專利名稱：一種魏氏梭菌病及其致病菌型的檢測試紙的制作方法
技術領域：
本發明涉及了一種魏氏梭菌病及其致病菌型的金膠檢測試紙，具體講是一種能快速檢測樣品中魏氏梭菌α毒素及能鑒定魏氏梭菌病致病菌型的試紙，可應用于獸醫臨床、畜牧養殖、食品安全、公共衛生、水質監測及相關領域。
背景技術：
魏氏梭菌(Clostridi umWelchii)，又稱產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridiumperfringens)，廣泛分布于自然界，屬典型的條件致病菌，也是動物腸道正常菌群的成員之一。它能引起各種動物壞死性腸炎、腸毒血癥、人畜創傷性壞疽以及人類食物中毒，是近年來我國家畜“猝死癥”的主要病原菌之一，對畜牧養殖業和人類健康構成嚴重危害。魏氏梭菌能產生多種外毒素，其中α、β、ε和ι是主要的致死毒素。依據主要致死性毒素與其抗毒素的中和試驗可將魏氏梭菌分為A、B、C、D和E 5個型。各型菌均能產生的α毒素是第一個被發現既有酶活性又有毒素特性的細菌蛋白，被認為是最基本、最重要的致病因子。
目前，魏氏梭菌檢測采用的技術方法有魏氏梭菌的分離鑒定、對流免疫電泳、PCR、復合PCR、M-PCR、DNA芯片、ELISA、IHA、SPA-ELISA以及Dot-ELISA等。其中，魏氏梭菌的分離鑒定和對流免疫電泳采用傳統的生化鑒定、動物感染試驗，其方法繁瑣耗時、靈敏度低，與臨床的快速和準確診斷要求相去甚遠；而PCR、復合PCR、M-PCR、DNA芯片、ELISA等方法的樣品處理過程復雜，需要在有設備條件的實驗室進行，并要求有熟練掌握分子生物學實驗操作技能的實驗人員，且成本較高。IHA、SPA-ELISA及Dot-EL ISA僅用于檢測抗魏氏梭菌毒素抗體，不能檢測毒素，在魏氏梭菌病，特別是魏氏梭菌所引起的“猝死癥”中，動物機體往往來不及產生相應的抗體就已經死亡。現有免疫學診斷基于多價抗魏氏梭菌抗血清中和反應檢測，這種方法耗時、靈敏度低，無法鑒定到亞型。
膠體金免疫層析技術作為一種快速臨床診斷技術，其特點是單分檢測，方便快捷，除商品試劑外無需任何儀器設備，幾分鐘即可肉眼觀察結果，且保質期長。然而到目前為止，國內外尚無基于膠體金層析法的魏氏梭菌病診斷檢測試紙，包括文獻報道和發明專利。本發明能同時完成魏氏梭菌病的早期診斷和致病菌的亞型鑒定，可應用于農村養殖戶、基層養殖場、獸醫臨床等現場。
發明內容
本發明的目的在于提供一種能夠克服現有技術的不足，方便及時地檢測魏氏梭菌病及其致病菌型的金膠檢測試紙。
本發明提供的魏氏梭菌病及其致病菌型的金膠檢測試紙，其α、A、B、C、D及E條帶的金標墊由玻璃纖維素膜組成，α、A、B、C、D及E條帶的反應膜由硝酸纖維素膜構成，其上分別具有檢測帶(T帶)和質控帶(C帶)。將加樣膜、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜和吸水紙依次貼在塑料底板上分別制成α、A、B、C、D及E共6條試紙條帶，其中，α條帶含抗魏氏梭菌α毒素單抗1和抗魏氏梭菌α毒素不同表位的單抗2，A條帶含抗A型魏氏梭菌單抗1和抗A型魏氏梭菌不同表位的單抗2，B條帶含抗B型魏氏梭菌單抗1和抗B型魏氏梭菌不同表位的單抗2，C條帶含抗C型魏氏梭菌單抗1和抗C魏氏梭菌不同表位的單抗2，D條帶含抗D型魏氏梭菌單抗1和抗D魏氏梭菌不同表位的單抗2，E條帶含抗E型魏氏梭菌單抗1和抗E型魏氏梭菌不同表位的單抗2。各條帶質控帶包被抗鼠IgG。
