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專利名稱：：一種檢測心肌肌鈣蛋白i的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測用的試劑盒，尤其涉及一種利用心肌肌鈣蛋白相關(guān)的免疫反應(yīng)免疫層析顯色來診斷心肌梗塞的檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：作為危害人類生命和健康的第一殺手——心腦血管疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，每年在急診部門美國有4.5億急性心肌梗塞(AMI)癥狀的病人，有4億的病人被確定為AMI，有2.7億病人并非AMI，有約500萬病人被確診為非AMI，但其中2-3%的人真正有AMI并且由于AMI的癥狀多種多樣，合并癥多在臨床存在著相當大的誤診及漏診，有一些已經(jīng)存在的心肌損傷因為不典型的發(fā)作被醫(yī)生及患者忽視，沒有及時的進行治療出現(xiàn)了再次發(fā)作危及生命。鑒于急性心肌梗死發(fā)病急、死亡率高的特點，以及AMI的早期診斷和及時治療對于降低AMI死亡率的重要性，研制出一種靈敏度高、特異性好、臨床診斷符合率高、檢測快捷方便的急性心肌梗塞檢測試劑成為急性心肌梗塞臨床診斷的發(fā)展方向。目前我國AMI的診斷標準是臨床癥狀、心電圖異常及血清心臟酶學標志物含量測定三項中的兩項。但由于大約25。％的AMI病人發(fā)病早期沒有典型的臨床癥狀，約50%的病人心電圖無典型變化，若單獨依靠心電圖改變和臨床癥狀，AMI的診斷符合率僅為75%。血清酶肌酸激酶(CK)及其同工酶雖然具有較高的靈敏度，但心肌特異性不高、"窗口期"短(開始升高的時間較晚及持續(xù)時間較短)，易造成漏診。早期標志物——肌紅蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白、碳酸酐酶m等的聯(lián)合運用，大大有助于提高早期檢出率，但尚缺乏特異性。心肌肌鈣蛋白I(英文名稱為CardiacTroponinI,英文縮寫cTnl)和肌鈣蛋白T(cTnT)與其他的心肌梗塞血清生化學標記物相比，具有1)特異性強、靈敏度高；2)"窗口期"長的優(yōu)點。經(jīng)國際臨床化學及實驗室聯(lián)合會(IFCC)和歐洲心臟病協(xié)會(ESC)證明cTnl和cTnT在臨床診斷中，cTnl比cTnT特異性更高。其原理是cTnT與骨骼肌肌鈣蛋白有交叉反應(yīng)，且在腎臟損傷時也有無法解釋的cTnT升高。cTnl是唯一存在心肌細胞中，迄今為止診斷AMI靈敏度和特異性最高的血清生化指標，被廣泛地研究作為心肌損傷的確定性標志物，正成為當今診斷心肌梗塞(AMI)的"金標準"。文獻還表明，正常人血液中的cTnl水平在0.5ng/ml以下，發(fā)生心肌梗塞后會在4-6個小時內(nèi)會上升到0.5ng/ml以上，所以0.5ng/ml的靈敏度對心肌梗塞診斷有典型的臨床意義。現(xiàn)有的cTnl檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法和免疫熒光法。兩者的主要缺點是需要專用設(shè)備、操作復雜，檢測耗時長，需要3個小時以上，需經(jīng)嚴格訓練的專業(yè)人員完成，難以在普通病患中普及。而且在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，這些cTnl檢測試劑對樣本的測定值存在著差異，不同的cTnl分析方法對同一份標本的檢測值最大可相差30余倍。造成這一結(jié)果的主要原因是不同試劑盒采用不同cTnl抗體為原料，cTnl抗體原料質(zhì)量差異大。因此，cTnl抗體質(zhì)量的好壞決定了試劑盒質(zhì)量的優(yōu)劣。國內(nèi)現(xiàn)有類似的心肌肌鈣蛋白I檢測方法的相關(guān)專利有申請?zhí)?00310119332.3，且其提供的一步法快速測定cTnl的方法操作步驟繁雜，需采用專用設(shè)備測定cTnl的含量。申請?zhí)?00410093480.7，該專利技術(shù)缺陷是沒有提供相關(guān)的純化心肌肌鈣蛋白I制備方法，且采用雙抗夾心ELISA法檢測病人血清，該法檢測過程復雜，操作耗時，不利于對病患者爭取寶貴的診斷治療時間。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)，如酶聯(lián)免疫檢測法和發(fā)光法免疫檢測法等檢測心肌肌鈣蛋白I速度慢，操作復雜，靈敏度低的缺點，提供一種快速、方便、靈敏地不依靠專門設(shè)備的心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供上述檢測試劑盒的制備方法。