專利名稱：一種博萊霉素單位的hplc分析方法及其流動相的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種博萊霉素單位的HPLC分析方法及其流動相的組成。
技術背景由于環境的惡化和不健康的生活習慣，世界范圍內的腫瘤發病率持續增 高。從1996年以來全球每年新確診的腫瘤患者均在1030萬人以上，到1999 年底全球腫瘤患者總數已逾4000萬人。世界衛生組織2001年報道，世界癌 癥發病率和死亡率比1990年上升了 22%，今后20年還將上升大約50%。博萊霉素是一族具有獨特結構和作用的廣譜抗菌抗腫瘤抗生素，對多種腫瘤疾病有效，并且不引起白細胞減少，不抑制機體免疫功能，不損傷造血 系統。博萊霉素殺傷腫瘤細胞的機制是在體內與鐵和氧結合形成復合物，然 后與染色體作用進攻DNA靶點，引發DNA降解反應，從而通過抑制腫瘤 細胞DNA合成，達到抗腫瘤的效果。所以開發博萊霉素具有重要的現實意 義。博萊霉素的檢測方法在博萊霉素的研究中有相當重要的作用，以往用生 物檢測的方法，其準確性差，且須用大量時間，HPLC方法快速準確，比起 生物檢測有著很大的優越性，但目前所用的HPLC分析方法中的流動相里都 要添加離子對試劑，如美國藥典中分析博萊霉素的HPLC條件中在0.08mol/l 的醋酸溶液里加入戊烷磺酸鈉組成流動相的緩沖溶液。離子對試劑價格昂貴 且一般實驗室并不常備。
發明內容
本發明要解決的技術問題即是克服現有技術的缺陷，提供一種成本低且 易配置的博萊霉素單位的HPLC分析方法的流動相及采用所述流動相的博萊霉素單位的HPLC分析方法。本發明人通過研究發現，在所述HPLC分析方法的流動相中采用較常見 且價格低廉的可溶性硫酸鹽類代替現有離子對試劑，即可取得了良好的效 果。因此，本發明博萊霉素單位的HPLC分析方法中的流動相，其包括 pH3.5 5的緩沖液與極性有機溶劑，該緩沖液包括弱酸溶液和溶于其中的 鹽，其特征在于所述的鹽為硫酸鹽。其中，上述緩沖液的弱酸溶液、極性有機溶劑均可采用現有技術，例如 美國藥典(USP25版)，所述的弱酸溶液為0.08mol/l的醋酸溶液，極性有機 溶劑(有機相)為乙腈和/或甲醇。由于現有HPLC分析方法中采用流動相 梯度洗脫的方法，因此極性有機溶劑在流動相中的比例逐漸由低到高，通常 在5 25% (v/v)范圍內。本發明所說的鹽為電離時生成金屬離子或銨根離子(NH4+)，以及酸根 離子或非金屬離子的化合物。本發明所述的硫酸鹽是可以溶解于上述弱酸溶液的任何硫酸鹽，優選自 硫酸鉀，硫酸鈉和硫酸銨中的一種或幾種。由弱酸溶液和硫酸鹽形成了本發 明流動相的緩沖液。較佳地，所述硫酸鹽在緩沖液中的用量為0.02 0.2。/。(w/v)。其用量過小 會使目的峰理論踏板數下降，用量過大會對液相色譜儀硬件產生不利影響。上述流動相的制備包括將硫酸鹽溶解于弱酸溶液，如1000ml， 0.08mol/l 的醋酸溶液中形成緩沖液，用氨水調節pH至3.5 5;再加入所需比例的有 機相。而本發明博萊霉素單位的HPLC分析方法，其特點在于選用上述流動相。在本發明的HPLC分析方法中，除流動相的組成外，其余條件均可同現 有技術，例如固定相可為Cs或C,8的硅膠柱，柱溫為35 45。C，檢測波長為 290或254nm，流動相流速為0.8-1 ml/min等。另外，流動相也采用梯度洗 脫的方法，極性有機溶劑在流動相中的比例逐漸由低到高，到一定比例后保 持一段時間，通常在約30分鐘的時間內有機相比例在5 25% (v/V)范圍內 升高，保持IO分鐘左右。本發明方法所分析的博萊霉素樣品可以是博萊霉素發酵液提取過程中 間樣品，或者其它博萊霉素樣品，如博萊霉素粗品或精品。這些樣品的定義 及制備方法可參見(Prep Biochem. 1991;21(4):257-68. Bleomycin A2 and B2 purification by flash chromatography for chemical and biochemical studies.Freyder CP, Zhou W, Doetsch PW， Marzilli LG.)本發明的積極進步效果在于現有的博萊霉素HPLC分析方法需要在流動相中加入一定量的離子對試劑，如美國藥典中加入戊烷磺酸鈉。離子對試劑價格昂貴，價格一般在每100克1000 —3000元，且一般實驗室并不常備。 本發明用較常見且價格低廉的可溶性硫酸鹽類(價格大約在每500克10元 左右)代替之，可縮短HPLC樣品分析時間，大大降低流動相配置費用，且 分析效果同現有技術相當。