裝配時可以為α條帶單獨使用，也可以將α條帶同A條帶、B條帶、C條帶、D條帶、E條帶任意一條帶或幾條帶組合使用。
本發明的魏氏梭菌病及其致病菌型的聯檢金膠試紙具有以下優點(1)在魏氏梭菌病，特別是魏氏梭菌所引起的“猝死癥”中，動物機體往往來不及產生相應的抗體就已經死亡。而本發明是基于魏氏梭菌α毒素的檢測，一旦魏氏梭菌產生異常就會分泌α毒素，從而能實現對魏氏梭菌病的早期診斷，對魏氏梭菌病的流行病學及臨床都有重要意義；(2)在知道畜禽患病后，為了防止魏氏梭菌病進一步傳染和進行流行病學研究，從而為該病的預防及臨床診斷與治療提供可靠的依據。需要知道魏氏梭菌病的致病菌型，而本發明即可滿足這一要求；(3)準確靈敏，特異性好，結果受外因影響較少，免疫膠體金快速診斷方法并不因為其快速而犧牲了它的靈敏準確性。此外，由于膠體金標記蛋白質是一物理結合過程，結合牢固，很少引起蛋白質活性改變，所以試劑非常穩定，不受溫度等外界因素影響，可應用于農村養殖戶、基層養殖場、獸醫臨床等現場，實驗結果也可長期保存；(4)在實地即可應用，不需要在有設備條件的實驗室內進行，對操作人員要求不高，按說明書操作即可，并可隨時檢測待檢樣品。因為沒有諸如放射性同位素、鄰苯二胺等有害物質參與，所以也不會污染環境，具有放射性同位素或酶標等檢測方法所無法比擬的安全性；
(5)迅速快捷，結果客觀，肉眼易于判斷，可在幾分鐘之內得出結果；成本低廉，樣品不需要特殊處理，所需試劑和樣本量少。
四
圖1，魏氏梭菌病及其致病菌型檢測試紙結構正面示意圖。
1吸水紙；2金標墊；3金標線(結合的單克隆抗體1為抗魏氏梭菌α毒素的單抗，也可以為抗A型魏氏梭菌單抗，也可以為抗B型魏氏梭菌單抗，也可以為抗C魏氏梭菌單抗，也可以為抗D魏氏梭菌單抗，也可以是抗E型魏氏梭菌單抗)；4檢測帶(結合的單克隆抗體2為抗魏氏梭菌α毒素不同表位的單抗，也可以為抗A型魏氏梭菌不同表位的單抗，也可以為抗B型魏氏梭菌不同表位的單抗，也可以為抗C魏氏梭菌不同表位的單抗，也可以為抗D魏氏梭菌不同表位的單抗，也可以是抗E型魏氏梭菌不同表位的單抗)；5反應膜；6質控帶(結合抗鼠IgG)；7加樣膜。
五具體實施例方式
實施例(一)抗原的提取抗原魏氏梭菌α毒素的提取經過粗提和精提兩個階段。
粗提將A型魏氏梭菌菌株接種于半固體皰肉培養基，37℃培養10h后，按0.5％接種于半固體皰肉培養基中，37℃培養6h，用EKS濾板除菌濾過，濾液為粗制α毒素。
精提粗制α毒素(培養濾液)用70％飽和硫酸銨鹽析30min，10000rpm離心15min后，棄上清；沉淀加等量生理鹽水溶液懸浮，經20％飽和硫酸銨鹽析30min，10000rpm離心15min，上清再經60％飽和硫酸銨鹽析30min，10000rpm離心15min，棄上清；沉淀加適量生理鹽水溶液懸浮，再加15％丙酮(-20℃)，于4℃攪拌2h，1000rpm離心20min，上清再加60％丙酮于4℃攪拌30min，10000rpm離心15min，棄上清；沉淀加適量生理鹽水溶液懸浮，然后加35％丙酮于4℃攪拌2h，10000rpm離心15min，上清再加60％丙酮于4℃靜置30min，10000rpm離心15min，沉淀加適量生理鹽水溶液懸浮，然后用生理鹽水溶液透析；透析好的樣品過HW-55凝膠柱，用0.01molpH7.1的硼酸緩沖液(含0.03molCaCl2)平衡并洗脫，按每管5ml收集，再次離心，條件同上，最后將沉淀懸浮1ml的NaCI溶液中，-20℃保存備用。
