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專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)接受基因治療的受治者血清中有復(fù)制能力的病毒的方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)測(cè)定病人血清中是否存在抗體來(lái)檢測(cè)基因治療過(guò)程中是否存在有復(fù)制能力的病毒(RCV)的方法，該方法是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag或Env蛋白的特定抗原部分來(lái)實(shí)現(xiàn)的，基因治療中所使用的病毒載體來(lái)源于該逆轉(zhuǎn)錄病毒。
基因治療是一種醫(yī)學(xué)干涉方法，通過(guò)將正常基因?qū)氲讲∪思?xì)胞中，來(lái)治療由基因突變或代謝紊亂引起的疾病。毫無(wú)疑問(wèn)，生物和遺傳工程技術(shù)在將來(lái)會(huì)繼續(xù)快速發(fā)展，所以預(yù)計(jì)基因治療會(huì)成為一種治療目前不能治愈或難以治愈的疾病的最有效的方法。
基因治療的最重要部分是載體系統(tǒng)，它用來(lái)將用于治療的基因?qū)肷矬w。目前廣泛使用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺伴隨病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是最常用的，目前用于約50％的臨床試驗(yàn)中。大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來(lái)源于鼠白血病病毒(MLV)。
雖然病毒載體是基因治療的具代表性的選擇，但在它們的應(yīng)用中有一定的安全性問(wèn)題。治療性的病毒載體通過(guò)遺傳工程設(shè)計(jì)為復(fù)制缺陷型，但通過(guò)載體和病人中與病毒基因組類(lèi)似的核苷酸序列之間的同源重組，可以產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒(RCV)。這在用病毒載體進(jìn)行基因治療中存在嚴(yán)重危險(xiǎn)。因此，為確保基因治療的安全性，已經(jīng)發(fā)展了幾種方法來(lái)檢測(cè)RCV。美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)指南規(guī)定，不僅要在重組病毒的產(chǎn)生階段篩查是否有具有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒(RCR)存在，而且需在對(duì)病人給藥病毒載體后進(jìn)行定期篩查。
應(yīng)該在兩個(gè)階段檢測(cè)RCR是否存在。第一個(gè)階段是在病毒載體從生產(chǎn)者細(xì)胞系的產(chǎn)生階段或在用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體體外轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞之前。第二個(gè)階段是在將進(jìn)行遺傳工程操作的細(xì)胞給藥受治者后，其中細(xì)胞含有通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入的用于治療的基因。典型的做法是10-20個(gè)受治者參與I期的臨床試驗(yàn)，以一年三次的頻率監(jiān)測(cè)RCR是否存在。因此在該過(guò)程中耗費(fèi)了大量的人力，時(shí)間和物力。
已經(jīng)有幾種方法用于RCR的檢測(cè)，包括用Mus dunni細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
用Mus dunni細(xì)胞檢測(cè)RCR如下所述。產(chǎn)病毒的細(xì)胞或含病毒的培養(yǎng)上清與含標(biāo)記基因(如潮霉素，LacZ基因)的Mus dunni細(xì)胞共培養(yǎng)。從該共培養(yǎng)物中獲得的上清用來(lái)感染適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞，通過(guò)標(biāo)記基因的表達(dá)監(jiān)測(cè)病毒的存在(Forestell等，J Virol Methods 60171-178，1996)。該方法基于以下原理含有標(biāo)記基因的RCR僅能通過(guò)具有包裝序列而不含有其他病毒序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒與不含有包裝序列的Mus dunni細(xì)胞之間進(jìn)行重組而產(chǎn)生。Mus dunni細(xì)胞也用于S+L-病灶(focus)檢測(cè)(Haapala DK等J Virol.53827-833，1985)。RCR可通過(guò)Mus dunni細(xì)胞與產(chǎn)病毒細(xì)胞或從產(chǎn)病毒細(xì)胞獲得的上清共培養(yǎng)后病灶的形成來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。這些方法要花費(fèi)多于一個(gè)月的時(shí)間，因?yàn)樾枰獛纵喩锨寤虍a(chǎn)病毒細(xì)胞與Mus dunni細(xì)胞的共培養(yǎng)以增加RCR的滴度。另外，S+L-檢測(cè)本身也要另外花費(fèi)5-7天。
逆轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)方法需要根據(jù)以下假設(shè)進(jìn)行，只有通過(guò)重組產(chǎn)生的RCR具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，而用于治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒沒(méi)有。
