專利名稱：黃瓜花葉病毒雙抗體夾心酶聯免疫吸附檢測試劑盒及制備方法
技術領域：
本發明涉及百合黃瓜花葉病毒雙抗體酶聯免疫吸附檢測試劑盒，以及這種檢測試劑盒的制備方法。本發明所述的雙抗體酶聯免疫吸附特別指雙抗體夾心法酶聯免疫吸附。
背景技術：
百合(Lilium spp.)傳統上是藥用和食用植物，現已成為國際上重要切花觀賞花卉之一。荷蘭1997年百合種植面積達3560萬hm2，每年生產鱗莖18億個，70％以上出口，在荷蘭根花卉生產中名列第二位。但隨著百合種植面積日益擴大，高密度種植和長期無性繁殖使病毒不斷積累，病毒病對百合的危害日趨嚴重，影響了百合的產量和品質，給百合種植業造成巨大的經濟損失。但人們對百合受病毒危害的重視不夠，百合的抗病毒品種極少。百合的引種頻繁，鮮花進出口頻率高，加速了病毒的傳播。據報道，百合病毒病在19世紀后期幾乎把百合栽培種和品種推向絕滅境地，現已知百合病毒病原有14種，類菌原體1種，其中為害嚴重的病毒有4種，即百合無癥病毒(Lily symptomless virus，LSV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)、郁金香碎錦病毒(Tulip breaking virus，TBV，異名Lily mottle virus，LMoV)和百合叢簇病毒(Lily rosette virus，LRV)，其他各種病毒均為局部地區發生，百合病毒常復合侵染，不同病毒在百合上表現相似癥狀，同種病毒在不同條件下的癥狀有很大變異。
當前切花百合在我國花卉產業產值中占第四位，同時作為食品和藥材，百合也是一種重要的經濟作物。我國是百合病毒病流行較為嚴重的國家，其中主要是由于LSV和CMV等病毒引起的。減少病毒病在百合種植業中的損失，最便捷的方法是采用脫毒培養。國內現在大量采用脫毒培養技術，但依然存在不少問題，最主要的是缺少LSV和CMV的方便快捷、準確可靠的檢測方法。
黃瓜花葉病毒百合株(CMV-Li)可侵染百合科植物的病毒，是百合科植物的主要病毒病害之一，廣泛分布于世界各地。黃瓜花葉病毒經常與百合隱癥病毒(LSV)、百合斑駁病毒(LMoV)等復合侵染百合科植物。單一CMV感染通常有輕微花葉癥狀，CMV通常和LSV等病毒復合侵染，造成嚴重的花葉癥狀、不開花、植株形態異常和球莖減小，每年在全世界范圍內的園藝和農業生產中造成幾十億美元的重大損失。在我國，每年因CMV感染造成的經濟損失也有十多億元。
1896年Stewart首次報道了侵染百合的CMV，而后1937年Price也進行了報道，之后很多學者對侵染百合的CMV進行了研究。Benetti(1988)的調查研究表明CMV在意大利百合中廣泛發生，并常和LSV符合侵染百合。Hagita(1989)通過酶聯免疫方法檢測百合CMV。Kim在1994研究報道了病毒唑對CMV的作用效果，在1995年通過組織吸附免疫的方法檢測侵染百合的CMV等病毒，在1996年研究CMV的血清型與致病性的相關性時指出，CMV分離物的致病性與其血清型緊密相關，并將血清型分為Y(亞組I)與P(亞組II)兩型，而來自百合的分離物不能使茄科和葫蘆科等易被CMV侵染的作物發病，是相對獨立的一個類群，同時對韓國光州等地區的百合植物進行病毒檢測與調查，認為CMV為三種主要病毒之一。Cohen(1996)在以色列百合的病毒病一文中報道CMV的為主要病毒之一。Lee(1998)利用RT-PCR檢測了侵染東方百合的CMV。Korbin(1998)等研究了CMV分離物的特性，利用ELISA和生物學實驗，對波蘭12種觀賞植物的250個樣品進行了CMV調查，發現病毒的侵染伴隨著生物學形狀而出現，并且在被病毒侵染的植物樣品種，90％以上是多種病毒的符合侵染。