本發(fā)明的一方面，提供了一種檢測心肌肌鈣蛋白I的檢測試劑盒，它包含試劑條，試劑條上含有抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體及膠體金標記的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，以及抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的二抗。較佳的，試劑條由玻璃纖維墊片、硝酸纖維素膜片、濾樣墊片和吸水墊片四部分組成。玻璃纖維墊片上包被有膠體金標記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，硝酸纖維素膜片不同的區(qū)域上分別上噴點有未標記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的二抗。制備本試劑盒的原料需要的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體是通過下述方法制備的-a)提取人心肌組織中的心肌肌鈣蛋白I粗品，經(jīng)68-C加熱處理及DEAE纖維素層析柱離子交換層析和S印hadexG75凝膠過濾層析純化而獲得心肌肌鈣蛋白I純品；b)取步驟a中所述純品用雜交瘤技術(shù)并篩選出高抗體分泌細胞株，經(jīng)分離純化制得抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體。上述步驟a)所述的純品為人心肌細胞中游離的人心肌肌鈣蛋白I，而非通過基因工程重組的心肌肌鈣蛋白I，由于原有構(gòu)象得以保護，故以人心肌肌媽蛋白I作為免疫原而獲得的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體在特異性和靈敏度方面比用重組心肌肌鈣蛋白I作為免疫原獲得的單克隆抗體要好。此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)68'C處理不僅有利于除去無關(guān)雜蛋白，且不破壞心肌肌鈣蛋白I的構(gòu)象，是之后獲得高效價、高特異性的單抗的關(guān)鍵。在本發(fā)明提供的優(yōu)選實施例中，粗品經(jīng)68'C加熱處理3分鐘，10000rpm離心30分鐘取上清，上DEAE纖維素層析柱離子交換層析處理，洗脫液為PH5.6，0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液，洗脫流速為60ml/h，洗脫3個柱體積；收集洗脫液，上S印hadexG75凝膠過濾層析柱，洗脫液為PH7.0-7.4，0.2M磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為20ml/h，收集流出液第一峰；用雜交瘤技術(shù)并篩選出高抗體分泌細胞株后，表達獲得的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，經(jīng)蛋白A-S印harose4B層析柱親和層析純化處理，洗脫液為PH7.2，0.2M磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為15ml/h，收集流出液第二峰。用SDS-PAGE法測定其純度大于95%，用ELISA法測定效價，和心肌肌鈣蛋白I反應(yīng)，效價大于1:106倍稀釋。上述步驟b)中所指的雜交瘤單克隆抗體技術(shù)優(yōu)選BALB/c小鼠脾細胞及SP2/0骨髓瘤細胞進行融合。本發(fā)明的另一方面，提供了一種檢測心肌鈣蛋白I的試劑盒的制備方法，包括以下步驟(1)用人心肌組織中的心肌肌鈣蛋白I粗品，經(jīng)68'C加熱處理，以及DEAE纖維素層析柱離子交換層析和S印hadexG75凝膠過濾層析純化而獲得心肌肌鈣蛋白I純品用雜交瘤技術(shù)制備抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體；(2)制備膠體金標記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，并用標記好的單克隆抗體包被在玻璃纖維墊片上獲得免疫膠體金墊片；(3)將心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的二抗(如羊抗鼠IgG)分別固定硝酸纖維素膜片的檢測線和質(zhì)控線上，得到免疫硝酸纖維素膜片；(4)將制得的免疫膠體金墊片、免疫硝酸纖維素膜片和濾樣墊片、吸水墊片按照吸水墊片、免疫硝酸纖維素膜片、免疫膠體金墊片、濾樣墊片的順序，粘貼組裝成試劑條(圖1);(5)將試劑條組裝入塑料卡內(nèi)，即獲得心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒。本發(fā)明的其它方面，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)得知。本發(fā)明的原理本發(fā)明是采用膠體金免疫層析技術(shù)以及雙抗體夾心法原理定性檢測人血清或血漿或全血樣本中的心肌肌f丐蛋白I(cTnl)。檢測時，樣本從試劑盒加樣孔中加入，滲透到試劑條的加樣墊片上，被檢樣本首先與試劑盒內(nèi)試劑條玻璃纖維片上的膠體金標記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體混合，并繼續(xù)往試劑條硝酸纖維素膜片流過，順序通過硝酸纖維素膜上噴點了抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的檢測線和噴點了抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體二抗(如羊抗鼠IgG)的質(zhì)控線。如果樣品中有cTnl存在，cTnl首先和標記了膠體金的抗cTnl單克隆抗體結(jié)合，形成"cTnl-抗cTnl單克隆抗體-膠體金復合物"，在層析至檢測線時，會被預(yù)先包被在檢測區(qū)域的抗cTnI單克隆抗體捕獲，形成"抗cTnI單克隆抗體-cTnI-抗cTnl單克隆抗體-膠體金"的雙抗體夾心復合物，由于復合物中膠體金呈紅色，因此在檢測線位置便顯示出一條紅色線條，為陽性結(jié)果。如果樣本中沒有cTnl，則不會在檢測線位置顯示紅色，為陰性結(jié)果。另外，通過觀察質(zhì)控線位置的紅色線條是否出現(xiàn)來判斷檢測操作是否正確，因為包被在質(zhì)控線抗cTnl二抗(如羊抗鼠IgG)總是能捕獲cTnl單克隆抗體-膠體金復合物，因此，無論樣本中有無cTnl，噴點了抗cTnl二抗(如羊抗鼠IgG)的質(zhì)控線位置總應(yīng)有紅色線條出現(xiàn)，該紅色線條的表示檢測操作正確；如果沒有紅色線條出現(xiàn)，則表示操作不正確，應(yīng)換新的試劑盒重新檢測。本發(fā)明的有益效果在于(1)本發(fā)明制備的人心肌肌鈣蛋白I是高純度人心肌細胞中游離的cTnl，將其作為抗原免疫小鼠建立的單克隆抗體細胞株能分泌高效價、高特異性的抗cTnl單克隆抗體；(2)本發(fā)明制備的抗cTnl單克隆抗體具有純度高(SDS-PAGE檢測純度〉95%)、效價高(ELISA效價至少1:106)、特異性好，可大批量制備等優(yōu)點;(3)本發(fā)明制備的心肌鈣蛋白I檢測試劑盒，具有靈敏度高，可檢出血液樣品中0.5ng/ml的cTnl，可以及早診斷心肌梗塞；特異性強，當膽固醇、血紅蛋白、甘油三酯濃度分別不高于8.0mg/ml、2.5mg/ml、2.5mg/ml時均不影響檢測結(jié)果；臨床符合率高；操作簡單；檢測結(jié)果肉眼判斷，無需特殊試驗儀器和專業(yè)技術(shù)人員；檢測快速，10-15分鐘內(nèi)顯示檢測結(jié)果；而且檢測費用低廉，儲存和運輸方便等優(yōu)點。圖1為試劑條組成結(jié)構(gòu)圖其中A區(qū)為吸水墊片;B區(qū)為硝酸纖維素膜片；E區(qū)為玻璃纖維墊片；F區(qū)為濾樣墊片；C區(qū)對應(yīng)的條帶區(qū)為質(zhì)控區(qū)即質(zhì)控線，即噴點了羊抗鼠IgG的區(qū)域，T區(qū)對應(yīng)的條帶區(qū)為檢測區(qū)即檢測線，即包被了心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的區(qū)域；C區(qū)及T區(qū)包括在B區(qū)內(nèi)。具體實施例方式本發(fā)明中術(shù)語"抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體"指用人心肌肌轉(zhuǎn)蛋白I純品采用雜交瘤技術(shù)(見Kohler等人，Nature256:495，1975:Kohler等人，Eur-J.Jmmunol.6:511，1976:Kohler等人，Eur.J.Jramunol.6:292,1976:N.Y.,1981)來制備的單克隆抗體，該單克隆抗體能與心肌肌鈣蛋白I特異性結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子。