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專利名稱：電化學(xué)檢測(cè)器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測(cè)器，尤其涉及一種用于確定載液中分析物的濃度的電化學(xué)生物檢測(cè)器。本發(fā)明尤其適用于確定血液中葡萄糖濃度，并且本文照此進(jìn)行說(shuō)明，但應(yīng)該理解，本發(fā)明也可用于其它分析物的確定。
背景技術(shù)：
電化學(xué)生物檢測(cè)器一般包括具有工作電極，反電極和參考電極的電解槽。有時(shí)反電極和參考電極的功能結(jié)合在一起而成為一個(gè)電極，稱作“反/參考”電極或“準(zhǔn)參考電極”。在這種情況下本文使用的術(shù)語(yǔ)“反電極”一般包括反/參考電極。
使含有分析物的試樣和電解槽中的含有酶和氧化還原媒劑的試劑接觸。媒劑被還原(接收至少一個(gè)電子)，同時(shí)分析物被氧化(放出至少一個(gè)電子)或反之。通常是分析物被氧化，媒劑被還原。本發(fā)明主要對(duì)這種情況進(jìn)行說(shuō)明，但也可用于分析物被還原，媒劑被氧化的系統(tǒng)。
電化學(xué)葡萄糖分析器例如由糖尿病人使用的用于監(jiān)視血糖值的或在診所或醫(yī)院使用的那些通常根據(jù)利用酶例如葡糖氧化酶脫氫酶(GOD)和氧化還原媒劑例如氰鐵酸鹽或氰亞鐵酸鹽。在這種現(xiàn)有技術(shù)的系統(tǒng)中，含有分析物(例如葡萄糖)的試樣(例如血)和電解槽內(nèi)的試劑接觸。葡萄糖被氧化成葡萄糖酸并借以使葡萄糖氧化酶還原。然后媒劑再氧化葡萄糖酸并在此過(guò)程中被還原。然后，當(dāng)還原的媒劑把電子轉(zhuǎn)移給工作電極時(shí)被再氧化。在經(jīng)過(guò)足以獲得能精確測(cè)量的法拉第電流的預(yù)定時(shí)間之后，從測(cè)得的電流或電壓信號(hào)的大小計(jì)算葡萄糖的濃度。
現(xiàn)有技術(shù)的電解槽由兩個(gè)(或三個(gè))在絕緣體的一側(cè)上被分開的并適用于和測(cè)量裝置相連的相鄰電極構(gòu)成。在電極上或電極之間限定一個(gè)用于放置血試樣的目標(biāo)區(qū)域。共同的待審申請(qǐng)PCT/AU95/00207描述了一個(gè)電解槽，其中電極被設(shè)置在多孔膜的相對(duì)側(cè)，其中一個(gè)電極具有可透液體的目標(biāo)區(qū)域。
在現(xiàn)有技術(shù)中，需要使工作電極和反電極(或反/參考電極)分開足夠的距離，以避免在一個(gè)電極上的電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物干擾另一個(gè)電極上的電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物。在實(shí)際上，為了達(dá)到可接受的精度，需要使電極分開500μm。
要求電解槽的每一批被事先標(biāo)定過(guò)，并在使用期間因?yàn)樵撆鷥?nèi)的試樣成分和環(huán)境條件的變化而導(dǎo)致測(cè)量不精確。
需要改善這種生物檢測(cè)器的精度和可利用性。在檢測(cè)器旨在用于確定血液中的分析物的濃度的情況下，實(shí)現(xiàn)這些目的是困難的，因?yàn)樵诨就该鞯拿劫|(zhì)中血液含有溶解的氣體，離子，膠體，復(fù)合膠粒，小的細(xì)胞碎片，和活的細(xì)胞成分。其中任何一個(gè)都可干擾確定的結(jié)果?，F(xiàn)有的檢測(cè)器對(duì)來(lái)自可能存在于試樣中并可在工作電極被氧化而被誤認(rèn)為是感興趣的其它干擾物質(zhì)的影響也很敏感。此外，干擾物質(zhì)可以還原氧化還原媒劑的氧化物形式。這些影響會(huì)使分析物濃度的估算偏高。此外，在分析物被加入之前，總有一些還原的氧化還原媒劑存在，其濃度需要是已知的，以便從測(cè)量的被還原的媒劑中減去，給出分析物的精確濃度。另外，在血液中的氧對(duì)于葡糖氧化酶脫氫酶(GOD)在和氰亞鐵酸鹽競(jìng)爭(zhēng)中可以作為氧化還原媒劑。這種高氧濃度可以導(dǎo)致低的葡萄糖濃度的估計(jì)值。此外，測(cè)量對(duì)于例如濕度，溫度，溶液黏度和分血器容量的變化等因素也很敏感。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分析方法和使用該方法的裝置，至少可以避免或減輕現(xiàn)有技術(shù)中的一些缺點(diǎn)。本發(fā)明的最佳形式的目的在于提供一種改進(jìn)精度，與/或可靠性，與/或速度的生物檢測(cè)器，及其使用方法。
