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專利名稱：用內(nèi)部參考斑點減少微陣列變異的制作方法
背景技術：
以下描述提供與本發(fā)明有關的信息概述，而不是承認提供的消息或其中參考的出版物中任何一條是本發(fā)明的現(xiàn)有技術。
微陣列是以小的斑點(約1mm或更小)沉積到合適的固相支持物上的離散捕獲因子的陣列或模式。微陣列的合適固相支持物的例子是具有多個測試區(qū)的聚丙烯平板或其它的平板，平板上的測試區(qū)內(nèi)沉積斑點的陣列。試劑和大量樣品被添加到所述測試區(qū)以檢測靶配體。
使用微陣列的分析能夠以多種方法進行，包括眾所周知夾心技術。在所述夾心技術中，分析中使用靶配體，靶配體檢測器，和捕獲配體?！鞍信潴w“和“抗-配體”是能夠通過結(jié)合到其它分子形成復合物的抗原，抗體，結(jié)合蛋白，半抗原，激素受體，及其他生物分子。捕獲配體是結(jié)合到靶配體的抗配體?！鞍信潴w檢測器”是還結(jié)合到靶配體或靶配體-捕獲配體復合物的標記的抗-配體。
在夾心分析中，捕獲配體結(jié)合到靶配體上至少一個位點以形成第一復合物，從而捕獲或連接到所述靶配體。靶配體檢測器還結(jié)合到靶配體以形成第二復合物。所述夾心復合物中標記的成分能夠表明在微陣列中的特定位置存在靶配體。
微陣列可用于檢測小體積樣品中一種或多種靶配體的存在。然而，微陣列通常確定靶配體是否存在，而不定量所述靶配體。微陣列中各靶配體的定量對于許多應用而言是非常有用的或關鍵，并將改善和擴展微陣列的用處。
精確的定量在微陣列形式上的靶配體是復雜的；分析過程中任何階段的可變條件能夠影響精確性。這些變量是顯著的并減少精確性?？勺儣l件可在分析過程的一個和多個階段發(fā)生，來自1)將捕獲因子作為斑點沉積到微陣列上，2)將樣品和試劑沉積到微陣列，3)溫育樣品和試劑，和/或4)在檢測和測量對應于各靶配體的信號的過程中。添加樣品或捕獲因子到微陣列中的過程能夠?qū)е驴勺兞康睦鄯e。如果使用可見的標記來檢測靶配體，那么灰塵，不均勻的照明，調(diào)焦問題，和/或儀器問題都可引起所述標記的強度檢測和測量的易變性。溫度，濕度，溫育時間，和振動是在使用微陣列的分析中發(fā)生的其它變量。變量還能在陣列內(nèi)的不同測試區(qū)發(fā)生。所有這些因素皆影響微陣列在檢測和測量靶配體時的性能和精確性。需要考慮和校正靶配體檢測和測量中的變量的微陣列分析方法。
由于斑點是小型的，所以對應于直接地或間接地連接于各靶配體的各標記物的信號強度的檢測和定量是非常復雜的。精確鑒定各捕獲位點在各測試區(qū)域內(nèi)的位置和各靶配體在標記的復合物中對應的身份是關鍵的。微陣列，通常缺乏使用戶能容易和迅速地確定微陣列中在測的對應于各靶配體的斑點的內(nèi)部標記物或參考點。缺少內(nèi)部參考點導致使用微陣列時用戶不得不以耗時的方式定位或排列對應于微陣列中捕獲的靶配體的斑點。根據(jù)在微陣列中正在進行測試的不同靶配體的數(shù)量，能夠延遲對試驗結(jié)果的分析。
因此，存在對下列微陣列分析方法的需求其是定量的；提高微陣列分析的精確性；便于定向或?qū)R微陣列以保證點在各陣列中的準確檢測；以及無需昂貴的和耗時的方法定量捕獲的靶配體。
發(fā)明概述本發(fā)明滿足了需要。本發(fā)明提供使用內(nèi)部參考斑點以提高精確性和減少微陣列變異的系統(tǒng)。本發(fā)明的系統(tǒng)包括微陣列裝置，分析方法和形成微陣列的方法。
根據(jù)本發(fā)明，確定樣品中多個靶配體的數(shù)量的微陣列裝置包含，具有多個測試區(qū)的固相支持物；多個固定到測試區(qū)的不同靶捕獲配體；以及至少一個固定到測試區(qū)的參考捕獲配體，所述參考捕獲配體被選擇以捕獲正常情況下不存在于樣品中的參考配體。
根據(jù)本發(fā)明，確定樣品中多個靶配體的數(shù)量的微陣列裝置包含具有多個幾何形狀基本上相同的測試區(qū)的固相支持物；多個固定到測試區(qū)的不同靶捕獲配體；以及至少一個固定到測試區(qū)的參考捕獲配體，所述參考捕獲配體被選擇以捕獲正常情況下不存在于樣品中的參考配體，所述參考捕獲配體位于各測試區(qū)基本上相同的位置。
上述微陣列裝置的實施方案包括具有一種或者多種以下組件的裝置至少一個沒有參考捕獲配體的測試區(qū)；至少一個沒有靶捕獲配體的測試區(qū)；以及其中所述靶捕獲配體已經(jīng)放置到預定的陣列中。
在上述微陣列裝置的優(yōu)選實施方案包括的裝置中，靶捕獲配體和參考捕獲配體的位置在預定的陣列中，以及所述參考捕獲配體處于陣列中至少兩個空間隔開的位置。更優(yōu)選，參考捕獲配體處于陣列中至少兩個角落位置。最優(yōu)選，參考捕獲配體處于陣列中至少三個角落位置。
根據(jù)本發(fā)明，用于確定多個不同靶配體的分析法包括選擇如上所述的本發(fā)明的微陣列裝置的步驟。另一個步驟是在至少一個測試區(qū)放置(i)含有靶配體的樣品，其中至少一些靶配體被靶捕獲配體捕獲，(ii)參考配體，其中至少一些參考配體被參考捕獲配體捕獲，(iii)與捕獲的參考配體形成復合物的參考配體檢測器，和(iv)與捕獲的靶配體形成復合物的靶配體檢測器。該方法的另一個步驟是檢測復合物中參考配體檢測器和靶配體檢測器的量。
在上述分析法的實施方案中，靶捕獲配體和參考捕獲配體固定在微陣列裝置預定的陣列中，以及所述參考捕獲配體固定到陣列的至少兩個角落位置上。
