用于檢測樣品中的分析物的固相載體和方法
【專利摘要】用于檢測樣品中處于預定閾值或高于預定閾值的分析物的存在的固相載體，其包含：在所述固相載體中的競爭性分析物，其中所述競爭性分析物與結合對的第一元件偶聯；所述固相載體中處于所述競性爭分析物下游的經標記的綴合物，其中所述分析物同所述競爭性分析物競爭結合所述綴合物；以及固定于所述固相載體中的、處于所述綴合物下游的捕獲試劑，其中所述捕獲試劑包含結合對的第二元件；其中選擇固相載體中結合對的第一元件和第二元件彼此間的親和力以及綴合物與捕獲試劑之間的距離和/或綴合物與競爭性分析物之間的距離，以提高固相載體對分析物的閾值。
【專利說明】用于檢測樣品中的分析物的固相載體和方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分析物檢測。更具體地，本發明涉及用于檢測樣品中處于預定閾值或高于預定閾值的分析物的固相載體和方法。
[0002]發明背景
[0003]一般而言，用于檢測分析物的固相載體和方法具有提高靈敏度的目標，因為大多數分析物在樣品中以非常低的水平存在，并且檢測的臨床相關閾值通常在ng/ml至低μ g/ml的范圍。然而，某些分析物在樣品中以高得多的量存在，并且臨床相關閾值太高而不能使用常規方法直接檢測。相反，檢測這樣的高濃度分析物的一般方法包括由最終使用者稀釋樣品。此外，許多常規方法不適于由最終使用者直接使用，并且相反樣品必須被送至實驗室用于測定最終結果。當分析物檢測必須快速進行時，這種延遲是有問題的。
[0004]例如，新生小牛僅可通過從初乳中攝取免疫球蛋白(Ig)來獲得對疾病的被動免疫。該初乳Ig的傳遞僅可能在小牛生命的約第一天內發生。在產后的約12小時后，以逐漸升高的速率自發發生小牛腸通透性的終止。Ig傳遞的量變化較大，并且已認識到，多至約40%的小牛未獲得足夠的被動免疫。在那些小牛中所得到的低Ig濃度與高發病率和死亡率有關。然而，無論它們是否需要免疫轉移，小牛中存在的Ig的量都非常高，處于mg/ml范圍，并因此超出了常規方法直接檢測的范圍。
[0005]因此，需要減輕和/或克服現有技術的至少一種缺陷。
[0006]發明概述
[0007]在一些方面，本發明涉及用于檢測樣品中處于預定閾值或高于預定閾值的分析物的存在的固相載體和一步式方法。本文描述的固相載體和方法可用于檢測閾值處于mg/ml范圍的樣品中的分析物。因此，這樣的固相載體和方法可用于鑒定在出生后短時間內需要免疫系統傳遞的新生小牛或其他哺乳動物。
[0008]根據一個方面，提供了用于檢測樣品中處于預定閾值或高于預定閾值的分析物的存在的固相載體，所述固相載體包含:
[0009]-在所述固相載體中的競爭性分析物，其中所述競爭性分析物與結合對的第一元件偶聯；
[0010]-所述固相載體中處于所述競性爭分析物下游的經標記的綴合物，其中所述分析物同所述競爭性分析物競爭結合所述綴合物；以及
[0011]-固定于所述固相載體中的、處于所述綴合物下游的捕獲試劑，其中所述捕獲試劑包含所述結合對的第二元件；
[0012]其中選擇所述固相載體中所述結合對的所述第一元件和所述第二元件彼此間的親和力，以及所述綴合物與所述捕獲試劑之間的距離，和/或所述綴合物與所述競爭性分析物之間的距離，以提高所述固相載體對所述分析物的閾值。
[0013]在一個方面，如權利要求1所述的固相載體，其中所述分析物是免疫球蛋白，例如IgG0
[0014]在一個方面，所述綴合物是對所述分析物具有特異性的抗體。
[0015]在一個方面，所述結合對的所述第一元件是生物素，并且所述結合對的所述第二元件是抗生物素蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白。
[0016]在一個方面，所述樣品是選自全血、血清、血漿、尿、乳和初乳的生物樣品。
[0017]在一個方面，所述預定閾值為至少約lmg/ml、3mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml 或 50mg/mlo
