18份(90.0%)是陰性(按照Fisher檢驗P=0.026)。來自于PD患者的30份樣品中的13份(43.3%)是TGFA陽性的，而采集自PR或者SD患者的20份樣品中的18份(90.0%)是陰性(按照Fisher檢驗P=0.014)。采集自PD患者的30t分血清樣品中的19份(63.3。/。)是至少一種蛋白陽性的，然而來自于PR+SD患者的20份樣品中的17份(85.0°/。)是陰性的(按照Fisher檢驗P=0.001)。這表明在63%的PD病例中，結合使用雙調蛋白和TGFA的分析是良好的低應答性預測標志物。顯示PD的假陽性比例僅有15.0%。表1也顯示出在該50位患者中臨床病理學因素與針對吉非替尼治療的應答性之間的相關性。在本研究中，發現了一般狀態(0/1對2;按照Fisher檢驗P=0.037)和吸煙史(目前和以前是吸煙者的對從不吸煙的人；按照Fisher檢驗P=0.035)以及雙調蛋白和/或TGFA陽性度也同樣地與針對吉非替尼的應答性有顯著的相關性。如上所述，發現了吉非替尼治療對雙調蛋白陽性的14位患者中的12位以及TGFA陽性的15位患者中的13位沒有作用。在標志物中的任意一種是陽性的22位患者中，有19位被判斷為PD。接受吉非替尼治療的雙調蛋白陰性患者的存活時間的中值顯著地長于雙調蛋白陽性患者(按照時序檢驗P二0.032;圖3A)。在TGFA-陰性患者中觀察到了相同的結果(按照時序檢驗P二0.001;圖3B)。也使用單變量分析對患者的預后與其它因子之間的相關性進行了評價，其中所述其它因子包括年齡、性別(男性對女性)、PS(0/1對2)、疾病階段(IIIB對其他階段)、吸煙史(目前或以前吸煙對從未吸煙)、組織學分類(腺癌對其他組織學類型)、血清雙調蛋白值(陽性對陰性)以及血清TGFA值(陽性對陰性)(表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在這些變量中，血清雙調蛋白陽性[優勢比(OR),2.235;95%CI,1.050-4.761;P=0.037]、血清TGFA陽性(OR,3.315;95%CI,1.557-7.059;P=0.002)、以及PS(OR,6.707;95%CI，2.544—17.682;P<0.002)與預后不艮顯著相關。然而，多變量分析的結果表明血清TGFA水平(OR，2.457;95%CI,1.072—5.625;P=0.034)以及PS(OR,4.792;95%CI,1.420—16.171;P=0.012)與接受了吉非替尼治療的進行性非小細胞肺癌患者的預后征候并不顯著相關。為了考察在EGFR突變與血清中雙調蛋白水平及TGFA水平之間是否存在機理上的關系，使用13位患者的腫瘤通過PCR進行了對EGFR酪氨酸激酶結構域(外顯子18-21)的直接測序，對這些患者的血清也進行了ELISA分析。如在表5中所示，在接受吉非替尼治療之后顯示PR或者SD的八位患者中的四位(50%)和顯示PD的五位患者中的兩位(40%)檢測到了EGFR突變，這表明在EGFR突變與血清中雙調蛋白以及TGFA的水平之間沒有顯著的相關性。表5NSCLC患者的臨床病理學特性以及EGFR突變狀態'PR,部分應答；SD,穩定；PD,進行性ND,未檢測到突變雙調蛋白和轉化生長因子a在通過隨機取樣獲得的肺癌組織中的表達狀態為了考察雙調蛋白和TGFA過表達的臨床意義，還通過組織微陣列的方法檢測了雙調蛋白和TGFA蛋白的表達，其中該分析使用采自于隨機選取的449位已經接受了手術的非小細胞肺癌患者的組織。如前報道的，主要在腫瘤細胞的細胞質和/或核中檢測到了雙調蛋白(EbertM,a/.,Cancer例子年齡.年1692663574645646537478489461053115912801369組織學ECOG—類型般狀態ADC1ADC1ADC1SCC1SCC0ASC1ADC0ADC1ADC0ADC1ADC2SCC2ADC0EGFR突變針對吉非替尼的應答性缺失E746-A750PR缺失E746-A750PRL858RPRNDPRL858RSDNDSDNDSDNDSDL858RPDL858RPDNDPDNDPDNDPD吸煙史別性性性性tSi5J!