根據(jù)本發(fā)明，用于確定樣品中多個靶配體的數(shù)量的微陣列形成方法，所述微陣列包括選擇具有多個幾何形狀基本上相同的測試區(qū)的固相支持物的步驟。另一個步驟是將預定陣列中的多個不同的靶捕獲配體和至少一個參考捕獲配體固定在測試區(qū)上，所述參考捕獲配體被選擇以捕獲正常情況下不存在于樣品中的參考配體。
上述微陣列形成方法的實施方案包括形成其中至少一個測試區(qū)沒有參考捕獲配體；和其中至少一個測試區(qū)沒有靶捕獲配體的微陣列。優(yōu)選，如上述微陣列形成方法，固定至少一個參考捕獲配體的步驟包括參考捕獲配體被固定到陣列的至少兩個角落位置上。最優(yōu)選，如上述微陣列形成方法，固定至少一個參考捕獲配體的步驟包括參考捕獲配體被固定到陣列的至少三個角落位置上。
附圖本發(fā)明的這些特征，方面和優(yōu)點通過以下說明書，權利要求書和附圖將變得更容易理解，其中

圖1描述了微陣列測試區(qū)內(nèi)的陣列，并鑒定陣列內(nèi)對應于內(nèi)部參考斑點和檢測斑點或靶配體斑點的位置。
圖2顯示本發(fā)明利用基于IL-8微陣列的免疫測定技術的標準化結(jié)果并校正分析過程中打印和混合差異后的變異系數(shù)(“CV”)的比較圖。
圖3是類似于圖2的圖表，本發(fā)明的IL-8微陣列分析的標準化結(jié)果，其中對不同溫育時間比如30，45，60和75分鐘的可變量進行調(diào)節(jié)。
圖4描述了使用本發(fā)明預定的柵格或模式，以沉積對應于測試區(qū)內(nèi)陣列中待捕捉的特異靶配體的特異性捕獲寡核苷酸。
具體實施例方式
以下討論描述本發(fā)明的實施方案和這些實施方案的多個變體。然而該討論不應被理解為將本發(fā)明限制至這些具體的實施方案。本領域技術人員將還識別許多其它的實施方案。
A.定義此處使用的“微陣列”是指以小斑點沉積在合適的固相支持物上測試區(qū)中離散的捕獲因子的陣列或模式。
此處使用的術語“測試區(qū)”是指對應于并且直接圍繞微陣列中的陣列的任何表面區(qū)域。例如，“測試區(qū)”包括微量培養(yǎng)板的微孔內(nèi)的表面區(qū)域或玻璃載玻片的表面區(qū)域或珠子的表面區(qū)域，其中所述斑點沉積作為陣列。
此處使用的術語“測試孔”是指微量培養(yǎng)板的孔內(nèi)的表面區(qū)域或玻璃載玻片的表面區(qū)域，其中所述斑點沉積作為不同的陣列。
此處使用的術語“捕獲因子”是指能夠在適當條件下雜交到附著于捕獲配體的互補寡核苷酸的“捕獲配體”或捕獲寡核苷酸。
此處使用的術語“捕獲配體”是指捕獲或結(jié)合到“靶配體”的任何生物分子。
此處使用的術語“捕獲寡核苷酸”指固定或附著于固相支持物上能夠結(jié)合附著于捕獲配體上的互補寡核苷酸的寡核苷酸。
此處使用的術語“互補寡核苷酸”或“與捕獲寡核苷酸互補的寡核苷酸”是指附著于捕獲配體的核苷酸序列，其在適于雜交的條件下雜交到捕獲寡核苷酸從而形成雙鏈核酸二鏈體。
此處使用的術語“生物分子”或“靶配體”或“抗-配體”包括任何有機分子，并且包括但是不局限于寡核苷酸，核酸，比如DNA和RNA，多肽，半抗原和糖類。
此處使用的術語“多肽”包括但是不局限于蛋白質(zhì)的和抗體，以及其任何片段。
此處使用的術語“半抗原”是指小分子，比如藥物，激素，以及合成的化合物，包括但不限于與使用治療性藥物和濫用藥物相關的化合物。與藥物濫用有聯(lián)系的半抗原的例子包括但是不局限于與可卡因，嗎啡，和煙堿的代謝或使用有關的化合物。治療藥物的半抗原的例子包括但是不局限于與托布拉霉素，苯巴比妥，3-二甲基嘌呤，拉諾辛和正泰霉素的利用有關的化合物。
此處使用的術語“靶配體檢測器”是指還結(jié)合到所述靶配體形成結(jié)合物的標記的抗-配體。
此處使用的術語“參考配體”是指與“靶配體”屬于相同類型的生物分子，并且用來使陣列中靶配體的微陣列分析結(jié)果標準化的“生物分子”。
此處使用的術語“參考配體檢測器”是指標記的抗-配體，其還結(jié)合到所述參考配體以形成結(jié)合物。
此處使用的術語微陣列的“定位”或“定向”或“排列”或“對齊”是指安置所述微陣列或檢測儀器以排列陣列中的各點用于檢測和測量。斑點在各測試區(qū)之內(nèi)的位置基于沉積方法而稍有變化，而小斑點位置細微變化能夠影響準確性。
此處使用的術語“校正信號”是指響應于檢出的已知量參考配體的強度，調(diào)節(jié)與靶配體有關的信號，從而改善靶配體測量的準確性。
B.本發(fā)明本發(fā)明提供方法用于定量測定微陣列中的靶配體；用于調(diào)整能夠在微陣列分析過程中產(chǎn)生的變異以改善分析的精確性；和為更準確的分析促進微陣列的定向；和容許使用相對便宜的和節(jié)省時間的程序測量捕獲的靶配體。
本發(fā)明用于比如各種靶配體或生物分子的分析的診斷程序。本發(fā)明可被用于，例如包括分析細胞因子的數(shù)量和存在，生物體中疾病狀態(tài)的存在，治療藥物的數(shù)量和存在，以及檢測造成潛在感染的核酸的測定中。
本發(fā)明使用以離散斑點沉積在合適的微陣列基材上的捕獲因子。合適的微陣列基材是任何具有適當?shù)幕瘜W性質(zhì)的表面，其中微陣列打印機或其它的裝置可用于將捕獲因子以顯微斑點沉積至基材上。微陣列基材包括但是不局限于下列表面平板狀顯微鏡載玻片；硝酸纖維素，尼龍和PVDF制成的柔性膜；以及玻璃，聚丙烯酸酯類，聚苯乙烯，聚丙烯，和聚碳酸酯制成的微孔滴定板。表面固定有捕獲因子的微陣列還可以是可商購的。例如，Pierce Chemical Co.，PO Box 117，Rockford，IL 61105銷售含有低密度捕獲因子陣列的96孔微量培養(yǎng)板(零件號碼84682至84689)。