在進行生物學實驗時，大部分植物上的CMV分離物科通過汁液摩擦接種使這些長劍的CMV系統與鑒別寄主發病，喪失了通過汁液摩擦接種傳播的特性。Niimi(1999)利用ELISA和DIBA檢測田間樣品種的CMV，在550個Lilium X Enchantment樣品種的發生情況，在5個樣品中檢測到了CMV的存在，侵染率為0.9％。Chikara(2002)報道了來自日本與韓國的CMV分離物HL-CMV與Ly2-CMVs，它們具有共同的生物學特性，寄主范圍相同，只侵染百合植物，根據它們的RNA3核苷酸序列分析表明盡管兩個分離物來自不同的國家，但它們具有很高的同源性，達97％，據3a蛋白基因核CP基因序列樹狀進化圖分析表明，這兩種分離物在進化種單獨成簇，說明它們來源于同一個祖先。Niimi等(2003)利用RT-PCR檢測了侵染百合的CMV，并同時進行了ELISA檢測，比較了兩種檢測方法的靈敏度。
CMV-Li屬于黃瓜花葉病毒組，為三分體單正鏈RNA病毒，病毒顆粒呈正20面體，直徑28～30nm。一般有RNA1、RNA2、RNA3和RNA4四條單正鏈線性核酸，長度分別為3300nt，305nt，2200nt和1000nt左右。CMV衣殼蛋白只有一種亞基，分子量為24kDa。已有報道對該病毒進行了全序列測序并分析了基因組結構。
目前國內尚無成熟的CMV-Li免疫檢測方法，很難滿足花卉及食用百合的脫毒檢測需求。建立靈敏、穩定、高通量和易操作的CMV-Li的檢測方法，是生產百合脫毒株的基礎，是提高花卉百合品質和食用藥用百合產量和質量的前提。
國內外現在對黃瓜花葉病毒百合株的主要檢測手段有指示植物檢測、電鏡檢測、分子生物學檢測和免疫學檢測等。
其中指示植物檢測為較為傳統的檢測方法，測試條件受外界環境變化影響會出現不同的檢測結果，檢測周期也很長，操作十分復雜，檢測結果不準確。
電鏡檢測靈敏度不高，需要大量病毒樣本，檢測過程復雜，并且檢測結果受主觀影響較大。由于電子顯微鏡代價昂貴，對大多數檢測來說不具備條件。
分子生物學檢測方法較為操作較為簡單，通過病毒特異性引物進行RT-PCR檢測，所需檢測時間較短。但由于該病毒是單鏈正鏈RNA病毒，制備用于檢測的樣本模板較為復雜，對檢測實驗條件要求很高，且需要PCR儀等貴重儀器，檢測試劑昂貴。需要有相當經驗的操作者才能獲得較為可靠的結果。
以上檢測手段由于靈敏度、檢測費用和操作難度等原因，都不適合作為大規模商業檢測方法推廣。
此外，現有技術制備ELISA檢測試劑盒時，是用CMV全病毒免疫制備多克隆抗體，由此產生的抗體對全病毒具有特異性，但不一定對病毒衣殼蛋白亞單位單體表現高靈敏度。因此當被檢植株尚未復制組裝形成完整病毒顆粒，而僅含有尚未組裝的衣殼蛋白亞單位游離單體時，利用現有技術將很難檢測出來。
在現有技術中也沒有對食用百合黃瓜花病毒檢測的披露。
發明內容
本發明的目的是建立一種基于特異性多克隆抗體的CMV雙抗體夾心酶聯免疫檢測(DAS-ELISA)方法，并研制出試劑盒，為CMV檢測提供一種準確簡便的技術手段。本發明所提供的這種試劑盒可以克服現有技術的不足，不僅可以快速得出被檢植株是否染病，而且可以在病毒感染早期尚未組裝形成完整病毒顆粒時就可檢測出病毒感染情況。
