專利名稱：一種淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測試劑盒和檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物;險測技術領域，尤其涉及的是， 一種淡水魚類肝吸蟲 快速免疫檢測試劑盒和檢測方法。
背景技術：
肝吸蟲是一種常見人體寄生蟲，通過食入含有肝吸蟲嚢蚴的淡水魚類 而感染。肝吸蟲成蟲寄生于人體肝臟膽管內，導致肝吸蟲病，引起一系列 的肝膽損害，包括膽管炎癥、結石、膽汁性肝硬化，最終可以誘發肝癌。
目前對人體肝吸蟲病的診斷方法很多，包括病原學方法檢查糞便蟲卵 和免疫學方法檢測病人血清中肝吸蟲抗體。病原學方法準確可靠，但蟲卯 小，排卯不規律，容易漏診，而且要采集病人糞便，用清水反復沉淀并淘 洗多次，取沉渣，之后由專業技術人員用高倍顯微鏡檢查，過程較長，—— 般需幾個小時或更多，操作煩瑣不便，耗費人工，難以推廣普查；免疫學 方法敏感特異，方便快速，檢測血清即可，因此，得到較為廣泛的應用。
在免疫學方法中，酶聯免疫檢測技術應用最為普遍，國內在20世紀90
等，華支睪吸蟲病快速ELISA診斷試劑盒的建立，中國寄生蟲病防治雜志， 1995年8巻4期，起止頁碼295-296)，每文感性達到92%以上，特異性達 到98%以上。
然而，要真正切斷肝吸蟲流行，保障人民健康，必須從源頭上對淡水 魚肉品進行安全監^S防止含有肝吸蟲嚢姆的病魚流入市場。但目前對淡 水魚肝吸蟲檢測還缺乏有效手段。傳統的魚類肝吸蟲檢查，是采用顯微鏡
對魚肉中的肝吸蟲嚢坳進行觀測，但這種方法要在一般重達1000克的魚肉 中，肉眼觀察到不足1毫米的嚢坳是非常困難的，不僅效率低下，而且極 易發生遺漏。因此，顯微鏡檢查魚肉，查肝吸蟲，除了科學研究外，幾乎 沒有在實際中得到應用，這也是造成淡水魚肝吸蟲缺乏安全監督的重要原
因。而淡水魚肝吸蟲免疫;f全測方法迄今也未建立。
因此，現有技術沒有檢測淡水魚類肝吸蟲的有效工具。
發明內容
本發明的目的在于提供一種淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測試劑盒和檢 測方法，從而提供一種檢測淡水魚類肝吸蟲的檢測工具和方法。 本發明的技術方案如下
一種淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測試劑盒，其盒體內設置酶聯反應板、 酶結合物、洗滌液、底物液、顯色劑、稀釋液、終止液；其中，所述酶聯 反應板為從肝吸蟲中提取可溶性抗原并純化，然后包被所述可溶性抗原制 得的酶聯反應板；所述酶結合物為辣根過氧化酶標記抗魚免疫球蛋白的酶 結合物。
所述的試劑盒，其中，所述酶聯反應板是在通用聚苯乙烯微孔板上包 被可溶性抗原，然后在室溫靜置12~24小時，冷凍真空干燥后裝袋封口制 成；其中，所述可溶性抗原是從感染動物中獲取肝吸蟲成蟲，并提取得到 其可溶性抗原；包被液為含0.01%~ 1%可溶性抗原的緩沖液，所述緩沖液 是0.01 mol/L~0.15 mol/L的磷酸鹽、硼酸鹽或碳酸鹽緩沖液，pH7.5 ~ pH9,5。
所述的試劑盒，其中，所述酶結合物為采用純化的魚免疫球蛋白免疫 動物，分離出抗魚免疫球蛋白，經純化后采用辣根過氧化酶進行免疫標記 制成。
所述的試劑盒，其中，所述酶結合物是含0.05%~ 1%的辣根過氧化物
酶標記抗魚免疫^求蛋白的0.01mol/L ~ 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6 ~ 8; 并且添加含量足以抑制細菌生長的防腐劑。
所述的試劑盒，其中，其還至少包括陰性對照品、陽性對照品其中之