[0018]在一個方面，所述固相載體還包含所述競爭性分析物上游的封閉捕獲試劑。
[0019]根據另一個方面，提供了用于檢測樣品中處于預定閾值或高于預定閾值的分析物的存在的固相載體，所述固相載體包含:
[0020]-固定于所述固相載體中的封閉捕獲試劑，其中所述封閉捕獲試劑與所述樣品中的所述分析物結合，并從而降低可移動的所述分析物的濃度；
[0021]-所述固相載體中的、處于所述封閉捕獲試劑下游的經標記的綴合物；以及
[0022]-固定于所述固相載體中的、處于所述綴合物下游的捕獲試劑，其中所述捕獲試劑是競爭性分析物，并且其中所述分析物同所述競爭性分析物競爭結合所述綴合物；
[0023]其中選擇所述固相載體中所述綴合物與所述捕獲試劑之間的距離，以提高所述固相載體對所述分析物的閾值。
[0024]根據另一個方面，提供了用于檢測樣品中分析物的一步式方法，所述方法包括將所述樣品施加至本文所述的固相載體，其中陽性信號表示所述分析物不存在，或者以低于預定閾值的量存在。
[0025]根據另一個方面，提供了用于確定新生哺乳動物是否需要免疫轉移的一步式方法，所述方法包括將來自所述新生哺乳動物或其母體的生物樣品施加至固相載體，所述固相載體包含:
[0026]-與結合對的第一元件偶聯的哺乳動物IgG；
[0027]-所述哺乳動物IgG下游的經標記的抗哺乳動物IgG抗體；以及
[0028]-所述抗哺乳動物IgG下游的所述結合對的第二元件；
[0029]其中選擇所述結合對的所述第一元件和所述第二元件彼此間的親和力，以及所述抗哺乳動物IgG抗體與所述結合對的所述第二元件之間的距離，和/或所述抗哺乳動物IgG與所述哺乳動物IgG之間的距離，以使得當所述哺乳動物具有處于或低于mg/ml范圍內的預定閾值時產生陽性信號，指示所述哺乳動物需要免疫轉移。
[0030]在一個方面，所述結合對的所述第一元件是生物素，并且所述結合對的所述第二元件是抗生物素蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白。
[0031]在一個方面，所述樣品來源于所述新生哺乳動物，并且選自全血、血清、血漿和尿。
[0032]在一個方面，所述樣品來源于所述新生哺乳動物的母體，并且選自乳和初乳。
[0033]在一個方面，所述哺乳動物是牛、馬、羊駝或無峰駝。
[0034]在一個方面，所述預定閾值為約10mg/ml。
[0035]本發明的其他特征和優點將從下文的詳細描述中變得顯而易見。但是，應理解，詳述和具體實例在表示本發明實施方案的同時，僅以解釋說明的方式給出，因為對本領域技術人員來說，本發明精神和范圍內的多種改變和修飾都將從所述詳述中變得顯而易見。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0036]本發明將通過下文的描述以及參考附圖而得到進一步的理解，其中:
[0037]圖1示出了如本文描述的固相載體第一方面的示意圖；并且
[0038]圖2示出了如本文描述的固相載體第二方面的示意圖。
[0039]發明詳述
[0040]常規的固相載體測定已被進行了優化以提高其靈敏度，從而降低樣品中存在的分析物的檢測閾值。這是因為大多數分析物的臨床相關閾值水平十分低，例如在μ g/mi的范圍內或者更低。因此，這樣的常規固相載體測定在用于鑒定樣品中以較高量存在的分析物的閾值水平的一步式方法中不是直接可用的，其中這樣的分析物的臨床相關閾值水平要高得多，例如處于mg/ml的范圍內。
[0041]當使用常規固相載體測定來檢測以較高量存在于樣品中的分析物時，在將樣品施加至固相載體之前通常需要進行樣品稀釋。“稀釋”是指在施用于固相載體測定之前用合適的稀釋劑稀釋例如血液或尿樣品，并且不原樣使用直接來自身體的樣品。因此，由于需要進行樣品稀釋，這樣的測量不視為“一步式”測定。樣品稀釋可導致若干問題，至少包括由于對樣品的不適當稀釋而導致的樣品污染和測試結果不準確。此外，樣品的稀釋需要最終使用者進行計算和測量，這也可導致測試結果不準確。