本發明所述的檢測盒是包括反應板、酶標抗體、緩沖液、顯色液、終止液及洗滌劑，其中反應板上包被有CMV病毒多克隆抗體；酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的CMV抗體；緩沖液為用蒸餾水配制的其內含1％聚乙二醇4000，0.5％蛋白胨，0.5‰硫柳汞鈉以及1‰吐溫-20的pH＝7.4，0.07M的磷酸鹽緩沖液；洗滌液為含1‰吐溫-20，pH＝7.2的磷酸緩沖液；稀釋液為生理鹽水；顯色劑A為內含0.5‰，pH＝5.0的過氧化脲醋酸水溶液；顯色劑B為甲醇中溶入1.6‰四甲基聯苯胺，并在溶解后加一倍的甘油；終止液為用蒸餾水配制的2M硫酸溶液。
本發明的檢測試劑盒中反應板上包被的CMV病毒多克隆抗體與酶標抗體的制備方法如下反應板上包被的CMV病毒多克隆抗體制備方法是將健康的雄性兔或豚鼠或羊或雞等動物中的任一種動物致敏后，在皮下或肌肉內注射經分離、純化后所得CMV病毒衣殼蛋白使動物產生特異免疫反應，對產生抗體的實驗動物進行采血，將所采血進行抗血清的分離。再對抗血清進行鹽析、透析、離子交換層析等純化步驟，得到純化的CMV病毒多克隆體IgG，再將經純化的CMV病毒多克隆IgG包被于檢測反應板上；如收集到血清不能及時后述的處理時，可在其中加入千分之一濃度的疊氮鈉保存于-20℃或加入等體積飽和硫酸銨保存于4℃。
辣根過氧化物酶標記的CMV抗體制備方法是將不同于制備CMV病毒多克隆抗體動物的健康雄性兔或豚鼠或羊或雞中的任一種動物致敏后，肌肉或皮下內注射純化CMV病毒衣殼蛋白使動物產生免疫，再對產生抗體的實驗動物進行采血，將所采血進行抗血清的分離，再對所得的抗血清進行鹽析、透析、離子交換層析等純化步驟，得到純化的待標記的CMV病毒多克隆抗體。利用戊二醛二步法對該純化的多克隆抗體進行辣根過氧化物酶標記，獲得酶標抗體。這里所述的不同于制備CMV病毒多克隆抗體動物的健康雄性兔或豚鼠或羊或雞中的任一種動物是指在制備用于酶標抗體時采用的動物，應當與制備用于包被的CMV病毒多克隆抗體所采用的動物不同。如制備用于包被的CMV病毒多克隆抗體采用家兔時，制備辣根過氧化物酶標記的CMV抗體應當采用豚鼠，或山羊，或雞等，而不能再使用兔子。如收集到的抗血清不能及時進行后續處理，可加入等體積滅菌甘油，保存于-20℃。
本發明中用于包被的CMV病毒多克隆抗體與用于酶標的待標記的CMV病毒多克隆抗體的制備方法是用現有技術得到CMV衣殼蛋白亞單位溶液，即將經分離純化所得的CMV病毒經裂解，層析或電泳得到CMV病毒衣殼蛋白亞單位溶液。將此溶液透析于注射用水配置的pH＝7.2，0.02M的磷酸鹽緩沖液PBS中，透析后，再用pH＝7.2，0.02M的磷酸鹽緩沖液PBS將CMV衣殼蛋白濃度稀釋至400ug/ml。
將前述的制備好的400ug/ml的CMV衣殼蛋白溶液與等體積的弗氏完全佐劑混合并充分乳化成基礎免疫抗原，給動物皮下多點注射，做基礎免疫；基礎免疫中CMV衣殼蛋白的劑量為家兔200ug/只，豚鼠50ug/只，雞200ug/只，山羊1mg/只。
三周后，將經前述方法處理的400ug/ml的CMV病毒衣殼蛋白溶液與弗氏不完全佐劑混合并充分乳化，對前述已做基礎免疫的動物經皮下多點注射做第一次加強免疫；第一次加強免疫中CMV衣殼蛋白的劑量為家兔200ug/只，豚鼠50ug/只，雞200ug/只，山羊1mg/只。
第一次加強免疫后，每隔兩周后再次重復加強免疫一次，劑量途徑與第一次加強免疫相同。
第二次加強免疫之后10天少量采血，檢測抗體效價大于1∶64時即可大量采血。采血前動物禁食12小時以上。
本發明的檢測試劑盒中用于包被的CMV病毒多克隆抗體與用于酶標的多克隆抗體的制備方法是將抗血清溫浴于25℃，在攪拌下緩慢加入硫酸銨固體粉末至濃度為18％，再于25℃下溫浴數十分鐘后，進行離心處理，棄去上清液，將沉淀溶解于去離子水中，再加入硫酸銨粉末至濃度為14％，25℃溫浴30min后再離心處理，棄去上清液，將沉淀溶解于15ml去離子水中，再在pH為6.3濃度為0.07M的磷酸緩沖液PBS中透析至無銨離子，再進行離子交換層析，同時檢測洗脫液280納米處的光吸收值(OD280)，待有吸收峰出現，收集最先流出的10ml組分，即為純化的IgG。