所述的試劑盒，其中，所述洗滌液為包含有0.1%~ 1%表面活性劑的 0.01mol/L-0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6 ~ 8;底物液為0.1%~0.5%過氧化 氫溶液；顯色劑為3,3，,5,5，-四曱基聯苯胺;稀釋液為0.01mol/L ~ 0.5mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH6 8;終止液為1 mol/L~2mol/L的^5危酸或氳氧化鈉。
一種用于權利要求1所述的試劑盒的檢測方法，其包括步驟
Al、從感染動物中獲取肝吸蟲成蟲，并提取得到其可溶性抗原，在通 用聚苯乙烯微孔板上包被所述可溶性抗原，然后在室溫靜置12~24小時， 冷凍真空干燥后制成酶聯反應板，并裝袋封口保存；其中，包被液是含有 0.01% 1%所述可溶性抗原的緩沖液，所述緩沖液是pH7.5 pH9.5的0.01 mol/L ~ 0.15 mol/L的磷酸鹽、硼酸鹽或碳酸鹽緩沖液；
A2、采用純化的魚免疫球蛋白免疫動物，分離出抗魚免疫球蛋白，經 純化后采用辣根過氧化酶進行免疫標記制成酶結合物；
A3、所述酶聯反應板每孔分別加稀釋液1滴，加入待檢的樣本50ul， 混勻；其中，所述稀釋液為0.01mol/L 0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6 8;
A4、充分反應后甩去孔內液體，每孔加洗滌液l滴后立即注滿純凈水， 靜置30秒后甩去，再用純凈水洗滌至少一次，恩去，拍干；其中，所述洗 滌液為包含有0.1% ~ 1%表面活性劑的0.01mol/L ~ 0.5mol/L磷酸鹽緩沖液， pH6 8;
A5、每孔加酶結合物2滴，充分反應后甩去孔內液體，每孔加洗滌液 1滴后立即注滿純凈水，靜置30秒后甩去，再用純凈水洗滌至少一次，甩 去，拍干；
A6、加底物液和顯色劑各1滴，混勻，充分顯色反應后加終止液1滴，
混勻，終止反應；其中，所述底物液為0.1%~0.5%過氧化氫溶液；所述顯 色劑為3,3，,5,5，-四曱基聯苯胺；所述終止液為1 mol/L~2mol/L的硫酸或氫 氧化鈉。
所述的檢測方法，其中，步驟A3中，還包括步驟設置陰性孔、陽性 孔及空白對照孔，陰性孔、陽性孔分別加稀釋液1滴，然后分別加入陰性 對照品、陽性對照品各50ul，空白對照孔加入稀釋液2滴。
所述的4企測方法，其中，所述充分反應為37。C避光反應30分鐘，所述 充分顯色反應為37'C避光反應IO分鐘。
所述的一企測方法，其中，步驟A1中，在室溫靜置12~24小時之后， 還包括步驟采用0.1%~5%卵清蛋白或牛血清白蛋白封閉2小時，經冷凍 真空干燥后制成所述酶聯反應板。
采用上述方案，本發明通過利用快速免疫檢測技術的敏感性、特異性 以及實用性、經濟性，建立了淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測方法，同時適 用于活魚和死魚；方便實用，試劑盒為即開即用型，用戶不必另行配制或 稀釋，操作簡單易行；不僅可以用儀器定量判斷結果，也可以肉眼直接判 斷，尤適合于條件受限的現場檢測；安全環保，采用了無害的酶聯免疫顯 色劑四曱基聯苯胺，避免了常規方法所帶來的危害和污染。
圖l是本發明產品的結構示意圖； 圖2是本發明方法的流程示意圖。
具體實施例方式
以下對本發明的較佳實施例加以詳細說明。
如圖l所示，本發明提供了一種淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測試劑盒， 其盒體內設置酶聯反應板101和各種試劑102，各種試劑具體包括酶結合物、
