專利名稱：一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法及試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學檢驗測定技術領域，特別是一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法及試劑。
背景技術：
血清/漿同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)是一種含硫分子的氨基酸，在身體內經由甲硫氨酸(methionine)代謝后而得到的中間代謝產物。眾多臨床資料已經證實HCY 是心臟冠狀動脈硬化、心肌梗塞、腦中風和末梢血管阻塞的重大危險因子。長久以來，醫學上都認為心臟疾病與膽固醇增加有關，但是卻仍有25%的心臟病患者在體內沒有明顯的膽固醇或其它危險因子升高的現象。上世紀60年代末期，一些學者注意到患有遺傳性高胱氨酸尿癥的病人，大多數伴有亞臨床心血管病。1976年，Wichen等通過流行病學調查提出同型半胱氨酸是心血管病人一個獨立危險因素，但一直未受到人們重視。近年來的研究發現， 同型半胱胺酸HCY的代謝與心血管疾病或中風有極大關聯。動物試驗表明，應用3%蛋氨酸飲食長期喂養家兔，誘發同型半胱氨酸血癥，家兔血中甘油三酯、游離脂肪酸、脂質過氧化物含量均明顯升高，病理檢查表明主動脈脂肪大量沉積，并發生動脈粥樣硬化。Glueck等報道，他們對482例高血脂病人進行分析，18例患者同時伴有血漿同型半胱氨酸含量升高。其中13人患有動脈粥樣硬化，發病率為72%，遠高于血漿同型半胱氨酸含量正常的高血脂患者。在18例高同型半胱氨酸血癥患者的直系親屬中動脈粥樣硬化的發病率可達78%。目前，HCY對心血管疾病的診斷意義已被臨床充分重視。由于同型半胱氨酸測定對心血管疾病的診斷有較好的特異性和靈敏度，在近20 年中，測定方法得到不斷開發和改進。主要有高效液相色譜法(HPLC)、熒光偏振免疫測定法(FPIA)、酶聯免疫分析法(ELISA)、毛細管電泳-激光誘導熒光(CE-LIF)等。這些方法需要對HCY進行衍生和復雜的樣品前處理，同時需特殊、昂貴儀器，不適合臨床常規分析。 近幾年來，利用酶法測定HCY的方法得到了開發和改進，目前臨床上主要應用美國Teco Diagnostics公司的Homocysteine Reagent (下稱"iTeco法”)進行HCY的測量，該法通過循環酶反應將HCY轉化為丙酮酸鈉，然后用測定丙酮酸鈉的方法對HCY進行定量，此法靈敏度高，可應用于臨床廣泛使用的全自動生化分析儀，從而實現HCY的自動化分析，但該法無法排除內源性胱硫醚干擾，易使HCY測定結果假性升高。
發明內容
本發明的目的是提供一種能夠消除內源性胱硫醚干擾，測定結果真實、準確的血清同型半胱氨酸測定方法及試劑。為了達到上述目的，本發明采用以下技術解決方案一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法，其特征在于它包括以下步驟(1)配制含胱硫醚裂解酶(CBL)、還原性輔酶I (NADH)、乳酸脫氫酶(LDH)、海藻糖的pH8. 50-9. OOTris-HCl緩沖液為試劑I，按一定比例加入含內源性干擾物質胱硫醚的待測同型半胱氨酸(HCY)血清樣品，監測340nm處吸光度的降低值，與標準液對照后計算出由干擾物質胱硫醚轉化生成的同型半胱氨酸濃度Chc^1 ；(2)配制含絲氨酸、胱硫醚合成酶(CBS)、海藻糖的pH7. 50-7. 80Tris_HCl緩沖液為試劑II，將試劑II按一定比例加入到第(1)步試劑I和待測血清樣品的混合溶液中，監測340nm處吸光度下降速率，與標準液對照后計算出同型半胱氨酸總濃度Ch。y,2 ；(3)將第( 步所測得的同型半胱氨酸總濃度Ch。y,2減去第(1)步所測得的同型半胱氨酸濃度Chc^1得血清同型半胱氨酸(HCY)濃度C