按照一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于確定在包括工作電極和與其分開預(yù)定距離的反電極的電化學(xué)電解槽中氧化還原劑的還原(或氧化)的形式的濃度的方法，所述方法包括下述步驟(1)在電極之間施加一個(gè)電位差，(2)如此選擇工作電極的電位，使得氧化還原劑的還原形式的電氧化(或氧化形式的電還原)的速率是擴(kuò)散控制的，(3)如此選擇工作電極和反電極之間的間距，使得來(lái)自反電極的反應(yīng)產(chǎn)物到達(dá)工作電極，(4)在施加電壓之后并在達(dá)到穩(wěn)態(tài)之前確定作為時(shí)間的函數(shù)的電流，(5)計(jì)算穩(wěn)態(tài)電流的幅值，以及(6)由電流隨時(shí)間的變化和穩(wěn)態(tài)電流的幅值獲得表示氧化還原劑的還原形式(或氧化形式)的擴(kuò)散系數(shù)與/或濃度的值。
用這種方法測(cè)量的濃度基本上和還原形式的擴(kuò)散系數(shù)的變化無(wú)關(guān)，并因此而補(bǔ)償溫度和黏度的變化。這樣測(cè)量的濃度基本上和分血器的變化以及其它影響氧化還原劑的還原形式的擴(kuò)散系數(shù)的物質(zhì)無(wú)關(guān)。
應(yīng)該理解，本發(fā)明的方法同樣適用于確定氧化還原劑的還原形式的濃度，或電解槽中的氧化還原劑的氧化形式的濃度。在確定還原形式的濃度的情況下，必須如此保持工作電極的電位，使得還原形式的電氧化的速率在步驟(2)是擴(kuò)散控制的，并在步驟(5)獲得氧化還原劑的還原形式的濃度。或者，在確定氧化形式的濃度的情況下，必須如此保持工作電極的電位，使得氧化形式的電還原的速率在步驟(2)是擴(kuò)散控制的，并在步驟(5)獲得氧化還原劑的氧化形式的濃度。
氧化還原劑可以是分析物，或者是氧化還原媒劑。
在該方法的最佳實(shí)施例中，使用一種媒劑，并且該媒劑的還原形式(或氧化形式)的濃度又用于表示分析物的濃度，并確定媒劑的還原(或氧化)形式的擴(kuò)散系數(shù)的大小作為確定分析物濃度的前提。
特選的電解槽包括工作電極和反/參考電極。如果使用和反電極分開的參考電極，參考電極可以位于和檢測(cè)器中的試樣接觸的任何方便的位置。
和現(xiàn)有技術(shù)不同，當(dāng)使用本發(fā)明的方法時(shí)，電極充分靠近，使得在反電極的電化學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物在試驗(yàn)期間向工作電極遷移。例如，在酶氰鐵酸鹽系統(tǒng)中，在反電極產(chǎn)生的氰鐵酸鹽向工作電極擴(kuò)散。
這使得能夠達(dá)到電極之間的穩(wěn)態(tài)濃度分布曲線，從而導(dǎo)致穩(wěn)態(tài)電流。這又使得擴(kuò)散系數(shù)和氧化還原劑(媒質(zhì))的濃度的測(cè)量和試樣的變化無(wú)關(guān)，因此，大大改善了精度和可靠性。
該方法還使得可以利用查表(或從血漿中分離出紅細(xì)胞并測(cè)量紅細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的擴(kuò)散系數(shù))和血漿濃度并對(duì)兩者進(jìn)行比較，從擴(kuò)散系數(shù)確定血液的分血器濃度。
按照第二方面，本發(fā)明提供一種裝置，用于確定在電化學(xué)電解槽中的氧化還原劑的濃度，該裝置包括具有工作電極和反(或反/參考)電極的電化學(xué)電解槽，在所述電極之間提供電位差的裝置，用于測(cè)量電流隨時(shí)間變化的裝置，其特征在于，工作電極和反電極之間的距離小于500μm。
在最佳實(shí)施例中，電解槽具有1.5毫升或更小的有效容積。在本發(fā)明中使用的裝置可以包括多孔膜，在多孔膜一側(cè)上的工作電極，在另一側(cè)上的反/參考電極，所述電極和其間的膜區(qū)域一起限定一個(gè)電解槽，并且其中的膜從電解槽橫向延伸到和電解槽區(qū)隔開一個(gè)大于膜的厚度的距離的試樣放置區(qū)。
最好，多孔膜，目標(biāo)區(qū)和電解槽部分之間的距離，以及膜的厚度被如此結(jié)合地選擇，使得當(dāng)血液(包括血漿和紅細(xì)胞)被放在目標(biāo)區(qū)時(shí)，血漿前沿在紅細(xì)胞之前向著電化學(xué)電解槽區(qū)橫向擴(kuò)散。
這樣，便可以不用會(huì)引起氧化還原媒劑的擴(kuò)散系數(shù)變化的并如后面說(shuō)明的會(huì)影響試樣精度的分血器使一薄層血漿充滿電解槽。