本發明所采用的動物最好為家兔、山羊和豚鼠。
本發明提供了雙抗體夾心法酶聯免疫檢測盒，采用這種屬于免疫學方法進行檢測具有如下優點1、靈敏度高，可以檢測到樣品中ng級水平的病毒。
2、操作簡單，普通工作人員經過簡單培訓就可以完成。
3、可重復性好，檢測結果穩定可靠。
4、對儀器要求較低，僅需要普通恒溫水浴箱、酶標儀等。如只需定性檢測，則可直接通過目測獲得檢測結果，連酶標儀都不需要。
5、由于本發明的CMV病毒多克隆抗體所用的毒株為黃瓜花葉病毒蘭州百合分類株，因此，它不但可以用于花卉百合，也可用于食用百合。
6、本發明采用的免疫源為CMV病毒衣殼蛋白，因此采用由此免疫源產生的抗體，不僅對完整病毒有特異敏感性，而且對尚未形成完整病毒的病毒蛋白亞單位也有相當的敏感性。用這種抗體制備的檢測試劑盒可以檢測出已染病但尚未形成完整病毒的植株。本發明的這一優點可以在感染早期就檢測出植株是否已經感染，以及時采取隔離、拔除等措施，避免病毒感染范圍在大田種群中擴大，從而避免或減小損失，無疑這對相關花卉及食用百合的種植生產是有極為積極的作用。
正是基于以上優點，本發明適于作為大規模商業檢測方法推廣，具有良好的市場前景。
附圖1為用本發明的方法檢測已知感染CMV樣品的結果。其中1至8樣品中每組樣品的第一個柱狀線(即左邊第一個柱狀線)為100倍稀釋；第二個柱狀線為200倍稀釋；第三個狀線為400倍稀釋；第四個柱狀線為800倍稀釋；第五個柱狀線為1600倍稀釋，第六個柱狀線為3200倍稀釋，第七個柱狀線為6400倍稀釋。
附圖2為本發明與全病毒多抗DAS-ELISA的比較。其中各被測樣品(樣品1至14，以及陰性樣品和陽性樣品)中的第一個柱狀線(即每個樣品左邊第一個柱狀線)為本發明的結果；而第二個柱狀線(即每個樣品左邊第二個柱狀線)為全病毒多抗DAS-ELISA的檢測結果。
具體實施例方式
本發明以下提供一個實施例，并根據實施例例詳細解說本發明的有關內容。在本實施例中是用兔和豚鼠為免疫動物。其抗體及檢測試劑盒的制備如下步驟一實驗動物致敏準備2.5kg左右雄性日本大耳兔若干只，200g左右雄性豚鼠20只，禁食一天。用弗氏完全佐劑(石蠟油∶羊毛脂＝7∶1，加入滅活的分枝桿菌至4mg/ml)致敏，家兔劑量為1ml/只，豚鼠劑量為0.2ml/只，致敏途徑為腹腔注射。
步驟二一次免疫一周后，將-20℃保存的400ug/ml CMV病毒衣殼蛋白溶液與等體積與弗氏完全佐劑混合，充分乳化，經皮下多點注射做基礎免疫。每只家兔免疫劑量為CMV衣殼蛋白200ug，每只豚鼠免疫劑量為CMV衣殼蛋白50ug。
步驟三加強免疫三周后，將-20℃保存的400ug/ml CMV病毒衣殼蛋白溶液與等體積與弗氏不完全佐劑(石蠟油∶羊膜脂＝7∶1)混合，充分乳化，經皮下多點注射做第一次加強免疫。每只家兔免疫劑量為CMV衣殼蛋白200ug，每只豚鼠免疫劑量為CMV衣殼蛋白50ug。
步驟四二次加強免疫第一次加強免疫后2周，進行第二次加強免疫，劑量途徑同第一次。每隔2周，重復該步驟一次至抗血清效價符合要求。
步驟五抗血清滴度檢測第三次免疫之后10天，自免疫家兔耳緣靜脈及豚鼠腿部靜脈各采血200ul至無菌微量離心管中，6000g離心2分鐘。分離血清。經免疫雙擴散法檢測抗體滴度應不低于1∶64。
步驟六采血于最后一次免疫后第10天，對試驗動物禁食一天。家兔采用頸動脈放血法采血，豚鼠采用心臟采血。