PCR方法對(duì)RCR的檢測(cè)是通過(guò)一對(duì)引物進(jìn)行的，其中一個(gè)引物序列存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，而另一個(gè)存在于原始病毒上，但不存在于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上。這是臨床試驗(yàn)中最常用的一個(gè)方法，但其自身存在重現(xiàn)性低的問(wèn)題(Long等，Human Gene Ther.91165-1172，1998；Otto等，Human Gene Ther.5567-575，1994)。上述方法都需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和勞力，而且受低重現(xiàn)性和靈敏度的問(wèn)題的困擾。
因此，已經(jīng)進(jìn)行研究以發(fā)展更為經(jīng)濟(jì)的方法，使其需要更短的時(shí)間和更少的樣品，但是仍能保持高的靈敏度。已報(bào)道的一種此類(lèi)的研究是通過(guò)ELISA檢測(cè)是否產(chǎn)生抗MLV的抗體來(lái)檢測(cè)RCR(Martineau等，Human Gene Ther.81231-1241，1997)。然而，由于整個(gè)MLV病毒被作為一個(gè)抗原，該方法的特異性和靈敏度仍不能令人滿(mǎn)意。因此，需要生產(chǎn)具有高特異性和靈敏度的抗原來(lái)解決基于抗原-抗體相互作用進(jìn)行RCR測(cè)定中抗原的特異性，靈敏度及其導(dǎo)致的使用上受限的問(wèn)題，為了克服原有RCR檢測(cè)方法中的問(wèn)題，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種高通量的RCR檢測(cè)方法，它可以在逆轉(zhuǎn)錄病毒基因治療后，使用從MLV衍生的特異抗原與病人的血清反應(yīng)，從而很容易的篩查抗體的產(chǎn)生。該方法基于以下發(fā)現(xiàn)Gag或Env蛋白的特定片段具有RCR檢測(cè)所需的特異性和靈敏度水平。
本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種高靈敏度和經(jīng)濟(jì)的方法，可以高效地并用最少量的樣品來(lái)檢測(cè)受治者中RCR的產(chǎn)生。
本發(fā)明更進(jìn)一步的目的是提供一種通過(guò)病人血清與從MLV的Gag或Env衍生的抗原反應(yīng)來(lái)檢測(cè)RCR的方法，該方法是通過(guò)檢測(cè)受治者中抗RCR的免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的抗體是否存在來(lái)進(jìn)行的。
圖2表示重組質(zhì)粒的構(gòu)建的示意圖，其中編碼病毒蛋白的相應(yīng)DNA片段插入到pMAL-c2載體中，以使MLV Gag的p30(CA)或Env的p15E(TM)可以作為麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)融合蛋白而被表達(dá)。
圖3表示重組質(zhì)粒的構(gòu)建的示意圖，其中相應(yīng)的編碼DNA插入到pET-17b或pET-3a載體中，以使它們可以表達(dá)MLV Env的CA，TM或gp70(SU-1)用來(lái)作為T(mén)7標(biāo)記的蛋白。
圖4a為SDS-PAGE照片，所示的是IPTG誘導(dǎo)前后MLV Gag(CA)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)水平。
泳道1對(duì)照(IPTG誘導(dǎo)的pMAL-c2)泳道2和3IPTG誘導(dǎo)前后的MBP-CA(70kDa)泳道4和5IPTG誘導(dǎo)前后的T7-CA(31kDa)
圖4b為SDS-PAGE照片，所示的是IPTG誘導(dǎo)前后MLV Env(TM和SU-1)蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)水平。
泳道1對(duì)照(IPTG誘導(dǎo)的pMAL-c2)泳道2和3IPTG誘導(dǎo)前后的MBP-TM(57kDa)泳道4和5IPTG誘導(dǎo)前后的T7-TM(17kDa)泳道6和7IPTG誘導(dǎo)前后的T7-SU-1(24kDa)圖5為凝膠照片，所示的為收獲在大腸桿菌中產(chǎn)生的抗原蛋白后經(jīng)柱層析的純化結(jié)果(MBP融合蛋白用直鏈淀粉樹(shù)脂柱，T7-標(biāo)記的蛋白用Sepharose柱)。
泳道1CA，其中MBP部分用蛋白酶因子X(jué)a除去泳道2T7-CA 泳道3MBP-TM泳道4T7-TM 泳道5.T7-SU-1圖6a所示的為顯示W(wǎng)estern印跡的結(jié)果的照片，其中從pMAL-c2，pET-17b或pET-3a中表達(dá)的重組蛋白CA，TM和SU-1與兔抗-CA血清反應(yīng)。
泳道1CA泳道2T7-CA 泳道3MBP-TM泳道4T7-TM 泳道5T7-SU-1圖6b所示的為顯示W(wǎng)estern印跡的結(jié)果的照片，其中從pET-17b或pET-3a中表達(dá)的重組蛋白CA，TM和SU-1與小鼠抗-MLV血清反應(yīng)。
泳道1T7-CA泳道2T7-TM 泳道3T7-SU-1圖7a所示的為進(jìn)行ELISA反應(yīng)后T7-CA以S/CO(樣品吸收值與臨界值(cutoff value)的比)表示的特異性的圖，其中兔抗-CA血清作為陽(yáng)性樣品，而正常兔血清作為陰性對(duì)照。
圖7b所示的為進(jìn)行ELISA反應(yīng)后T7-SU-1以S/CO(樣品吸收值與臨界值的比)表示的特異性的圖，其中小鼠抗-MLV血清作為陽(yáng)性對(duì)照，而正常小鼠血清作為陰性對(duì)照。
圖7c所示的為進(jìn)行ELISA反應(yīng)后T7-CA和T7-SU-1的特異性的照片，其中每個(gè)蛋白單獨(dú)或者共同用作抗原，并且與小鼠抗-MLV血清反應(yīng)。
圖8所示的為特異性測(cè)驗(yàn)的結(jié)果，其中T7-CA，T7-TM和T7-SU-1制成蛋白芯片的形式，并且與兔抗-CA血清(a)，小鼠抗-MLV血清(b)和正常小鼠血清(c)進(jìn)行反應(yīng)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種通過(guò)檢測(cè)病人血清中是否存在抗體來(lái)檢測(cè)基因治療中是否存在有復(fù)制能力的病毒(RCV)的方法，該方法是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒Gag或Env蛋白的一些抗原部分來(lái)實(shí)現(xiàn)的，基因治療中所使用的病毒載體來(lái)源于該逆轉(zhuǎn)錄病毒。
