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專利名稱：痕量二惡英的生物檢測方法
技術領域：
本發明涉及包含有核酸的檢測方法，確切的說是一種通過分子生物學方法進行的基于芳香烴受體系統的痕量二惡英的生物檢測方法。
背景技術：
二惡英(dioxins)是一類毒性很強的化合物的總稱，慢性毒性研究已經證明其具有極強的致癌性、致畸性、免疫毒性、生殖毒性、肝毒性等。因其對人類健康危害非常大，日益成為當前的一個研究熱點。二惡英類化學物質(dioxin-type chemicals，DTCs)主要包括多氯代二苯并二惡英(polychlorinated dibenzo-p-dioxins，PCDDs)，多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzo-p-furans，PCDF)和多氯聯苯(polychlorinated biphenyls，PCB)，其中只有2，3，7，8四個共平面取代位置均為氯原子的17種二惡英同族體才有毒，其中研究最多也是最典型和毒性最強的物質為2，3，7，8-四氯代二苯并二惡英(TCDD)被認為是世界上毒性最強的化合物。但由于二惡英檢測和分析費用昂貴，目前我國僅能進行少量樣品的檢測，對二惡英造成我國食品的危害程度還不完全清楚。因此，建立一種經濟、快捷的食品中二惡英檢測方法日益成為目前食品衛生檢測工作中的重點。
目前二惡英類化學物質檢測方法的研究主要集中于色譜法、免疫法和生物檢測法三大類。
盡管目前認為高分辨氣相色譜與高分辨質譜聯用技術(HRGC-HRMS)是目前唯一適合的分析方法，但由于化學分析方法所使用的儀器價格昂貴，試樣需多步分離、凈化步驟十分繁瑣，這一工作在大多數實驗室不能開展。
色譜學方法是目前國際公認的檢測二惡英類化學物質的標準方法，尤其是高效毛細管色譜加高分辨率質譜(以選擇性離子方式)。其優點可以分離混合物中的每種組分，并進行準確的定量。其缺點需要有復雜的樣品前處理過程，通常需要數天；要求有精密的儀器、良好的實驗環境和訓練有素的操作人員；需要標準品來進行定性和定量，但目前有些標準品還不具備；一般檢測一個二惡英樣品需要耗時數周至一個月，而且成本昂貴；色譜法僅能反映樣本的二惡英類化學物質總量，并不能反映其生物效應。
免疫學方法以其選擇性好、靈敏度高，在很多方面得到了應用。檢測原理為放射性碘(125I)標記的二抗與二惡英競爭性地與一抗結合，然后通過檢測沉淀物中放射性的減少來定量。雖然所需時間較短，操作相對較簡單，對檢測人員要求相對較松；檢測樣品的費用也較便宜。但利用二惡英為半抗原來免疫動物獲得多克隆抗體這種方法有其自身的缺陷，首先用二惡英同系物與血清白蛋白偶聯免疫家兔制備的抗體只能特異性識別這種特異性的抗原或某種與其結構/抗原性非常相似的物質。一方面針對不同待測物質需要制備不同的抗體，比較繁瑣不適合對二惡英污染的篩查和檢測工作；另一方面某些與其結構/抗原性相似的混雜物會對其造成假陽性的干擾。其次加之由于抗原本身對免疫宿主就有毒性，在一定程度上加大了獲得高效價抗體的難度。
生物學方法與色譜學方法比較，雖然不能檢測二惡英類化學物質的各個成分，但它簡便、快速、費用低，并且能更準確地反映二惡英類化學物質對機體的影響。但是通過檢測特異基因的表達產物來反映二惡英類化學物質的量，需要將樣本的抽提物與細胞共同培養數天，收集細胞、裂解細胞、離心收集上清用于檢測酶活性。這種檢測方法需要進行細胞培養，檢測周期比較長。雖然，細胞培養難度不大，但是極容易發生污染，為了防止污染要求有清潔度比較高的專門的細胞培養室，常常需要專門的細胞培養人員參與。
中國專利1661089A公開了一種“痕量二惡英的生物檢測方法”，其是將二惡英與芳香烴受體形成的復合物與特異性核酸序列結合并保護其免受核酸外切酶III和核酸酶S1的降解，然后利用核酸擴增技術檢測復合物結合保護的特異核酸序列，復合物結合的核酸序列與二惡英的量程比例關系。

發明內容
本發明就是為了解決現有技術中二惡英檢測和分析費用昂貴，過程復雜，耗時較長的問題，而提供一種便捷、經濟、快速的痕量二惡英的生物檢測方法。