步驟七抗血清的分離采集到的血樣，置滅菌血清分離瓶中，37℃靜置2小時，4℃靜置過夜。第二天，用滅菌毛細管小心收集析出血清，剩余樣品于3000g離心5分鐘，繼續收集分離出的血清。收集到的血清在不能及時進行后述處理時可加入千分之一濃度的疊氮鈉保存于-20℃。
步驟八多克隆IgG的粗分離將血清溫浴于25℃，加入等體積無菌生理鹽水，混勻。攪拌下，以每100ml血清稀釋物緩慢加入硫酸銨固體粉末18g至濃度為18％，25℃下溫浴30min，3000g離心30min。棄去上清液，將沉淀溶解于去離子水中至體積為25ml，此時多克隆抗體濃度與原抗血清中相等。攪拌下，加入硫酸銨粉末至14％(不可忽略第一次沉淀處理殘留的硫酸銨量)。25℃溫浴30min。3000g離心30min，棄去上清液。將沉淀溶解于15ml去離子水中，在PBS(pH6.3 0.07M)中透析至無銨離子。準備一個1.6cm×30cm的層析柱，用經過處理的DE52(Whatman)50ml裝柱，室溫下以PBS(pH6.3 0.07M)平衡3個柱床體積。將樣品加入該離子交換柱中，用同樣的緩沖液洗脫，流速控制在1ml/1分鐘。檢測OD280，待有吸收峰出現，收集最先流出的10ml組分，即為初步純化IgG。此方法對于羊、兔抗血清和豚抗血清都適用。
步驟九辣根過氧化物酶(HRP)標記的豚抗CMV抗體的制備辣根過氧化物酶(HRP)標記豚抗CMV抗體。稱取HRP25mg溶于0.5ml的1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。反應后的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG12000濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。然后加入1M pH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3小時。加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，4℃置1小時。3000g離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000g離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。
步驟十兔抗CMV多克隆IgG預包被條的制備經由包被、封閉、干燥過程A.包被用CB(pH9.6，0.05M)將兔抗CMV多克隆抗體稀釋至50或100ug/ml，100ul/孔包被于酶標檢測板上，37℃溫浴2小時，4℃過夜。
B.封閉用含有0.2％明膠，5％小牛血清，2％蔗糖的Tris-HCl(pH8.0)以150ul/孔封閉，37℃溫浴3小時。
C、干燥37℃下盡量干燥。
步驟十一酶工作液配制A.緩沖液配制以蒸餾水配制磷酸鹽緩沖液(pH7.4，0.07M)，內含1％聚乙二醇4000作為增敏劑0.5％蛋白胨；0.5‰硫柳汞鈉以及1‰吐溫-20。
B.以所配的緩沖液按適當濃度稀釋凍存的酶標記抗體。
步驟十二其他試劑的配制A.洗滌液PBST洗液(PBS，pH7.2含1‰吐溫-20)B.樣品提取液1000ml PBST中含有亞硫酸鈉1.3g、聚乙烯吡咯烷酮20g、疊氮鈉0.2g、牛血清白蛋白2g和吐溫-20 20g。
C.顯色劑A以蒸餾水配制的醋酸緩沖液pH5.0，內含0.5‰過氧化脲。
D.顯色劑B用甲醇配制的1.6‰四甲基聯苯胺(TMB)，溶解后對倍加甘油。
E.終止液蒸餾水配制的2M硫酸溶液。
F.陽性對照適當濃度稀釋的CMV純化樣品。