抗原A、B、C、D及E型魏氏梭菌菌體蛋白的提取過程為，無菌接種環刮取凍存的魏氏棱菌菌種，劃線接種于固體培養基上，37℃厭氧條件下培養過夜。挑取單個菌落，接種于100ml厭氧肉湯培養基中。37℃200rpm振蕩培養18小時后。將細菌培養物轉移到無菌的離心管中。4℃以12000rpm離心20分鐘。取沉淀用0.25MNaCI洗滌兩次，再次離心，條件同上，最后將菌體懸浮于1ml的NaCI溶液中，-20℃保存備用。
實施例(二)分泌單抗的雜交瘤細胞的獲取分泌魏氏梭菌α毒素單抗的雜交瘤細胞的獲取過程如下1.小鼠的免疫(1)初次免疫將0.5ml抗原魏氏梭菌α毒素(含50μg)與等量完全福氏佐劑混合充分攪拌使混合液呈乳化狀態，取8～10周齡雌性BALB/c小鼠，進行腹股溝腋下四點免疫，每只0.2ml；(2)再次免疫3周后抗原魏氏梭菌α毒素濃度不變，改用福氏不完全佐劑，依步驟(1)進行免疫；(3)加強免疫間隔3周后以水劑抗原100μg/ml，每只0.2ml，對小鼠進行腹腔注射；(4)末次免疫在融合前三天，再加強免疫一次，同步驟(3)，免疫后經小鼠眼眶內取血，以間接ELISA法測定血清中相應抗體，達到預定效價1∶3200以上，復合要求的小鼠可用于融合。
2.細胞的融合飼養細胞的制備用頸椎脫臼法處死小鼠1只；將小鼠浸泡在75％乙醇內5min消毒，用10ml注射器吸取無血清的PRMI-1640基礎培養液8ml；將小鼠移入超凈工作臺內，以仰躺于臺面上，用眼科剪剪開腹部皮膚并拉開，用酒精棉球對腹膜進行消毒；將注射器內的培養液全部注入腹腔，并用棉球輕揉腹腔1～2min；收集腹腔內的細胞懸液移入10ml離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，此沉淀即為收集到的小鼠腹腔巨噬細胞；同時對腹腔內的細胞懸液進行細胞計數，總數應在4×106以上；將小鼠腹腔巨噬細胞重懸于HAT培養液，調整細胞濃度在2×105個/ml左右；最后將細胞懸液按每孔0.1ml的量加入到96孔培養板的各個孔中。
小鼠免疫脾細胞的制備用頸椎脫臼法處死經檢測效價最高的小鼠，無菌條件下剪開小鼠腹腔，取出脾臟；將脾臟放入盛在平皿內的不銹鋼篩網中，剔除脂肪和結締組織；用2支注射器針頭撕開脾包膜，使細胞釋放進入含20ml PRMI-1640基礎培養液的平皿內；吸出平皿內的脾細胞懸液到50ml的離心管中，1000rpm離心5min沉淀細胞，棄上清；用4℃的0.91％NH4Cl溶液5ml混懸沉淀的細胞，置細胞懸液于冰浴條件下5min，破壞從脾臟中釋出的紅細胞；加入PRMI-1640基礎培養液15ml終止NH4Cl的作用；將脾淋巴細胞以1000rpm離心5min，棄上清，再加入10ml基礎培養液重新懸浮沉淀的脾淋巴細胞，此即為待融合的脾淋巴細胞，取樣進行脾淋巴細胞計數。
SP2/O骨髓瘤細胞的收集為了防止HGPRT缺陷的回復突變，將SP2/O骨髓瘤細胞以每20代的間隔用8-雜氮鳥嘌呤(8-AG，15～20ug/ml培養基)處理，連續培養7天，除去含HGPRT的骨髓瘤細胞。融合前，收集進入對數生長期的SP2/O骨髓瘤細胞6～8瓶，將SP2/O細胞懸液在室溫下以1000rpm離心5min，棄上清液；用PRMI-1640基礎培養液20ml將沉淀的細胞洗2次，再用5ml PRMI-1640基礎培養液重新懸浮后計數細胞，備用。