本發明是基于芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)在二惡英的活化作用下能夠與芳香烴受體核轉運蛋白(aryl hydrocarbonreceptor translocator，ARNT)特異性結合的分子機制，利用pGEX-5X-1質粒分別克隆表達ARNT和AhR的片段AhR1的融合蛋白，并用AhR1免疫家兔，然后進行抗體純化獲得專門針對AhR的特異性抗體。將ARNT的融合蛋白與含有生物活性AhR的小鼠肝細胞勻漿提取液進行溫育結合，并在溫育結合體系中加入不同濃度的TCDD。然后采用親和吸附及免疫印漬(Western Blot)等方法來研究AhR與ARNT結合的程度與TCDD的劑量反應關系，以此為基礎來建立快速的痕量二惡英的生物檢測方法。
本發明是按以下技術方案實現的。
一種痕量二惡英的生物檢測方法a.小鼠肝組織中抽提總RNA，通過逆轉錄PCR擴增目的基因AhR、ARNT、AhR1，酶切產物純化后與pGEX-5X-1質粒進行連接，構建了含外源目的基因的重組質粒；b.制備感受態細胞及轉化重組質粒，進行融合蛋白GST-AhR、GST-ARNT、GST-AhR1的誘導表達與純化；c.將大量表達的ARNT全長融合蛋白GST-ARNT與從C57BL/6J純系小鼠中提取的富含AHR的胞漿提取液在TCDD存在的條件下溫育結合，得到二聚體復合物；d.利用Glutathione Sepharose 4B珠子對該二聚體復合物進行親和吸附，用目的蛋白GST-AhR1制備的多克隆免疫血清為一抗，通過免疫印漬方法對二聚體復合物的結合情況進行檢測。
所述痕量二惡英的生物檢測方法，其AhR全長上游引物5′-gatgagcagcggcgccaac-3′下游引物5′-ggccggctcgagtcaactctgcaccttgctta-3′下游引物加入了Xho I的酶切位點和終止密碼子TCA；ARNT全長上游引物5′-ccggccgaattcatggcggcgactacagc-3′下游引物5′-ggccggctcgagctattcggaaaagggggga-3′上游引物加入了EcoR I的酶切位點，下游引物加入了Xho I的酶切位點和終止密碼子CTA；AhR1(AhR的bHLH PAS區)下游引物5′-ggccggctcgagtcagggcagcgacgtacttc-3′下游引物加入了Xho I的酶切位點和終止密碼子TCA。
所述痕量二惡英的生物檢測方法，其取目的蛋白GST-AhR1與等體積的弗氏完全佐劑混勻，并充分乳化，免疫家兔，得到實驗所需的多克隆免疫血清。
所述痕量二惡英的生物檢測方法，其酶切產物純化后與質粒載體進行連接是將目的基因AhR、ARNT、AhR1與pGEX-5X-1質粒按3∶1的比例混合在T4 Ligase作用下室溫進行。
所述痕量二惡英的生物檢測方法，其向富含AhR的C57BL/6J小鼠肝細胞提取液中加入融合蛋白ARNT和不同濃度的TCDD樣本，于由25mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，1.2mM乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，10％丙三醇，200mM NaCl，0.1％乙基苯基聚乙二醇(NP-40)制備的pH為7.4的結合緩沖液中在20℃振蕩孵育2小時得到二聚體復合物。
本發明采用的Western Blot檢測水平為5ng，由于TCDD對AhR活化和進一步與ARNT形成復合物是以等摩爾的關系進行的，由于AhR的分子量較大(約為95KD)，為TCDD的三百倍，因此通過使用專門針對AhR的特異性抗體作為一抗所作的Western Blot檢測，其5ng水平的檢測下限反映到TCDD則相應提高三百倍，達到pg水平。
本發明具有的優點是1.本發明基于二惡英作用的芳烴受體細胞信號傳導機制，通過配基與受體、蛋白與蛋白、蛋白與特定核酸序列等生物特異性的結合實現的，因此，將顯著地提高檢測方法的選擇性和靈敏度。