本發(fā)明中術(shù)語"抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的二抗"、"抗cTnl二抗"均指能與上述抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體特異性結(jié)合的抗體。下面結(jié)合實施例進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置，未注明來源的產(chǎn)品均可通過市場途徑獲得。實施例1心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的制備。(1)心肌肌鈣蛋白I的分離純化a)取心臟疾病死亡者心肌，加PH值為5.6，0.2M的醋酸-醋酸鈉緩沖液浸泡，經(jīng)高速攪拌機勻漿，700010000rpm離心30分鐘，3次，取上清液，于68。C加熱處理3分鐘，10000rpm離心30分鐘取上清，上DEAE纖維素層析柱離子交換層析處理，洗脫液為PH5.6，0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液，洗脫流速為60ml/h，洗脫3個柱體積；收集洗脫液，上S印hadexG75凝膠過濾層析柱，洗脫液為PH7.0-7.4，0.2M磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為20ml/h，收集流出液第一峰。b)將層析收集的純品經(jīng)SDS-PAGE測定分子量和純度，檢測分子量為29KD，純度在80%以上，用羅氏公司ELISA心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒檢測，檢測結(jié)果為陽性，證明獲得了心肌肌鈣蛋白I。(2)抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的制備c)取純化的心肌肌鈣蛋白Ilmg/ml，總量lml,經(jīng)腹腔注射免疫BALB/c小鼠。每間隔2周以同樣方法加強免疫1次，共免疫3次，末次免疫后的第4天，取免疫小鼠的脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞進行融合；d)用HAT培養(yǎng)基篩選出高抗體分泌細胞，將篩選出的細胞進行克隆，用ELISA法篩選出高分泌特異性的細胞株(即ELISA效價在1:10000以上的陽性克隆)，再行克隆化，制備特異具有穩(wěn)定滴度的大量分泌cTnl單克隆抗體的細胞株；e)將上述篩選出的雜交瘤細胞株注入BALB/c小鼠腹腔進行擴增培養(yǎng)，2一3周后收集腹水；f)腹水經(jīng)硫酸銨沉淀后，用蛋白A-S印harose4B層析柱親和層析純化，洗脫液為PH7.2，0.2M磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為15ml/h，收集流出液第二峰。用SDS-PAGE法測定其純度大于95X，用ELISA法測定效價，和心肌肌鈣蛋白I反應(yīng)，效價大于l:106倍稀釋。實施例2診斷心肌梗塞的檢測試劑盒的制備(1)膠體金的制備用檸檬酸三鈉還原氯金酸制得粒徑在4060nm的膠體金a)分別配制0.01%的HauCl水溶液和1.0%枸櫞酸三鈉水溶液；b)將0.01X的HauCl溶液1000ml置燒杯中，在電爐上加熱至沸騰。加入1.0%枸櫞酸三鈉水溶液6.5ml，邊加邊攪拌。并繼續(xù)加熱煮沸1015分鐘至溶液呈透明的紅色。冷卻至室溫，加純化水恢復至原體積。(2)膠體金標記的抗cTnl單克隆抗體的制備a)將經(jīng)實施例1獲得的抗cTnl單克隆抗體用PH7.2、0.1M磷酸鹽緩沖液稀釋至蛋白濃度為1.2mg/ml;b)將稀釋的抗cTnl單克隆抗體溶液加入到膠體金溶液中，室溫反應(yīng)10min并不時緩緩攪拌；c)加入PH7.2，0.01M磷酸鹽一0.01XBSA緩沖液純化濃縮膠體金標記的抗cTnl單克隆抗體。(3)將膠體金標記的抗cTnl單克隆抗體包被到玻璃纖維素紙片上制得免疫膠體金紙片；(4)將實施例1制得的抗cTnl單克隆抗體稀釋至2.Omg/ml，羊抗鼠IgG(為抗cTnl單克隆抗體的二抗，來源于羅氏公司)稀釋至2.5mg/ml，將兩種溶液噴點于硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線(圖l)，干燥，得到免疫硝酸纖維素膜片。(5)試劑盒的組裝將制得的免疫膠體金墊片、免疫硝酸纖維素膜片和濾樣墊片、吸水墊片按照吸水墊片、免疫硝酸纖維素膜片、免疫膠體金墊片、濾樣墊片的順序，粘貼組裝成試劑條。