融合操作將所收集的脾淋巴細胞懸液與待融合的SP2/O骨髓瘤細胞懸液按1∶1～10∶1的比例混合，室溫下以1000rpm離心min，棄上清液；用無菌濾紙吸干離心管內的殘余液體；用吸管在1min內逐滴緩慢加入37℃預溫的50％的PEG2000 0.4ml，與沉淀的細胞混合均勻；立即將細胞懸液吸入毛細管內，靜置30秒鐘，再緩慢將細胞懸液吹入離心管，慢慢加入8～10mlPRMI-1640基礎培養液，邊加邊輕輕攪動；將終止反應后的細胞懸液以1000rpm離心5min，棄上清液，留下細胞；最后，按每2×107個脾淋巴細胞加入10ml HAT培養液的比例，加入HAT培養液重新懸浮已沉淀的融合細胞，接種于鋪有飼養細胞的96孔培養板中，每孔0.1ml，放入CO2培養箱，在37℃，5％CO2和飽和濕度下培養。
3.融合細胞的選擇性培養將以HAT培養液重新懸浮的融合細胞按每孔0.1ml的量，加到前述的預先準備好的含飼養細胞的96孔培養板中；將接種了融合細胞的96孔培養板置37℃、5％CO2、飽和濕度的培養箱中培養；融合后一周左右用新配的HAT培養液置換孔內的1/2培養液(每孔約0.1ml)，12天左右改用HT培養液。
4.雜交瘤細胞的篩選融合3天后，逐日鏡檢。待培養孔中細胞集落達1/3視野以上時開始初篩。以間接ELISA法檢測克隆板培養液上清，同時以稀釋的正常小鼠血清(1∶500)作陰性對照。以稀釋的免疫小鼠血清(1∶500)為陽性對照。首先，吸取雜交瘤培養上清2滴，加入預先包被抗原魏氏梭菌α毒素的酶標板中，用封板膜封好，37℃溫育30min，洗滌板孔3次；再加入稀釋好的HRP標記羊抗小鼠IgG，50μl/孔，用封板膜封好，37℃15min，洗滌板孔3次；最后，加入底物使用液100μl，用封板膜封好，37℃溫育10min。終止液終止反應。在酶標儀上測OD值。以OD值高于陰性對照2倍以上的為陽性孔。
5.雜交瘤細胞的克隆培養本實驗采用有限稀釋法(1)在已檢測過的96孔培養板內將待克隆的孔做好標記；
(2)用吸管吹打孔內的細胞使其散開，從孔內吸出0.1ml細胞懸液到1ml雜交細胞培養液中計數；(3)初次克隆時用HT培養液調整雜交瘤細胞密度到3～10個/ml。每塊96孔培養板為10ml(第二次或第三次克隆可改用雜交細胞培養液)；(4)將調好預定密度的細胞懸液加到含飼養細胞的96孔培養板，每個孔加0.1ml；(5)將96孔培養板置37℃、5％CO2、飽和濕度的培養箱中培養(6)第4天用新培養液置換孔內1/2上清液；(7)第7天至第9天，當孔底細胞集落在1～2mm大小時，吸出雜交瘤細胞生長孔的上清液。按抗體篩選方法檢測上清液中的抗體。計算雜交瘤細胞的陽性孔比率(陽性孔數/雜交細胞生長孔數×100％)；(8)將抗體陽性的孔內細胞移到24孔培養板擴大培養2～4d；(9)按步驟(1)～(7)，將擴大培養后的陽性細胞再重復克隆2～3次，直到雜交瘤細胞的陽性孔率達到100％為止。孔內的細胞即為克隆化后的雜交瘤細胞；(10)將克隆化后的雜交瘤細胞擴大培養后，以1000rpm離心5min。收集上清液作單抗鑒定，凍存沉淀的細胞備用；本發明涉及的分泌A、B、C、D及E型魏氏梭菌單抗的雜交瘤細胞的獲取過程同上。
實施例(三)單抗的制備和純化魏氏梭菌α毒素單抗的制備和純化過程如下1.鼠腹水的誘導和制備用雜交瘤細胞誘生的小鼠腹水中，抗體的濃度比培養上清液高1000倍以上。