法性3!&如如^1如^&^如^男1^如AcG王性汰性性wi!wi法Is!法法未未未前未前前未前前前未未從從從以從目以從目以以從從Res.1994;54:3959-62.;BostwickDQ"a/.,Prostate2004;58:164-8)。TGFA主要在腫瘤細胞的細胞質中被染色。如在表6中所示，性別(男性更高；按照Fisher檢驗P〈0.001)，組織學分類(非腺癌更高；按照Fisher檢驗P<0.001)以及吸煙史(目前和以前吸煙的人更高；按照Fisher檢驗P<0.001)與雙調蛋白陽性顯著地相關。對于TGFA發現了相似的趨勢(男性更高，P-0.001;非腺癌更高，P<0.001;目前和以前吸煙的人的比例更高，按照Fisher檢驗P=0.005)。在非細支氣管肺泡(P=0.004)和非乳頭狀(P=O.Oll)類型的腺癌中雙調蛋白陽性的比例顯著更高，但是對于TGFA陽性來說沒有觀察到顯著的差別。表6在NSCLC組織中AREG/TGFA陽性與臨床特性之間的相關性(n=449)AREG狀態TGFA狀態由I又里合計AREGAREGP值TGFA-TGFA-P值n=449-陽性n=163-陰性n=286陽性n=301陰性n=148性別體寐310141342976110<0.001*2237887610.001+年齡，y<6521577148NS14471NS2348613815777組織學類型ADC28578207170115secLCC121286119609<0.001*+9426272ASC15510114優勢組織學類型乳頭狀非乳頭狀218555223166320.011+127329123NSBAC非BAC1381352748111870.004*78816054NS疾病階段I+1I+HIA359130229NS248111NSII舊TT1+T29033575337320108212NS217103NST3+T412955748445NN0+N1336114222NS221115NSN2+N311349648033吸煙史非吸煙者吸煙者13931025138114172<0扁*8022159890駕*縮略i吾LCC,大細月包癌(large-cellcarcinoma);BAC,纟田支氣管肺泡癌(bronchioloalveolarcarcinoma)。+P<0,05(Fisher檢驗)fADC對其它分類雙調蛋白陰'性患者的存活時間的中值與雙調蛋白陽性患者相比顯著較長(按照時序檢驗P=0.013;表7)。同樣地，TGFA陰性患者的存活時間的中值與TGFA-陽性患者的該值相比更長(按照時序檢驗P=0.029;表7)。表7對未接受吉非替尼治療的進行性NSCLC患者的預后因子進行的Cov比例風險模型分析<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>十P<0.05吉非替尼是作為EGFR酪氨酸激酶的"選擇性"抑制劑被開發的。然而，在體外或者體內系統中都沒有發現在癌細胞對于吉非替尼的應答性與EGFR水平之間有明顯的相關性。對于以前的研究中的患者進行的多變量分析發現就對于吉非替尼的應答的比例來說女性高于男性，并且腺癌患者高于鱗狀細胞癌患者(FukuokaMd"/.,J.Clin.Oncol.2003;21:2237-46.;KimYHda/.,Clin.CancerRes.2004;10:7311-7)。近年的臨床研究提示，吉非替尼可能有效的患者主要是患有細支氣管肺泡肺瘤或者以乳頭類型為優勢的腺癌，并且無吸煙史(上述的KimYH""/.2004;MillerVAda/.,J.Clin.Oncol.2004;22:1103-9)。近年，由Lynch等(LynchTJ.