洗滌液、底物液、顯色劑、稀釋液、終止液等等；其中，所述酶聯反應板 為從肝吸蟲中提取可溶性抗原并純化，然后包^^所述可溶性抗原制得的酶
聯反應板；所述酶結合物為辣根過氧化酶標記抗魚免疫球蛋白的酶結合物。 以下對本發明試劑盒的酶聯反應板和各種試劑進行詳細說明。
室溫靜置12~24小時，冷凍真空干燥后裝袋封口制成。在室溫靜置12~24 小時之后，還可以采用0.1%~5%卵清蛋白或牛血清白蛋白封閉2小時，然 后再冷凍真空干燥后裝袋封口制成所述酶聯反應板。其中，通用聚苯乙烯
微孔板，可以是48孔板或96孔板，或其他板；所述可溶性抗原是從感染 動物中獲取肝吸蟲成蟲，并提取得到其可溶性抗原，即可溶于水的肝吸蟲 成蟲的抗原；包被液為含0.01%~ 1%可溶性抗原的緩沖液，所述緩沖液是 0.01 mol/L~ 0.15 mol/L的磷酸鹽、硼酸鹽或碳酸鹽緩沖液，pH7.5 pH9.5。
所述酶結合物為采用純化的魚免疫球蛋白免疫動物，分離出抗魚免疫 球蛋白，經純化后采用辣根過氧化酶進行免疫標記制成。例如，所述酶結 合物是pH6 ~ 8的0.01mol/L ~ 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，其中含有0.05% ~ 1%的經過辣4艮過氧化物酶標記的抗魚免疫^泉蛋白，即抗抗體；并且添加含 量足以抑制細菌生長的防腐劑。例如，所述防腐劑是0.01%~0.1%的硫柳 汞(Thimerosal,也稱柳石充汞、水楊乙汞)。本發明對防腐劑的種類和用量 沒有額外的限制，只要能夠抑制細菌生長即可。其中，磷酸鹽緩沖液最好 為0.05 mol/L, pH7.0。
所述的試劑盒還可以包括陰性對照品(negative control)和/或陽性對照 品(positive control),為便于用戶使用，最好是同時具備陰性對照品和陽性 對照品。所述陰性對照品為正常魚血清標本，所述陽性對照品為含有肝吸 蟲抗體的魚血清標本。 一般來說，陽性對照品和陰性對照品是檢驗試驗有 效性的控制品，同時也作為判斷結果的對照，因此對照品，特別是陽性對 照品的基本組成應盡量與檢測標本的組成相一致。陰性對照品須先行檢測，
確定其中不含待測物質。陽性對照品多以含蛋白保護劑的緩沖液為基質， 其中如入一定量的待才全物質，此量最好在試劑說明書中標明；加入的量應 與試劑的敏感度相稱，在測定中得到的吸光值與受檢標本吸光值比較，可對標本中受檢物質的量有一個粗略的估計。在對照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。
所述試劑盒中，所述洗滌液為包含有0.1% ~ 1%表面活性劑的 0.01mol/L 0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6 8;底物液為0.1%~0.5%過氧化 氫溶液；顯色劑為3,3',5,5'-四甲基聯苯胺;稀釋液為0.01mol/L ~ 0.5mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH6 ~ 8;終止液為1 mol/L ~ 2 mol/L的石克酸或氫氧化鈉。
并且，如圖2所示，本發明還提出了一種用于淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測試劑盒的檢測方法，其包括以下步驟。
Al、從感染動物中獲取肝吸蟲成蟲，并提取得到其可溶性抗原，在通 用聚苯乙烯微孔板上包被所述可溶性抗原，然后在室溫靜置12~24小時， 冷凍真空干燥后制成酶聯反應板，并裝袋封口保存；其中，包被液是含有 0.01%~1%所述可溶性抗原的緩沖液，所述緩沖液是pH7.5 pH9.5的0.01 mol/L~ 0.15 mol/L的磷酸鹽、硼酸鹽或碳酸鹽緩沖液。