[0042]特別地，常規固相載體測定的高靈敏度已經成為快速鑒定需要免疫轉移的新生小牛方面的問題。這樣的小牛必需盡快得到鑒定，因為免疫轉移可有效進行的時間窗十分有限。此外，新生小牛的血液中一般存在mg/ml范圍的牛IgG，其中將小牛分成需要免疫轉移的小牛(IgG低于10mg/ml的小牛)和不需要免疫轉移的小牛(IgG為10mg/ml或更高的小牛)的閾值為約10mg/ml IgG。過去難以找到可“在牛旁邊”以一步式方式進行的而無需進行樣品稀釋的測試來提供快速和準確的測試結果，從而確定哪些小牛低于該測試閾值并因此需要免疫轉移。
[0043]因此，本發明涉及固相載體用于檢測樣品中處于預定閾值或高于預定閾值的分析物的存在的固相載體和一步式方法。一般而言，該閾值處于mg/ml范圍內。因為本文描述的固相載體已經被修飾成通過降低固相載體對分析物的靈敏度將閾值或“截斷”檢測水平增加至mg/ml范圍，通常不需要為了達到可用的結果而進行樣品稀釋。因此，在一個方面，本發明明確地排除了在將樣品施加至本文描述的固相載體前進行樣品稀釋的步驟。
[0044]所述固相載體和方法的第一方面在圖1中示出。固相載體10用于檢測分析物12。在一個方面，固相載體10是包含分離膜14和分析膜16的膜陣列。分析膜16包含固定的封閉捕獲試劑17，其將結合并捕獲樣品中一定量的分析物12。封閉捕獲試劑17的下游是綴合物22，其包含與可檢測標記24綴合的分析物結合分子23。綴合物22的下游是固定的競爭性分析物18。競爭性分析物18與分析物12相當或足夠相當，從而使得分析物12同競爭性分析物18競爭結合綴合物22。
[0045]在使用中，在一端將樣品施加至固相載體10。在一個方面，固相載體是包含分離膜14和分析膜16的膜陣列，并且樣品被施加于分離膜14。樣品將橫向地沿著固相載體10通過毛細管作用從分離膜14流至分析膜16。樣品將首先遇到封閉捕獲試劑17，其將捕獲并固定樣品中預定量的分析物12，有效降低將進一步流至固相載體下游的分析物12的量。樣品將繼續沿著固相載體10移動，直至其遇到綴合物22和競爭性分析物18。樣品中的任何剩余分析物12都將同競爭性分析物18競爭結合綴合物22，基于樣品中分析物12的量形成分析物12和綴合物22的復合物和/或競爭性分析物18和綴合物22的復合物。
[0046]如果樣品中不存在分析物12或以低于預定閾值的量存在分析物12，則分析物12將不會以勝過競爭性分析物18的足夠的量存在來與綴合物22結合。在這種情況下，綴合物22將與足夠量的競爭性分析物18結合，從而產生陽性信號，指示樣品中不存在分析物12或者樣品中以低于預定閾值的量存在分析物。
[0047]在另一方面，如果樣品中存在等于或大于預定閾值的量的分析物12，則分析物12將以勝過競爭性分析物18的足夠的量存在來與綴合物22結合。在這種情況下，綴合物22將不會與足夠量的競爭性分析物18結合以產生陽性信號，指示樣品中存在等于或大于預定閾值的量的分析物12。
[0048]所述固相載體和方法的第二方面在圖2中示出。固相載體10用于檢測分析物12。在一個方面，固相載體10是包含分離膜14和分析膜16的膜陣列。分析膜16包含與結合對的第一元件20偶聯的競爭性分析物18。競爭性分析物18的下游是綴合物22，其包含與可檢測標記24綴合的分析物結合分子23。競爭性分析物18與分析物12相當或足夠相當，從而使得分析物12同競爭分析物18競爭結合與綴合物22。
[0049]綴合物22下游是結合對的第二元件26，其也稱為捕獲試劑，因為它將結合并捕獲結合對的第一元件20。應理解，本文描述的固相載體10利用組合的三明治/競爭性測定模式，其中分析物12同競爭性分析物18競爭結合綴合物22。此外，如將要描述的，如果分析物12以低于預定閾值的量存在，則結合對的第二元件26和綴合物22將與競爭性分析物18和結合對的第一元件20形成“三明治”。