在按照本發(fā)明的生物檢測(cè)器的最佳實(shí)施例中，由第二工作電極和與第二工作電極在膜的相對(duì)側(cè)的第二反/參考電極限定膜的第二電化學(xué)電解槽區(qū)。第二電化學(xué)電解槽區(qū)位于第一電解槽區(qū)和試樣放置區(qū)或“目標(biāo)區(qū)”之間，或位于遠(yuǎn)離第一電化學(xué)區(qū)的目標(biāo)區(qū)的一側(cè)上。在這些實(shí)施例中，血漿和酶在第一電化學(xué)電解槽中或在通向第一電化學(xué)電解槽的通路上相接觸，而到達(dá)第二電解槽的血漿則不和其接觸。這樣，第一電解槽用于在血漿(包括電化學(xué)干擾物質(zhì))和酶存在的情況下測(cè)量還原的媒劑的濃度，第二電化學(xué)電解槽在存在血漿(包括電化學(xué)干擾物質(zhì))和不存在酶的情況下測(cè)量還原的媒劑的濃度。這便能夠在第二電解槽中確定還原的干擾物質(zhì)的濃度，并在第一電解槽中確定還原的干擾物質(zhì)加上分析物的濃度。從一個(gè)值中減去另一個(gè)值，便給出分析物的絕對(duì)濃度。
在本發(fā)明的一個(gè)最佳實(shí)施例中，使用一個(gè)空的電解槽，其中工作電極和參考(或反/參考)電極之間的距離小于500μm，最好是20-200μm。
本發(fā)明提供一種電化學(xué)檢測(cè)器，該電化學(xué)檢測(cè)器包括多孔膜，在膜的一側(cè)上的工作電極，在膜的另一側(cè)上的反電極，所述電極和其間的膜的區(qū)域限定一個(gè)第一電化學(xué)電解槽，其中膜從第一電化學(xué)電解槽向和第一電化學(xué)電解槽區(qū)隔開一個(gè)大于膜的厚度的距離的試樣放置區(qū)橫向延伸，該距離足夠使得當(dāng)血液放置在試樣放置區(qū)上時(shí)，血漿前沿在紅血球之前朝向著第一電化學(xué)電解槽區(qū)橫向擴(kuò)散，以血漿填充第一電化學(xué)電解槽區(qū)而不用分血器。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，其中，電極被隔開的距離小于500μm。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，其中，檢測(cè)器包括工作電極，反電極和單獨(dú)的參考電板。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，其中，電極之間的間距被這樣選擇，使得在所需的時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，其中，電化學(xué)電解槽含有試劑。6.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，電化學(xué)電解槽含有氧化還原媒劑。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，其中，膜在第一電化學(xué)電解槽和試樣放置區(qū)中間位置含有酶。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，其中，進(jìn)一步包括在試樣放置區(qū)附近的pH緩沖劑。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，其中，進(jìn)一步包括在工作電極附近的pH緩沖劑。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，包括由第二工作電極和位于膜的另一側(cè)上且結(jié)合在一起的反電極及參考電極限定的第二電化學(xué)電解槽區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，其中，第二電化學(xué)電解槽區(qū)位于第一電化學(xué)電解槽區(qū)和目標(biāo)區(qū)中間，目標(biāo)區(qū)即試樣放置區(qū)。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，其中，未被壓縮的膜具有20μm～500μm的厚度。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，其中，工作電極由包括金屬金、銀、鉑、鈀、銥、鉛及所述金屬的合金在內(nèi)的一種金屬制成。。
根據(jù)本發(fā)明的上述電化學(xué)檢測(cè)器，用于測(cè)量血液中葡萄糖的濃度。


現(xiàn)在參照附圖以舉例方式詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，其中圖1是按照本發(fā)明的第一實(shí)施例的以側(cè)剖面表示的示意圖(未按比例)。
圖2是圖1的實(shí)施例的頂視平面圖。
圖3是第一實(shí)施例的底視平面圖。
圖4是第一實(shí)施例的端視剖面圖。
圖5是按照本發(fā)明的第二實(shí)施例的以側(cè)剖面表示的示意圖(未按比例)。