本發(fā)明的RCV檢測(cè)方法通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)檢測(cè)病人血清中抗體是否存在。反應(yīng)中所用的與病人血清反應(yīng)的抗原蛋白的編碼基因不存在于基因治療中所用的病毒載體上，而存在于該載體所來(lái)源的病毒基因組中。
在基因治療中所用的病毒載體通常不能進(jìn)行復(fù)制，因?yàn)榇蟛糠值膅ag，pol和env從原始病毒基因組中除去了。要將它們包裝到病毒顆粒中，需要轉(zhuǎn)染到可以反式(in trans)提供Gag，Pol和Env的包裝細(xì)胞的步驟。因此，Gag或Env的部分作為抗原蛋白是優(yōu)選的，因?yàn)槠渚幋a基因不存在于基因治療中所用的病毒載體上，而存在于該病毒載體所來(lái)源的病毒基因組中。因此，有可能消除病毒載體自身可能產(chǎn)生的假陽(yáng)性信號(hào)，從而使本發(fā)明具有高度特異性。
本發(fā)明中的RCR檢測(cè)方法可用于以逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒及慢病毒作為治療所用的載體的各種情況。而且，本發(fā)明中的RCR檢測(cè)方法也可用于使用逆轉(zhuǎn)錄病毒，特別是鼠白血病病毒(MLV)進(jìn)行的基因治療。
抗原是MLV的Gag或Env蛋白的部分是尤其優(yōu)選的。而且，對(duì)于更高的特異性和靈敏度更為優(yōu)選的是，MLV Gag蛋白的部分包括SEQID2所代表的氨基酸序列，以及MLV Env蛋白的部分包括SEQ ID6所代表的氨基酸序列。
上述抗原性蛋白可以融合蛋白形式生產(chǎn)-與麥芽糖結(jié)合蛋白或由11個(gè)氨基酸構(gòu)成的T7標(biāo)記進(jìn)行融合-以便于純化。
本發(fā)明的基于抗原-抗體反應(yīng)的RCR檢測(cè)方法可通過(guò)各種方法進(jìn)行操作，包括ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)，Western印跡，F(xiàn)LISA(熒光聯(lián)免疫吸附測(cè)定)及其他可檢測(cè)抗原-抗體結(jié)合的分析方法。雖然ELISA和FLISA是優(yōu)選的方法，但偶連ELISA或FLISA的Western印跡和中和測(cè)定方法可提高分析的精確性。而且，本發(fā)明與已知的PCR方法偶連可用于得到同樣的效果。
本發(fā)明中的抗原蛋白可以用自動(dòng)微陣列布放系統(tǒng)(microarrayer)以蛋白芯片的形式進(jìn)行制造，以用來(lái)進(jìn)行分析。應(yīng)用蛋白芯片可完成高通量的自動(dòng)化的高效的反應(yīng)，因?yàn)榇罅康臉悠房梢杂靡粋€(gè)芯片在一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行分析。蛋白芯片是一個(gè)小規(guī)模的固相的矩陣，在其上排列數(shù)十個(gè)到幾百個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)包含1-100pg抗原，并被固定在小規(guī)模固相矩陣上。芯片可以用來(lái)大規(guī)模分析(mass-analysis)，因?yàn)樗梢杂米詣?dòng)化的微陣列布放系統(tǒng)產(chǎn)生。所用的產(chǎn)生上述蛋白芯片的基片可由各種材料制作。優(yōu)選的材料包括玻璃和改性的硅氧烷，和常用的聚合物(例如四氟乙烯，聚苯乙烯和聚丙烯)和凝膠，但并不限于這些材料。雖然包被該微基片的優(yōu)選的材料是氨基烷基硅烷，但也可以使用其他的材料，包括塑料，樹(shù)脂，碳水化合物，硅石，硅石衍生物，碳，金屬，無(wú)機(jī)玻璃，膜或者化學(xué)物質(zhì)，以固定抗原蛋白。
包被了抗原的蛋白芯片可浸入濃度高于50％的醇中。基于用上述包被了抗原的蛋白芯片進(jìn)行的RCV分析，如果病人的血清與使用微陣列布放系統(tǒng)的抗原反應(yīng)，然后與作為第二抗體的結(jié)合了熒光染料的抗人IgG抗體反應(yīng)，那么可進(jìn)行大量-分析(mass-analysis)。結(jié)果可通過(guò)自動(dòng)記錄儀，如高速熒光掃描儀獲得.
本發(fā)明也提供一種診斷試劑盒，可分析接受基因治療的病人血清中RCV的產(chǎn)生。本發(fā)明的試劑盒包含抗原，其編碼基因不存在于基因治療所用的病毒載體上，而存在于該載體所來(lái)源的病毒基因組上。
作為上述過(guò)程中的抗原蛋白，MLV的Gag或Env蛋白的部分是優(yōu)選的。特別是，當(dāng)Gag蛋白的部分包括SEQ ID NO2所代表的氨基酸序列或MLV Env蛋白的部分包括SEQ ID NO6的所代表的氨基酸序列時(shí)更為優(yōu)選。上述的RCR診斷試劑盒可以以蛋白芯片的形式提供，其中的抗原蛋白固定在小規(guī)模的固相矩陣中。
上述的試劑盒包括附加的ELISA，F(xiàn)LISA或Western印跡通常所需的合適的試劑或者器材。
本發(fā)明的RCR檢測(cè)方法中所用的抗原蛋白可通過(guò)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含來(lái)自用于產(chǎn)生治療用重組病毒的病毒基因組的一些基因，以及在大腸桿菌中表達(dá)這些基因等來(lái)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明提供一種包含SEQ ID NO1的核苷酸序列(編碼SEQ ID NO2的抗原)的表達(dá)載體，和一種包含SEQ ID NO5的核苷酸序列(編碼SEQID NO6的抗原)的表達(dá)載體，它們保藏在韓國(guó)微生物保藏中心，保藏號(hào)為KCCM-10173(1999年11月11日)和KCCM-10224(2000年11月10日)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)例中，p30(衣殼蛋白CA，MLV Gag蛋白的部分)，p15E(TM)和gp70(包括脯氨酸-富集序列的上游區(qū)；SU-1)被選作抗原來(lái)檢測(cè)抗MLV的抗體。已知衣殼蛋白p30在大部分逆轉(zhuǎn)錄病毒中高表達(dá)，其氨基酸序列在不同的亞型中高度保守。Env抗原被選作診斷試劑中的主要抗原。雖然Env的氨基酸序列沒(méi)有衣殼蛋白的序列保守，但預(yù)期其免疫性卻更高。而且Env蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)和胞外結(jié)構(gòu)域(SU-1)均被克隆，因?yàn)槎Y(jié)構(gòu)域的抗原性顯得不同。所選擇的抗原(CA，TM和SU-1)在基因組中的位置如