血清hcy °步驟(1)中的反應條件為在37°C環境中反應180-600秒；步驟O)中的反應條件為在37°C環境中反應90-480秒。步驟(1)中，所述血清樣品與所述試劑I的體積比為V血清Vwji = 16.5 250 ；步驟⑵中，所述血清樣本與所述試劑I、試劑II的體積比為Vtt Vwji V試 ^ijii = 16. 5 250 50。步驟⑴中，所述試劑I中各物質最適濃度為pH8. 50-9. OOTris-HCl濃度為 30-100mmol/L，所述胱硫醚裂解酶(CBL)濃度為10-50KU/L，所述還原性輔酶I (NADH)濃度為4-6g/L，所述乳酸脫氫酶(LDH)濃度為30-100KU/L，所述海藻糖濃度為20_100g/L ；步驟⑵中，所述試劑II中各物質最適濃度為pH7. 50-7. SOTris-HCl濃度為50-200mmol/L，所述絲氨酸濃度為2. 5-10mmol/L,所述胱硫醚合成酶(CBQ濃度為 30-80KU/L，所述海藻糖濃度為20-100g/L。步驟(1)中，所述的由干擾物質胱硫醚轉化生成的同型半胱氨酸濃度Chc^1的計算公式為= [(Au-AtlV(As-Atl)]，其中Au為步驟⑴樣品吸光度值，AS為步驟 (1)同體積的標準液代替樣品所測得的吸光度值，Atl為步驟(1)同體積的去離子水代替樣品所測得的吸光度值，為標準液中胱硫醚的濃度。步驟O)中，所述的同型半胱氨酸總濃度Ch。y,2的計算公式為Ch。y,2 = [(AAu/ min- Δ A0/min) / ( Δ As/min- Δ A0/min) ] X ((^準脅+(^準胱硫醚)，其中 A Au/min 為步驟⑵樣品每分鐘吸光度變化值，AAsAiin為步驟O)同體積的標準液代替樣品所測得的每分鐘吸光度變化值，AAtlAiin為步驟(2)同體積的去離子水代替樣品所測得的每分鐘吸光度變化值， Cs ih。y為標準液中同型半胱氨酸(HCY)的濃度，為標準液中胱硫醚的濃度。為了達到上述目的，本發明還采用以下技術解決方案一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定試劑，其特征在于測定試劑由試劑I和試劑II組成，試劑I中的ρΗ8· 50-9. OOTris-HCl濃度為30-100mmol/L,含有的胱硫醚裂解酶(CBL)濃度為10-50KU/L、還原性輔酶I(NADH)濃度為4_6g/L、乳酸脫氫酶(LDH)濃度為30-100KU/ L、海藻糖濃度為 20-100g/L ；試劑 II 中的 pH7. 50-7. 80Tris-HCl 濃度為 50-200mmol/L，含有的絲氨酸濃度為2. 5-lOmmol/L、胱硫醚合成酶(CBQ濃度為30-80KU/L、海藻糖濃度為 20-100g/L。本發明通過構建一種基于胱硫醚合成酶(CBQ-胱硫醚裂解酶(CBL)-乳酸脫氫酶 (LDH)偶聯、可消除內源性胱硫醚干擾的同型半胱氨酸測定新體系，實現同型半胱氨酸的準確測定。該法在測定同型半胱氨酸之前，血清內源性干擾物質胱硫醚在步驟(1)經胱硫醚裂解酶(CBL)作用后轉化為同型半胱氨酸、丙酮酸及氨，生成的丙酮酸在乳酸脫氫酶(LDH)作用下將還原性輔酶I (NADH)轉化為氧化性輔酶I (NAD+)，還原性輔酶I (NADH)在340nm有最大吸收，通過監測340nm處吸光度的降低值，可計算出由內源性干擾物質胱硫醚轉化生成的同型半胱氨酸濃度；在步驟O)中通過胱硫醚合成酶(CBQ-胱硫醚裂解酶(CBL)-乳酸脫氫酶(LDH)偶聯途徑測得總同型半胱氨酸(HCY)濃度后，減去由干擾物質胱硫醚轉化生成的同型半胱氨酸濃度，即為消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸濃度。依據該法構建的同型半胱氨酸(HCY)測定試劑置2-8°C保存可穩定14個月，可以應用于目前廣泛使用的臨床生化自動分析儀，從而達到大規模測定樣本的要求。本發明的檢測方法與美國iTeco Diagnostics公司的Homocysteine Reagent ( “Teco法”)相比較結果見下表。
Teco 法本發明試劑I主要組份Tris-HCK NADH、LDH. 絲氨酸Tris-HCK CBL、NADH、 LDH試劑II主要組份Tris-HCK CBL、CBSTris-HCK 絲氨酸、CBS標準品組份HCYHCY,胱硫醚試劑I主要作用消除內源性丙酮酸鈉干擾消除內源性丙酮酸鈉干擾，并測量出由內源性胱硫醚作用生成的HCY 濃度試劑1+試劑II 主要作用測定HCY總濃度測定HCY總濃度HCY計算方式與標準品對照直接計算 HCY總濃度與標準品對照計算出 HCY總濃度后再減去由內源性胱硫醚作用生成的HCY濃度內源性胱硫醚干擾干擾30umol/L以下不干擾
具體實施例方式
