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專利名稱：禽白血病病毒j亞群診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于禽病毒檢測診斷技術領域。
ALV-J是反轉錄病毒，其前病毒基因組DNA可整合到宿主細胞，與宿主細胞長期共存；而且ALV-J病毒既可水平傳播，又可垂直傳播。故ALV-J病毒在雞體內引起持續性感染，雞體產生的抗原抗體復合物，不象正常情況很快被血液中巨噬細胞和枯否細胞等構成的免疫系統清除掉，抗原抗體復合物可在血液中循環，并可在腎、肺、皮膚、關節或血管等組織中沉積，引起炎癥，組織損傷。因此，檢測ALV-J病毒抗原抗體復合物可以反應雞體ALV-J的感染情況，是一種有效的診斷方法。
本發明的技術方案是應用群特異性單克隆抗體制備檢測ALV-JELISA試劑盒或試紙。其制備方法為應用ALV-J特異性單克隆抗體作包被抗體制備檢測ALV-J試劑盒或試紙。具體步驟為1.ALV-J病毒的分離鑒定采用雞胚成纖維細胞分離培養，并通過免疫熒光技術鑒定。
2.用PCR方法擴增ALV-J囊膜蛋白env基因，并進行克隆。
3.用昆蟲桿狀病毒表達系統表達ALV-J env基因產物。
4.以重組基因產物作為免疫源免疫BALB/C小鼠，研制特異性單克隆抗體。
5.以單克隆抗體建立獨特酶聯免疫試驗檢測試劑盒或檢測試紙。
6.檢測試劑盒或檢測試紙檢測感染雞血清、臟器及羽囊中抗原抗體復合物。
7.抗原抗體復合物陽性者判定為ALV-J感染。
本發明的效果利用該試劑盒檢或檢測試紙測血清、臟器、羽囊等樣本中ALV-J的存在情況，其特異性強、靈敏性高、檢測速度快、成本低廉。檢出率達100％，比用細胞分離鑒定病毒快6-7天，與病毒分離和PCR檢測結果的符合率大于90％。
具體實施例方式
方式1.1.抗ALV-J特異性單克隆抗體JE9包被96孔聚苯乙烯酶標板用0.02M pH9.6的碳酸鹽緩沖液將單克隆抗體稀釋為3.25ug/ml，包被96孔聚苯乙烯酶標板，每孔100ul，37℃溫浴4hr；洗液(含0.05％Tween-20的0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液)洗滌3遍。2.抗體包被孔聚苯乙烯酶標板的封閉用封閉液(含50mM甘氨酸的0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液)于37℃下封閉1hr；洗液洗滌3遍干燥后即為反應板，置4℃或-20℃備用。3.樣品處理1)血清樣品1∶40稀釋(稀釋液為0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液，即PBS。)后直接作為加樣稀釋液。
2)內臟樣品包括肝、脾、腎、胸腺等，處理如下取0.10g內臟于400ulPBS中碾磨后，10000rpm離心5min，取上清1∶10稀釋后直接作為加樣稀釋液。
3)羽囊樣品處理如下0.10g羽囊于400ul PBS中碾磨后，10000rpm離心5min，取上清1∶5稀釋后作為加樣稀釋液。4.ELISA檢測操作步驟1)將被待檢樣本加入包被有ALV-J特異性的單克隆抗體的96孔聚苯乙烯酶標板，每孔100ul，每個樣加2孔，并設陽性樣本、正常樣本和空白對照；置37℃45min后，用洗液洗滌3遍；2)每孔加酶標抗體(工作濃度)100ul；置37℃45min，用洗液洗滌5遍；3)每孔加底物顯色液100ul，室溫避光顯色30min后，每孔加100ul的終止液；4)用酶標儀測定每孔的OD490值，OD490值超過0.20，且P/N≥2.1者判為陽性，否則為陰性。方式21.抗ALV-J特異性單克隆抗體JE9包被硝酸纖維素紙片將單克隆抗體JE9作適當稀釋，直接點加硝酸纖維素紙片上；自然干燥后，洗液洗滌3遍。2.非特異性封閉將點加單克隆抗體的硝酸纖維素紙片，再以封閉液于37℃下封閉60min；洗液洗滌3遍，自然干燥后4℃保存。3.樣品處理同試驗方式14.檢測操作步驟1)將上述硝酸纖維素紙片放入待檢樣本中，置37℃30min后，用洗液洗滌3遍；2)將洗滌后的硝酸纖維素紙片放入金標記抗體溶液中；置37℃30min，用洗液洗滌5遍；3)出現條帶的為陽性，否則為陰性。附試劑配方1稀釋液磷酸鹽緩沖液PBS(pH7.2)Nacl 8gNa2HPO412H2O 2.9gKH2PO4 0.2gKcl 0.2g雙蒸水1000ml2封閉液脫脂乳10gPBS(pH7.2) 100ml3洗滌液Tween-20 0.5mlPBS(pH7.2) 999.5ml4酶標抗體使用液HRP標記的兔抗雞IgG抗體4ulPBS(pH7.2) 10ml5底物顯色液0.1M的檸檬酸(C6H6O7.H2O 10.5g，雙蒸水500ml) 4.86ml0.2M磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H2O 71.6g，雙蒸水1000ml) 5.14ml鄰苯二胺 4mgH2O3100ul6 2M的硫酸溶液98％濃H2SO421.7ml雙蒸水 178.3ml
權利要求
1.一種禽白血病病毒J亞群診斷試劑盒，其特征在于應用群特異性單克隆抗體制備檢測ALV-J ELISA試劑盒；
2.一種禽自血病病毒J亞群診斷試劑盒的制備方法，其特征在于應用ALV-J特異性單克隆抗體作包被抗體制備檢測ALV-J ELISA試劑盒；
3.一種禽白血病病毒J亞群診斷試紙，其特征在于應用群特異性單克隆抗體制備檢測ALV-J檢測試紙；
4.一種禽白血病病毒J亞群診斷試紙的制備方法，其特征在于其特征在于應用ALV-J特異性單克隆抗體作包被抗體制備檢測ALV-J檢測試紙；
5.根據權利要求1或權利要求3所述禽白血病病毒J亞群診斷試劑盒或試紙的應用，其特征在于可以檢測感染雞血清、臟器及羽囊中的ALV-J抗原。
全文摘要
本發明屬于禽病毒檢測診斷技術領域。J亞群禽白血病病毒(ALV－J)是90年代鑒定出的一個新的禽白血病病毒亞群，是肉雞髓細胞瘤(ML)的病原。本發明用PCR方法擴增出ALV－J囊膜蛋白env基因，并進行克隆，然后用昆蟲桿狀病毒表達系統表達ALV－J env基因產物，以此重組基因產物作為免疫源免疫BALB/C小鼠，研制出特異性單克隆抗體。再以單克隆抗體研制出了獨特酶聯免疫試驗檢測試劑盒，以其檢測感染雞血清、臟器及羽囊中抗原抗體復合物，判定是否感染ALV－J。
文檔編號G01N33/535GK1437023SQ0311300
公開日2003年8月20日 申請日期2003年3月20日 優先權日2003年3月20日
發明者秦愛建, 葉建強, 劉岳龍, 金文杰 申請人:揚州大學