在本發(fā)明中，以對應于用于鑒定陣列中各具體靶配體和參考配體的存在并定量的位置的指定模式將捕獲因子以小斑點沉積到微陣列基材上。對應于用于具體靶配體或參考配體的捕獲因子的模式中的各斑點或陣列中的斑點可以是空的(即，沒有捕獲因子)。參考配體在各測試區(qū)提供內(nèi)部參考斑點，其與所述靶配體的捕獲因子接受相同的條件。整個分析中，各測試區(qū)的內(nèi)部參考斑點接受影響在該測試區(qū)中靶配體的檢測和測量的相同條件，比如沉積斑點的變異性，樣品，試劑，溫度或分析程序中其它變量。
對應于柵格中具體位置的指定模式或“預定柵格”的一個實例在圖4中描繪，在該位置靶配體和參考配體被捕獲。在圖4，所述斑點對應于其中靶配體，或參考配體通過本發(fā)明的分析設法被捕獲的位置。
圖4描繪的模式中待捕獲的具體的靶配體是IL-1b(白介素1b)；IL-2(白介素2)；IL-4(白介素4)；IL-6(白介素8)；IL-8(白介素8)；IL-10(白介素10)；IL-12(白介素12)；FGFb(堿性成纖維細胞生長因子)；GM-CSF(粒細胞/單核細胞集落刺激因子)；INFg(γ干擾素)；TNFa(α腫瘤壞死因子)；VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)；和USER(被用戶選擇的靶配體或空白斑點(沒有靶配體))，通常是與上述靶配體不同的靶配體。本領域的一般技術人員將知曉對可處于測試區(qū)域的陣列中的指定模式存在各種不同的置換。
圖4中名稱REF是通常不存在于進行分析的樣品中的參考配體。在實施例1描述的實驗中，參考配體REF是TNFα，并且未使用USER靶配體(即，空白斑點)。
在本發(fā)明中，一種或者多種內(nèi)部參考斑點可被沉積到測試區(qū)域上，并且只受到該測試區(qū)域斑點數(shù)目的限制。然而，隨著在該測試區(qū)域內(nèi)部參考斑點數(shù)目增加，相應的可以檢測靶配體的斑點數(shù)目減少。
在本發(fā)明中，內(nèi)部參考斑點沉積在各測試區(qū)內(nèi)相同的位置。內(nèi)部參考斑點能夠沉積在測試區(qū)的任何位置。然而，內(nèi)部參考斑點優(yōu)選的位置位于一個或多個角上，如果角以成形的結(jié)構(gòu)存在。圖1描述了微陣列測試區(qū)內(nèi)的陣列，并鑒定測試斑點(或靶配體捕獲斑點)和參考斑點(或內(nèi)部參考配體捕獲斑點)。
在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，用于參考配體的捕獲因子沉積在各測試區(qū)相同的三個角上。將用于參考配體的捕獲因子定位在角上使得所述儀器或微陣列更容易定向或?qū)R，以對陣列中各斑點更準確的檢測。作為改善定量的參照物，參考斑點可以放置在任何地方。將所述斑點放置在4個角中的3個上給出分析軟件分散和再現(xiàn)的參考點，以放置用于鑒定和定量剩余斑點的‘映象’。借助于這些分散和可重現(xiàn)的參考點，軟件能夠被設計或修改為在不介入這部分試驗獲得數(shù)碼照片之后自動地定位和映射微陣列。
在本發(fā)明的方法中用作捕獲因子的生物分子是具有活性基團的分子，其在沉積捕獲因子到微陣列上的步驟過程中結(jié)合到合適的微陣列基材上。具有至少一個活性氨基，巰基或羥基的生物分子能夠結(jié)合到微陣列基材供本發(fā)明之用。具有至少一個活性氨基、巰基或羥基的多肽、半抗原和糖類，能夠購自Sigma，P.O.Box 14508，St.Louis MO63178。在沉積捕獲因子到微陣列上的步驟中能夠與合適的微陣列基材結(jié)合的寡核苷酸包括氨基衍生的寡核苷酸和具有至少一個游離巰基的寡核苷酸。氨基寡核苷酸能夠在3’氨基改性劑C7 CPG(購自GlenResearch，22825 Davis Drive，Sterling，佛吉尼亞20164)上按照制造商的規(guī)程使用DNA合成儀ABI 394(購自Applied Biosystems，850Lincoln Centre Drive，F(xiàn)oster City，CA 94404)合成。氨基能夠放置在寡核苷酸3′末端或5′末端。3′氨基寡核苷酸優(yōu)選用于本發(fā)明氨基寡核苷酸的制備。制備氨基衍生的寡核苷酸的方法還描述于U.S.專利號6,110,669中，其在此引入作為參考。此外，具有至少一個游離巰基的寡核苷酸能夠在購自Glen Research的支持物上按照該廠家規(guī)程合成。
斑點能夠使用各種不同的方法沉積或打印到合適的微陣列基材上。沉積斑點到微陣列上的方法對本領域技術人員而言是公知的。參見例如，美國專利號6,312,960，此處其被引作參考。舉例來說，而不是作為限制，噴墨技術和壓電微噴印刷技術已經(jīng)用于輸出小量的溶液，并且稱為在固相支持物“打印”斑點。打印生物分子到固相支持物上的一個方法描述于美國專利號6,146,833中，其在這里引作參考。另一個沉積斑點的方法是接觸印刷，其中針被浸漬到待打印分子的溶液中，并且與釋放可重現(xiàn)體積的液體的表面接觸。毛細管打印是又一個在微陣列中沉積斑點的方法。
