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專利名稱：：一種臨床磁共振成像檢測慶大霉素的方法
技術領域：
：本發明涉及一種磁性納米粒子標記抗體定量檢測慶大霉素的方法，屬于免疫檢測
技術領域：
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背景技術：
：慶大霉素是由小單孢菌產生的多組分抗生素，含C,、C2、C,a等組分，結構見附圖l。硫酸慶大霉素是白色粉末，有吸濕性，易溶于水，難溶于一般有機溶劑，對溫度和酸、堿都穩定，抗菌譜和卡那霉素基本相同。特點是對綠膿桿菌、變形桿菌和耐青霉素金葡萄都具抑制作用。與新霉素、卡那霉素有交叉耐藥現象。主要用于上述敏感菌的嚴重感染如敗血癥、呼吸道感染、肺炎、腸道感染、膽道感染、尿路感染、軟組織感染等的治療。慶大霉素的毒理作用同氨基糖苷類其它藥物類似，具有很強的腎毒性和肝毒性，毒害很大。當今國際上常用的慶大霉素殘留檢測的方法有微生物法、液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、氣-質聯用法(GC-MS)、液-質聯用法(LC-MS)等。微生物檢測不準確且檢測靈敏度不高，而儀器分析方法不僅需要昂貴的儀器設備，對操作人員的要求也比較高，需要經過復雜的樣品前處理才能進行。國外早已經開展了對氨基糖苷類抗生素免疫分析方法的研究，常用的方法為酶聯免疫分析法(ELISA)或稱為免疫酶定量分析法(IEMA)，這類方法是將包被原包被酶標板，加入藥物及抗藥物抗體，再加入酶標二抗，即檢測抗體，最后加入底物顯色，一定時間后，用酶標儀檢測某一特定波長的吸光度值，根據已知標準品含量計算樣品中待測藥物的濃度，此操作繁瑣，費時。磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)技術由于可以用來對生物內臟器官和軟組織進行無損的快速檢測，己經成為診斷軟組織病變尤其是檢測腫瘤的最為有效的臨床診斷方法之一。對于超順磁性納米顆粒而言，其主要作用是縮短橫向馳豫時間(T2)，而對縱向馳豫時間(TO影響不大。國內目前為止尚未見有利用超順磁性納米粒子的磁共振信號達到對體外目標物檢測的報道，本發明彌補了這一空白。
發明內容本發明的目的是提供一種具有靈敏性、特異性、準確度、操作方法簡單的磁性納米粒子標記抗體的免疫檢測方法，用于慶大霉素殘留的快速檢測。本發明的技術方案一種臨床磁共振成像檢測慶大霉素的方法，首先將慶大霉素修飾磁性納米粒子，加慶大霉素標準或待測上清液，慶大霉素抗體，羊抗兔二抗，抗體與慶大霉素修飾磁性納米粒子形成免疫聚合物，由此產生磁共振信號，進行磁共振檢測；步驟為(1)慶大霉素與磁性納米粒子的藕聯1pL碳二亞胺EDC禾卩2.4mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺sulfo-NHS加入到0.5mL、1.3mg/mL的Fe304水溶液中，反應15min活化，活化后的Fe304力口入lmg慶大霉素(GM藥品)，室溫反應4小時，于0.01M、pH7.4的PBS中透析24小時，除去未反應的慶大霉素小分子，制得慶大霉素修飾的Fe304磁性納米粒子；(2)磁共振檢測，繪制馳豫時間T2C慶大霉素濃度標準曲線20^L、150[Ag/mL的慶大霉素修飾的Fe3(34磁性納米粒子中加入20pL不同濃度的慶大霉素標準品，加入lpL、5mg/mL慶大霉素抗體，再加入lnL羊抗兔二抗，孵育2小時后，稀釋到體積為250pL，加入到微孔板中，測磁共振，以橫向馳豫時間T2繪制T2C慶大霉素濃度標準曲線；對照組設置慶大霉素抗體用地塞米松抗體代替，其它操作同上；所用的溶液皆為0.01M、pH7.4的PBS緩沖液；慶大霉素標準品濃度分別為0、8、12、16、32、48、72、100、120、144ng