[0050]固相載體10被設計成具有用于檢測分析物12的預定閾值，即，當分析物12在樣品中以低于該預定閾值的水平存在時，固相載體10將通過可檢測標記24產生陽性結果。雖然調節固相載體閾值的一般方法包括改變試劑濃度、膜孔徑、抗體親和力等，但是現在已發現還可基于至少兩種額外的新因素進一步調節預定閾值。
[0051]首先，可基于結合對元件彼此間的親和力來選擇結合對的第一元件20和第二元件26。通過選擇彼此間具有高親和力的結合對，可提高預定閾值。例如，生物素與抗生物素蛋白鏈菌素彼此間具有特別強的親和力。因此，使用生物素作為結合對的第一元件20并且使用抗生物素蛋白鏈菌素作為結合對的第二元件26將得到具有比選擇具有更低親和力的結合對時得到的閾值更高的預定閾值的固相載體10。
[0052]其次，可改變競爭性分析物18與綴合物22之間的距離以及綴合物22與結合對的第二元件26之間的距離，以調節固相載體10的預定閾值。當將競爭性分析物18與綴合物22布置得彼此更接近時，競爭性分析物18到達綴合物22之前須移動的距離減小。競爭性分析物18在到達綴合物22之前須移動的距離的該減小使得競爭性分析物18在固相載體中的擴散度變得更小，從而有效地將到達綴合物22并與之反應的競爭性分析物18的濃度保持在較高水平。此外，當將綴合物22與結合對的第二元件26布置得彼此更近時，在與綴合物22的反應過程中，由于反應時間減少而使競爭性分析物18的擴散進一步降低。因為存在于樣品中的分析物12的濃度一直恒定，并且不受擴散的影響，這些變量一起導致固相載體10的預定閾值的相比較的提高。
[0053]應理解，如圖2所示的固相載體和方法的該第二方面還可包含競爭性分析物18上游的封閉捕獲試劑17。
[0054]在使用中，在一端將樣品施加至固相載體10。在一個方面，固相載體是包含分離膜14和分析膜16的膜陣列，并且樣品被施加于分離膜14。樣品將橫向地沿著固相載體10通過毛細管作用從分離膜14流至分析膜16。樣品首先遇到與結合對的第一元件20結合的競爭性分析物18。然后，競爭性分析物18將松動，并將沿著固相載體10與樣品一起移動，直至樣品遇到包含與可檢測標記24結合的分析物結合分子23的綴合物22。樣品中的任何分析物12都將同競爭性分析物18競爭結合綴合物22，基于樣品中分析物12的量形成分析物12和綴合物22的復合物和/或競爭性分析物18和綴合物22的復合物。樣品與復合物將繼續沿著分析膜流動，直至他們遇到結合對的第二元件26。
[0055]如果樣品中不存在分析物12或以低于預定閾值的量存在分析物12，則分析物12將不會以勝過競爭性分析物18的足夠的量存在來與綴合物22結合。由于結合對的第一元件20和第二元件26之間的親和力，即使是少量的競爭性分析物18與綴合物22的復合物也將與結合對的第二元件26結合，并產生陽性信號，指示樣品中不存在分析物12，或者樣品中以低于預定閾值的量存在分析物12。
[0056]在另一方面，如果樣品中存在等于或大于預定閾值的量的分析物12，則分析物12將以勝過競爭性分析物18的足夠的量存在來與綴合物22結合，使得幾乎沒有或完全沒有競爭性分析物18和綴合物22的復合物與結合對的第二元件26的結合。在這種情況下，由于綴合物沒有以足以產生信號的量來結合結合對的第二元件26，將不存在來自綴合物22中的標記24的信號，指示樣品中存在等于或大于預定閾值的量的分析物12。
[0057]在固相載體10中使用的樣品可為任何體液。在一個方面,所述樣品選自全血、血清、血漿、尿、涎、汗、脊液、精液、組織溶解物、乳、初乳及以上的組合。在一個特定方面，所述樣品是全血。可選地，所述樣品是乳或初乳。此外，所述樣品可來自任何來源，但通常來源于哺乳動物。術語“哺乳動物”是指歸類為哺乳動物的任何動物，包括人、其他高等靈長類、家養動物和農場動物，以及動物園動物、運動動物或寵物，例如狗、貓、牛、馬、無峰駝、羊駝、綿羊、豬、山羊、兔等。一般地，所述哺乳動物是牛、馬、無峰駝或羊駝。
[0058]例如，樣品可為來源于諸如牛或馬的新生農場動物的全血，以確定該動物是否需要免疫轉移。可選地，所述樣品可來源于新生農場動物母體的乳或初乳，以從母體是否能夠為新生動物提供足夠的抗體方面來確定母體的乳或初乳質量。計劃對新生動物和母體二者都進行測試以確定動物需要免疫轉移的總體可能性。