根據(jù)作為斑點沉積到微陣列上的捕獲因子的類型，需要有效進行分析的條件能夠改變。然而，使用具體分析的條件是本領域技術人員公知的，包括而不是局限于使用比如寡核苷酸，細胞，多肽比如抗體的捕獲因子。參見例如Wang H，Wang H，Zhang W，F(xiàn)uller GN.，Tissuemicroarraysapplications in neuropathology research，diagnosis，andeducation.(組織微陣列在神經(jīng)病理學研究、診斷和教育中的應用)，Brain Pathol 2002 Jan；12(1)95-107(組織微陣列)；Mousses S，Kallioniemi A，Kauraniemi P，Elkahloun A，Kallioniemi OP.，Clinical andfunctional target validation using tissue and cell microarrays(使用組織和細胞微陣列的臨床和功能靶確認)，Curr Opin Chem Biol 2002 Feb；6(1)97-101(細胞微陣列)；Wilson DS，Nock S.，F(xiàn)unctional proteinmicroarrays(功能蛋白微陣列)，Curr Opin Chem Biol 2002Feb；6(1)81-5(總蛋白微陣列)；Schweitzer B，Kingsmore SF.，Measuring proteins onmicroarrays(在微陣列上測量蛋白)，Curr Opin Biotechnol 2002 Feb；13(1)14-9(抗體微陣列)，和Shoemaker，DD，和Linsley，PS Recentdevelopments in DNA microarrays(DNA微陣列最新進展)，Curr OpinMicrobiol 5(3)334-7，June 2002(DNA微陣列)。
當捕獲寡核苷酸作為斑點沉積到微陣列上時，分析中在一些點添加連接到互補寡核苷酸的捕獲配體。所述連接到互補寡核苷酸的捕獲配體能夠是抗原，抗體，結(jié)合蛋白，半抗原，激素受體，激素，植物血凝素，糖類，代謝物，藥物，酶底物，或病毒蛋白質(zhì)。所述寡核苷酸附著到抗原，抗體，結(jié)合蛋白，半抗原，激素受體，激素，植物血凝素，糖類，代謝物，藥物，酶底物，和病毒蛋白質(zhì)是本領域技術人員公知的技術。參見美國專利號5,648,213，此處其被引作參考。將抗體作為結(jié)合物連接于寡核苷酸上的優(yōu)選方法描述在2001年10月24日提交的序列號10,032,592，發(fā)明名稱為“蛋白質(zhì)-寡核苷酸結(jié)合物的高效合成”的專利申請中，其在這里引作參考。
在使用寡核苷酸的分析中，條件有時必須適于允許互補寡核苷酸雜交以捕獲寡核苷酸形成核酸二鏈體。利于通過寡核苷酸形成核酸復合物的條件本領域普通技術人員是公知的。(正如下列文獻所述，例如，Sambrook和Russell，分子克隆實驗室手冊，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，或Current Protocols in MolecularBiology.Frederick Ausubel編輯，John Wiley and Sons Publishing，NewYork，1987)用于本發(fā)明的捕獲和互補寡核苷酸的長度為大約15到大約45個堿基寡核苷酸。所述捕獲和互補寡核苷酸優(yōu)選分別為大約20到大約30個堿基寡核苷酸。
優(yōu)選的捕獲寡核苷酸和互補寡核苷酸對，描述于2003年4月18號提交的申請序列號10/419,020，代理人Docket No.13796，發(fā)明名稱為“用于多重結(jié)合陣列的寡核苷酸對”，在這里以其全文引作參考。所述優(yōu)選的寡核苷酸對在室溫下雜交形成核酸二鏈體，基本不具有交叉雜交。這對存在多重靶配體的分析檢測適用。根據(jù)本發(fā)明檢測多重靶配體時，這些是優(yōu)選的序列。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，沉積到微陣列上的斑點是捕獲寡核苷酸，其對于各靶配體和參考配體是不同的。所述捕獲和互補寡核苷酸從上面鑒定的寡核苷酸對中選出。
各種不同類型的可檢測標記能夠被直接地連接于捕獲的或互補的寡核苷酸并用于本發(fā)明。那些可檢測標記包括但是不局限于熒光團，放射性，化學發(fā)光，生物發(fā)光，酶，濁度，比濁，和可見的標記?？杀挥糜诒景l(fā)明的熒光團的例子包括但是不局限于羅丹明110、rhodal、熒光素、香豆精和羅丹明110、rhodal或熒光素的衍生物。花青染料比如Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7?？杀挥糜诒景l(fā)明的放射性標記的例子包括但是不局限于32P、33P、35S、3H和125I?？杀挥糜诒景l(fā)明的化學發(fā)光標記的例子包括但是不局限于吖啶酯、釕復合物、金屬絡合物、乙二酸酯-過氧化物組合。可被用于本發(fā)明的酶標記的例子包括但是不局限于堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β半乳糖苷酶?？杀挥糜诒景l(fā)明的可見標記的例子包括但是不局限于thiopeptolides、anthroquinone染料、硝基四唑藍、鄰硝基苯酚β-D-半乳糖苷-piranoside(ONPG)、膠體金和微顆粒。上面論述的相同類型的標記能用于檢測器配體。將可探測標記連接于寡核苷酸上的方法對本領域的技術人員是公知的。比如，上述的方法描述于Yang和Millar，Methods inEnzymology，Vol.278，417-444頁，1997。