在室溫靜置12~24小時之后，還可以包括步驟采用0.1%~5%卵清 蛋白或牛血清白蛋白封閉2小時，經冷凍真空干燥后制成所述酶聯反應板。
A2、采用純化的魚免疫球蛋白免疫動物，分離出抗魚免疫球蛋白，經 純化后采用辣根過氧化酶進行免疫標記制成酶結合物。 一般地，所述酶結 合物是含0.05% ~ 1%的辣根過氧化物酶標記抗魚免疫球蛋白的0.01mol/L ~ 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6 8;并且添加含量足以抑制細菌生長的防 腐劑。例如，所述防腐劑是0.01%的硫柳汞。
A3、所述酶聯反應板每孔分別加稀釋液1滴，加入待檢的樣本50ul， 混勻；其中，所述洗滌液為包含有0.1%~ 1%表面活性劑的0.01mol/L 0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6 8;更好的是，所述稀釋液為0.1 mol/L磷酸
鹽緩沖液，pH7.0。
并且，步驟A3甲，還可以包括步驟設置陰性孔、陽性孔及空白對照 孔，陰性孔、陽性孔分別加稀釋液1滴，然后分別加入陰性對照品、陽性 對照品各50ul,空白對照孔加入稀釋液2滴。
A4、充分反應后甩去孔內液體，每孔加洗滌液1滴后立即注滿純凈水， 靜置30秒后甩去，再用純凈水洗滌至少一次，甩去，拍干；其中，所述洗 滌液為包含有0.1% ~ 1%表面活性劑的O.Olmol/L ~ 0.5mol/L磷酸鹽緩沖液， pH6~8。 一般的，采用純凈水洗滌至少四次或以上，效果更好一些。其中， 充分反應一般為37。C避光反應30分鐘。
A5、每孔加酶結合物2滴，充分反應后甩去孔內液體，每孔加洗滌液 1滴后立即注滿純凈水，靜置30秒后甩去，再用純凈水洗滌至少一次，甩 去，拍干。 一般的，采用純凈水洗滌至少四次或以上，效果更好一些。其 中，充分反應一般為37i:避光反應30分鐘。
A6、加底物液和顯色劑各l滴，混勻，充分顯色反應后加終止液1滴， 混勻，終止反應；其中，所述底物液為0.1%~0.5°/。過氧化氬溶液；所述顯 色劑為3,3，,5,5，-四甲基耳關苯胺；所述終止液為1 mol/L~2mol/L的碌^酸或氫 氧化鈉。例如，所述終止液為1.5mol/L的硫酸。所述充分顯色反應一般為 37。C避光反應IO分鐘。
然后，判斷加入待檢的樣本的孔內液體是否顯色。
以下對本發明所述的試劑盒和檢測方法進行具體說明。為達到上述目 的，本發明采用了以下技術方案。 '
一、rf吸蟲抗原的制備純化鑒定，具體包括從感染動物獲取肝吸蟲 成蟲；提取肝吸蟲成蟲可溶性抗原；對抗原進行純化，例如采用層析等方 法對抗原進行純化；鑒定純化的抗原。鑒定方法可以包括測定蛋白含量； 蛋白電泳觀察抗原成^f分；ELISA測定抗原活性。通過將純化抗原包被反應 板，與已知抗體含量肝吸蟲免疫血清進行反應，觀察反應強度是否達到原
先水平，從而判斷抗原活性。
二、 淡水魚免疫球蛋白的制備純化鑒定標記，具體包括以下步驟。
2.1、 魚類對抗原刺激可以產生免疫應答，形成抗體。對硬骨魚如鰻魚、 鱒魚、鯉魚等各種魚類的研究表明，魚免疫球蛋白主要是19S型，具有抗 體的結構和性能。
2.2、 對魚免疫球蛋白的提取與純化。首先，采用鹽析法初級提取魚血
清中的球蛋白；其次，采用層析法進一步純化提取其免疫球蛋白。
2.3、 對純化物進行分析鑒定。包括測定蛋白含量和進行電泳分析等， 例如，采取BRADFORD微量蛋白測定法測定蛋白濃度；采取SDS-PAGE 對純化的魚免疫球蛋白進行成分分析，純化后的免疫球蛋白僅有55KD左 右重鏈和23KD左右輕鏈兩條帶型，無明顯其它雜帶；