圖1所示。
根據(jù)MLV Gag和Env的氨基酸序列選擇高度保守的區(qū)域。然后通過(guò)PCR得到編碼CA，TM和SU-1的部分的基因，并插入到表達(dá)載體中。可形成MBP融合蛋白的pMAL-c2載體，pET17b和pET3a(表達(dá)T7標(biāo)記的蛋白)被用來(lái)作為表達(dá)載體以利于蛋白的純化。在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)結(jié)果表明，蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和抗原性因序列而異。最明顯的是，由263個(gè)氨基酸構(gòu)成的CA和由197個(gè)氨基酸構(gòu)成的SU-1表現(xiàn)出最高的表達(dá)水平和抗原性。另一方面，插入到pET17b中的SU-1蛋白的表達(dá)水平太低，不能用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
在大腸桿菌中的蛋白表達(dá)，通過(guò)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，并在SDS-PAGE上進(jìn)行檢測(cè)，然后蛋白通過(guò)柱層析進(jìn)行純化。本發(fā)明中的抗原蛋白的表達(dá)水平在加入IPTG之前非常低，但加入IPTG后，增加到總蛋白的10-20％。在純化后所檢測(cè)到的抗原幾乎為單一的條帶，這表明其純度很高(見(jiàn)圖5)。
在本發(fā)明的其他例子中，Western印跡和ELISA被用來(lái)檢測(cè)抗原對(duì)抗MLV抗體的特異性和靈敏度。融合蛋白MBP-CA用蛋白酶因子X(jué)a進(jìn)行處理，以獲得純的CA蛋白。純化的CA腹膜腔內(nèi)注射到兔中，獲得含抗CA抗體的兔血清。抗MLV抗體是通過(guò)將MLV(作為整個(gè)病毒)注射到小鼠尾靜脈中，并從免疫的小鼠中收獲陽(yáng)性小鼠血清得到的。在該例子中使用兔抗CA血清和小鼠抗MLV血清，因?yàn)镸LV在人類(lèi)中感染的病例很少，并且不可能獲得陽(yáng)性的人血清。Western印跡是通過(guò)本發(fā)明的抗原性蛋白與上述兔抗-CA血清或小鼠抗-MLV血清反應(yīng)進(jìn)行的。結(jié)果表明每個(gè)抗原與該抗體特異性地反應(yīng)(見(jiàn)圖6a和6b)。對(duì)Gag而言，CA和T7-CA都非常強(qiáng)烈地與1∶5000稀釋度的兔血清反應(yīng)。但Env蛋白的TM和SU-1沒(méi)有反應(yīng)。而且，只有T7-CA和T7-SU-1與小鼠抗MLV血清反應(yīng)。在兩個(gè)蛋白中，SU-1比CA表現(xiàn)出更強(qiáng)的反應(yīng)性。T7-TM根本沒(méi)有反應(yīng)。
在本發(fā)明的其他例子中，通過(guò)抗原性蛋白與抗體的ELISA反應(yīng)，來(lái)評(píng)估測(cè)定的靈敏度和特異性。ELISA的臨界值(cutoff)為高于陰性對(duì)照的平均吸收值(正常兔血清或正常小鼠血清)0.3的值。結(jié)果表示為S/CO(樣品OD/臨界值)，當(dāng)S/CO大于1時(shí)，被認(rèn)為是陽(yáng)性的。
CA和T7-Ca對(duì)兔抗CA血清的S/CO高于4，并且被認(rèn)為是陽(yáng)性的，但MBP-TM，T7-TM，和T7-SU-1對(duì)兔抗CA血清的S/CO低于1，并且被認(rèn)為是陰性的。這些結(jié)果與前面實(shí)驗(yàn)中的Western印跡是一致的，而且表明本實(shí)驗(yàn)的CA抗原具有高特異性。CA，T7-CA和T7-SU-1對(duì)小鼠抗MLV血清的S/CO高于3，而MBP-TM和T7-TM的S/CO在1-2之間。這些結(jié)果表明這些蛋白的抗原性是不同的。
根據(jù)這些結(jié)果，用顯示高抗原性的T7-CA和T7-SU-1評(píng)估ELISA的敏感性。
在ELISA中，這些抗原的靈敏度的評(píng)估是通過(guò)2倍系列稀釋樣品來(lái)進(jìn)行的。ELISA反應(yīng)用稀釋到1∶640,000的兔血清和稀釋到1∶2560的小鼠血清進(jìn)行。最初的小鼠血清在人血清中進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)阅M人暴露于MLV的狀態(tài)。T7-CA的S/CO直到兔抗-CA血清稀釋到1∶160,000時(shí)仍大于3(見(jiàn)圖7a)，表明其具有高靈敏度。T7-SU-1的S/CO直到小鼠抗MLV血清稀釋到1∶64時(shí)仍大于4(見(jiàn)圖7b)。T7-CA和T7-SU-1的S/CO分別在直到小鼠抗MLV血清1∶64的稀釋度和1∶256的稀釋度時(shí)仍然大于3。當(dāng)兩個(gè)抗原混合時(shí)，S/CO在直到稀釋到1∶256時(shí)仍大于2(見(jiàn)圖7c)，上面的結(jié)果表明CA和SU-1抗原均有高靈敏度和高特異性，這證明它們可以在接受基因治療的病人血清中通過(guò)檢測(cè)MLV抗體，來(lái)檢測(cè)通過(guò)同源重組產(chǎn)生的RCR。T7-SU-1的S/CO隨血清稀釋度的降低比T7-CA的慢。這表明即使T7-SU-1被用作單獨(dú)的抗原，它也能作為一種有效的抗原來(lái)檢測(cè)任何抗MLV的抗體。
本發(fā)明的其他例子中，其中T7-CA，T7-TM，和T7-SU-1抗原被固定在氨基烷基硅烷包被的玻片上的蛋白芯片被用來(lái)研究大規(guī)模分析的應(yīng)用的可行性。T7-CA和T7-SU-1在蛋白芯片上的抗原-抗體反應(yīng)中表現(xiàn)出高的靈敏度和特異性，因此已證實(shí)本發(fā)明的的抗原適于應(yīng)用蛋白芯片進(jìn)行RCR的大規(guī)模分析。
本發(fā)明在以下的實(shí)施例中進(jìn)行詳細(xì)描述。
顯然，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，以下的實(shí)施例是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明而非限定其范圍。