所述標記的測量和檢測依賴于分析中所用標記的類型，和基于本領域技術人員公知的廠家或其它的規(guī)程。參見比如，美國專利5,316,906，其描述了形成螢光沉淀的酶底物的應用，其在這里引作參考。當分析中使用熒光團作為標記，數(shù)據(jù)能夠以整個微陣列的數(shù)碼照片的形式被采集。參考斑點和靶配體特異的斑點能夠同時在數(shù)碼照片中檢測到。
在標記檢測之時或之后，對收集自參考斑點數(shù)據(jù)使用算法以對屬于微陣列中其他斑點的數(shù)據(jù)進行標準化(normalize)或換算(scale)。雖然許多標準化算法是可能的，一個算法被用于產(chǎn)生本發(fā)明的表和實施例中顯示的數(shù)據(jù)；即，靶配體特異的信號(斑點)除以來自參考斑點數(shù)目結(jié)果的平均值。
因為參考斑點的定量基于與同一微陣列上其它斑點接受相同條件的已知量的參考配體，能夠換算來自未知濃度的靶配體的結(jié)果，和改善它們的孔與孔之間的重復性。圖2為利用本發(fā)明IL-8微陣列的標準化結(jié)果的圖，并對測定中打印過程和混合進行調(diào)整。圖2顯示出分析步驟之前打印過程和分析步驟中混合發(fā)生變化時通過此方法在1000，100，10和1pg/mL IL-8生成的信號強度的精確度的改進(即，CV的減少)。圖3是類似于圖2的圖表，本發(fā)明的IL-8微陣列分析的標準化結(jié)果，其中對不同溫育時間比如30，45，60和75分鐘的可變量進行調(diào)節(jié)。
本發(fā)明提供使用內(nèi)部參考斑點以減少微陣列變異的系統(tǒng)。本發(fā)明的系統(tǒng)包括微陣列裝置，分析方法和形成微陣列的方法。
根據(jù)本發(fā)明，確定樣品中多個靶配體的數(shù)量的微陣列裝置包含，具有多個測試區(qū)的固相支持物；多個固定到測試區(qū)的不同靶捕獲配體；以及至少一個固定到測試區(qū)的參考捕獲配體，所述參考捕獲配體被選擇以捕獲正常情況下不存在于樣品中的參考配體。
根據(jù)本發(fā)明，確定樣品中多個靶配體的數(shù)量的另一微陣列裝置包含，具有多個幾何形狀基本上相同的測試區(qū)的固相支持物；多個固定到測試區(qū)的不同靶捕獲配體；以及至少一個固定到測試區(qū)的參考捕獲配體，所述參考捕獲配體被選擇以捕獲正常情況下不存在于樣品中的參考配體，所述參考捕獲配體位于各測試區(qū)基本上相同的位置。
上述微陣列裝置的實施方案包括具有一種或者多種以下組件的裝置至少一個沒有參考捕獲配體的測試區(qū)；至少一個沒有靶捕獲配體的測試區(qū)；以及其中所述靶捕獲配體已經(jīng)放置到預定的陣列中。
在上述微陣列裝置的優(yōu)選實施方案包括的裝置中，靶捕獲配體和參考捕獲配體的位置在預定的陣列中，以及所述參考捕獲配體處于陣列中至少兩個空間隔開的位置。更優(yōu)選，參考捕獲配體處于陣列中至少兩個角落位置。最優(yōu)選，參考捕獲配體處于陣列中至少三個角落位置。
根據(jù)本發(fā)明，用于確定多個不同靶配體數(shù)量的分析法包括選擇如上所述的本發(fā)明微陣列裝置的步驟。另一個步驟是在至少一個測試區(qū)放置(i)含有靶配體的樣品，其中至少一些靶配體被靶捕獲配體捕獲，(ii)參考配體，其中至少一些參考配體被參考捕獲配體捕獲，(iii)與捕獲參考配體形成復合物的參考配體檢測器，和(iv)與捕獲的靶配體形成復合物的靶配體檢測器。該方法的另一個步驟是檢測復合物中參考配體檢測器和靶配體檢測器的量。
在上述分析法的實施方案中，靶捕獲配體和參考捕獲配體固定在微陣列裝置上的預定陣列中，以及所述參考捕獲配體固定到陣列的至少兩個角落位置上。
根據(jù)本發(fā)明，用于確定樣品中多個靶配體的數(shù)量的微陣列形成法，所述微陣列包括選擇具有多個幾何形狀基本上相同的測試區(qū)的固相支持物的步驟。另一個步驟是將預定陣列中的多個不同的靶捕獲配體和至少一個參考捕獲配體固定在測試區(qū)上，所述參考捕獲配體被選擇以捕獲正常情況下不存在于樣品中的參考配體。
上述微陣列形成法的實施方案包括形成的微陣列中，至少一個測試區(qū)沒有參考捕獲配體；和至少一個測試區(qū)沒有靶捕獲配體。優(yōu)選，如上述微陣列形成法中，固定至少一個參考捕獲配體的步驟包括參考捕獲配體被固定到陣列的至少兩個角落位置上。最優(yōu)選，在上述微陣列形成法中，固定至少一個參考捕獲配體的步驟包括參考捕獲配體被固定到陣列的至少三個角落位置上。
本發(fā)明不局限于本節(jié)描述的優(yōu)選實施例。該實施方式僅為示例性，本領域技術人員會認識到，本發(fā)明可能有許多其它的實施方式。剛才概括地描述本發(fā)明，其通過對照以下實施例將更容易理解，實施例在此作為例證而提出，并不是對本發(fā)明的限制，除非另有規(guī)定。
實施例1根據(jù)本發(fā)明使用微量培養(yǎng)板的微陣列測定的制備和分析在本實施例中，A2(A2是陣列內(nèi)陣列的縮寫)平板是用作微陣列基材的微量滴定板。A2平板市場上不能買到。A2平板是由96個測試孔組成的聚丙烯平板，由Beckman Coulter制造。預處理方法被用于A2微量滴定板表面以產(chǎn)生與寡核苷酸上的胺基反應的化學性質(zhì)，該方法描述于2001年10月24日提交的專利申請序列號10/033,308，名稱為固定生物分子，在這里全文引作參考。