2.4、 抗魚免疫球蛋白抗體的制備用純化的魚免疫球蛋白免疫動物； 分離純化抗魚免疫球蛋白；酶免疫標記，例如采用改良過石典酸鈉法進行辣 根過氧化物酶標記，然后分離純化并進行鑒定。改良過硤酸鈉法，是取 5mgHRP溶于0.2mol/L pH5.6的乙酸緩沖液0.5ml,再加入O.lmol/L 0.25ml 的過碘酸鈉混勻。加入抗魚免疫球蛋白抗體約5mg混勾，調pH為9.0, 4 。C過夜，加入硼氫化鈉0.5mg混勻，透析過^f^。在以上溶液中緩慢加入等 體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，4。C 30min，離心，去上清，沉淀以少許 0.02mol/L pH7.4 PBS液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4。C透析除鹽過 夜；次日取出離心，以除去不溶物，即得酶-抗體結合物，以0.02mol/LpH7.4 PBS液加至5ml;效價測定合格后，加入等量優質甘油，分裝小瓶，低溫保 存。當然，也可以采用堿性磷酸酶(alkaline pHosohatase，AP)、葡萄糖氧化 酶、P-D-半乳糖苷酶和脲酶等標記抗魚免疫i^蛋白抗體。本發明對具體的 改良過碘酸鈉法、辣根過氧化物酶標記方法等均無額外限制。
三、 建立淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測試劑盒
3.1、抗原包被板'.采用快速包被工藝，預先在通用聚苯乙烯微孔板上
包被抗原。包被液為含適量抗原的0.01-0.15 mol/L的磷酸鹽、硼酸鹽或碳 酸鹽緩沖液，pH7.5-9.5;室溫靜置12-24小時；用0.1-5 %卯清蛋白或牛血 清白蛋白封閉2小時；冷凍真空干燥；真空裝袋封口，并在板袋外標示。
包被量一般為緩沖液的0.01%~1%，在實際測定條件下一般進行"滴 配"，以選擇能達到高敏感度的最大稀釋度作為試劑盒中的工作濃度。例如， 在實際選擇中，可以用方陣滴定法來測定最適包被量；即將抗原用包被緩 沖液進行一系列稀釋，如1:100， 1:200, 1:400……1:25600,與一定濃度的 酶結合物反應，選擇OD (Optical Delnsity,光密度，也稱吸光度)值在1.2 左右的稀釋度為包被最適濃度。
3.2、 酶結合物液磷酸鹽緩沖液，pH7.0, 0.05 mol/L,加含量足以抑 制細菌生長的適量防腐劑，如重量百分比為0.01%的硫柳汞，以及重量百分 比為0.05% ~ 1%的抗魚免疫球蛋白抗體-辣根過氧化物酶標記結合物。例如， 如上所述，標記物采用過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶對抗魚免疫球蛋白抗 抗體標記。
3.3、 洗滌劑采用0.5%TRITON-X100的磷酸鹽緩沖液(pH7.0),還 可以添加適量的防腐劑，例如0.01% ~ 1%的柳>5克汞。
3.4、 底物液及顯色劑底物液為過氧化氫溶液；顯色劑為對人體無害 的TMB (3，3，,5,5，-四曱基聯苯胺)溶液，也可以為ABTS ( 2, 2，-邊氮基-雙
(3-乙基苯并遙吡咯啉-6磺酸))或鄰苯二胺(O-phenylenediamine， OPD ) 等等。
3.5、 樣本稀釋液磷酸鹽緩沖液，pH7.0, 0.1 mol/L。
3.6、 終止液1.0-2 mol/L硫酸或氫氧化鈉。