pMLV(Shinnick等，《自然》293543-548，1981)被用來(lái)作為模板，合成的包含適當(dāng)?shù)南拗泼肝稽c(diǎn)的寡核苷酸被用來(lái)作為5’和3’引物擴(kuò)增CA，TM和SU-1。在PCR中所用的引物序列根據(jù)目的基因和限制酶位點(diǎn)以SEQ ID NOs7-14表示并列于表1中。
表1
用MLV HIT456基因組作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)包括30個(gè)循環(huán)，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分30秒。反應(yīng)包括每種引物1ul(10pmol/ul)和0.75mM高保真PCR系統(tǒng)(Roche，美國(guó))。PCR產(chǎn)物連接到pCR Blunt(Invitrogen，The Nethelands)或pCR2.1(Invitrogen，The Nethelands)上。詳細(xì)描述如下，CA基因片段通過(guò)序列為SEQ ID NOs7和9，或7和8的引物的組合進(jìn)行擴(kuò)增，TM基因片段通過(guò)序列為SEQ ID NOs10和12，或11和12的引物的組合進(jìn)行擴(kuò)增，并將它們插入到pCR Blunt載體上。同時(shí)，SU-1基因片段通過(guò)序列為SEQ ID NOs13和14的引物的組合進(jìn)行擴(kuò)增，并將它們插入到pCR2.1載體上。
上述基因克隆到pMAL-c2(New England Biolabs，美國(guó))，pET-17b(Novagen，美國(guó))，或pET-3a(Novagen，美國(guó))上，以MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)融合蛋白，或T7-標(biāo)記的(Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Glu-Glu-Met-Gly)蛋白質(zhì)的形式進(jìn)行抗原表達(dá)。表達(dá)載體的構(gòu)建方案如圖2和3所示。
首先，將用一對(duì)引物SEQ ID NOs7和9擴(kuò)增的CA PCR產(chǎn)物(768bp)插入到pMAL-c2的EcoRI/SalI位點(diǎn)，得到MBP-CA。將用一對(duì)引物SEQ ID NOs8和9擴(kuò)增的CA PCR產(chǎn)物(734bp)插入到pET-17b的BamHI/XhoI位點(diǎn)，得到T7-CA。將用一對(duì)引物SEQ IDNOs10和12擴(kuò)增的TM PCR產(chǎn)物(396bp)插入到pMAL-c2的EcoRI/SalI位點(diǎn)，得到MBP-TM。將用一對(duì)引物SEQ ID NOs11和12擴(kuò)增的TM PCR產(chǎn)物(369bp)插入到pET-17b的BamHI/XhoI位點(diǎn)，得到T7-TM。
將用一對(duì)引物SEQ ID NOs13和14擴(kuò)增的SU-1 PCR產(chǎn)物(591bp)插入到pET-3a的BamHI位點(diǎn)，得到T7-SU-1。來(lái)源于pET-17b和pET-3a的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中。
用T7-CA轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株(BL21-T7-p30)和用T7-TM轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株(BL21-T7-p15E)在1999年11月11日保藏在韓國(guó)微生物保藏中心(保藏號(hào)KCCM-10173，KCCM-10174)。用T7-SU-1轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株(BL21-T7-gp70)在2000年11月10日保藏在同一中心(保藏號(hào)KCCM-10224)。實(shí)施例2在大腸桿菌中表達(dá)和純化MLV抗原用實(shí)施例1中制備的MLV Gag或Env表達(dá)質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在1升LA肉湯(2％細(xì)菌用胰蛋白胨，1％酵母抽提物，2％氯化鈉，1x氨芐青霉素)中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.5。加入異丙基-β-D-硫代吡喃型半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoid)(IPTG)至終濃度1mM以誘導(dǎo)Gag的CA，Env的TM和SU-1的表達(dá)。4℃，5000rpm離心10分鐘收獲細(xì)胞。然后將細(xì)胞沉淀重新懸浮到裂解緩沖液(20mMTris，2mM EDTA，1mM苯基-甲基磺酰化氟，pH8.0)中，冰上放置20分鐘。超聲5分鐘使細(xì)胞裂解，離心得到上清和沉淀。
用SDS-PAGE來(lái)鑒定目的抗原是否存在于上清或沉淀中。上清中的抗原不需要進(jìn)一步的純化，但是在沉淀中的抗原根據(jù)表達(dá)載體用兩種方法進(jìn)行純化。
對(duì)從pET-17b中表達(dá)的抗原，將其沉淀溶解在8M尿素溶液中，調(diào)節(jié)pH到5.6，上樣到用平衡緩沖液(醋酸鈉中的8M尿素，pH5.6)平衡的Q Sehparose Fastflow柱(Amersham Pharmacia，瑞典)中。上樣后，用多于3倍床體積的平衡緩沖液洗柱。監(jiān)測(cè)洗脫液的光密度后，用梯度從50mM到500mM的氯化鈉純化目的蛋白。從pET-3a中表達(dá)的SU-1抗原用同樣的方案進(jìn)行純化，除了溶液的pH調(diào)到pH9.6，用含8M尿素的碳酸鹽緩沖液(碳酸鈉含8M尿素，pH9.6)作為平衡緩沖液，及使用SP Sehparose Fastflow柱(AmershamPharmacia，瑞典)進(jìn)行純化。
對(duì)于從pMAL-c2載體中表達(dá)的抗原，將其沉淀溶解在直鏈淀粉樹(shù)脂平衡緩沖液(20mM Tris-HCl，2mM NaCl，1mM EDTA，10mM巰基乙醇，pH7.4)中，并加樣到用平衡緩沖液平衡的直鏈淀粉柱(NewEngland Biolabs，美國(guó))中。上樣后，用多于10倍床體積的平衡緩沖液洗柱。用洗脫緩沖液(在平衡緩沖液中含10mM麥芽糖)純化目的抗原，并在280nm監(jiān)測(cè)洗脫液的光密度。用因子X(jué)a除去MBP標(biāo)記，并且該產(chǎn)物用于以后的實(shí)驗(yàn)中。