含有捕獲寡核苷酸的溶液的42個斑點使用商業(yè)的非接觸陣列打印機PixSys 4200(Cartesian Technologies，Inc.17851 Sky Park CircleSuite C，Irvine，CA，92614)作為微陣列被印刷到96個測試孔的各孔中。
用于本實施例的打印溶液由20μM捕獲氨基寡核苷酸組成，所述捕獲氨基寡核苷酸通過使用10nL滴、20μM的50mM碳酸鹽+4％w/v硫酸鈉的堿性緩沖液而產(chǎn)生。捕獲寡核苷酸在低塵，高濕環(huán)境被印刷到A2平板被預處理的表面上。一旦沉積到表面上，斑點在被洗去以前溫育過夜(大約16小時)。然后平板上的剩余致活化學性質(zhì)通過將平板與過量含胺分子的溶液反應而失活。在沖洗和干燥之后，平板備用。
捕獲寡核苷酸的42個斑點在各測試孔中對應如下a.在各斑點待檢測和定量的12個不同靶配體；b.1套參考斑點；和c.1套用于除了上面指定的12個靶配體之外的靶配體的斑點，對應于圖4所示格子中用戶選定的靶配體或用戶選定的沒有捕獲靶配體的斑點(USER)。
上述各捕獲寡核苷酸被一式三份沉積到所述陣列預定的位置。因此，3×(倍)14個斑點等于陣列中總數(shù)42個斑點。三個參考斑點被沉積在角落，并提供微陣列定向和位置的信息。
對應于實施例1所用陣列中的特異靶配體，用于打印捕獲寡核苷酸的預定格子(位置)顯示于說明書之前鑒定過的圖4。在圖4，REF是指參考配體，和USER是指用戶選定的靶配體或上面描述的空位置。用于實施例1的參考配體是TNFα，USER斑點沒有捕獲靶配體。
在本實施例中，對13個不同斑點組分別沉積不同的捕獲寡核苷酸，USER斑點沒有沉積捕獲寡核苷酸。捕獲寡核苷酸選自預先鑒定的優(yōu)選序列對，并打印到微陣列基材上。各序列對的(其它的)互補寡核苷酸使用下列文獻描述的方法被結(jié)合到對應于其靶配體的抗體上2001年10月24號提交的專利申請序列號10,032,592，專利名稱為蛋白質(zhì)-寡核苷酸結(jié)合物的高效合成，其在這里預先引作參考。在適當?shù)臈l件下，所述序列對雜交形成核酸二鏈體。
雜交緩沖液Superblock緩沖液根據(jù)廠商(Pierce Biotechnology，郵政信箱117.Rockford，IL，61105)的說明制備。Superblock緩沖液與甲酰胺按Superblock∶甲酰胺＝3∶1混合。該緩沖液制備后立即使用。
方法a)在雜交緩沖液2中制備所需的單克隆-寡核苷酸結(jié)合物(分別1.4μg/mL)的混合物。所有12個分析物特異結(jié)合物加上卵清蛋白參考結(jié)合物被用于本實施例。
b)孔用洗滌緩沖液稍加沖洗，然后各孔加入70μl抗體-寡核苷酸結(jié)合物混合物。
c)平板用聚苯乙烯蓋子覆蓋并在室溫下混合1小時。
d)平板通過添加200μl洗滌緩沖液到各孔而洗滌，并混合1分鐘。通過迅速在水槽中倒置平板而除去洗滌緩沖液。所述平板放到多層紙巾上輕敲以除去剩余的緩沖液。本過程被重復兩遍，總計三次。
e)制備1∶10 SuperBlock的TBS稀釋液用于下一步。
f)35μl稀釋的SuperBlock被添加到各孔，隨后添加35μl樣品到各孔。
g)如上述步驟(c所述進行溫育。
h)如上述步驟(d進行洗滌。
i)制備所需的多克隆抗體-生物素結(jié)合物(分別0.25μg/mL)在稀釋的SuperBlock緩沖液中的混合物。
j)70μl所述多克隆抗體-生物素結(jié)合物被添加到各孔。
k)如上述步驟(c所述進行溫育。
l)如上述步驟(d進行洗滌。
m)用稀釋的SuperBlock緩沖液制備鏈親和素-PBXL 1(MartekBiosciences Corporation，哥倫比亞，MD)的稀釋液至6.7μg/mL(1mg/mL儲備溶液1∶150稀釋)。
n)70μl稀釋的鏈親和素-PBXL 1被添加到各孔。
o)如上述步驟(c所述進行溫育。
p)如上述步驟(d進行洗滌。
q)200μl洗滌緩沖液被添加到各孔，平板在暗處4℃存儲直到成像。各孔的洗滌緩沖液在成像過程中不除去以保存PBXL熒光。
用于測量熒光的儀器是Beckman Coulter A2讀板儀的試驗板形式，其尚末可商購。儀器由容納平板的自動化鏡臺，CCD攝像機(RoperCoolsnap CF)，和白光源組成。平板使用550nm激發(fā)光源照明，并用裝有675nm發(fā)射濾光片的CCD攝像機顯象以檢測用于陣列中結(jié)合的抗原的PBXL 1標記。與格子上鑒定的位置相關的抗原顯示于圖4。使用Roper Coolsnap CF對陣列拍攝數(shù)碼照片。
所得到的圖像使用上述商業(yè)軟件Imagene根據(jù)廠家說明書而定量。用來使結(jié)果標準化的公式是靶配體特異信號(斑點)除以參考斑點數(shù)目結(jié)果的平均值。
實施例2根據(jù)本發(fā)明使用微量培養(yǎng)板和生物素基團的微陣列測定的制備和分析在本實施例中，A2平板是用作微陣列基材的微量滴定板。A2平板市場上不能買到。A2平板是由96個測試孔組成的聚丙烯平板，由Beckman Coulter制造。預處理方法被用于A2微量滴定板表面以產(chǎn)生與寡核苷酸上的胺基反應的化學性質(zhì)，該方法描述于2001年10月24日提交的專利申請序列號10/033,308，名稱為固定生物分子，在這里全文引作參考。
含有捕獲寡核苷酸的溶液的42個斑點使用商業(yè)的非接觸陣列打印機PixSys 4200(Cartesian Technologies，Inc.17851 Sky Park CircleSuite C，Irvine，CA，92614)作為微陣列被印刷到96個測試孔的各孔中。