圖6是圖5的實(shí)施例的頂視平面圖。
圖7是按照本發(fā)明的第三實(shí)施例的以側(cè)剖面表示的示意圖(未按比例)。
圖8是圖7的實(shí)施例的頂視平面圖。
圖9是以頂視平面圖表示的本發(fā)明的實(shí)施例的示意圖(未按比例)。
圖10是圖9的實(shí)施例的端視剖面圖。
圖11是圖9的實(shí)施例的側(cè)視剖面圖。
圖12是以橫截面圖表示的本發(fā)明的中空電解槽的示意圖(未按比例)。
圖13是在進(jìn)行本發(fā)明的方法期間電流(縱軸)對(duì)時(shí)間(橫軸)的曲線。
圖14是說(shuō)明本發(fā)明的方法的另一個(gè)曲線。
在圖5到圖12中，與圖1到圖4中功能相應(yīng)的元件用相同的標(biāo)號(hào)表示。
具體實(shí)施例方式
參見圖1到圖4，其中示出了本發(fā)明的裝置的第一實(shí)施例，在這種情況下，生物檢測(cè)器用于確定血液中的葡萄糖濃度。本實(shí)施例包括薄的條狀膜1，具有上下表面2，3，并具有在設(shè)置在上表面2上的工作電極5和設(shè)置在下表面3上的反電極6之間限定的電解槽區(qū)4。膜的厚度如此選擇，使得電極被距離“l(fā)”隔開，距離“l(fā)”足夠近，使得在反電極的電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物在試驗(yàn)期間遷移到工作電極，并基本達(dá)到穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散分布。一般地說(shuō)，“l(fā)”小于500μm。在膜1的上表面2上限定的試樣放置或“目標(biāo)”區(qū)7和電解槽區(qū)4分開一個(gè)大于膜厚的距離。膜1具有在目標(biāo)區(qū)7和電解槽區(qū)4之間延伸的擴(kuò)散區(qū)8。膜的電解槽區(qū)4內(nèi)或/與電解槽區(qū)4和目標(biāo)區(qū)7之間含有合適的試劑，其中包括氧化還原媒劑“M”，酶“E”，和pH緩沖劑“B”。試劑還可以包括穩(wěn)定劑之類。
在某些情況下，最好把酶和媒劑與/或緩沖劑放在膜的不同的區(qū)中。例如媒劑最初可以放在電化學(xué)電解槽區(qū)4內(nèi)，而酶可以放在目標(biāo)區(qū)7下面或放在擴(kuò)散區(qū)8中。
血紅蛋白在低pH下釋放氧，而在高pH下卻很牢固地和氧結(jié)合。氧對(duì)于葡糖氧化酶脫氫酶(GOD)作為氧化還原媒劑。在葡萄糖檢測(cè)器的情況下，這和氧化還原媒劑競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致計(jì)算的葡糖濃度低。因此，希望在目標(biāo)區(qū)7附近含有第一pH緩沖劑，使得把pH升高到所有的氧都和血紅蛋白結(jié)合的程度。這種pH值對(duì)于GOD/葡萄糖動(dòng)力學(xué)不是最佳的，因而有損于試驗(yàn)的速度和靈敏度。在本發(fā)明的最佳實(shí)施例中，含有第二pH緩沖劑作為工作電極附近的試劑，以便把pH值恢復(fù)到在動(dòng)力學(xué)上最佳的值。使用第二緩沖劑不會(huì)使氧從血紅蛋白中放出，因?yàn)檠t蛋白被含在被保持在血液目標(biāo)區(qū)域附近的血細(xì)胞內(nèi)，或在擴(kuò)散時(shí)比血漿滯后，因此不受第二緩沖劑的影響。用這種方式，可以大大減少或消除氧的干擾。
在使用這種檢測(cè)器時(shí)，把含有要被確定的葡萄糖濃度的一滴血液放在目標(biāo)區(qū)7上。血液成分芯吸朝向電解槽區(qū)4，從而使血漿成分比血紅細(xì)胞擴(kuò)散得更快，使得血漿前沿比血細(xì)胞提前到達(dá)電解槽區(qū)4。
當(dāng)血漿和試劑接觸時(shí)，試劑被溶解并發(fā)生使分析物氧化使媒劑還原的反應(yīng)。在經(jīng)過(guò)預(yù)定時(shí)間完成這一反應(yīng)之后，在工作電極和反電極之間加上一個(gè)電位差。工作電極的電位被保持足夠高，使得在工作電極的媒劑的還原形式的電氧化的速率由媒劑的還原形式向工作電極擴(kuò)散的速率確定，而不由跨過(guò)電極/溶液界面的電子轉(zhuǎn)移速率確定。
此外，在反電極媒劑的氧化形式的濃度，被維持在足以確保當(dāng)電流在電化學(xué)電解槽中流動(dòng)時(shí)，反電極的電位因而也是工作電極的電位，不會(huì)向陰極方向移動(dòng)得太遠(yuǎn)，一致使工作電極的電位不再處于擴(kuò)散控制區(qū)的一個(gè)值上。這就是說(shuō)，在反電極的氧化形式的濃度必須足以維持在工作電極處的媒劑的還原形式的擴(kuò)散控制的電氧化。