，"a/"N.Engl.J.Med.2004;350:2129-39)和Paez等(PaezJGa/.,Science2004;304:1497-500)進行的研究顯示EGFR的酪氨酸激酶結構域的突變與非小細胞肺癌對吉非替尼的敏感性之間有關聯。包括EGFR突變在內的對于吉非替尼敏感性的臨床病理學判斷在一定程度上能夠預測；然而，已知的因子都不能完美地預測非小細胞肺癌對于吉非替尼的應答性(上述的LynchTJ.,"a/"2004;上述的PaezJGaa/.,2004;PaoW&a/"Proc.Natl.Acad,Sci.USA2004;101:13306-11.;TokumoMda/.,Clin.CancerRes.2005;11:1167隱73.;MitsudomiT"a/.，J.Clin.Oncol.2005;23:2513-20.;上述的KakiuchiS自/.，2004)。此外，吉非替尼治療的臨床效果并不局限于諸如PR這樣的客觀見效，并且也應該適用于SD患者(上述的KakiuchiSe^/.，2004)。在以前的報道的臨床試驗(上述的FukuokaM"a/.,2003;KimYH"a/.，2004)中，一組患者雖然腫瘤尺寸沒有可觀的減小，但是顯示出了癥狀的改善和病況穩定期的延長。該研究與本發明的研究也是一致的就是說，與PD患者的存活時間(按照時序檢驗P=0.011)相比PR+SD組患者的存活時間大大延長了。對于突變或者表達譜的分析是耗時的程序，并且需要含有足夠數目的癌細胞的活檢樣品。進行性非小細胞肺癌患者很少選擇外科手術，并且其治療方案的選擇不一定需要為了病理學診斷而進行侵害性的活檢樣品采集，因此上述的突變或者表達語分析等方法不適于進行常規的藥物應答性診斷。事實上，涉及經支氣管活檢的主要并發癥的發病率為0.5%到6.8%(BritishThoracicSociety.Guidelinesondiagnosticflexiblebronchoscopy.SubcommitteeonStandardsofCareCommittee,BritishThoracicSociety.Thorax2001;56:il-21)。因此，本發明人認為必須馬上建立諸如血清學檢測這樣的能夠很容易在任何醫院應用的安全的更小傷害性的系統來預測個體患者對于藥物應答性。本發明人發現，雙調蛋白和TGFA這兩種EGFR和ErbB的配體在對于吉非替尼無應答性的肺瘤細胞中顯著地過表達，但是在應答性細胞中很難檢測得到(上述的KakiuchiSda/.,2004)。通過對一群進行性非小細胞肺癌患者的血清中雙調蛋白和TGFA的值考察，發現雙調蛋白和TGFA蛋白對于預測這樣的患者對于吉非替尼的低應答性具有很高的診斷價值。30位吉非替尼非應答性的患者中的12人(40%)的血清雙調蛋白是陽性的，而對于TGFA,30位患者中的13人(43.3。/。)的血清是陽性的。聯合使用兩個標志物將對于非應答性患者的檢測靈敏度提高到了63.3%。分析EGFR突變的已知方法能夠選擇PR患者，但是根本不能識別SD患者(上述的LynchTJ.,&a/.,2004;PaezJGWa/.,2004;PaoWWa/.,2004;TokumoM"a/.，2005;MitsudomiTWa/.，2005)。另一方面，基于本發明的<吏用這兩種標志物的預測系統，主要針對吉非替尼，能夠將PD病例與PR或者SD患者區分開來。這是本發明重要的優點之一。實際上，統計分析也支持血清雙調蛋白和TGFA值在生物學上與EGFR突變狀態不相關的假設。這項研究也顯示，與雙調蛋白或者TGFA陰性的患者相比，陽性患者的存活時間更短。特別地，使用這些血清中標志物的診斷顯示，每種標志物都是獨立地與預后不良相關。一項III期試驗主要終點初始分析(對于1，692例肺癌患者的易瑞莎存活率的評價；http:〃www.astrazeneca.com/pressrelease/4245.aspx)顯示，在雙盲法分析中，吉非替尼與安慰劑相比不一定能延長所有的母群體(風險比，0.89;P=0.11;中值，5.6對5.1個月)和腺癌患者(風險比，0.83;P=0.07;中值，6.3對5.4個月)的存活時間。