用于本實施例的打印溶液由20μM捕獲氨基寡核苷酸組成，所述捕獲氨基寡核苷酸通過使用12nL滴、20μM的堿性緩沖液而產(chǎn)生。捕獲寡核苷酸在低塵，高濕環(huán)境被印刷到A2平板被預處理的表面上。一旦沉積到表面上，斑點在被洗去以前溫育過夜(大約16小時)。平板上的剩余致活化學性質(zhì)然后通過將平板與過量含胺分子的溶液反應而失活。在沖洗和干燥之后，平板備用。
捕獲寡核苷酸的42個斑點在各測試孔中對應如下a.在各斑點待檢測和定量的12個不同靶配體；b.1套參考斑點；和c.1套用于除了上面指定的12個靶配體之外的靶配體的斑點，對應于圖4所示格子中用戶選定的靶配體或用戶選定的沒有捕獲靶配體的斑點(USER)。
上述各捕獲寡核苷酸被一式三份沉積到所述陣列預定的位置。因此，3x(倍)14個斑點等于陣列中總數(shù)42個斑點。三個參考斑點被沉積在角落，并提供微陣列定向和位置的信息。
對應于實施例1所用陣列中的特異靶配體，用于打印捕獲寡核苷酸的預定格子(位置)顯示于說明書之前鑒定過的圖4。在圖4，REF是指參考配體，和USER是指用戶選定的靶配體或上面描述的空位置。用于實施例2的參考配體是TNFa，USER斑點沒有捕獲靶配體。
在本實施例中，對13個不同斑點組分別沉積不同的捕獲寡核苷酸，包括參考斑點。捕獲寡核苷酸選自預先鑒定的優(yōu)選序列對，并打印到微陣列基材上。各序列對的互補寡核苷酸使用下列文獻描述的方法被結(jié)合到對應于其靶配體的抗體上2001年10月24號提交的專利申請序列號10/032,592，專利名稱為蛋白質(zhì)-寡核苷酸結(jié)合物的高效合成，除了與連接于微陣列上的參考斑點的序列互補的寡核苷酸之外。互補到參考斑點的序列用生物素基團在3’位置合成。在適當?shù)臈l件下，所述序列對雜交形成核酸二鏈體。
雜交緩沖液Superblock緩沖液根據(jù)廠商(Pierce Biotechnology，郵政信箱117.Rockford，IL，61105)的說明制備。Superblock緩沖液與甲酰胺按Superblock∶甲酰胺＝3∶1混合。該緩沖液制備后立即使用。
方法a)在雜交緩沖液中制備所需的單克隆-寡核苷酸結(jié)合物(分別1.4μg/mL)和20nM生物素化的參考寡核苷酸的混合物。
b)孔用洗滌緩沖液稍加沖洗，然后各孔加入70μl抗體-寡核苷酸結(jié)合物/參考生物素化寡核苷酸的混合物。
c)平板用聚苯乙烯蓋子覆蓋并在室溫下混合l小時。
d)平板通過添加200μl洗滌緩沖液到各孔而洗滌，并混合1分鐘。通過迅速在水槽中倒置平板而除去洗滌緩沖液。所述平板放到多層紙巾上輕敲以除去剩余的緩沖液。本方法被重復兩遍，總計三次。
e)制備SuperBlock的TBS 1∶10稀釋液用于下一步。
f)35μl稀釋的SuperBlock被添加到各孔，隨后添加35μl樣品到各孔。
g)如上述步驟(c所述進行溫育。
h)如上述步驟(d進行洗滌。
i)制備所需的多克隆抗體-生物素結(jié)合物(分別0.25μg/mL)在稀釋的SuperBlock緩沖液中的混合物。
j)70μl所述多克隆抗體-生物素結(jié)合物混合物被添加到各孔。
k)如上述步驟(c所述進行溫育。
l)如上述步驟(d進行洗滌。
m)用稀釋的SuperBlock緩沖液制備鏈親和素-PBXL 1(MartekBiosciences Corporation，哥倫比亞，MD)的稀釋液至6.7μg/mL(1mg/mL儲備溶液1∶150稀釋)。
n)70μl稀釋的鏈親和素-PBXL 1被添加到各孔。
o)如上述步驟(c所述進行溫育。
p)如上述步驟(d進行洗滌。
q)200μl洗滌緩沖液被添加到各孔，平板在暗處4℃存儲直到成像。各孔的洗滌緩沖液在成像過程中不除去以保存PBXL熒光。
用于測量熒光的儀器是Beckman Coulter A2讀板儀的試驗模形式，其尚末可購得。儀器由容納平板的自動化平臺，CCD攝像機(RoperCoolsnap CF)，和白光源組成。平板使用550nm激發(fā)光源照明，并用裝有675nm發(fā)射濾光片的CCD攝像機顯象以檢測用于陣列中結(jié)合的抗原的PBXL 1標記。與格子上鑒定的位置相關的抗原顯示于圖4。使用Roper Coolsnap CF對陣列拍攝數(shù)碼照片。
所得到的圖像使用上述商業(yè)軟件Imagene根據(jù)廠家說明書而定量。用來使結(jié)果標準化的公式是靶配體特異信號(斑點)除以參考斑點數(shù)目結(jié)果的平均值。
實施例3使用本發(fā)明基于抗體的測定的預期實施例由不同特異性抗體組成的微陣列能夠使用目前用于蛋白質(zhì)微陣列的技術、化學性質(zhì)和表面來制備。這些由抗體組成的微陣列隨后用于通過競爭或非競爭分析法對特異性抗原的定量。競爭分析法通過使抗原在樣品中與限制量的標記的(通常是生物素化的)抗原或抗原類似物競爭結(jié)合到特異性抗體而進行。結(jié)合到特異性抗體的標記抗原的量與樣品中抗原濃度逆相關。由針對不存在于樣品中的被分析物的抗體組成的參考斑點連同仔細控制濃度的標記參考抗原可用于提供用于微陣列內(nèi)其它分析結(jié)果的標準化的內(nèi)部參考和作為數(shù)據(jù)自動收集的一組內(nèi)部參考點。非-競爭分析法能夠通過使樣品中的抗原結(jié)合到固定化的特異性抗體而進行。過量材料能夠通過洗滌除去，之后特異性針對相同抗原性分子上的不同位點的第二抗體或抗體組能夠被添加并允許結(jié)合。這些抗體能夠直接地用熒光或酶的‘標簽’分子標記或間接地用基團(比如生物素)標記，所述基團隨后在后一步驟標記。在任一情況下，結(jié)合到所述位點的第二抗體的量與樣品中抗原的濃度成正比。參考斑點由以下組成(1)針對不存在于樣品中的被分析物的抗體可與仔細控制濃度的參考抗原連用，和(2)針對所述參考抗原上不同位點的第二參考抗原-特異性抗體以提供用于微陣列內(nèi)其它分析結(jié)果標準化的內(nèi)部參考和作為用于數(shù)據(jù)自動收集的一組內(nèi)部參考點。