[0059]待測的樣品體積可通過改變固相載體中的尺寸、孔隙率以及其他變量而發生改變。一般而言，樣品體積較小，例如約一滴血的大小，例如約10 μ I至約50 μ I。在一個特定方面，樣品體積為約35 μ I。
[0060]樣品從固相載體上的接觸點流至固相載體的末端以得到測試結果所需的時間也可通過改變固相載體中的多個變量來進行改變。通常來說，該時間小于約30分鐘，例如小于約25分鐘、小于約20分鐘、小于約15分鐘、小于約10分鐘、小于約5分鐘或小于約2分鐘。
[0061]待檢測的分析物通常是以相對較高的量遍布于待測樣品中的分析物。一般而言，需要回答的問題不是樣品中是否存在分析物，而是分析物在樣品中是以高于還是低于閾值的量存在。通常來說，閾值量較高，例如處于mg/ml范圍，例如至少約lmg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml 或 50mg/ml。可選地，可以μ M的量來測量閾值量，且其可為至少約10 μ Μ、50 μ Μ、100 μ Μ、150 μ Μ、200 μ Μ、250 μ M或300 μ M0以這么高的量存在的分析物包括免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM;白蛋白；血紅蛋白或C-反應性蛋白(CRP)。在一個特定方面，所述分析物是IgG。
[0062]封閉捕獲試劑可為能夠結合目的分析物從而降低其沿著固相載體向前運動的濃度的任何試劑。封閉捕獲試劑可對目的分析物是特異性的，并且可為例如抗體。可選地，其可對目的分析物是非特異性的，并且可結合樣品中的若干種分子。在這種情況下，封閉捕獲試劑可為例如蛋白A或蛋白G。
[0063]競爭性分析物一般與待檢測的分析物相同。但是，應理解，本文涵蓋了能夠與待檢測分析物競爭結合綴合物的任何競爭性分析物。例如，如果分析物是牛IgG，則競爭性分析物也可為牛IgG。可選地，其可為例如牛IgG的競爭結合Fe區特異性的綴合物的Fe片段。
[0064]類似地，綴合物中的分析物結合分子可為結合分析物和競爭性分析物二者的任何分子。通常來說，分析物結合分子是抗體，例如抗IgG抗體。但是，綴合物還可為例如肽或小分子。此外，如果待檢測分析物是抗體，則分析物集合分子可為例如天然的或重組的蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L。
[0065]如果樣品中不存在分析物或樣品中存在的分析物低于閾值量，則綴合物與結合對第二元件的偶聯將憑借綴合物上的標記產生可見的線。通常來說，得到陽性測試結果時，綴合物上的標記是裸眼直接可見的。就此而言，所述標記可為例如金屬標記、酶標記或經著色的乳膠珠。金是常用的金屬標記，并且一般具有約20nm至65nm的粒徑。此外，應理解，可通過使用作為可見產物沉積的可還原的銀鹽(例如乳酸銀)組合還原劑(例如氫醌)來增強金信號以使其容易可見。金屬銀在每個金顆粒周圍形成容易辨識的黑色沉積物。
[0066]可選地，得到陽性測試結果時，所述標記可以不是裸眼直接可見的，例如，如果采用了熒光標記。在這種情況下，將通過使用例如讀取器來確定測試結果。
[0067]此外，如所公知的，可在固相載體上形成第二線作為指示測試完成的對照，無論結果是陽性還是陰性。此外，綴合物本身可發揮過程控制的功能。例如，如果綴合物包含經著色的標記，則在進行測試之前固相載體上將顯示線。在將樣品施加于固相載體后，綴合物將松動，并且第一線的強度將因此降低，指示測試正在進行。