(1)取BALB/c小鼠2～3只，經腹腔注入無菌石蠟油，每只小鼠0.2ml；(2)1周后，將對數期生長的雜交瘤細胞以1000rpm離心5min，棄上清液；(3)細胞計數，調節細胞密度至106個/ml；(4)將0.2ml細胞懸液注入已用無菌石蠟油處理l周的小鼠腹腔；(5)7～10天后，小鼠腹部增大。可以用粗針頭(12號針頭)扎入腹腔，擠壓腹部使腹水流出；(6)收集腹水，以1000rpm離心5min，上清液即為含有所需單抗的腹水。每3d可收一次腹水；直至小鼠死亡。也可以直接處死小鼠作一次性收集。
(7)從腹水中離心的細胞可以接種到用無菌石蠟油處理的其它小鼠腹腔，或凍存備用。
2.單抗的純化采用飽和硫酸銨沉淀法純化抗體，過程如下(1)將收集的腹水合并，置于4℃冰箱中沉淀脂肪等雜質，3000rpm離心10min，收集上清，測量體積；(2)加入等體積生理鹽水，于4℃下再緩慢加入等體積33％飽和硫酸銨，邊加邊攪拌；(3)置于4℃冰箱中過夜；(4)第二天離心，3000rpm離心5min，棄上清，沉淀用盡量少的PBS緩沖液重懸；(5)在4℃下用PBS緩沖液透析，每天更換2次，透析3天通過離心取上清液分裝貯存于-20℃。
本發明涉及的A、B、C、D及E型魏氏梭菌單抗的制備和純化過程同上。
實施例(四)金標單抗金標魏氏梭菌α毒素單抗過程如下1.待標記魏氏梭菌α毒素單抗溶液的制備將魏氏梭菌α毒素單抗預先在0.005mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后3500rpm 4℃離心1h，去除聚合物，沉淀用0.01的PBS緩沖液(pH8.0)稀釋至1mg/ml備用。
2.待標膠體金溶液的準備用0.1mol/L K2CO3將膠體金液的pH值調至8.2。由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板，因此，在調節pH時，采用精密pH試紙測定為宜。
3.金標魏氏梭菌α毒素單抗邊攪拌，邊向10ml濃度為1％的金膠溶液中逐滴加入2.5ml濃度為1mg/ml的魏氏梭菌α毒素單抗，10min后，加入5％的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為1％，繼續攪拌10min。制成的溶液即為膠體標記的金魏氏梭菌α毒素單抗溶液，測量體積備用。
4.金標魏氏梭菌α毒素單抗的純化將標記好的膠體金魏氏梭菌α毒素單抗用蔗糖透析，濃縮至原體積的1/10。再經1500rpm離心20min。取上清加至丙烯葡聚糖凝膠S-400層析柱純化。用0.02mol/l、pH8.2 TBS(內含1％BSA，0.05％疊氮鈉)洗脫，收集顏色峰值時的液體5ml，4℃保存備用。
本發明涉及的A、B、C、D及E型魏氏梭菌單抗的膠體金標記的過程同上。
實施例(五)金膠試紙α條帶的制備及裝配將6×3mm的玻璃纖維素膜放入含質量百分比濃度為1％BSA、質量百分比濃度為1％Tween-20的PBS緩沖液中浸泡30min，37℃干燥箱干燥，再將其浸泡于金標魏氏梭菌α毒素單抗1溶液中，自然干燥；用1mol/L PBS將不同表位魏氏梭菌α毒素單抗2和抗鼠IgG分別稀釋至1mol/ml，2mol/ml，在25×3mm的硝酸纖維素膜上用點膜機噴成兩條線，作為檢測帶和質控帶，37℃干燥箱干燥3h，然后選擇加封阻液作用1h，用緩沖液洗膜3次，自然干燥1h，用含質量百分比濃度為1％BSA的PBS緩沖液封閉2h，以0.01mol/LPBS緩沖液洗滌，自然干燥2h；將加樣膜、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜和吸水紙依次貼在塑料底板上，即可制得魏氏梭菌病金膠檢測α試紙條帶。