/mL;用德國西門子臨床磁共振成像設備(MAGNETOMAvanto1.5TMRI)測磁共振，回波時間(echotime)TE為20-120ms，脈沖重復間隔時間(repetitiontime)TR為2000ms，所用線圈為頭線圈；(3)磁共振定量檢測2(^L、150^ig/mL的慶大霉素修飾的Fe3O4磁性納米粒子中加入2(VL的待測上清液，加入卬L、5mg/mL慶大霉素抗體，再加入lpL羊抗兔二抗，孵育2小時后，稀釋到體積為250^L,加入到微孔板中，測磁共振，以橫向馳豫時間T2與繪制的T2C慶大霉素濃度標準曲線對照，求出樣品中慶大霉素的濃度。所述的慶大霉素修飾的磁性納米粒子是將慶大霉素用藕聯方法藕聯到羧基修飾的磁性納米粒子的表面；磁性納米粒子是雙羧基修飾的磁性納米粒子，其核心部分是Fe304。所述的抗體是抗慶大霉素的多克隆抗體，經硫酸銨沉淀法純化的特異性抗體。所述的抗體與慶大霉素修飾的磁性納米粒子形成免疫聚合物于慶大霉素修飾的磁性納米粒子中加入慶大霉素抗體后，磁性納米粒子表面的慶大霉素與溶液中游離的慶大霉素競爭抗體，通過抗原與抗體的特異性結合形成抗原-抗體免疫聚合物。所述的磁共振信號檢測是利用抗體與慶大霉素修飾磁性納米粒子形成免疫聚合物，有效的縮短水中質子橫向馳豫時間T2值而產生信號。通常樣品中慶大霉素濃度越大，被抗體捕獲的慶大霉素量越多，則與磁性納米粒子表面的慶大霉素結合的抗體越少，則測得的T2數值越大。本發明的有益效果(1)本法不需復雜的樣品前處理，即使對于全血，尿液，組織液。(2)本法操作簡便，只需加待測樣品孵育后進行直接測定T2值，只需一步就可完成。(3)本法用于標記超順磁性納米粒子，粒徑為10nm，水溶性高，分散性穩定性好。飽和磁化強度為65emug—圖l慶大霉素結構式。圖2磁共振成像圖(左)與微彩圖(右)。圖3磁共振檢測標準曲線。具體實施例方式實施例1慶大霉素與磁性納米粒子的藕聯lpL碳二亞胺EDC禾卩2.4mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺sulfo-NHS加入到0.5mL、1.3mg/mL的Fe304水溶液中，反應15min左右活化?；罨蟮腇e304加入lmg慶大霉素(GM藥品)，室溫反應4小時，于0.01M、pH7.4的PBS中透析24小時，除去未反應的藥物小分子。實施例2磁共振20pL、150pg/mL的慶大霉素修飾的Fe304中加入20pL不同濃度的慶大霉素標準品，加入lML慶大霉素抗體(5mg/mL)，再加入lpL羊抗兔二抗，孵育2小時后，稀釋到體積為250pL，加入到微孔板中，測磁共振。對照組設置慶大霉素抗體用地塞米松抗體代替，其它操作同上。所用的溶液皆為0.01M、pH7.4的PBS緩沖液。慶大霉素標準品濃度分別為0、8、12、16、32、48、72、100、120、144ng/mL。實施例3磁共振定量檢測磁共振設備為MAGNETOMAvanto1.5TMRI，德國西門子臨床磁共振成像設備。本實驗所用掃描時間參數為回波時間(echotime)TE為20-120ms，脈沖重復間隔時間(repetitiontime)TR為2000ms，所用線圈為頭線圈。磁共振檢測目標物的原理是通過抗體與藥物修飾磁性納米粒子免疫聚合物的形成引起水質子T2值的大小，達到檢測目標物目的。水中加入的慶大霉素越多則聚合物形成的越少，T2值則越大。通過建立的T2C/慶大霉素濃度標準曲線可對比求出樣品中慶大霉素的濃度。標準曲線見附圖3。實施例4實際樣品測定實際樣品處理取豬肉組織樣品lg，于50mL離心管中，10mL、0.2M的PB(磷酸緩沖液)與組織樣品混合，混合液在6(TC孵育30min，然后4000r/min離心15min，取上清液待測。