2.由于環境中存在的二惡英以其混合物形式存在，而本發明可以直接對樣品中二惡英混合物的生物毒性進行綜合評價，可以直接計算出毒性當量(TEQs)。
3.芳烴受體細胞檢測方法的研究，因選用的組織提取液做為實驗中使用的芳烴受體和芳烴受體核轉位蛋白的來源，遇到困難。而利用易于保持表達蛋白生物活性的pGEX-5X-1質粒載體，在大腸桿菌中克隆表達研究所需的芳烴受體(AhR)與芳烴受體核轉位蛋白(ARNT)兩種蛋白質，可以為檢測體系中所需的蛋白質提供一個簡便穩定的來源。
因此，本發明建立的一種特異性很強的二惡英生物快速檢測方法，其快速、便捷、經濟的特征便于更廣泛的應用于食品中痕量二惡英的篩查。
本發明非常適合日常檢測與普查工作，在食品衛生監測、環境衛生監測以及職業衛生監測等領域中都有著廣泛的應用前景。


圖1是ARNT全長基因序列；圖2是AhR全長基因序列。
具體實施例方式
一.逆轉錄PCR(RT-PCR)擴增目的基因1.處死小鼠，取出肝臟、迅速置于液氮中。從液氮中取出樣品剪取組織，放入預冷的Trizol中，勻漿。向勻漿中加入氯仿，充分震蕩混勻，靜置分層。4℃，12000rpm離心15min后，將RNA所在的水相轉移到無菌的Rnase-free新管中。加入異丙醇(4℃預冷)混勻，放置30min。離心10min后，小心棄去上清，沉淀用1ml 75％的乙醇洗滌2次，重復離心。用一次性吸頭吸除殘存的乙醇。用50μlDEPC-H2O溶解沉淀，RNA溶液儲存于-70℃。
2.抽提的總RNA為模板，分別采用AhR、ARNT、AhR1引物，AhR(全長)上游引物5′-gatgagcagcggcgccaac-3′下游引物5′-ggccggctcgagtcaactctgcaccttgctta-3′下游引物加入了Xho I的酶切位點和終止密碼子TCA；ARNT(全長)上游引物5′-ccggccgaattcatggcggcgactacagc-3′下游引物5′-ggccggctcgagctattcggaaaagggggga-3′上游引物加入了EcoR I的酶切位點，下游引物加入了Xho I的酶切位點和終止密碼子CTA；AhR1(AhR的bHLH PAS區)下游引物5′-ggccggctcgagtcagggcagcgacgtacttc-3′下游引物加入了Xho I的酶切位點和終止密碼子TCA；為了保證限制性內切酶的切割效率，在內切酶位點5′端再附加六個保護性堿基利用逆轉錄酶Superscipt II，合成互補DNA(cDNA)第一鏈，反應條件42℃ 60min，70℃ 15min。③以逆轉錄生成的cDNA第一鏈為模板，借助能夠產生平末端的pfu聚合酶來進行PCR反應，93℃變性40s，58℃復性1min，72℃延伸1min，循環30次，從而使目的基因得到擴增。
二.將PCR擴增產物酶切，將酶切產物純化后與質粒載體進行連接，從而構建含外源目的基因的表達質粒1酶切在PCR產物中加入1/10體積的乙酸鈉(NaAC)溶液，混勻后加入2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀20min。離心15min，棄上清，用1ml 70％乙醇洗滌，再次離心15min。棄上清，真空干燥沉淀。加滅菌水，使之溶解。然后根據其濃度向管中加入兩種限制性內切酶，建立酶切體系(雙酶切)，37℃，酶切2h。取2μl pGEX-5X-1質粒，也加入同樣的兩種限制性內切酶，建立酶切體系(雙酶切)37℃，酶切2h。
2純化與連接將目的基因AhR、ARNT、AhR1與pGEX-5X-1質粒按3∶1的比例混合在T4 Ligase作用下室溫進行連接。
三.制備感受態細胞及轉化重組質粒
1.挑取E.Coli DH5α原菌的單克隆菌落于2ml LB培養基中，37℃過夜培養。次日將菌液稀釋到80ml新鮮的LB培養基中，續振蕩培養。將80ml菌液在冰上放置，使培養物冷卻，離心。棄上清，用冰預冷的NaCl洗滌沉淀，重懸后離心，棄上清，用冰預冷的CaCl2重懸細菌沉淀，冰上放置20min。離心棄上清，加冰預冷的CaCl2重懸細胞，即為感受態細胞。