通過(guò)上述過(guò)程得到的抗原純度用SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。在加入IPTG前表達(dá)的抗原很少，而加入IPTG后表達(dá)水平增加到總蛋白的10-20％(見(jiàn)圖4a和4b)。使用柱層析對(duì)收集的包涵體進(jìn)行純化后，檢測(cè)到的抗原幾乎為單一條帶，表明其具有高純度(見(jiàn)圖5)。每個(gè)抗原蛋白的表達(dá)水平列于表2中。
表2
插入到pET-17b上的，通過(guò)一對(duì)序列為SEQ ID NOs13和14的引物擴(kuò)增的SU-1片段(591bp)不用于以后的實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)槠浔磉_(dá)水平太低，如上表所示。實(shí)施例3用MLV抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫從用MLV轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中獲得的病毒上清和通過(guò)除去MBP標(biāo)記來(lái)源于MBP-CA的CA抗原被用來(lái)作為動(dòng)物免疫中的免疫原。用DO-A2-CAT質(zhì)粒通過(guò)3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法(Yuco等，《核酸研究》，23-24，1995)轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞系(293T細(xì)胞)，并且在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，用0.45um的濾膜過(guò)濾培養(yǎng)液，制備包含病毒的上清。對(duì)20只小鼠(5周齡)的尾靜脈用100uL病毒上清在兩周內(nèi)注射4次。
對(duì)CA抗原，通過(guò)用因子X(jué)a處理在實(shí)施例3中純化的MBP-CA獲得CA部分。將它按照1∶1的比例與弗氏完全佐劑(GIbcoBTL，美國(guó))混合，以100ug/ml的濃度對(duì)兩只兔(8周齡)在4周內(nèi)腹膜腔內(nèi)注射3次。
免疫后從動(dòng)物心臟采血，以獲得抗MLV的血清，并且血清與純化的抗體一起用于Western印跡與ELISA中。實(shí)施例4Western印跡用CA，TM和SU-1抗原與實(shí)施例3中獲得的抗CA或MLV的抗體通過(guò)Western印跡分析抗原抗體的相互作用，以檢測(cè)在實(shí)施例2中產(chǎn)生的MLV抗原是否能有效地與MLV抗體反應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)中使用的是兔抗CA血清和小鼠抗MLV血清，因?yàn)樵谌祟?lèi)中MLV感染的病例非常稀少。
純化的抗原用小型凝膠設(shè)備(#SE280，Hoefer Pharmacia Biotech，美國(guó))進(jìn)行SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。將膜在封閉緩沖液(5％脫脂乳，0.1％Tween 20，Tris緩沖鹽)中緩慢振蕩溫育1小時(shí)，然后與1∶5000稀釋度的兔抗CA血清或1∶500稀釋度的小鼠抗MLV血清在室溫下溫育1小時(shí)。用TBST洗膜3次，然后與1∶10000稀釋度(在封閉緩沖液中)的連接辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的羊抗兔或抗小鼠IgG抗體溫育30分鐘。接著，用TBST洗膜3次。然后，加入1ml ECL溶液(魯米諾/增強(qiáng)劑及穩(wěn)定的過(guò)氧化物溶液，Amersham)。然后，將它在室溫下溫育1分鐘，在暗室中曝光底片，然后用顯影液顯示條帶。
Western印跡的結(jié)果表明純化的抗原與抗體特異性地發(fā)生相互作用。對(duì)Gag而言，CA和T7-CA都能與1∶5000稀釋度的兔血清強(qiáng)烈地相互作用。TM和SU-1都不能與兔血清作用(見(jiàn)圖6a)。T7-CA和T7-SU-1都能與小鼠抗MLV血清相互作用。SU-1比CA表現(xiàn)出更強(qiáng)的反應(yīng)性。T7-TM沒(méi)有任何相互作用(見(jiàn)圖6b)。實(shí)施例5ELISA病毒感染性的診斷通常是通過(guò)ELISA進(jìn)行的。用ELISA來(lái)確定是否本發(fā)明中的抗原具有RCR檢測(cè)的ELISA所需的特異性和靈敏度。將實(shí)施例2中純化的抗原在50mM碳酸鈉緩沖液(pH9.6)中稀釋到終濃度5ug/ml，然后將100ul稀釋的抗原加入到96孔板的每個(gè)孔中，室溫下放置18小時(shí)。然后，在每個(gè)孔中加入100ul含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(PBS)(Ph7.2)。室溫下溫育1小時(shí)后，將血清樣品加入到板中。兔抗CA血清和小鼠抗MLV血清作為陽(yáng)性對(duì)照，正常兔或小鼠血清作為陰性對(duì)照。100ul 1∶1000和1∶10稀釋度的每種血清(封閉緩沖液中含0.25％Tween 20)加入到每個(gè)孔中，在37℃溫箱里溫育1小時(shí)。溫育后，用PBST(在PBS中含0.05％的Tween 20)洗板5次，然后在每個(gè)孔中加入100ul 1∶10000稀釋度的HRP-連接的羊抗兔或抗小鼠IgG抗體。板在37℃溫箱里溫育30分鐘，用PBST(在PBS中含0.05％的Tween 20)洗板5次。然后加入100ul四甲氧基聯(lián)苯胺(tetramethoxybensidine)(TMB)，室溫下溫育30分鐘。加入100ul 0.5N的硫酸終止反應(yīng)。在450nm測(cè)定吸收值。
本實(shí)驗(yàn)中的ELISA臨界值為高于陰性對(duì)照的平均值0.3的值。結(jié)果以S/CO(樣品OD/臨界值)的形式給出，并且當(dāng)S/CO大于1時(shí)，該樣品被認(rèn)為是陽(yáng)性(表3)。
表3