20pL、150pg/mL的慶大霉素修飾的Fe304中加入20|iL待測上清液，加入lpL慶大霉素抗體(5mg/mL)，再加入l|aL羊抗兔二抗，孵育2小時后，稀釋到體積為250pL，加入到微孔板中，用德國西門子臨床磁共振成像設備(MAGNETOMAvanto1.5TMRI)測磁共振，回波時間(echotime)TE為20-120ms，脈沖重復間隔時間(repetitiontime)TR為2000ms,所測為水中氫質子的T2，故選TR為2000ms比較合適，所用線圈為頭線圈，以T2C/慶大霉素濃度標準曲線對照，求出樣品中慶大霉素的濃度。表1實際樣品添加回收<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>標準曲線的繪制，以標準品濃度為橫坐標，以AT2縱坐標，數據見下表，作圖，見附圖3。表2磁共振數據<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1、一種臨床磁共振成像檢測慶大霉素的方法，其特征是首先將慶大霉素修飾磁性納米粒子，加慶大霉素標準或待測上清液，慶大霉素抗體，羊抗兔二抗，抗體與慶大霉素修飾磁性納米粒子形成免疫聚合物，由此產生磁共振信號，進行磁共振檢測；步驟為(1)慶大霉素與磁性納米粒子的藕聯1μL碳二亞股EDC和2.4mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺sulfo-NHS加入到0.5mL、1.3mg/mL的Fe3O4水溶液中，反應15min活化，活化后的Fe3O4加入1mg慶大霉素，室溫反應4小時，于0.01M、pH7.4的PBS中透析24小時，除去未反應的慶大霉素小分子，制得慶大霉素修飾的Fe3O4磁性納米粒子；(2)磁共振檢測，繪制馳豫時間T2～C慶大霉素濃度標準曲線20μL、150μg/mL的慶大霉素修飾的Fe3O4磁性納米粒子中加入20μL不同濃度的慶大霉素標準品，加入1μL、5mg/mL慶大霉素抗體，再加入1μL羊抗兔二抗，孵育2小時后，稀釋到體積為250μL，加入到微孔板中，測磁共振，以橫向馳豫時間T2繪制T2～C慶大霉素濃度標準曲線；對照組設置慶大霉素抗體用地塞米松抗體代替，其它操作同上；所用的溶液皆為0.01M、pH7.4的PBS緩沖液；慶大霉素標準品濃度分別為0、8、12、16、32、48、72、100、120、144ng/mL；用德國西門子臨床磁共振成像設備MAGNETOMAvanto1.5TMRI測磁共振，掃描時間參數為回波時間TE為20-120ms，共6個回波，脈沖重復間隔時間TR為2000ms，所用線圈為頭線圈；(3)磁共振定量檢測20μL、150μg/mL的慶大霉素修飾的Fe3O4磁性納米粒子中加入20μL的待測上清液，加入1μL、5mg/mL慶大霉素抗體，再加入1μL羊抗兔二抗，孵育2小時后，稀釋到體積為250μL，加入到微孔板中，測磁共振，以橫向馳豫時間T2與繪制的T2～C慶大霉素濃度標準曲線對照，求出樣品中慶大霉素的濃度。全文摘要一種臨床磁共振成像檢測慶大霉素的方法，屬于免疫檢測
技術領域：
。本發明將慶大霉素修飾磁性納米粒子，慶大霉素標準或待測上清液，慶大霉素抗體，羊抗兔二抗，抗體與慶大霉素修飾磁性納米粒子免疫聚合物的形成，由此產生磁共振信號，進行磁共振檢測。磁共振信號檢測是利用抗體與慶大霉素修飾磁性納米粒子形成免疫聚合物，有效的縮短水中質子橫向馳豫時間T₂值而產生信號。通常樣品中慶大霉素濃度越大，被抗體捕獲的慶大霉素量越多，則與磁性納米粒子表面的慶大霉素結合的抗體越少，測得的T₂數值越大。本法不需復雜的樣品前處理；操作簡便，只需加待測樣品孵育后直接測定T₂值，一步就可完成；用于標記超順磁性納米粒子的粒徑約為10nm，水溶性高，分散性穩定性好。文檔編號G01N24/00GK101566592SQ20091002706公開日2009年10月28日申請日期2009年5月26日優先權日2009年5月26日發明者彭池方,徐麗廣,李灼坤,胥傳來,偉陳,偉馬申請人:江南大學