3.7、 以上組分包括了除純凈水之外的檢測所需要的全部試劑，其中液 體組分均已調整到工作濃度并裝入塑料滴瓶內，無須稀釋可以直接使用； 陰陽對照放入帶蓋的塑料管內，可以直接使用；，包被板拆封后也可直接使 用。
本發明所述的淡水魚類肝吸蟲快速免疫^T測試劑盒，選用肝吸蟲可溶
性抗原，分步通過辛酸法和DEAE (Diethylaminoethyl, 二乙氨基乙醇)52 離子層析柱層析純化制得精制抗原。進行預試驗，測定并選擇合適的抗原 包被濃度。用碳酸鹽緩沖液稀釋抗原包被96孔聚苯乙烯微孔板，100微升/ 孔；室溫過夜；甩去孔內液體，用同樣劑量含1%的卵清蛋白的磷酸鹽緩沖 液(pH7.0, 0.05 mol/L)室溫封閉2小時；冷凍真空干燥；真空條件下裝 袋，板袋上貼相應標示。
然后用磷酸鹽緩沖液稀釋抗魚免疫球蛋白辣根過氧化物酶標記結合 物。配制含有0.5%TRITON-X100的洗滌液。配制過氧化氫作為底物，配制 TMB溶液作為顯色劑。樣本稀釋液為磷酸鹽緩沖液。終止液為2mol/L硫 酸溶液。以上液體成分，裝入塑料滴瓶內。
將肝吸蟲抗原包被板與液體試劑瓶依次裝入試劑盒內，平行站立放置； 檢查后內容后，封蓋，即為淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測試劑盒。
試劑靈敏度高，特異性強，重復性好，操作方便快速，可分多次使用。
例如，試劑盒的試劑組成如下l.預包被板，48T/96T; 2.酶結合物(1
號液)l支；3.洗滌液(2號液)l支；4.底物(3號液)l支；5.顯色劑(4號液)1
支；6.樣本稀釋液(5號液)l支；7.終止液(6號液)l支；8.陽性對照品1支；
9.陰性對照品1支；還可以包括IO.使用說明書1份。 操作程序具體說明如下
l.加樣反應取出所需量的反應板條，每孔加樣本稀釋液(5號液)1 滴，再分別加入待檢的樣本50ul，混勻。同時設陰性、陽性及空白對照各 一孔，陰性、陽性對照與待檢樣本同步處理，空白對照孔僅加入樣本稀釋 液(5號液)2滴。37。C避光反應30分鐘后甩去孔內液體，每孔加洗滌液(2 號液)1滴，立即用蒸餾水注滿，靜置30秒后甩去，再直接用蒸餾水洗滌四 次，甩去，拍干。
2. 加酶反應除空白對照孔外其余每孔加酶結合物(l號液)2滴，37°C 避光反應30分鐘后甩去孔內液體，如上洗滌，拍干。
3. 顯色反應加底物(3號液)和顯色劑(4號液)各1滴，混勻，37。C下避 光顯色10分鐘。加終止液(6號液)1滴，混勻，終止反應(加終止液后藍色 會變為黃色)。TMB溶液作為顯色劑時，可以無須避光顯色反應， 一般顯 色反應的時間也可以稍微延長，例如10 30分鐘。
然后，通過肉眼或酶標儀來比較加入待4企樣本孔內液體與陰性對照品 孔內液體的顏色深淺，進行結果判斷，具體說明如下。
1. 肉眼觀察陰性對照接近無色，陽性對照呈明顯黃色，表示試驗有 效。待檢孔接近無色表示該標本為陰性，待檢孔呈明顯黃色表示該標本為 陽性;'或者待檢樣本孔顏色明顯深于陰性對照品孔，則待檢樣本為肝吸蟲 陽性。
2. 儀器判斷以空白對照調零用酶標儀于450nm(620nm作參比波長) 讀取O.D值，待4全孔O.D值(吸光度)大于陰性對照2.1倍者(含2.1倍) 為陽性。否則，待檢樣本為肝吸蟲陰性。當陰性對照O.D值低于0.05時按 0.05計算。
需要注意的是，
1. 試劑盒在2-8。C下保存，每次取出時先平衡至室溫后使用。滴瓶每次 用后"^定要將蓋擰緊，各瓶蓋之間切不可混用。各試劑盒之間不可混用。
2. 如陰陽對照為凍干品時，請先按標示加入蒸餾水溶解后使用。
3. 洗滌時將蒸餾水加滿孔內，每次停放三十秒鐘，甩去孔內液體。禁 用自來水等其它水源。
4. 為提高試驗的可比性，建議使用儀器判讀結果。
5. 如有條件，最好使用水浴箱孵育。