G.陰性對照適當稀釋的健康百合組織蛋白提取液。
步驟十三檢測方法A.樣品處理將樣品新鮮葉片組織0.1g，加入樣品提取液1ml，在研缽中勻漿，至微量離心管中8000g離心5分鐘，保留上清液。
B.加樣將上述上清液以100ul/孔，加入預包被的多抗板條孔中，同時設空白(只加100ul樣品稀釋液)、陰性對照(加100ul，不加樣品稀釋液)、陽性對照(加100ul，不加樣品稀釋液)，37℃溫浴60分鐘。PBST沖洗4次，甩干。
C.加酶標抗體每孔加入100ul上述酶工作液，37℃溫浴20分鐘，PBST沖洗加樣孔4-6次，盡量甩干。
D.顯色先后加入顯色劑A、B各50ul，37℃避光溫浴15分鐘。
E.終止加入一滴終止液。
F.檢測于酶標儀上檢測405nm吸收值。
檢測實例1稱取經過CMV接種的植物樣品各0.1g，分別加樣品提取液1ml，于組織勻漿器或研缽中勻漿。勻漿液在8000g離心5分鐘，吸取上清液100ul用樣品提取液稀釋至1ml，取100ul分別加入第一列檢測孔中，并在隨后的加樣孔中倍比稀釋直至6400倍。同時陰性對照液100ul，加入最后一列的檢測孔中。覆蓋上密封膜，在37℃孵育60分鐘。傾去孔內液體，PBST沖洗加樣孔4-6次，盡量甩干。每檢測孔中加入酶工作液100ul，覆蓋上密封膜，37℃孵育60分鐘。傾去孔內液體，PBST沖洗加樣孔4-6次，盡量甩干。每孔分別加入底物A和底物B各50ul，覆蓋上封閉膜，37℃避光孵育15分鐘。加入終止液50ul終止反應。于酶標儀上檢測405納米吸光值，結果參見附圖1。
結果說明本發明方法對陽性樣品提取物一般可檢測到800-1600倍稀釋度。
為對比起見，同時用TRizol法對同批樣品各取樣100mg提取總RNA，利用簡并引物進行RT-PCR擴增后用伯樂iCycler PCR儀進行檢測。檢測結果表明，當模板稀釋度大于320倍以上均無檢出。實際的檢測結果如下表。
上述對比實驗的結果說明，本發明方法對CMV的檢出率優于RT-PCR方法。
檢測實例2對疑似CMV感染情況樣品14份，分別取葉片組織0.1g，加入1ml樣品提取液，勻漿，8000g離心5分鐘，取上清100ul加入加樣孔中。經與前相同的處理，用本發明的方法及全病毒免疫多克隆抗體DAS-ELISA檢測，結果見圖2。
結果顯示，對于感染晚期樣品1、2、3、4感染中期樣品10、11、12、13、14本發明方法與全病毒多抗DAS-ELISA檢測結果相當。對于感染早期樣品5、6、7、8、9，本發明方法檢出率更高。
權利要求
1.百合黃瓜花葉病毒的雙抗體酶聯免疫吸附檢測試劑盒，包括反應板、酶標抗體、緩沖液、顯色液、終止液及洗滌劑，其特征在于反應板上包被有CMV病毒多克隆抗體；酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的CMV抗體；緩沖液為用蒸餾水配制的其內含1％聚乙二醇4000，0.5％蛋白胨，0.5‰硫柳汞鈉以及1‰吐溫-20的pH＝7.4，0.07M的磷酸鹽緩沖液；洗滌液為含1‰吐溫-20，pH＝7.2的磷酸緩沖液；稀釋液為生理鹽水；顯色劑A為內含0.5‰，pH＝5.0的過氧化脲醋酸水溶液；顯色劑B為甲醇中溶入1.6‰四甲基聯苯胺，并在溶解后加一倍的甘油；終止液為用蒸餾水配制的2M硫酸溶液。