[0068]所述固相載體和方法可為定性的、半定量的或定量的。在定性測定中，提供“是”或“否”答案，意指分析物以預定閾值或高于預定閾值存在或不以預定閾值或高于預定閾值存在。在半定量測定中，固相載體上產生第二線，其一般處于包含捕獲試劑的信號線的下游，其中第二線的強度是恒定的或與信號線的強度成反比。例如，如果綴合物包含單克隆抗體，則第二線可包含抗該單克隆抗體的抗體。任何游離的單克隆抗體都將結合于第二線，并發射信號。如果樣品中不存在分析物，或樣品中存在的分析物低于預定閾值，則將在結合對的第二元件所處的信號線處形成第二線，因為綴合物和競爭性分析物之間的復合物將會結合于該處。樣品中分析物的水平越高，該第二線將越弱。通過比較第一線和第二線，最終使用者可估計樣品中的分析物水平。在定量測定中，可通過儀器測量信號線的強度，以將該強度轉換為相應的分析物濃度。
[0069]如已經描述的，可改變競爭性分析物與綴合物之間的距離以及綴合物與結合對的第二元件之間的距離，以調節固相載體的預定閾值。應理解，這些距離將根據固相載體的尺寸和期望接收的樣品的量而發生改變。在一個方面，將綴合物布置于結合對的第二元件的緊上游，和/或將競爭性分析物布置于綴合物的緊上游。在另一個方面，在被設計成接收約5μ I至約50μ I樣品的固相載體中，綴合物與結合對的第二元件之間和/或競爭性分析物與綴合物之間可相距小于約5mm、小于約4mm、小于約3mm、小于約2mm或小于約1mm。在一個具體實例中，在被設計成接收35μ I樣品的固相載體中，競爭性分析物、綴合物和結合對的第二元件之間各自相距2mm。
[0070]上文已經描述結合對的第一元件和第二元件為例如生物素和抗生物素蛋白鏈菌素。應理解，可選擇其他結合對用于本發明，其中結合對元件彼此之間的親和力在一個方面被用于設置固相載體的預定閾值。例如，可使用的結合對還包括生物素和抗生物素蛋白，或者任何已知的高親和力抗原/抗體結合對。
[0071]上文已經描述固相載體是包含分離膜和分析膜的膜陣列。但是，應理解，在本發明中可使用任何固相載體模式。例如，本發明不需要分離膜，并且可明確地將其排除。在一個特定的方面，本發明用于美國專利第7, 785，865,7, 883，899和8，119，393號以及美國專利申請公布第 2005/0244985、2010/0137145、2010/0323433、2011/0189791 和 2011/0287461號中描述的任意一種或多種固相載體，其每個通過引用整體并入本文。使用本文描述的固相載體不需要膜。就此而言，所述固相載體可為例如由B1site市售的毛細通道(參見例如美國專利第6，669，907號，其通過引用整體并入本文)，或者其可為微流通道。
[0072]在理解本申請的范圍時，本文所用術語“包含(comprising)”及其派生詞旨在作為開放式術語，其指明存在所記載的特征、要素、組分、組、整數和/或步驟，但是不排除存在其他未記載的特征、要素、組分、組、整數和/或步驟。前述事項也適用于具有相似含義的詞語，例如術語“包括(including) ”、“含有(having)”及其派生詞。應理解，在用術語“包含(comprsing) ”或其等價詞描述本發明的任何特征時,本發明還包括這樣的變體,其中其“由所記載的特征組成”。最后，本文所用程度術語例如“基本”、“約”和“近似”意指不使最終結果發生顯著變化的所修飾術語的合理偏差量。這些程度術語應理解為包括所修飾術語的至少±5%的偏差，只要該偏差不否定其修飾的詞的含義即可。
[0073]上述公開內容在整體上描述了本發明。通過參考以下的具體實施例可得到更完整的理解。這些實施例僅用于舉例說明的目的，并且不旨在限制本發明的范圍。在情形可暗示或使得更為便利的情況下，本發明包括形式改變和等同物替換。雖然在本文中使用了具體的術語，但是這些術語旨在作為描述性的意義，而非用于限制目的。
實施例
[0074]實施例1-比較實施例
[0075]制備了用于實施分析物C-反應性蛋白(CRP)的檢測的競爭測定的固相載體，其包含分離膜和分析膜，其中分析膜處于分離膜的下游。以綴合于抗CRP單克隆抗體(Hytest)的40nm金顆粒(British B1cell Internat1nal)制備了終OD 3處于540nm的膠體金共軛溶液。用該膠體金共軛溶液包被分離膜(Whatman)，然后凍干所述分離膜以除去水。由具有的8 μ m孔徑的硝化纖維(Millipore)制得分析膜。用包含1.5mg/ml CRP的捕獲溶液浸潰分析膜，然后在37°C下孵育30分鐘以使分析膜干燥。將分離膜和分析膜用透明的聚酯帶(Adhesive Research)覆蓋，并用聚苯乙烯背襯帶(G&L Precis1n Die Cutting, Inc.)支承。