采用本發明的淡水魚肝吸蟲快速免疫檢測盒，開辟淡水魚肝吸蟲檢測 的新途徑，利用快速免疫檢測技術的敏感性、特異性以及實用性、經濟性，
建立了淡水魚肝吸蟲快速免疫檢測方法；實現了淡水魚肝吸蟲檢測技術商 品化，有力促進淡水魚肝吸蟲監測水平的全面提高，并為魚類肉品的食品 安全監管提供一個值得借鑒的思路，從而推動了肝吸蟲防治工作。這不僅 大大方便了用戶操作，而且還提高了檢測指標的一致性，實用性和可靠性 均得到改善。
本發明的試劑盒方便實用、安全環保，試劑盒不僅配備了檢測所必須 的試劑組分，而且均為即開即用型，用戶不必另行配制或稀釋，使操作簡 單易行。不僅可以用儀器定量判斷結果，也可以肉眼直接判斷，尤適合于
條件受限的現場檢測。本發明采用了無害的TMB試劑，避免了常規方法所 帶來的危害和污染。
應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以 改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護 范圍。'
權利要求
1、一種淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測試劑盒，其盒體內設置酶聯反應板、酶結合物、洗滌液、底物液、顯色劑、稀釋液、終止液；其特征在于，所述酶聯反應板為從肝吸蟲中提取可溶性抗原并純化，然后包被所述可溶性抗原制得的酶聯反應板；所述酶結合物為辣根過氧化酶標記抗魚免疫球蛋白的酶結合物。
2、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶聯反應板是 在通用聚苯乙烯微孔板上包被可溶性抗原，然后在室溫靜置12~24小時， 冷凍真空干燥后裝袋封口制成；其中，所述可溶性抗原是從感染動物中獲 取肝吸蟲成蟲，并提取得到其可溶性抗原；包被液為含0.01°/。-1%可溶性 抗原的緩沖液，所述緩沖液是0.01mol/L 0.15 mol/L的磷酸鹽、硼酸鹽或 石友酸鹽緩沖液，pH7.5 pH9.5。
3、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶結合物為采 用純化的魚免疫球蛋白免疫動物，分離出抗魚免疫球蛋白，經純化后采用 辣根過氧化酶進行免疫標記制成。
4、 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述酶結合物是含 0.05% ~ 1%的辣根過氧化物酶標記抗魚免疫球蛋白的0.01mol/L ~ 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6 ~ 8;并且添加含量足以抑制細菌生長的防腐劑。
5、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，其還至少包括陰性 對照品、陽性對照品其中之一。
6、 根據權利要求l.所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液為包含 有0.1% ~ 1%表面活性劑的0.01mol/L ~ 0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6 ~ 8;底物液為0.1%~0.5%過氧化氫溶液；顯色劑為3，3，,5,5，-四曱基聯苯胺；稀 釋液為0.01mol/L ~ 0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6 ~ 8;終止液為1 mol/L ~ 2 mol/L的硫酸或氯氧化鈉。