實施例4使用本發(fā)明基于細胞的測定的預期實施例細胞或組織微陣列還可以通過在固體表面上分配來自特異組織的不同細胞類型或薄切片而組裝。這些微陣列的內(nèi)容然后可以通過用DNA或RNA探針的原位雜交對遺傳學意義進行研究或通過標記的抗體免疫染色對特定蛋白質(zhì)進行研究。重復微陣列的使用允許相同樣本通過各種不同探針和/或抗體進行表征。一組由標準細胞或組織制劑組成的參考斑點除提供用于定量軟件的定向標志之外，將準許被靶向的分析物的相對定量。
如此描述本發(fā)明，明顯的是可以進行許多的修改和調(diào)整而不偏離上文說明書和權利要求書描述的本發(fā)明的范圍和本意。
雖然本發(fā)明參考某些優(yōu)選的方案已經(jīng)相當詳細描述，其他的實施方案是可能的。因此，權利要求書的實質(zhì)和范圍將不會限于這里描述的優(yōu)選的實施方案。
說明書，包括權利要求，摘要，和附圖公開的所有特征，和公開的任何方法或過程中的步驟，可以任何的組合合并，除了其中至少有些上述的特征和/或步驟是相互抵觸的組合之外。說明書，包括權利要求，摘要，和附圖公開的各特征除非有相反說明，能夠被起相同，等同或相似目的的替換特征替代。因此，除非另外說明，公開的各特征僅僅是一系列等同的或相似的特征中的一個例子。
任何在權利要求中未清楚表明的用于執(zhí)行指定功能的“方法”或用于執(zhí)行指定功能的“步驟”的要素，將不會被理解為35U.S.C.§112規(guī)定的“方法”或“步驟”條款。
權利要求
1.用于檢測和定量樣品中多個靶配體的微陣列裝置，所述微陣列包含a)具有多個測試區(qū)的固相支持物；b)固定到測試區(qū)上的多個不同靶捕獲配體；和c)至少一個固定到測試區(qū)的參考捕獲配體，所述參考捕獲配體被選擇以捕獲正常情況下不存在于樣品中的參考配體，所述參考捕獲配體位于各測試區(qū)基本上相同位置。
2.權利要求1所述的微陣列裝置，其中多個測試區(qū)是多個測試孔。
3.權利要求1所述的微陣列裝置，其中多個測試區(qū)是多個具有基本上相同幾何形狀的測試孔。
4.權利要求3所述的微陣列裝置，其中至少一個測試孔沒有參考捕獲配體。
5.權利要求或3或4所述的微陣列裝置，其中至少一個測試孔不包含靶捕獲配體。
6.權利要求2或3所述的微陣列裝置，其中靶捕獲配體置于預定的陣列中。
7.權利要求3所述的微陣列裝置，其中靶捕獲配體和參考捕獲配體置于預定的陣列中，以及參考捕獲配體位于陣列中至少兩個空間分開的位置。
8.權利要求3所述的微陣列裝置，其中靶捕獲配體和參考捕獲配體置于預定的陣列中，以及參考捕獲配體位于陣列中至少兩個角落位置。
9.權利要求3所述的微陣列裝置，其中靶捕獲配體和參考捕獲配體置于預定的陣列中，以及參考捕獲配體位于陣列中至少三個角落位置。
10.確定樣品中多個不同靶配體的數(shù)量的分析法，包含以下步驟a)選擇權利要求2或3所述的微陣列；b)在至少一個測試孔放置(i)含有靶配體的樣品，其中至少一些靶配體被靶捕獲配體捕獲，(ii)通常不存在于樣品中的參考配體，其中至少一些參考配體被參考捕獲配體捕獲，(iii)與捕獲的參考配體形成復合物的參考配體檢測器，以及(iv)與捕獲的靶配體形成復合物的靶配體檢測器；和c)檢測和定量復合物中參考配體檢測器和靶配體檢測器的數(shù)量。
11.權利要求10所述的分析法，其中放置在至少一個測試孔的步驟還包含將靶捕獲配體和參考捕獲配體固定在預定的陣列中；和將參考捕獲配體固定到陣列中至少兩個角落位置上。
12.用于檢測和定量樣品中多個靶配體的微陣列的形成方法，包含以下步驟a)選擇具有多個幾何形狀基本上相同的測試孔的固相支持物；b)將預定陣列中的多個不同的靶捕獲配體和至少一個參考捕獲配體固定在測試孔上，所述參考捕獲配體被選擇以捕獲正常情況下不存在于樣品中的參考配體。
13.權利要求12所述的微陣列的形成方法，其中至少一個孔不具有參考捕獲配體。
14.權利要求12或13所述的微陣列的形成方法，其中至少一個孔不包含靶捕獲配體。
15.權利要求12所述的微陣列的形成方法，其中固定至少一個參考捕獲配體的步驟還包含將參考捕獲配體固定到陣列中至少兩個角落位置上。
16.權利要求12所述的微陣列的形成方法，其中固定至少一個參考捕獲配體的步驟還包含將參考捕獲配體固定到陣列中至少三個角落位置上。
全文摘要
本發(fā)明提供使用內(nèi)部參考斑點以減少微陣列分析變異的系統(tǒng)。用于定量樣品中多個靶配體的微陣列裝置包括具有多個測試區(qū)的固相支持物；固定到測試區(qū)上的多個不同靶捕獲配體；和至少一個固定到測試區(qū)上的參考捕獲配體。所述參考捕獲配體捕獲通常不存在于樣品中的參考配體。
文檔編號G01N33/543GK1771333SQ200480009265
公開日2006年5月10日 申請日期2004年5月14日 優(yōu)先權日2003年5月16日
發(fā)明者帕拉梅斯瓦拉·梅達·雷迪, 庫爾特·布里爾哈特, 菲爾杜斯·法歐齊, 丹尼兒·A·基斯 申請人:貝克曼考爾特公司