[0076]為了進行測試，將35μ1人血清施加至分離膜。在約15分鐘后，完成測試。通過使用該常規設計，CRP檢測的閾值最高為約10 μ g/ml。
[0077]實施例2
[0078]制備了用于實施分析物IgG的檢測的經修改的競爭測定的固相載體，其包含分離膜(Whatman)和由具有5 μ m的孔徑的硝化纖維(Millipore)制得的分析膜。以綴合于山羊抗牛IgG多克隆抗體(B1sPacific)并且包含明膠作為封閉試劑的60nm金顆粒(BritishB1cell Internat1nal)制備了終0D16處于540nm的膠體金共軛溶液。制備了封閉捕獲溶液，并且其包含2.2mg/ml的與共軛溶液中所用的相同的山羊抗牛IgG多克隆抗體。最后，制備了包含3.5mg/ml牛IgG的捕獲溶液。將這三種溶液浸潰于分析膜中，其中共軛溶液處于封閉捕獲溶液下游，并且捕獲溶液處于共軛溶液下游。特別地，捕獲溶液位于共軛溶液下游小于約2_。隨后將分析膜于37°C下孵育40分鐘，以干燥試劑。將分析膜用透明的聚酯帶(Adhesive Research)覆蓋，并用聚苯乙烯背襯帶(G&L Precis1n Die Cutting, Inc.)支承。
[0079]為了進行測試，將35μ1牛血清施加至分離膜。在約15分鐘后，完成測試。通過使用該設計，IgG檢測的閾值為約3mg/ml。
[0080]實施例3
[0081]制備了用于實施分析物IgG的檢測的組合三明治/競爭測定的固相載體，其包含分離膜(Whatman)和具有5 μ m的孔徑的硝化纖維(Millipore)制得的分析膜。以綴合于山羊抗牛IgG多克隆抗體(B1sPacific)并且包含明膠作為封閉試劑的60nm金顆粒(BritishB1cell Internat1nal, BBI)制備了終OD 16處于540nm的膠體金共軛溶液。以3mg/ml的濃度制備了與待檢測的IgG對應的生物素化的牛IgG。最后,制備了包含3mg/ml抗生物素蛋白鏈菌素(IPOC Inc.)的捕獲溶液。將這三種溶液浸潰于分析膜中，其中共軛溶液處于生物素化的牛IgG下游，并且捕獲溶液處于共軛溶液下游。特別地，捕獲溶液位于共軛溶液下游小于約2_。然后將分析膜于37°C下孵育40分鐘，以干燥試劑。將分析膜用透明的聚酯帶(Adhesive Research)覆蓋，并用聚苯乙烯背襯帶(G&L Precis1n Die Cutting, Inc.)支承。
[0082]為了進行測試，將35μ1牛血清施加至分離膜。在約15分鐘后，完成測試。通過使用該設計，IgG檢測的閾值為至少約30mg/ml。
[0083]上述公開內容從整體上描述了本發明。雖然在本文中使用了具體的術語，但是這些術語旨在作為描述性的意義，而非用于限制目的。
[0084]所有出版物、專利和專利申請都通過引用整體并入本文，其程度跟特別并且單獨地指明通過引用將每個單獨的出版物、專利或專利申請整體并入本文一樣。
[0085]雖然本文已經詳細描述了本發明的示例性實施方案，但是本領域技術人員將理解，可對其作出改變而不脫離本發明的精神或所附權利要求的范圍。
【權利要求】
1.用于檢測樣品中處于預定閾值或高于預定閾值的分析物的存在的固相載體，所述固相載體包含: -所述固相載體中的競爭性分析物，其中所述競爭性分析物與結合對的第一元件偶聯； -所述固相載體中的、處于所述競爭性分析物下游的經標記的綴合物，其中所述分析物同所述競爭性分析物競爭結合所述綴合物；以及 -固定于所述固相載體中的、處于所述綴合物下游的捕獲試劑，其中所述捕獲試劑包含所述結合對的第二元件； 其中選擇所述固相載體中所述結合對的所述第一元件和所述第二元件彼此間的親和力，以及所述綴合物與所述捕獲試劑之間的距離和/或所述綴合物與所述競爭性分析物之間的距離，以提高所述固相載體對所述分析物的閾值。