2.感受態細胞加連接產物，輕旋混勻。42℃水浴加熱90sec后迅速轉移至冰水中冷卻。補加LB培養基，溫育45min，取含目的DNA的菌液800μl涂于AMP(50μg/ml)固體培養基平皿上，于恒溫培養箱中37℃培養12～16h。
四.融合蛋白GST-AhR、GST-ARNT、GAT-AhR1、的誘導表達與純化挑取單菌落過夜培養。次日按1∶100稀釋到新鮮的LB/AMP培養基中，37℃繼續培養。達到確定的OD600值后，加IPTG(異丙基-硫代-β-D-半乳糖苷)至終濃度0.1mM，20℃誘導3h(或37℃誘導5h)，將細菌培養物離心，棄上清用少量冰預冷的MTPBS(NaCl 150mM，Na2HPO416mM，NaH2PO44mM，調pH值至7.3)洗滌細胞，離心去除洗滌液。用MTPBS重懸細胞，加PMSF(苯甲基磺酰氟)，挑加少量溶菌酶，于液氮及37℃水浴中反復凍融。挑加DNase，使細菌裂解液的粘稠度明顯降低。加入Triton X-100，旋轉混合。離心收集上清，加入親和層析珠Glutathione Sepharose 4B(珠體積)，旋轉結合。自然沉降去上清，珠子用預冷的MTPBS洗滌。用5mM谷胱甘肽-Tris緩沖液洗親和層析珠，得到目的蛋白的融合蛋白。
五.制備多克隆免疫血清本發明采用的是中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所2002年發表在Cell Research上的一篇文章中介紹的免疫方法，該方法免疫全程通常為35天，與傳統的免疫方法(2個月左右)相比，不僅耗時比較短，而且所獲多克隆免疫血清的效價較高。選用2.5月齡、體重1.5～2.0千克的新西蘭大白兔兩只，適應性飼養一周后開始免疫。取目的蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻。用兩只塑料管連接的10ml玻璃注射器反復推吸，使蛋白液體與佐劑充分乳化。剪去家兔背部脊柱兩側的長毛，用酒精消毒。然后將乳化好的蛋白與佐劑的混合物在家兔頸后背部脊柱兩側進行皮下注射，于第一天、第三天、第28天分別免疫一次。于第35天再次耳緣靜脈取血1.5ml，通過Westen Blot檢測抗體效價。通過頸動脈放血收集抗血清。采集的免疫兔全血經37℃凝血2h后4℃過夜，次日取出，2,000～3,000rpm離心5min，將上層血清轉移至另一離心管中，56℃水浴1h以滅活補體，然后13,000rpm離心10min，此次得到的上層血清即為實驗所需的多克隆抗體，將抗體分裝，-20℃保存，待Western Blot中作為一抗使用。
六.從C57BL/6J純系小鼠肝臟中提取富含AhR的胞漿提取液成年雌、雄性小鼠用頸椎脫臼法處死，取其肝臟，用150mM冰預冷的氯化鉀溶液洗脫，于HEDG buffer(含25mM HEPES pH7.5，1mM EDTA，1MmDTT，10％(v/v)甘油)中勻漿，于4℃，10,000g離心20min，小心移取浮于上層的線粒體，在4℃下105,000g離心1小時，棄去沉淀，將上清分裝并于-80℃保存。
七.將ARNT全長融合蛋白與AhR胞漿提取液在TCDD存在的條件下溫育在C57BL/6J的AhR肝細胞提取液中加入融合蛋白ARNT和含不同濃度的TCDD(TCDD溶于二甲基亞砜，使得終濃度為0.2％二甲基亞砜)樣本，于結合緩沖液(25mM HEPES，1.2mM EDTA，10％丙三醇，200mMNaCl，0.1％NP-40，pH7.4)中在20℃振蕩孵育2小時得到二聚體復合物。
八.對兩種蛋白質的結合情況進行檢測1.向二聚體復合物中加入Glutathione Sepharose 4B珠子，4℃旋轉結合60min，用5mM谷胱甘肽-Tris緩沖液洗脫蛋白。
2.將蛋白上樣，走聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后正確安裝轉移裝置，將蛋白質轉移至硝酸纖維素濾膜上。
3.加入可以與目的蛋白特異性結合的一抗即多克隆免疫血清，反應后將未結合的一抗洗去；再加入連著一種酶標記的二抗，反應后將未結合的二抗洗去；最后加入顯色底物，二抗上連帶的酶可以將無色的底物轉變成有色物質，從而識別目標蛋白。