一薄層電解槽的功能是，如果氧化還原劑的氧化形式和還原形式都存在，則跨過(guò)電解槽最終建立穩(wěn)態(tài)濃度分布。這將引起穩(wěn)態(tài)電流。通過(guò)比較穩(wěn)態(tài)電流的測(cè)量值和在達(dá)到穩(wěn)態(tài)之前的電流變化中的變化速率已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，氧化還原媒劑的擴(kuò)散系數(shù)可以和其濃度一起測(cè)量。這和現(xiàn)有技術(shù)中被測(cè)量的Cottrell電流形成對(duì)比。通過(guò)在對(duì)檢測(cè)器電極施加電位之后的給定時(shí)間測(cè)量Cottrell電流，只能確定產(chǎn)物濃度乘以擴(kuò)散系數(shù)的平方根，因此，不能確定和其擴(kuò)散系數(shù)無(wú)關(guān)的煤劑的濃度。
在按照本發(fā)明的電解槽中，通過(guò)解合適的擴(kuò)散方程可以表明，在一個(gè)受限的時(shí)間范圍內(nèi)，ln(i/i∝-1)對(duì)時(shí)間(秒)的曲線是線性的，并具有等于-4π2D/l2的斜率(以S表示)，其中i是在時(shí)刻t時(shí)的電流，i∝是穩(wěn)態(tài)電流，D是擴(kuò)散系數(shù)，以cm2/秒表示，l是電極之間的距離，以cm表示，π近似為3.14159。當(dāng)電壓被加在電極之間時(shí)存在的還原的媒劑的濃度由2π2i∝/FAIS給出，其中F是法拉第常數(shù)，A是工作電極面積，其它符號(hào)的意義上面已經(jīng)給出。因?yàn)楹笠还绞褂肧，它包括擴(kuò)散系數(shù)的測(cè)量值。
因?yàn)閷?duì)于給定的電解槽l是常數(shù)，所以作為時(shí)間函數(shù)的i的測(cè)量值和i∝能夠計(jì)算氧化還原媒劑的擴(kuò)散系數(shù)值，并確定分析物的濃度。
此外，分析物的濃度確定補(bǔ)償在工作電極被電氧化或電還原的媒劑的擴(kuò)散系數(shù)的任何變化。溶液的溫度和黏度的變化或膜的滲透率的變化可以引起擴(kuò)散系數(shù)的值的改變。對(duì)于濃度的測(cè)量值的其它的調(diào)節(jié)可能需要考慮其它的因素，例如電解槽幾何形狀的改變，酶的化學(xué)性質(zhì)的改變，或其它可以影響測(cè)量濃度的因素。如果測(cè)量對(duì)于基本沒(méi)有分血器(如果存在，則引起氧化還原媒劑的擴(kuò)散系數(shù)的改變)的血漿進(jìn)行，則該方法的精度會(huì)進(jìn)一步改善。
電極5，6的每一個(gè)具有預(yù)定的面積。在圖1到圖4的實(shí)施例中，電解槽區(qū)4被和工作電極5、反電極6的邊沿一致的膜的邊9，10，11，和電極的前(相對(duì)于目標(biāo)區(qū)7)邊緣12，13限定。在本例中，電極厚度大約為600埃，寬度1-5mm。
膜的兩側(cè)除去目標(biāo)區(qū)7之外可以用疊層14(平面圖中省略了)蓋住，用于阻止水分從試樣中蒸發(fā)，并提供裝置的機(jī)械強(qiáng)度。水的蒸發(fā)是不希望的，因?yàn)檫@使試樣變濃，使電極干燥，使溶液變冷，從而影響擴(kuò)散系數(shù)，并使酶動(dòng)力學(xué)性能變慢，盡管擴(kuò)散系數(shù)可以按上述估算。
本發(fā)明的第二實(shí)施例如圖5，6所示，其中與第一實(shí)施例的區(qū)別在于包括第二工作電極25和反/參考電極26，它們限定其間的第二電解槽區(qū)24。在本例中，這些電極也被隔開小于500μm。第二工作電極25和反/參考電極26位于電解槽區(qū)4和目標(biāo)區(qū)7中間。在本例中，氧化還原媒劑包含在目標(biāo)區(qū)7下面或附近的，或目標(biāo)區(qū)7和第一電解槽區(qū)4的中間的膜中。酶包含在第一電解槽區(qū)4和第二電解槽區(qū)24內(nèi)的模中。酶不擴(kuò)展到第二電解槽24。在這種情況下，當(dāng)把血液加于目標(biāo)區(qū)時(shí)，它便溶解氧化還原媒劑。這沿著膜發(fā)生芯吸作用，從而使第二電化學(xué)電解槽24含有氧化還原媒劑分析物和包含電化學(xué)干擾物質(zhì)的血清。第一電化學(xué)電解槽接收媒劑，分析物，包含電化學(xué)干擾物質(zhì)的血清和酶。現(xiàn)在把電位加在兩個(gè)工作電極和一個(gè)反電極或兩個(gè)反電極之間，而對(duì)每一對(duì)電極分別測(cè)量電流隨時(shí)間的變化。這使得在沒(méi)有分析物的情況下能夠確定還原的媒劑的濃度加上在第二電解槽中的電化學(xué)干擾物質(zhì)的濃度和在第一電解槽中的這些物質(zhì)加上分析物的濃度。從另一個(gè)值中減去一個(gè)值便給出分析物的濃度。