2.如權利要求1所述的固相載體，其中所述分析物是免疫球蛋白。
3.如權利要求2所述的固相載體，其中所述免疫球蛋白是IgG。
4.如權利要求1至3中任一項所述的固相載體，其中所述綴合物是對所述分析物具有特異性的抗體。
5.如權利要求1至4中任一項所述的固相載體，其中所述結合對的所述第一元件是生物素，并且所述結合對的所述第二元件是抗生物素蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白。
6.如權利要求1至5中任一項所述的固相載體，其中所述樣品是選自全血、血清、血漿、尿、乳和初乳的生物樣品。
7.如權利要求1至6中任一項所述的固相載體,其中所述預定閾值為至少約lmg/ml、3mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml 或 50mg/ml。
8.如權利要求1至7中任一項所述的固相載體，其還包含所述競爭性分析物上游的封閉捕獲試劑。
9.用于檢測樣品中處于預定閾值或高于預定閾值的分析物的存在的固相載體，所述固相載體包含: -固定于所述固相載體中的封閉捕獲試劑，其中所述封閉捕獲試劑能與所述樣品中的所述分析物結合，并從而降低可移動的所述分析物的濃度； -所述固相載體中的、處于所述封閉捕獲試劑下游的經標記的綴合物；以及 -固定于所述固相載體中的、處于所述綴合物下游的捕獲試劑，其中所述捕獲試劑是競爭性分析物，并且其中所述分析物與所述競爭性分析物競爭結合所述綴合物； 其中選擇所述固相載體中所述綴合物與所述捕獲試劑之間的距離，以提高所述固相載體對所述分析物的閾值。
10.用于檢測樣品中分析物的一步式方法，所述方法包括將所述樣品施加至權利要求1至9中任一項所述的固相載體，其中陽性信號表示所述分析物不存在，或者以低于所述預定閾值的量存在。
11.用于確定新生哺乳動物是否需要免疫轉移的一步式方法，所述方法包括將來自所述新生哺乳動物或其母體的生物樣品施加至固相載體，所述固相載體包含: -與結合對的第一元件偶聯的哺乳動物IgG ； -位于所述哺乳動物IgG下游的、經標記的抗哺乳動物IgG抗體；以及 -位于所述抗哺乳動物IgG下游的、所述結合對的第二元件； 其中選擇所述結合對的所述第一元件和所述第二元件彼此間的親和力，以及所述抗哺乳動物IgG抗體與所述結合對的所述第二元件之間的距離和/或所述抗哺乳動物IgG與所述哺乳動物IgG之間的距離，以使得當所述哺乳動物具有處于或低于mg/ml范圍內的預定閾值時產生陽性信號，指示所述哺乳動物需要免疫轉移。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述結合對的所述第一元件是生物素，并且所述結合對的所述第二元件是抗生物素蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白。
13.如權利要求11或12所述的方法，其中所述樣品來源于所述新生哺乳動物，并且選自全血、血清、血漿和尿。
14.如權利要求11或12所述的方法，其中所述樣品來源于所述新生哺乳動物的母體，并且選自乳和初乳。
15.如權利要求11至14中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物是狗、貓、牛、馬、無峰駝、羊騎、綿羊、豬、山羊或兔。
16.如權利要求11至15中任一項所述的方法,其中所述預定閾值為約10mg/ml。
【文檔編號】G01N33/53GK104364652SQ201380030556
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2013年4月19日 優先權日:2012年4月20日
【發明者】史沁衛, 徐靜 申請人:Zbx公司
專業數控銑床產品供應商
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