SEQUENCE LISTING<110>天津醫科大學<120>二惡英類物質的檢測方法<130>DNA<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2623<212>DNA<213>ARNT<220>
<221>ARNT<222>(1)..(2623)<223>
<400>1ccatctcgac catggcggcg actacagcta acccagaaat gacatcagat gtaccatcgc60tgggtcccac cattgcttct ggaaaccctg gacctgggat tcaaggtgga ggagctgttg120tacagagggc tattaagcga cggtcagggc tggattttga tgatgaagta gaagtgaaca180ctaaattttt gagatgcgat gatgaccaga tgtgtaatga caaggagcgg tttgccaggt240cggatgatga gcagagctct gcggataaag agagacttgc cagggaaaat catagtgaaa300tagaacggcg gcgacggaac aagatgacag cttacatcac agaactgtca gacatggtac360ctacatgtag tgccctggct cgaaaaccag acaagctaac catcttacgc atggccgttt420ctcacatgaa gtccttgagg ggaactggca acacatctac tgatggctcc tacaagccat480ctttcctcac tgatcaggaa ctgaaacatt tgatcttgga ggcagcagat ggctttctgt540ttattgtctc ctgtgagact ggacgggtgg tgtatgtctc tgactcagtg actcccgttt600tgaaccagcc acagtctgaa tggttcggga gcacactgta tgatcaggtg cacccagatg660atgtggataa acttcgagag cagctctcta catcagaaaa tgccctaaca gggcgggtcc720tggatctgaa gactggaaca gtgaaaaagg aaggccagca gtcttccatg aggatgtgca780tgggctcacg aaggtcgttc atctgccgca tgaggtgtgg tactagctcc gtggaccctg840tttccatgaa tagactgagc tttttgagga acagatgcag gaatgggctt ggctctgtga900aggaaggaga acctcacttt gtggtagtcc actgcacagg ctacatcaag gcctggccac960cagcaggtgt ctccctccca gatgatgacc cagaggctgg ccaggggagc aaattctgcc1020tagtggccat tggcaggctg caggtaacta gttctcccaa ctgtacagac atgagtaaca1080tttgtcagcc aacagagttc atctcccgac acaacattga agggatattc acttttgtag1140accatcgttg tgtggctact gttggctacc agccacagga gctcttaggg aagaatattg1200tagaattttg tcatcctgaa gaccaacaac ttctaagaga cagctttcag caggtggtga1260aattaaaagg tcaggtgctg tccgtcatgt tccgattccg atctaagacc cgagaatggc1320tgtggatgag aacgagctcc tttaccttcc aaaaccctta ttcagatgaa attgagtata1380ttatctgcac caacaccaat gtgaagaact ctagccagga accacggcct acactgtcca1440acaccatccc aaggtcacaa ctaggtccga cagccaattt atccctagag atgggtacag1500ggcagctgcc atccaggcag cagcagcagc agcacacaga actggatatg gtaccaggaa1560