本發明涉及A、B、C、D及E條帶的制備及裝配同上。
用于檢測魏氏梭菌的金膠試紙裝配時可以為α條帶單獨裝配，也可以將α條帶同A條帶、B條帶、C條帶、D條帶、E條帶任意一條帶或幾條帶組合裝配。
權利要求
1.一種用于檢測魏氏梭菌的金膠試紙，它包括塑料底板、金標墊、加樣膜、吸水紙以及反應膜，其中反應膜上具有檢測帶(T帶)和質控帶(C帶)，其特征在于，所述金標墊由玻璃纖維素膜構成，膜上包被膠體金標記的單克隆抗體1，反應膜由硝酸纖維膜構成，膜上檢測帶包被單克隆抗體2，質控帶包被抗鼠IgG。
2.根據權利要求1所述的一種用于檢測魏氏梭菌的金膠試紙，其特征在于單克隆抗體1為抗魏氏梭菌α毒素的單抗，也可以為抗A型魏氏梭菌單抗，也可以為抗B型魏氏梭菌單抗，也可以為抗C魏氏梭菌單抗，也可以為抗D魏氏梭菌單抗，也可以是抗E型魏氏梭菌單抗。
3.根據權利要求1所述的一種用于檢測魏氏梭菌的金膠試紙，其特征在于單克隆抗體2為抗魏氏梭菌α毒素不同表位的單抗，也可以為抗A型魏氏梭菌不同表位的單抗，也可以為抗B型魏氏梭菌不同表位的單抗，也可以為抗C魏氏梭菌不同表位的單抗，也可以為抗D魏氏梭菌不同表位的單抗，也可以是抗E型魏氏梭菌不同表位的單抗。
4.根據權利要求1至3所述的一種用于檢測魏氏梭菌的金膠試紙，其特征在于抗體1和2可以為以下6種組合，α條帶含抗魏氏梭菌α毒素單抗1和抗魏氏梭菌α毒素不同表位的單抗2，也可以為A條帶含抗A型魏氏梭菌單抗1和抗A型魏氏梭菌不同表位的單抗2，也可以為B條帶含抗B型魏氏梭菌單抗1和抗B型魏氏梭菌不同表位的單抗2，也可以為C條帶含抗C型魏氏梭菌單抗1和抗C魏氏梭菌不同表位的單抗2，也可以為D條帶含抗D型魏氏梭菌單抗1和抗D魏氏梭菌不同表位的單抗2，也可以是E條帶含抗E型魏氏梭菌單抗1和抗E型魏氏梭菌不同表位的單抗2。
5.根據權利要求1至3所述的一種用于檢測魏氏梭菌的金膠試紙，其特征在于裝配時可以為α條帶單獨使用，也可以將α條帶同A條帶、B條帶、C條帶、D條帶、E條帶任意一條帶或幾條帶組合使用。
6.根據權利要求1至5所述的一種魏氏梭菌或是魏氏梭菌及其致病菌型的聯檢金膠試紙，其特征在于所述的魏氏梭菌或是魏氏梭菌及其致病菌型的聯檢金膠試紙可以在下列疾病檢測中應用人食物中毒、人及動物氣性壞疽、家畜肉性腎病及猝死癥、經濟動物腸毒血癥、豬梭菌性腸炎、雞壞死性腸炎、兔魏氏梭菌病、羊猝狙、羔羊痢疾以及由各型魏氏梭菌的分型鑒定。
全文摘要
本發明提供了一種魏氏梭菌病及其致病菌型的金膠檢測試紙，該試紙可應用于獸醫臨床、畜牧養殖、食品安全、公共衛生、水質監測及相關領域。它由塑料底板、金標墊、加樣膜、吸水紙以及反應膜組成。其中，α、A、B、C、D及E條帶的金標墊由玻璃纖維素膜組成，膜上結合了膠體金標記的單抗；α、A、B、C、D及E條帶的反應膜由硝酸纖維素膜構成，其上分別具有檢測帶(T帶)和質控帶(C帶)，各檢測帶包埋有相應不同表位的單抗，各質控帶結合有多抗。本發明能單獨或同時完成魏氏梭菌病的早期診斷和各種致病菌的分型鑒定，具有操作簡單、敏感特異、攜帶方便等特點。
文檔編號G01N33/549GK1945336SQ20061020102
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月26日 優先權日2006年10月26日
發明者李紅玉, 晏磊, 何麗娟, 陳瑜, 張波, 支德娟 申請人:蘭州大學
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