盡管如此，在統計學上，對這些人群的客觀見效率有所提高、對東方裔患者以及從未吸煙的患者有延長生命的效果。本發明人所得到的結果表明，可以使用血清雙調蛋白和/或TGFA值來挑選出可能對于吉非替尼無應答、不能得到任何延長生命的益處的患者，從而將吉非替尼的益處延伸到實際上能夠從其治療獲益的患者身上。目前，對血清雙調蛋白以及TGFA的檢測是用于預測進行性非小細胞肺癌對吉非替尼治療的非應答性的唯一常規的且有意義的方法。因此，開發基于本發明的試劑盒，在選擇吉非替尼治療的過程中檢測血清中雙調蛋白和TGFA的陽性度是有用的。'EGFR配體自分泌途徑在肺癌細胞的存活和生長中的重要性是無可置l是的(FontaniniGda/.,Clin.CancerRes.1998;4:241-9.;HurbinAda/.,J.Biol.Chem.2002;277:49127-33)。然而，雖然一些證據表明雙調蛋白的過表達與非小細胞肺癌患者存活時間的縮短之間有關聯，但是雙調蛋白和TGFA在肺癌細胞的發展和生長中的作用尚未得到很好的了解(上述的FontaniniGda/.，1998)。本發明人的研究還顯示，在非小細胞肺癌組織中的雙調蛋白和TGFA蛋白在一定程度上確實與已經接受了手術治療的患者的預后不良有關。而且，男性、非腺癌、以及吸煙史均與非小細胞肺癌組織中的雙調蛋白和TGFA陽性相關，并且在組織學上，腺癌的一些類型(非乳頭狀以及非細支氣管肺泡腫瘤)也與雙調蛋白陽性相關。近來，其他研究組已經報道過吉非替尼對于乳頭優勢型和/或細支氣管肺泡胂瘤型的腺癌有效；他們的數據也提示雙調蛋白/TGFA的表達以及組織學分類與吉非替尼抗性相關。另一方面，近來報道了雙調蛋白在人肺腺癌細胞中的抗凋亡活性(上述的HurbinAetal.,2002)。為了觀察在非小細胞肺癌細胞中是否由于雙調蛋白的抗凋亡活性誘導產生針對吉非替尼的抗性，預先使用對吉非替尼敏感但是不表達雙調蛋白的非小細胞肺癌細胞系PC9實施了生物學分析。其結果發現，由于雙調蛋白的自分泌，吉非替尼對PC-9細胞的抗腫瘤活性顯著下降(上述的KakiuchiS^a/.，2004)。該結果有力的證明，雖然EGFR的生長因子信號由于配體、二聚化因子、效應物、下游途徑等等因素的多樣性而與各種步驟相關，但是雙調蛋白是配體-受體自分泌途徑的首要激活因子，并且誘導癌細胞針對吉非替尼的抗性。總結來說，本發明顯示了血清中雙調蛋白以及TGFA值是對于非小細胞肺癌針對吉非替尼的應答性的預測而言最重要的因子。對于血清中雙調蛋白和TGFA值的測定是預測對于erbB受體抑制劑的應答性的常規可行的、無傷害性而且廉價的方法。工業實用性可使用本發明來預測erbB受體抑制劑對肺癌的療效。erbB受體抑制劑包括吉非替尼(商品名易瑞莎⑧)等物質。此外，本發明提供使用erbB受體抑制劑治療肺癌的方法。可以根據本發明來鑒定被預測為對erbB受體抑制劑具有低應答性的患者。更具體地，本發明能夠更靈敏地檢測不能期望對erbB受體抑制劑會有應答性的患者。也就是說，本發明能夠更特異地檢測出對erbB受體抑制劑有應答性的患者。其結果是，根據本發明，可以使用'erbB受體抑制劑更有效地實施肺癌治療。權利要求1.一種治療肺癌的方法，該方法包括對血液AREG濃度與標準值相比較低的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。2.—種治療肺癌的方法，該方法包括對血液AREG濃度或者血液TGFA濃度與標準值相比較低，或者此二者的濃度與標準值相比均較低的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。3.權利要求2的治療肺癌的方法，該方法包括對血液AREG濃度或者血液TGFA濃度與標準值相比較低的患者施用erbB受體抑制劑的步驟。4.