7、 一種用于權利要求1所述的試劑盒的檢測方法，其包括步驟 Al、從感染動物中獲取肝吸蟲成蟲，并提取得到其可溶性抗原，在通用聚苯乙烯微孔板上包被所述可溶性抗原，然后在室溫靜置12~24 小時，冷凍真空干燥后制成酶聯反應板，并裝袋封口保存；其中，包被 液是含有0.01% 1%所述可溶性抗原的緩沖液，所述緩沖液是pH7.5 pH9.5的0.01 mol/L ~ 0.15 mol/L的磷酸鹽、硼酸鹽或碳酸鹽緩沖液；A2、采用純化的魚免疫球蛋白免疫動物，分離出抗魚免疫球蛋白， 經純化后采用辣^f艮過氧化酶進行免疫標記制成酶結合物；A3、所述酶聯反應板每孔分別加稀釋液1滴，加入待檢的樣本50ul， 混勻；其中，所述稀釋液為0.01mol/L ~ 0.5mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6 ~ 8;A4、充分反應后甩去孔內液體，每孔加洗滌液1滴后立即注滿純凈 水，靜置30秒后甩去，再用純凈水洗滌至少一次，甩去，拍干；其中， 所述洗滌液為包含有0.1% ~ 1%表面活性劑的0.01mol/L ~ 0.5mol/L磷酸 鹽緩沖液，pH6 8;A5、每孔加酶結合物2滴，充分反應后甩去孔內液體，每孔加洗滌 液1滴后立即注滿純凈水，靜置30秒后甩去，再用純凈水洗滌至少一次， 甩去，拍干；A6、加底物液和顯色劑各1滴，混勻，充分顯色反應后加終止液l 滴，混勻，終止反應；其中，所述底物液為0.1%~0.5%過氧化氫溶液； 所述顯色劑為3,3，,5,5，-四曱基聯苯胺；所述終止液為1 mol/L~2 mol/L的硫酸或氬氧化鈉。
8、 根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，步驟A3中，還 包括步驟設置陰性孔、陽性孔及空白對照孔，陰性孔、陽性孔分別加稀釋液1滴，然后分別加入陰性對照品、陽性對照品各50ul，空白對照孔加 入稀矛奪液2滴。
9、 根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述充分反應為 37。C避光反應30分鐘，所述充分顯色反應為37'C避光反應IO分鐘。
10、 根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，步驟A1中，在 室溫靜置12~24小時之后，還包括步驟采用0.1%~5%卵清蛋白或牛血 清白蛋白封閉2小時，經冷凍真空干燥后制成所述酶聯反應板。
全文摘要
本發明公開了一種淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測試劑盒和檢測方法，該試劑盒的盒體內設置酶聯反應板、酶結合物、洗滌液、底物液、顯色劑、稀釋液、終止液；酶聯反應板為從肝吸蟲中提取可溶性抗原并純化，然后包被可溶性抗原制得的酶聯反應板；酶結合物為辣根過氧化酶標記抗魚免疫球蛋白的酶結合物。通過利用快速免疫檢測技術的敏感性、特異性以及實用性、經濟性，建立了淡水魚類肝吸蟲快速免疫檢測方法；方便實用，試劑盒為即開即用型，用戶不必另行配制或稀釋，操作簡單易行；不僅可以用儀器定量判斷結果，也可以肉眼直接判斷，適合于條件受限的現場檢測；安全環保，采用無害的酶聯免疫顯色劑四甲基聯苯胺，避免了常規方法所帶來的危害和污染。
文檔編號G01N33/543GK101387641SQ20071007697
公開日2009年3月18日 申請日期2007年9月11日 優先權日2007年9月11日
發明者胡紹良, 樂 饒 申請人:深圳市康百得生物科技有限公司
專業數控銑床產品供應商
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