2.根據權利要求1所述的檢測試劑盒中反應板上包被的CMV病毒多克隆抗體與酶標抗體的制備方法，其特征是a反應板上包被的CMV病毒多克隆抗體制備方法是將健康的雄性兔或豚鼠或羊或雞中任一種動物致敏后，在肌肉內注射CMV病毒的衣殼蛋白使動物產生免疫，檢測抗體滴度大于1∶64以上后即對實驗動物進行采血，并將所采血進行抗血清的分離，再將保存的血清進行柱層析，得到純化的CMV病毒多克隆體IgG，再將經純化CMV病毒多克隆體包被于檢測反應板上；b辣根過氧化物酶標記的CMV抗體制備方法是將不同于制備CMV病毒多克隆抗體的健康雄性兔或豚鼠或羊或雞中的任一種動物致敏后，在肌肉內注射CMV病毒的衣殼蛋白使動物產生免疫，再對實驗動物進行采血，將所采血進行抗血清的分離，收集到的血清加入千分之一濃度的疊氮鈉保存于4℃，再將保存的血清進行柱層析，得到純化的待標記的CMV病毒多克隆體IgG，再將辣根過氧化物酶溶于戊二醛溶液中，靜置使體系充分反應后，再進行柱層析得酶溶液，將待標記的抗體用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中，再在其中加入0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后在室溫靜置使體系反就充分，然后再滴加等體積的飽和硫酸銨，再經靜置后離心處理，棄去上清物，留沉淀物用半飽和硫酸銨洗滌，再將其0.15MPH7.4的磷酸緩沖液中，再進行透析處理，將經透析所得液體離心處理，取上清液為酶標抗體。
3.根據權利要求2所述的檢測試劑盒中反應板上包被的CMV病毒多克隆抗體與酶標抗體的制備方法，其特征是包被的CMV病毒多克隆抗體與酶標抗體的待標記的CMV病毒多克隆體IgG制備方法是將分離出的CMV病毒衣殼蛋白懸于用注射水配置的pH＝7.2，0.02M的磷酸鹽緩沖液中，再將其用磷酸緩沖液稀釋至濃度為200～500ug/ml，然后用等體積的弗氏完全佐劑混合并充分乳化，再給動物皮下多點注射免疫；兩周后，將分離出的CMV病毒衣殼蛋白重懸于注射用水配置的pH＝7.2，0.02M的磷酸鹽緩沖液PBS中，再將其稀釋至濃度為200～500ug/ml，與等體積的由石蠟油∶羊膜脂＝7∶1的弗氏不完全佐劑混合并充分乳化，給前述動物皮下多點注射免疫；兩周后再次重復前述步驟2次，在測定效價大于1∶64時采血，進行抗體分離。
4.根據權利要求2或3所述的檢測試劑盒中反應板上包被的CMV病毒多克隆抗體與酶標抗體的制備方法，其特征是將分離所得25ml多抗血清中再加入等體積無菌生理鹽水混勻，在攪拌下緩慢加入硫酸銨固體粉末至濃度為18％，再于25℃下溫浴10～30分鐘后，進行離心處理，棄去上清液，將沉淀溶解于去離子水中至體積為25ml，再在體系中加入硫酸銨粉末至濃度為14％，25℃溫浴10～30min后再離心處理，棄去上清液，將沉淀溶解于15ml去離子水中，在pH為6.3濃度為0.07M的磷酸緩沖液PBS中透析至無銨離子，再進行柱層析，同時檢測OD280，待有吸收峰出現，收集最先流出的10ml組分，即得到純化IgG。
全文摘要
本發明公開黃瓜花葉病毒檢測試劑盒以及制備方法。本發明的檢測盒包括反應板、酶標抗體、緩沖液、顯色液、終止液及洗滌劑。其中反應板上包被有CMV病毒多克隆抗體酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的CMV抗體。本發明采用的免疫源為CMV病毒衣殼蛋白。采用由此免疫源產生的抗體，不僅對完整病毒有特異敏感性，而且對尚未形成完整病毒的病毒蛋白亞單位也有相當的敏感性。
文檔編號G01N21/77GK1996020SQ20051002279
公開日2007年7月11日 申請日期2005年12月31日 優先權日2005年12月31日
發明者王若愚, 謝忠奎, 安黎哲, 王建輝 申請人:中國科學院寒區旱區環境與工程研究所
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