在圖7，圖8的實(shí)施例中使用不同的幾何形狀得到相同的優(yōu)點(diǎn)，其中第二工作電極和第二反/參考電極在遠(yuǎn)離第一電化學(xué)電解槽的目標(biāo)區(qū)7的一側(cè)上限定第二電解槽24。在這種情況下，酶可以包含在目標(biāo)區(qū)和電解槽1之間的帶狀膜中。氧化還原媒劑可以位于目標(biāo)區(qū)附近或在目標(biāo)區(qū)和每個(gè)電解槽之間。利用未溶解的酶使媒劑的擴(kuò)散系數(shù)降低，因而圖7和圖8的結(jié)構(gòu)具有把酶保持在薄層電解槽之外并使試驗(yàn)速度加快(因?yàn)槟軌蚋斓剡_(dá)到穩(wěn)態(tài)電流)的優(yōu)點(diǎn)。此外，氧化還原媒劑的擴(kuò)散常數(shù)在兩個(gè)薄層電解槽中是相同的，這使得能夠更精確地減去干擾。
雖然圖1到圖8的實(shí)施例的檢測(cè)器是一體的，應(yīng)該理解，可以在一個(gè)膜上形成多個(gè)檢測(cè)器，如圖9到11所示。在這種情況下，一個(gè)檢測(cè)器的電極和相鄰檢測(cè)器的電極電氣相連。這些檢測(cè)器可以相繼地使用，并在使用之后從帶上切下。
在圖9到圖11的實(shí)施例中，電極尺寸沿著擴(kuò)散方向(由箭頭表示)由在該方向上的電極的寬度限定。在垂直于擴(kuò)散方向上的電極的有效尺寸由膜的壓縮的容積16之間限定，其壓縮方式在共同申請(qǐng)的PCT/AU96/00210中更詳細(xì)地說(shuō)明了，該專利在此全文引為參考。為清楚起見，圖1中的選擇的疊層14在圖9-11中被省略了。
在圖12的實(shí)施例中，示出了按照本發(fā)明的中空電解槽，其中電極5，6被分開的聚合物壁30支撐著。在電解槽的一側(cè)上提供有開口31，借以使試樣加入空腔32中。在本實(shí)施例中，沒(méi)有使用膜。如前面的實(shí)施例，電極被分開小于500μm，最好是20-400μm，20-200μm更好。理想的有效電解槽的容積是1.5毫升或更小。
應(yīng)該理解，本發(fā)明的方法可以按照共同申請(qǐng)的專利PCT/AU95/00207中的電解槽結(jié)構(gòu)或其它已知的電解槽設(shè)計(jì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，只要對(duì)其進(jìn)行修改使得電極表面之間的距離足夠小即可。
現(xiàn)在參照?qǐng)D13和圖14進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的方法。
例1膜厚130微米，以60納米厚的鉑層覆蓋。通過(guò)使膜壓縮限定其面積為12.6平方毫米。含有0.2摩爾的鉀氰鐵酸鹽和1％重量的葡糖氧化酶脫氫酶的1.5毫升溶液被加入由膜限定的并允許水分蒸發(fā)的容積中。
然后，把鉑層連接于恒電勢(shì)器，用作工作電極和反/參考電極。3.0毫升的含有5毫克分子D葡萄糖和0.9wt％的NaCl的透明溶液被滴在膜的限定的面積上。經(jīng)過(guò)20秒之后，把300毫伏的電壓加在工作電極和反/參考電極之間，并以0.1秒的間隔在隨后的30秒內(nèi)記錄電流。
圖13是根據(jù)上述測(cè)量的電流對(duì)時(shí)間的曲線。使用穩(wěn)態(tài)電流為26.9毫安計(jì)算函數(shù)ln(i/26.9-1)，并劃出對(duì)于時(shí)間的曲線。曲線(圖14)的斜率是-0.342，它相應(yīng)于擴(kuò)散系數(shù)為每秒1.5×10-6cm2和5.0毫克分子的葡萄糖濃度(減去背景氰鐵酸鹽)。
穩(wěn)態(tài)電流是在試驗(yàn)期間電流不再作明顯變化時(shí)的電流。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以達(dá)到一個(gè)最小電流，在最小電流之后，可能有一由于例如橫向擴(kuò)散，蒸發(fā)，干擾的電化學(xué)反應(yīng)等因素而導(dǎo)致的漂移。然而，實(shí)際上，估算“穩(wěn)態(tài)”電流(i∝)并不困難。其中的一種方法涉及逼近i∝的一個(gè)初始值。對(duì)理論曲線使用i和t的數(shù)據(jù)對(duì)從而獲得一個(gè)i∝的較好的估算值。這被重復(fù)逼近，直到測(cè)量值和逼近值收斂在一個(gè)可接受的差之內(nèi)，便求得一個(gè)估算的i∝。
實(shí)際上，在時(shí)間t的電流i的測(cè)量在加上電位之后在最小時(shí)間t min和最大時(shí)間t max之間進(jìn)行。其中最小時(shí)間和最大時(shí)間由公式的適用范圍確定，并可以通過(guò)程序性質(zhì)實(shí)驗(yàn)被容易地確定。如果通過(guò)切斷電壓并允許氧化還原劑的濃度返回其初始狀態(tài)，則可重復(fù)所需的試驗(yàn)。