最后將試劑條裝配到塑料卡內(nèi)，組裝成檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒。實施例3心肌肌鈣蛋白I檢測試劑盒的臨床使用(1)取上述實施例2制得的試劑盒45份，選取20份心肌梗塞病人血樣及25份正常人血樣，一對一分別在該試劑盒加樣孔加二三滴血樣，在滴加樣品后1015分鐘內(nèi)45份試劑盒均己顯色。達到15分鐘內(nèi)顯示肉眼可見結(jié)果的預(yù)期目的。結(jié)果20份心急梗塞病人檢測結(jié)果全部為陽性，25份正常人的檢測結(jié)果全部為陰性，無未顯色的試劑盒，表明試劑盒檢測準確迅速。(2)結(jié)果判讀在滴加樣品后1015分鐘內(nèi)判讀結(jié)果。如果在檢測線和質(zhì)控線位置各出現(xiàn)一條紅色色帶，說明被檢樣品中有cTnl存在，結(jié)果為陽性。若只在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色色帶，表明樣品中無cTnl存在，結(jié)果為陰性，質(zhì)控區(qū)如不出現(xiàn)色帶則說明操作錯誤檢測結(jié)果無效，應(yīng)換新的試劑盒重新測試。實施例4檢測試劑盒靈敏度檢測取實施例2制得的檢測試劑盒，用cTnl質(zhì)控參考品，按實施例3的方式檢測，分別選取稀釋后濃度為0.1ng/ml，0.5ng/ml，1.0/ng/ml，2.5ng/ml，5.Ong/ml的系列質(zhì)控參考品按下表檢測，結(jié)果表明0.lng/ml的cTnl檢測結(jié)果為陰性，O.5ng/ml以上的cTnl檢測結(jié)果均為陽性，說明該檢測試劑盒對cTnl的檢出靈敏度為0.5ng/ml。正常人血液中的cTnl水平在0.5ng/ml以下，發(fā)生心肌梗塞后會在4-6個小時內(nèi)會上升到0.5ng/ml以上，所以0.5ng/ml的靈敏度對心肌梗塞診斷有典型的臨床意義。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例5檢測試劑盒特異性檢測取實施例2制得的檢測試劑盒，按下述表格分別加樣檢測，檢測結(jié)果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>由此可見，該試劑盒和血液中常見的物質(zhì)，如高濃度的膽紅素、膽固醇、血紅蛋白、骨骼肌肌鈣蛋白I、心肌肌鈣蛋白C、心肌肌鈣蛋白T均沒有交叉反應(yīng)，特異性好。權(quán)利要求1.一種檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒，包含試劑條，其特征在于試劑條上含有抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體及膠體金標記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體以及抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的二抗。2.如權(quán)利要求1所述的檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒，其特征在于，所述的試劑條由吸水墊片、硝酸纖維素膜片、玻璃纖維墊片、濾樣墊片四部分組成，其中玻璃纖維墊片上包被有膠體金標記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，硝酸纖維素膜片上的檢測線和質(zhì)控線分別噴點有未標記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的二抗。3.如權(quán)利要求12中任一權(quán)利要求所述的檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒，其特征在于，所述的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體是通過下述方法制備的a)提取人心肌組織中的心肌肌鈣蛋白I粗品，經(jīng)68。C加熱處理及DEAE纖維素層析柱離子交換層析和S印hadexG75凝膠過濾層析純化而獲得心肌肌鈣蛋白I純品；b)取步驟a)中所述純品用雜交瘤單克隆抗體技術(shù)篩選出高抗體分泌細胞株，制得抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體。4.如權(quán)利要求3所述的檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒，其特征在于，其中步驟a)所述的粗品為68。