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權利要求
1.一種痕量二惡英的生物檢測方法，其特征在于a.小鼠肝組織中抽提總RNA，通過逆轉錄PCR擴增目的基因AhR、ARNT、AhR1，酶切產物純化后與pGEX-5X-1質粒進行連接，構建了含外源目的基因的重組質粒；b.制備感受態細胞及轉化重組質粒，進行融合蛋白GST-AhR、GST-ARNT、GST-AhR1的誘導表達與純化；c.將大量表達的ARNT全長融合蛋白GST-ARNT與從C57BL/6J純系小鼠中提取的富含AHR的胞漿提取液在TCDD存在的條件下溫育結合，得到二聚體復合物；d.利用Glutathione Sepharose 4B珠子對該二聚體復合物進行親和吸附，用目的蛋白GST-AhR1制備的多克隆免疫血清為一抗，通過免疫印漬方法對二聚體復合物的結合情況進行檢測。
2.根據權利要求1所述痕量二惡英的生物檢測方法，其特征在于AhR全長上游引物 5′-gatgagcagcggcgccaac-3′下游引物 5′-ggccggctcgagtcaactctgcaccttgctta-3′下游引物加入了Xho I的酶切位點和終止密碼子TCA；ARNT全長上游引物 5′-ccggccgaattcatggcggcgactacagc-3′下游引物 5′-ggccggctcgagctattcggaaaagggggga-3′上游引物加入了EcoR I的酶切位點，下游引物加入了Xho I的酶切位點和終止密碼子CTA；AhR1下游引物 5′-ggccggctcgagtcagggcagcgacgtacttc-3′下游引物加入了Xho I的酶切位點和終止密碼子TCA。
3.根據權利要求1所述痕量二惡英的生物檢測方法，其特征在于取目的蛋白GST-AhR1與等體積的弗氏完全佐劑混勻，并充分乳化，免疫家兔，得到實驗所需的多克隆免疫血清。
4.根據權利要求1所述痕量二惡英的生物檢測方法，其特征在于酶切產物純化后與質粒載體進行連接是將目的基因AhR、ARNT、AhR1與pGEX-5X-1質粒按3∶1的比例混合在T4 Ligase作用下室溫進行。
5.根據權利要求1所述痕量二惡英的生物檢測方法，其特征在于向富含AhR的C57BL/6J小鼠肝細胞提取液中加入融合蛋白ARNT和不同濃度的TCDD樣本，于由25mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1.2mM乙二胺四乙酸二鈉，10％丙三醇，200mM NaCl，0.1％乙基苯基聚乙二醇制備的pH為7.4的結合緩沖液中在20℃振蕩孵育2小時得到二聚體復合物。
全文摘要
本發明公開了一種痕量二惡英的生物檢測方法，屬于包含有核酸的檢測方法。本發明依據芳烴受體在二惡英的活化作用下與芳烴受體核轉位蛋白特異性結合的分子機制，利用pGEX－5X－1質粒分別克隆表達ARNT和AhR的片段AhR 1的融合蛋白，并用AhR 1免疫家兔制備抗體；將融合蛋白ARNT與含有生物活性的AhR的鼠肝細胞漿提取液進行溫育結合，加入不同濃度的TCDD。采用免疫印漬等方法研究AhR與ARNT結合的程度與TCDD的劑量反應關系。本發明方法易于操作、能節省大量的經濟成本和時間成本，適合于日常檢測和普查工作，在食品衛生、環境衛生以及職業衛生檢測等領域有著廣泛的應用前景。
文檔編號G01N33/546GK101074953SQ20061001378
公開日2007年11月21日 申請日期2006年5月19日 優先權日2006年5月19日
發明者張萬起, 宓懷風, 湯乃軍, 沈鈞, 吳蘊棠, 孫忠, 王卓, 趙娜 申請人:天津醫科大學