應(yīng)該理解的是，分析電流對(duì)時(shí)間的曲線從而獲得擴(kuò)散系數(shù)和濃度的值并不限于上述方法，而是可以用其它方法實(shí)現(xiàn)。
應(yīng)該理解，在本發(fā)明的實(shí)施中，電信號(hào)由一個(gè)表示電流隨時(shí)間變化的裝置發(fā)出。該信號(hào)可以是模擬信號(hào)或數(shù)字信號(hào)，或是以預(yù)定的時(shí)間間隔發(fā)出的一系列信號(hào)。這些信號(hào)可以用微處理器或其它常規(guī)電路處理，從而按照存儲(chǔ)的算法進(jìn)行所需的計(jì)算，以便產(chǎn)生分別代表擴(kuò)散系數(shù)，分析物濃度，分血器濃度等的輸出信號(hào)。可借助于模擬或數(shù)字顯示器顯示一個(gè)或幾個(gè)這種輸出信號(hào)。
可以通過(guò)合適的電解槽設(shè)計(jì)來(lái)把電解槽作為耗盡電解槽操作，測(cè)量使媒劑耗盡所需的電流。例如在圖5的實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可以使用其間的距離小于500μm的工作電極5、反電極6實(shí)現(xiàn)。可以使用其間距離大于500μm的工作電極5和反/參考電極26進(jìn)行測(cè)量電流的或測(cè)量電壓的耗盡測(cè)量，并且這樣在通過(guò)測(cè)量電流確定的在工作電極5、反/參考電極26的氧化還原劑之間沒(méi)有干擾。
耗盡測(cè)量可以在由本發(fā)明的方法測(cè)量擴(kuò)散系數(shù)之前，期間或之后進(jìn)行。這可以實(shí)質(zhì)地改善精度，因而獲得再現(xiàn)性。
在上述的實(shí)施例中，膜最好是在專利No.4,629,563和4,774,039中說(shuō)明的那種不對(duì)稱的多孔膜，這兩個(gè)專利在此全文列為參考。不過(guò)，也可以使用對(duì)稱的多孔膜。這種膜可以呈片狀，管狀，中空纖維狀或其它合適的形式。
如果膜是不對(duì)稱的則目標(biāo)區(qū)最好設(shè)置在不對(duì)稱膜的多的敞開的一側(cè)。未經(jīng)壓縮的膜最好具有20-500μm的厚度。最小厚度在考慮速度，靈敏度，精度和成本之后確定。如果需要，可以使用凝膠以便使分血器和GOD分開。凝膠可以設(shè)置在電極之間與/或設(shè)置在試樣放置區(qū)和電極之間的間距中。
工作電極由合適的金屬制成，例如金，銀，鉑，鈀，銥，鉛，和它們的合金。工作電極可以在現(xiàn)場(chǎng)用任何合適的方法實(shí)現(xiàn)或制成，例如通過(guò)濺射，在局部真空下蒸發(fā)，通過(guò)無(wú)電涂覆，電鍍等。合適的非金屬導(dǎo)體也可用于制造電極。例如導(dǎo)電的聚合物，如聚吡咯，聚苯胺，卟啉“絲”，聚異戊二烯和摻雜碘的聚順丁二烯以及“梯形聚合物”。其它非金屬電極可以是石墨或混合有黏合劑的碳或添加有塑料的碳制成的。無(wú)機(jī)電極例如In2O3或SnO2也可以使用。反/參考電極的結(jié)構(gòu)例如可以和工作電極類似。鎳的氫氧化物或銀的鹵化物也可以用于形成反/參考電極。可以使用銀的氯化物，但應(yīng)該理解，可以不需要氯化，并且如果在血液試樣中存在足夠的氯化物離子，則可以使用銀。雖然在所述的實(shí)施例中所示的工作電極在生物檢測(cè)器的上表面，反/參考電極在下表面，但可以是相反的。
最好工作電極和反(或反/參考)電極的有效幾何面積基本相同。
如果使用分開的反電極和參考電極，它們的結(jié)構(gòu)可以相似。參考電極可以處于任何合適的位置。
應(yīng)該理解，上述的一個(gè)實(shí)施例的特征可以和另一個(gè)實(shí)施例的特征相結(jié)合。本發(fā)明不限于利用任何酶和媒劑的特定組合，例如在EP0351982中說(shuō)明的組合或其它的組合也可以使用。通過(guò)合適的試劑的適應(yīng)，并通過(guò)合適的膜的選擇，該系統(tǒng)可以用于確定葡萄糖之外的分析物(例如膽固醇)。該系統(tǒng)可用于血液之外的介質(zhì)。例如該方法可用于確定污染物的濃度，例如水中的氯氣，鐵，鉛，鎘，銅等。
雖然本文說(shuō)明的電解槽一般具有平面的平行電極，應(yīng)該理解，也可以使用其它的形狀，例如一個(gè)電極是桿狀的，另一個(gè)電極是同心套筒狀的。
顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員不脫離本文所披露的本發(fā)明的構(gòu)思可以以其它形式實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種電化學(xué)檢測(cè)器，該電化學(xué)檢測(cè)器包括多孔膜，在膜的一側(cè)上的工作電極，在膜的另一側(cè)上的反電極，所述電極和其間的膜的區(qū)域限定一個(gè)第一電化學(xué)電解槽，其中膜從第一電化學(xué)電解槽向和第一電化學(xué)電解槽區(qū)隔開一個(gè)大于膜的厚度的距離的試樣放置區(qū)橫向延伸，該距離足夠使得當(dāng)血液放置在試樣放置區(qū)上時(shí)，血漿前沿在紅血球之前朝向著第一電化學(xué)電解槽區(qū)橫向擴(kuò)散，以血漿填充第一電化學(xué)電解槽區(qū)而不用分血器。
2.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，電極被隔開的距離小于500μm。
3.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，檢測(cè)器包括工作電極，反電極和單獨(dú)的參考電極。
4.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，電極之間的間距被這樣選擇，使得在所需的時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流。
5.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，電化學(xué)電解槽含有試劑。
6.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，電化學(xué)電解槽含有氧化還原媒劑。
7.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，膜在第一電化學(xué)電解槽和試樣放置區(qū)中間位置含有酶。
8.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，進(jìn)一步包括在試樣放置區(qū)附近的pH緩沖劑。
9.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，進(jìn)一步包括在工作電極附近的pH緩沖劑。
10.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，包括由第二工作電極和位于膜的另一側(cè)上且結(jié)合在一起的反電極及參考電極限定的第二電化學(xué)電解槽區(qū)。
11.如權(quán)利要求10所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，第二電化學(xué)電解槽區(qū)位于第一電化學(xué)電解槽區(qū)和目標(biāo)區(qū)中間，目標(biāo)區(qū)即試樣放置區(qū)。
12.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，未被壓縮的膜具有20μm～500μm的厚度。
13.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，其中，工作電極由包括金屬金、銀、鉑、鈀、銥、鉛及所述金屬的合金在內(nèi)的一種金屬制成。
14.如權(quán)利要求1所述的電化學(xué)檢測(cè)器，用于測(cè)量血液中葡萄糖的濃度。
全文摘要
一種用于確定電化學(xué)檢測(cè)器中的氧化還原劑的氧化的(或還原的)形式的濃度的方法，所述電化學(xué)檢測(cè)器包括工作電極和與工作電極隔開一個(gè)預(yù)定距離的反電極，所述方法包括(1)在電極之間施加電位差，(2)如此選擇工作電極的電位，使得媒劑的還原形式的電氧化速率(或氧化形式的還原速率)是擴(kuò)散控制的，(3)選擇工作電極和反電極之間的距離，使得來(lái)自反電極的反應(yīng)產(chǎn)物到達(dá)工作電極，(4)在施加電位之后和達(dá)到穩(wěn)態(tài)之前，確定作為時(shí)間函數(shù)的電流，(5)估算穩(wěn)態(tài)電流的幅值，(6)從電流隨時(shí)間的變化和穩(wěn)態(tài)電流的幅值獲得代表擴(kuò)散系數(shù)與/或媒劑的還原形式(或氧化形式)的擴(kuò)散系數(shù)的值。
文檔編號(hào)G01N33/487GK1690701SQ20051007263
公開日2005年11月2日 申請(qǐng)日期1996年6月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月19日
發(fā)明者阿拉斯泰爾·邁克英多·霍奇斯, 托馬斯·威謙·貝克, 奧德瓦·喬納森 申請(qǐng)人:利費(fèi)斯坎公司