本發明測定原理第一步，配制含胱硫醚裂解酶(CBL)、還原性輔酶I (NADH)、乳酸脫氫酶(LDH)、海藻糖的pH8. 50-9. OOTris-HCl緩沖液為試劑I，加入待測血清樣品。待測血清樣品中的內源性干擾物質胱硫醚經胱硫醚裂解酶(CBL)作用后轉化為同型半胱氨酸、丙酮酸及氨，生成的丙酮酸及血清內源性丙酮酸在乳酸脫氫酶(LDH)作用下將還原性輔酶 I (NADH)轉化為氧化性輔酶I (NAD+)，還原性輔酶I (NADH)在340nm有最大吸收，監測340nm 處吸光度的降低值，與標準液對照后計算出由干擾物質胱硫醚轉化生成的同型半胱氨酸濃度Cheyil ；第二步，配制含絲氨酸、胱硫醚合成酶(CBS)、海藻糖的pH7. 50-7. SOTris-HCl緩沖液為試劑II，將試劑II按一定比例加入到第一步試劑I和待測血清樣品的混合溶液中。 血清中的同型半胱氨酸(HCY)和第一步反應中生成的同型半胱氨酸(HCY)在絲氨酸的存在下經胱硫醚合成酶(CBQ作用后轉化為胱硫醚，胱硫醚經胱硫醚裂解酶(CBL)作用后轉化為同型半胱氨酸、丙酮酸及氨，生成的同型半胱氨酸以一定的反應速率重新進入酶法循環途徑。反應生成的丙酮酸在乳酸脫氫酶(LDH)作用下將還原性輔酶I (NADH)轉化為氧化性輔酶I (NAD+)，檢測340nm的吸光度下降速率，與標準品對照后計算出同型半胱氨酸總濃度 Chcy,2 ；將第二步所測得的同型半胱氨酸總濃度Ctey,2減去第一步所測得的同型半胱氨酸濃度Chc^1即得血清同型半胱氨酸(HCY)濃度。
樣品液臨床血清標本。標準液精密稱取優級純胱硫醚、同型半胱氨酸，用去離子水稀釋至胱硫醚濃度為 15 μ mol/L、同型半胱氨酸(HCY)濃度為25 μ mol/L。樣品液中同型半胱氨酸(HCY)的計算公式待測樣品同型半胱氨酸(HCY)含量(μ mol/L) = [ ( Δ Au/min- Δ A0/min) / ( Δ As/min- Δ A0/min) ] X (Chcy+C 胱硫趣)_ [ (Au-A0) / (As-Atl)] XCimw，其中AAu/min為反應第二步樣品管每分鐘吸光度變化值，AAs/min為反應第二步同體積的標準液代替樣品所測得的每分鐘吸光度變化值，AAtlAiin為反應第二步同體積的去離子水代替樣品所測得的每分鐘吸光度變化值。Au為反應第一步樣品管吸光度值，As為反應第一步同體積的標準液代替樣品所測得的吸光度值，A0為反應第一步同體積的去離子水代替樣品所測得的吸光度值，(_為標準中同型半胱氨酸(HCY)的濃度，Cis 為標準中胱硫醚的濃度。實施例1 配制含胱硫醚裂解酶(CBL)濃度為50KU/L、還原性輔酶I (NADH)濃度為6g/L、乳酸脫氫酶(LDH)濃度為100KU/L、海藻糖濃度為10%的30mmol/LpH9. OOTris-HCl緩沖液為試劑I ；配制含絲氨酸濃度為lOmmol/L、胱硫醚合成酶(CBQ濃度為80KU/L、海藻糖濃度為 10%的50mmol/L pH7. 50Tris-HCl緩沖液為試劑II。將該測定試劑用于測定樣品液時，采用的儀器為奧林巴斯M00全自動生化分析儀，反應溫度為37°C，樣本體積為16. 5 μ 1，試劑 I體積為250 μ 1，試劑II體積為25 μ 1，測定主/副波長為340/450nm，試劑I和樣本混合后在測定溫度反應180秒后分別讀取空白管、標準管、血清管的吸光度Ap As、Au，加入試劑 II混勻后在測定溫度孵育30秒后分別讀取60秒內空白管、標準管、血清管的吸光度的變化速率ΔΑα/min、ΔΑ> η, AAu/min。用本法和HPLC法同時測定了 30例血清樣品液中同型半胱氨酸(HCY)濃度。下表為本實施例所述方法測定的血清樣品中同型半胱氨酸(HCY) 濃度的測定值與HPLC法測定的同型半胱氨酸(HCY)濃度的值對照表，本實施例所述方法與 HPLC法的相關系數!·為0. 9999，兩者顯示了極好的相關性。
權利要求
1.一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法，其特征在于它包括以下步驟(1)配制含胱硫醚裂解酶(CBL)、還原性輔酶I(NADH)、乳酸脫氫酶(LDH)、海藻糖的 pH8. 50-9. OOTris-HCl緩沖液為試劑I，按一定比例加入待測血清樣品，監測340nm處吸光度的降低值，與標準液對照后計算出由干擾物質胱硫醚轉化生成的同型半胱氨酸濃度Ch。y, 1 ‘(2)配制含絲氨酸、胱硫醚合成酶(CBS)、海藻糖的pH7.50-7. SOTris-HCl緩沖液為試劑II，將試劑II按一定比例加入到第(1)步試劑I和待測血清樣品的混合溶液中，監測 340nm處的吸光度下降速率，與標準液對照后計算出同型半胱氨酸總濃度Ch。y,2 ；(3)將第( 步所測得的同型半胱氨酸總濃度Ch。y,2減去第(1)步所測得的同型半胱氨酸濃度Chc^1得血清同型半胱氨酸(HCY)濃度C血清hcy °