CA和T7-CA對(duì)兔抗CA血清的S/CO高于4，并且被認(rèn)為是陽(yáng)性的。但是，MBP-TM，T7-TM和T7-SU-1的S/CO低于1，并且被認(rèn)為是陰性的。這些結(jié)果與Western印跡的結(jié)果是一致的，而且表明本發(fā)明所用的CA抗原具有很高的特異性。該實(shí)驗(yàn)中所用蛋白的抗原性是不同的，因?yàn)镃A，T7-CA和T7-SU-1對(duì)小鼠抗-MLV血清的S/CO高于3，而MBP-TM和T7-TM的S/CO在1-2之間。根據(jù)這些結(jié)果，用顯示高抗原性的T7-CA和T7-SU-1對(duì)ELISA的靈敏度進(jìn)行了評(píng)價(jià)。實(shí)施例6CA和SU-1的ELISA靈敏度實(shí)施例5的結(jié)果表明，T7-CA和T7-SU-1對(duì)兔抗-CA和小鼠抗-MLV血清具有很高的特異性。由于靈敏度是大量分析中一個(gè)很重要的因素，所以用ELISA評(píng)估抗原的靈敏度。將2倍系列稀釋的血清樣品加到包被了T7-CA和T7-SU-1的孔板中，這些蛋白在前面的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的反應(yīng)性，并且ELISA如實(shí)施例5所述進(jìn)行操作。兔血清稀釋到1∶640000的最終稀釋度，而小鼠血清稀釋到1∶2560的最終稀釋度。最初的小鼠血清在人血清中進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)阅M人暴露于MLV的情況。
抗原的靈敏度以S/CO值的形式如圖7所示；T7-CA對(duì)兔抗CA的S/CO見(jiàn)圖7a，T7-SU-1對(duì)小鼠抗MLV的S/CO見(jiàn)圖7b，T7-CA和T7-SU-1對(duì)小鼠抗MLV的S/CO見(jiàn)圖7c。
如圖7a所示，T7-CA表現(xiàn)出高靈敏度，其與高到1∶640000稀釋度的兔抗CA血清的S/CO仍大于3，而與正常兔血清的S/CO小于1(圖7a)。T7-SU-1對(duì)正常小鼠血清是陰性的，但對(duì)小鼠抗MLV血清為陽(yáng)性的，并且與高到1∶64稀釋度的S/CO仍大于4(圖7b)。T7-CA和T7-SU-1與高達(dá)1∶64稀釋度和1∶256稀釋度的小鼠抗MLV血清的S/CO分別大于3。當(dāng)兩種抗原混合時(shí)，與高達(dá)1∶256稀釋度的S/CO仍大于2(圖7c)。這些結(jié)果表明，CA和SU-1抗原具有足夠水平的靈敏度和特異性，可以被用來(lái)通過(guò)檢測(cè)接受基因治療的病人血清中MLV抗體，來(lái)檢測(cè)通過(guò)同源重組產(chǎn)生的RCR。
T7-SU-1的S/CO隨稀釋度的降低的速率比T7-CA慢。因此，即使T7-SU-1作為單獨(dú)抗原，其也可以作為有效的抗原來(lái)檢測(cè)抗MLV抗體的存在。實(shí)施例7應(yīng)用蛋白芯片進(jìn)行FLISA在應(yīng)用本發(fā)明的抗原進(jìn)行RCR檢測(cè)時(shí)，如使用由自動(dòng)微陣列布放系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白芯片，則可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量的樣品進(jìn)行分析。為了考察用這種蛋白芯片進(jìn)行RCR檢測(cè)的可行性，本發(fā)明人用GMS 417ArrayerTM(Genetic MicroSystems，美國(guó))將純化的抗原固定在載玻片上制成蛋白芯片，并通過(guò)FLISA評(píng)估其反應(yīng)性。
T7-CA，T7-TM和T7-SU-1以濃度100微克/毫升加到96孔板上，將板放在微陣列布放系統(tǒng)中。將10皮升的每種抗原點(diǎn)到一個(gè)2.5×7.5厘米的顯微鏡栽玻片(Sigma，美國(guó))上，包括4組，每組由400個(gè)點(diǎn)組成。用4個(gè)針孔和環(huán)以一種排列模式進(jìn)行點(diǎn)樣，所用的玻片用氨基烷基硅烷進(jìn)行包被。
將包含樣點(diǎn)的栽玻片在室溫下放置40分鐘，然后將栽玻片浸入到100％的乙醇中對(duì)包被的抗原進(jìn)行固定。通過(guò)乙醇處理，抗原通過(guò)其氨基基團(tuán)與包被在栽玻片上氨基烷基硅烷的烷基基團(tuán)結(jié)合而被固定，然后將栽玻片進(jìn)行徹底干燥。
用實(shí)施例5所述的每種抗原制得的蛋白芯片進(jìn)行ELISA。在實(shí)驗(yàn)中使用了兔抗CA血清，小鼠抗MLV血清和正常小鼠血清。單獨(dú)的抗體與每個(gè)芯片進(jìn)行反應(yīng)，并且點(diǎn)在封口膜(parafilm)上的抗體緊密附著在該栽玻片的表面，以一致性地應(yīng)用抗體。抗原-抗體反應(yīng)后，用高速熒光掃描儀GMS 418 Array Scanner(Genetic MicroSystems，GM200)檢測(cè)熒光，該熒光是由熒光相連的抗-兔或抗-小鼠IgG抗體產(chǎn)生的。栽玻片的表面用飛點(diǎn)顯微鏡在532nm進(jìn)行讀數(shù)，得到的數(shù)據(jù)用ImageneTM(Genetic MicroSystems，2.0版本)分析該表達(dá)的數(shù)據(jù)的軟件進(jìn)行分析(見(jiàn)圖8)。
圖8a所示的為使用兔抗CA血清的結(jié)果，而圖8b和c為使用小鼠抗MLV血清和正常血清的結(jié)果。T7-CA與兔抗-CA血清和小鼠-抗MLV均強(qiáng)烈反應(yīng)。另一方面，T7-TM不與兔抗CA血清反應(yīng)，而與小鼠抗MLV血清反應(yīng)。但T7-TM與兔血清的反應(yīng)性低于T7-CA的。T7-SU-1與兔抗CA血清顯示陰性反應(yīng)，而與小鼠抗MLV血清有強(qiáng)烈的陽(yáng)性反應(yīng)。這些結(jié)果與實(shí)施例5和實(shí)施例6中的ELISA結(jié)果是一致的。T7-CA，T7-TM和T7-SU-1不與正常的小鼠血清反應(yīng)。以上結(jié)果清楚地表明本發(fā)明的CA和SU-1抗原既具有高靈敏度，也具有高度的特異性。