權利要求1的治療方法，其中該erbB受體抑制劑是選自由吉非替尼、埃羅替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib組成的組的任意化合物。5.—種肺癌治療劑，該治療劑含有erbB受體抑制劑作為活性成分，供施用于血液AREG濃度與標準值相比較低的患者。6.—種肺癌治療劑，該治療劑含有erbB受體抑制劑作為活性成分，供施用于血液AREG濃度和血液TGFA濃度與標準值相比均較低的患者。7.權利要求5或6的肺癌治療劑，其中該erbB受體抑制劑是選自由吉非替尼、埃羅替尼、PKI-166、培利替尼、拉帕替尼以及canertinib組成的組的任意化合物。8.erbB受體抑制劑在制備肺癌治療劑中的用途，所述治療劑供施用于血液AREG濃度和血液TGFA濃度與標準值相比均較低的患者。9.一種治療肺癌用試劑盒，該試劑盒包括以下組件(1)含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑；以及(2)記載下列內容的說明書血液AREG濃度與標準值相比較高的患者對于含有針對erbB受體抑制劑的抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性較低。10.權利要求9的治療肺癌用試劑盒，該試劑盒還包括以下組件(3)記載下列內容的說明書血液TGFA濃度與標準值相比較高的患者對于含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性較低。11.一種檢查對于肺癌治療劑的應答性的方法，其中該肺癌治療劑含有erbB受體抑制劑作為活性成分，其中該方法包括以下步驟(1)測量肺癌患者的血液樣品中的AREG濃度；以及(2)當AREG濃度與標準值相比較高時，確定該患者對于含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性較低。12.權利要求11的檢查方法，該方法還包括以下步驟，(1)測量肺癌患者的血液樣品中的TGFA濃度；以及(2)當AREG濃度或者TGFA濃度高于標準值或者此二者的濃度均高于標準值時，確定該患者對于含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性較低。13.權利要求11的方法，其中當AREG濃度或者TGFA濃度相比于標準值較高時，確定該患者對于含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性較低。14.權利要求U的檢查方法，該方法包括使用免疫測定來測量血液樣品中AREG濃度。15.—種檢查試劑盒，用于檢查針對含有erbB受體抑制劑作為活性成分的肺癌治療劑的應答性，其中該試劑盒包括以下組件i.用于測量AREG血液濃度的免疫測定試劑；以及ii.AREG的陽性對照。16.權利要求15的檢查試劑盒，該試劑盒還包括以下組件iii.用于測量TGFA血液濃度的免疫測定試劑；以及iv.TGFA的陽性對照。17.權利要求16的^:查試劑盒，其中陽性對照樣品含有AREG和TGFA。18.權利要求17的檢查試劑盒，其中陽性對照樣品是液體。全文摘要本發明提供了治療肺癌的方法，該方法使用針對肺癌的含有作為活性成分的erbB受體抑制劑治療劑。還提供了測定肺癌患者對于erbB受體抑制劑應答性的方法，該方法使用血液雙調蛋白(AREG)作為指示劑。此外，也提供了選擇性地對預期有反應的患者施用治療劑來治療肺癌的方法，在該方法中基于血液中AREG濃度來確定針對erbB受體抑制劑的應答性。通過對按預想對erbB受體抑制劑有反應的患者施用該抑制劑可以期望獲得更好的療效。本發明有助于提高吉非替尼(產品名易瑞莎)以及此類藥物對于肺癌的療效。文檔編號G01N33/574GK101415440SQ200680054190公開日2009年4月22日申請日期2006年2月10日優先權日2006年2月10日發明者中村佑輔,醒醐彌太郎申請人:腫瘤療法科學股份有限公司