圖1為本發明實施例1的HPLC圖譜。
具體實施方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。 實施例1用Qs硅膠柱(HypersilODS2， 4.6*250)，柱溫40。C，檢測波長254nm。 流動相配比硫酸鉀1克，溶解在1000ml, 0.08mo1/1的醋酸溶液中，用氨 水調pH5，以乙腈為有機相。流速0.8ml/min，有機相比例在30min內由5
% (v/v)上升到20% (Wv)，并保持10mim HPLC分析的樣品為博萊霉素 提取粗品的水溶液，圖譜如圖1所示。博萊霉素各組分能被良好地分離，目 的峰A2理論踏板數為18563，目的峰B2理論踏板數為16931。作為對照，用上述美國藥典方法，以戊烷磺酸鈉替換本實施例的硫酸鹽， 進行HPLC檢測的結果示目的峰A2理論踏板數為17452，目的峰B2理論 踏板數為16905。實施例2用ds硅膠柱(HypersilODS2， 4.6*250)，柱溫35。C，檢測波長254nm。 流動相配比硫酸銨0.2克，溶解在1000ml， 0.08mol/l的醋酸溶液中，用氨 水調pH3.5，以甲醇為有機相。流速lml/min，有機相比例在30min內由10 。％ (v/v)上升到25% (v/v)，并保持10min， HPLC分析的樣品為博萊霉素 提取粗品的水溶液。博萊霉素各組分能被良好地分離。目的峰A2理論踏板 數為16623，目的峰B2理論踏板數為14785。作為對照，用上述美國藥典方法，以戊垸磺酸鈉替換本實施例的硫酸鹽， 進行HPLC檢測的結果示目的峰A2理論踏板數為16227，目的峰B2理論 踏板數為13985。實施例3用Q硅膠柱(ZORBAX XDB，4.0*200)，柱溫45。C，檢測波長290nm。 流動相配比硫酸鈉2克，溶解在1000ml， 0.08mol/l的醋酸溶液中，用氨 水調pH4.6，以乙腈為有機相。流速0.9ml/min，有機相比例在30min內由8 % (v/v)上升到18% (v/v)，并保持10min， HPLC分析的樣品為博萊霉素 提取粗品的水溶液。博萊霉素各組分能被良好地分離。目的峰A2理論踏板 數為19772，目的峰B2理論踏板數為18306。作為對照，用上述美國藥典方法，以戊烷磺酸鈉替換本實施例的硫酸鹽， 進行HPLC檢測的結果示目的峰A2理論踏板數為19150，目的峰B2理論踏板數為18251。
權利要求
1. 一種博萊霉素單位的HPLC分析方法中的流動相，其包括pH3.5～5的緩沖液與極性有機溶劑，該緩沖液包括弱酸溶液和溶于其中的鹽，其特征在于所述的鹽為硫酸鹽。
2、 根據權利要求1所述的流動相，其特征在于所述的硫酸鹽選自硫酸 鉀，硫酸鈉和硫酸銨中的一種或幾種。
3、 根據權利要求1所述的流動相，其特征在于所述硫酸鹽在緩沖液中 用量為0.02 0.2%(w/v)。
4、 根據權利要求1所述的流動相，其特征在于所述的弱酸溶液為 0.08mol/l的醋酸溶液，其用氨水調節pH至3.5 5。
5、 根據權利要求1所述的流動相，其特征在于所述的極性有機溶劑為 乙腈和/或甲醇。
6、 一種博萊霉素單位的HPLC分析方法，其選用如權利要求1 5任--項所述的流動相。
7、 根據權利要求6所述的HPLC分析方法，其特征在于所述的博萊霉 素是指博萊霉素發酵液提取過程中間樣品，博萊霉素粗品或精品。
全文摘要
本發明公開了一種博萊霉素單位的HPLC分析方法中的流動相，其包括pH3.5～5的緩沖液與極性有機溶劑，該緩沖液包括弱酸溶液和溶于其中的鹽，其特征在于所述的鹽為硫酸鹽。采用本發明流動相的HPLC分析方法，可縮短HPLC樣品分析時間，大大降低流動相配置費用。
文檔編號G01N30/00GK101210911SQ20061014812
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月27日 優先權日2006年12月27日
發明者垚 劉, 李繼安, 陳代杰 申請人:上海醫藥工業研究院
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