序列表<110>金善榮<120>一種檢測(cè)接受基因治療的受治者血清中有復(fù)制能力的病毒的方法<130>OPF0068/PCT<150>KR99-50510<151>1999-11-15<160>14<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>768<212>DNA<213>鼠白血病病毒<220><221>CDS<222>(1)..(768)<223>編碼部分的Gag蛋白的DNA，p30(CA)<400>1gga aac gga cag ctt caa tac tgg ccg ttc tcc tct tct gac ctt tac 48Gly Asn Gly Gln Leu Gln Tyr Trp Pro Phe Ser Ser Ser Asp Leu Tyr15 1015aac tgg aaa aat aat aac cct tct ttt tct gaa gat cca ggt aaa ctg 96Asn Trp Lys Asn Asn Asn Pro Ser Phe Ser Glu Asp Pro Gly Lys Leu2025 30aca gct ctg atc gag tct gtt ctc atc acc cat cag ccc acc tgg gac 144Thr Ala Leu Ile Glu Ser Val Leu Ile Thr His Gln Pro Thr Trp Asp3540 45gac tgt cag cag ctg ttg ggg act ctg ctg acc gga gaa gaa aaa caa 192Asp Cys Gln Gln Leu Leu Gly Thr Leu Leu Thr Gly Glu Glu Lys Gln505560cgg gtg ctc tta gag gct aga aag gcg gtg cgg ggc gat gat ggg cgc 240Arg Val Leu Leu Glu Ala Arg Lys Ala Val Arg Gly Asp Asp Gly Arg65 70 7580ccc act caa ctg ccc aat gaa gtc gat gcc gct ttt ccc ctc gag cgc 288Pro Thr Gln Leu Pro Asn Glu Val 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1.一種檢測(cè)接受使用病毒載體的基因治療的受治者中有復(fù)制能力的病毒的方法，該方法包括受治者的血清與一種抗原蛋白進(jìn)行反應(yīng)，該蛋白是由不存在于病毒載體上，而存在于該病毒載體所來(lái)源的病毒基因組中的基因所編碼的；并在受治者的血清中檢測(cè)抗體蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的病毒載體來(lái)源于逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒或慢病毒。
3.權(quán)利要求2的方法，其中的逆轉(zhuǎn)錄病毒是鼠白血病病毒。
4.權(quán)利要求1的方法，其中的抗原蛋白是鼠白血病病毒的Gag或Env蛋白的部分。
5.權(quán)利要求4的方法，其中的鼠白血病病毒的Gag蛋白的部分具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求4的方法，其中的鼠白血病病毒的Env蛋白的部分具有SEQ ID NO6的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1的方法，其中的抗原蛋白呈與麥芽糖結(jié)合蛋白或由11個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的T7標(biāo)記的融合蛋白形式。
8.權(quán)利要求1的方法，其中的抗原檢測(cè)步驟是由選自酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，Western印跡和熒光聯(lián)免疫吸附的方法進(jìn)行的。
9.權(quán)利要求1的方法，在反應(yīng)步驟前進(jìn)一步包括用自動(dòng)微陣列布放系統(tǒng)將抗原固定在蛋白芯片上。
10.一種用來(lái)檢測(cè)接受使用病毒載體的基因治療的受治者中有復(fù)制能力的病毒的診斷試劑盒，它包括一種抗原蛋白，該蛋白是由不存在于病毒載體上，而存在于該病毒載體所來(lái)源的病毒的基因組中的基因所編碼的。
11.權(quán)利要求10的診斷試劑盒，其中的病毒載體來(lái)源于逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒或慢病毒。
12.權(quán)利要求10的診斷試劑盒，其中的抗原蛋白是鼠白血病病毒的Gag或Env蛋白的部分。
13.權(quán)利要求12的診斷試劑盒，其中的鼠白血病病毒的Gag蛋白的部分具有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求12的診斷試劑盒，其中的鼠白血病病毒的Env蛋白的部分具有SEQ ID NO6的氨基酸序列。
15.權(quán)利要求10的診斷試劑盒，其中的抗原蛋白固定在蛋白芯片的微基片上。
16.一種表達(dá)載體，該載體包含編碼用于檢測(cè)有復(fù)制能力的病毒的抗原蛋白的SEQ ID NO1的核苷酸序列(KCCM-10173)。
17.一種表達(dá)載體，該載體包含編碼用于檢測(cè)有復(fù)制能力的病毒的抗原蛋白的SEQ ID NO5的核苷酸序列(KCCM-10224)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)接受基因治療的受治者血清中是否存在有復(fù)制能力的病毒的方法，該方法包括用特異性抗原檢測(cè)血清中的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的抗體的步驟。該抗原的基因不存在于用于基因治療的病毒載體中，而僅存在于該病毒載體來(lái)源的病毒基因組中，并且該抗原優(yōu)選地選自鼠白血病病毒的部分的Gag和部分的Env蛋白。同時(shí)還提供了其氨基酸序列包括SEQ ID NO2或SEQ ID NO6的序列的抗原，由于其特異性和靈敏度，它們?cè)诨诿庖叻磻?yīng)的RCR檢測(cè)中用處很大。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1411513SQ00817358
公開(kāi)日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2000年11月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月15日
發(fā)明者金善榮, 樸銀珍, 羅英順, 柳承信 申請(qǐng)人:迪吉株式會(huì)社