C加熱處理3分鐘，10000rpm離心30分鐘取上清，上DEAE纖維素層析柱離子交換層析處理，洗脫液為PH5.6，0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液，洗脫流速為60ml/h，洗脫3個柱體積；收集洗脫液，上S印hadexG75凝膠過濾層析柱，洗脫液為PH7.0-7.4，0.2M磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為20ml/h，收集流出液第一峰。5.如權(quán)利要求3所述的檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒，其特征在于，其中步驟b)所述的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，經(jīng)蛋白A-S印harose4B層析柱親和層析純化處理，洗脫液為PH7.2，0.2M磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為15ml/h，收集流出液第二峰。6.—種如權(quán)利要求1或2所述的檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒的制備方法，包括以下步驟a)用人心肌組織中的心肌肌鈣蛋白I粗品，經(jīng)68-C加熱處理，以及DEAE纖維素層析柱離子交換層析和S印hadexG75凝膠過濾層析純化而獲得心肌肌鈣蛋白I純品用雜交瘤單克隆抗體技術(shù)制備抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體;b)制備膠體金標記的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，并用標記好的單克隆抗體加至玻璃纖維墊片上獲得免疫膠體金墊片；c)將抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體和抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的二抗固定在硝酸纖維素膜片不同區(qū)域上，得到免疫硝酸纖維素膜片；d)將制得的免疫膠體金墊片、免疫硝酸纖維素膜片和濾樣墊片、吸水墊片按照吸水墊片、免疫硝酸纖維素膜片、免疫膠體金墊片、濾樣墊片的順序，粘貼組裝成試劑條；e)將試劑條組裝到塑料卡內(nèi)，形成完整的檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒。7.如權(quán)利要求6所述的檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒的制備方法，其特征在于，其中步驟a)所述的粗品純化條件為68。C加熱處理3分鐘，10000rpm離心30分鐘取上清，上DEAE纖維素層析柱離子交換層析處理，洗脫液為PH5.6，0.1M醋酸-醋酸鈉緩沖液，洗脫流速為60ml/h，洗脫3個柱體積；收集洗脫液，上S印hadexG75凝膠過濾層析柱，洗脫液為PH7.0-7.4，0.2M磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為20ml/h，收集流出液第一峰；所述的抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體，經(jīng)蛋白A-S印harose4B層析柱親和層析純化處理，洗脫液為PH7.2，0.2M磷酸鹽緩沖液，洗脫流速為15ml/h，收集流出液第二峰。全文摘要本發(fā)明涉及一種檢測心肌肌鈣蛋白I的試劑盒及其制備方法。本發(fā)明提供的試劑盒包含試劑條，試劑條上含有膠體金標記的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體及未標記的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體及抗心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體的二抗，本發(fā)明還提供了上述檢測試劑盒的制備方法。該檢測試劑盒的優(yōu)點在于可以快速、方便、靈敏地檢測人血液樣本中出現(xiàn)的心肌肌鈣蛋白I，用于診斷心肌梗塞。文檔編號G01N33/549GK101105497SQ20061002891公開日2008年1月16日申請日期2006年7月13日優(yōu)先權(quán)日2006年7月13日發(fā)明者張國華申請人:上海凱創(chuàng)生物技術(shù)有限公司