2.根據權利要求1所述的一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法， 其特征在于步驟(1)中的反應條件為在37°C環境中反應180-600秒；步驟O)中的反應條件為在37°C環境中反應90-480秒。
3.根據權利要求2所述的一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法，其特征在于步驟(1)中，所述待測血清樣品與所述試劑I的體積比為 Vwji = 16. 5 250 ；步驟⑵中，所述待測血清樣品與所述試劑I、試劑II的體積比為V血清Vwji V試 ^ijii = 16. 5 250 50。
4.根據權利要求3所述的一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法， 其特征在于步驟(1)中，所述試劑I中各物質最適濃度為pH8. 50-9. OOTris-HCl濃度為 30-100mmol/L，所述胱硫醚裂解酶(CBL)濃度為10-50KU/L，所述還原性輔酶I (NADH)濃度為4-6g/L，所述乳酸脫氫酶(LDH)濃度為30-100KU/L，所述海藻糖濃度為20_100g/L步驟⑵中，所述試劑II中各物質最適濃度為pH7. 50-7. SOTris-HCl濃度為 50-200mmol/L,所述絲氨酸濃度為2. 5-10mmol/L,所述胱硫醚合成酶(CBQ濃度為 30-80KU/L，所述海藻糖濃度為20-100g/L。
5.根據權利要求4所述的一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法， 其特征在于步驟(1)中，所述的由干擾物質胱硫醚轉化生成的同型半胱氨酸濃度Chc^1的計算公式為= [(Au-Aj/A-AMXC^^^ ，其中Au為步驟⑴樣品吸光度值，^為步驟(1)同體積的標準液代替樣品所測得的吸光度值，Atl為步驟(1)同體積的去離子水代替樣品所測得的吸光度值，為標準液中胱硫醚的濃度；步驟⑵中，所述的同型半胱氨酸總濃度Ch。y,2的計算公式為Ch。y,2= [(AAu/ min- Δ A0/min) / ( Δ As/min- Δ A0/min) ] X (C ^ hcy+C) 0 其中 AAu/min 為步驟(2)樣品每分鐘吸光度變化值，AAsAiin為步驟O)同體積的標準液代替樣品所測得的每分鐘吸光度變化值，AAtlAiin為步驟O)同體積的去離子水代替樣品所測得的每分鐘吸光度變化值，Cs ih。y為標準液中同型半胱氨酸(HCY)的濃度，為標準液中胱硫醚的濃度。
6.一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定試劑，其特征在于測定試劑由試劑I和試劑II組成，試劑I中的pH8. 50-9. OOTris-HCl濃度為30-100mmol/L，含有的胱硫醚裂解酶(CBL)濃度為10-50KU/L、還原性輔酶I(NADH)濃度為4_6g/L、乳酸脫氫酶(LDH)濃度為 30-100KU/L、海藻糖濃度為 20- 100g/L ；試劑 II 中的 ρΗ7· 50-7. 80Tris_HCl 濃度為50-200mmol/L，含有的絲氨酸濃度為2. 5-lOmmol/L、胱硫醚合成酶(CBQ濃度為 30-80KU/L、海藻糖濃度為 20-100g/L。
全文摘要
本發明涉及醫學檢驗測定技術領域，特別是一種消除內源性胱硫醚干擾的血清同型半胱氨酸測定方法及試劑。它通過構建一種基于胱硫醚合成酶-胱硫醚裂解酶-乳酸脫氫酶偶聯、可消除內源性胱硫醚干擾的同型半胱氨酸測定新體系，實現對同型半胱氨酸的準確測定和測定結果真實的目的。并依據該法構建的同型半胱氨酸測定試劑置2-8℃保存可穩定14個月，可以應用于目前廣泛使用的臨床生化自動分析儀，滿足大規模測定樣本的要求。
文檔編號G01N21/33GK102393373SQ20111034013
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月22日 優先權日2011年10月22日
發明者陳光永 申請人:溫州市德福泰生物科技有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
