結核分枝桿菌抗原特異性hla-a*0201限制性表位肽及應用的制作方法
【專利摘要】首次揭示一組具有較高免疫原性的結核分枝桿菌抗原特異性HLA-A*0201限制性表位肽。所述表位肽是PPE68來源的、HLA-A*0201限制性的CTL表位肽，可誘導高水平的CTL反應。
【專利說明】結核分枝桿菌抗原特異性HLA-A*0201限制性表位肽及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術和醫藥領域；更具體地，本發明涉及結核分枝桿菌抗原特異性HLA-A*0201限制性表位肽及應用。
【背景技術】
[0002]結核(Tuberculosis,TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所引起的慢性傳染性疾病，其目前是全球感染性疾病死亡的主要病因之一。2010年度世界衛生組織關于結核的報告指出:全球約1/3的人群感染過MTB，每年新增加大約940萬感染者，且2009年度約有170萬人死于結核。自1921年始，BCG(卡介苗)作為疫苗開始用于預防人類結核，然而，BCG的免疫效果并不太理想，表現為不能誘導持續性保護性免疫以及在免疫缺陷者(如艾滋病患者)中可恢復毒力進而引起結核。
[0003]MTB株和BCG株的基因組對比實驗顯示:各種MTB株中均存在一種獨特的基因區域RD-1 (Region of differencel)，而BCG株則缺乏該基因區域。若將RDl基因插入BCG中，則可顯著提高BCG誘導保護性免疫的效率。RDl可編碼MTB特異性抗原PPE68 (GenBankAccession:YP_007270600 ;368aa)，其表達于MTB細胞膜和細胞壁中的ΡΡΕ68。大量研究證實:PPE68蛋白可以誘導強烈的CD8+T細胞(細胞毒性T細胞，CTL)反應，其可保護小鼠抵抗MTB的感染；而且，PPE68還可在結核患者體內誘導強烈的CTL反應，改善結核患者預后。
[0004]由于目前BCG預防結核分枝桿菌的效果有限，因此迫切需要開發新的可用于防治結核性疾病的疫苗，尤其是 安全性和特異性高的CTL表位肽疫苗。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供結核分枝桿菌抗原特異性HLA_A*0201限制性表位肽及應用。
[0006]在本發明的第一方面，提供一種分離的多肽，所述的多肽是選自如SEQ ID N0:USEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。
[0007]在一個優選例中，所述的多肽來源于結核分枝桿菌。
[0008]在另一優選例中，所述的所述的多肽來源于抗原PPE68。
[0009]在本發明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制備誘導發生細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應的藥物組合物。
[0010]在一個優選例中，所述的細胞毒性T淋巴細胞分泌IFN- Y的細胞。
[0011]在另一優選例中，所述的細胞毒性T淋巴細胞是HLA_A*0201限制性的細胞毒性T淋巴細胞。
[0012]在本發明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于制備診斷或防治(預防或治療)結核分枝桿菌感染性疾病的藥物組合物。
[0013]在一個優選例中，所述的結核分枝桿菌感染性疾病包括(但不限于):結核病。[0014]在本發明的另一方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有:
[0015]有效量的所述的一種或多種多肽；和
[0016]藥學上可接受的載體。
[0017]在一個優選例中,所述的藥物組合物是疫苗。
[0018]在本發明的另一方面，提供所述的藥物組合物的用途，用于制備誘導發生細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應的藥盒。
[0019]在本發明的另一方面，提供所述的藥物組合物的用途，用于制備診斷或防治(預防或治療)結核分枝桿菌感染性疾病的藥盒。
[0020]在本發明的另一方面，提供一種藥盒，所述的藥盒中含有:一種或多種所述的多肽；或所述的藥物組合物。
[0021]本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1、多肽PPE68133_141的質譜圖。
[0023]圖2、多肽PPE68166_174的質譜圖。
[0024]圖3、多肽PPE68126_134的質譜圖。
[0025]圖4、多肽PPE68148_156的質譜圖。
[0026]圖5、多肽與HLA_A*0201分子的結合力。圖中紅色實心圖為未加多肽的T2細胞的流式圖(背景對照)，黑色空心圖為加lμg/ml多肽的T2細胞的流式圖(實驗組)，綠色空心圖為加10 μ g/ml多肽的T2細胞的流式圖(實驗組)，藍色空心圖為加100 μ g/ml多肽的T2細胞的流式圖(實驗組)。
[0027]圖6、結核痊愈者外周血單個核細胞(PBMC)中肽特異性CTL的ELISP0T檢測。上圖為部分ELISP0T結果圖，下圖為10名HLA-A*0201陽性結核痊愈者PBMC的ELISP0T結果的統計圖，*表示肽刺激組與無肽刺激組間比較有統計學差異。
[0028]圖7、表位肽免疫的HLA_A*0201轉基因小鼠脾細胞中肽特異性CTL的ELISP0T檢測。上圖為部分ELISP0T結果圖，下圖為表位肽免疫的HLA-A*0201轉基因小鼠脾細胞的ELISP0T結果的統計圖(每組5只小鼠)，*表示肽刺激組與無肽刺激組間比較有統計學差異。[0029]圖8、表位肽免疫的HLA_A*0201轉基因小鼠淋巴結細胞中肽特異性CTL的ELISP0T檢測。上圖為部分ELISP0T結果圖，下圖為表位肽免疫的HLA-A*0201轉基因小鼠淋巴結細胞的ELISP0T結果的統計圖(每組5只小鼠)，*表示肽刺激組與無肽刺激組間比較有統計學差異。
[0030]圖9、表位肽免疫的HLA_A*0201轉基因小鼠脾細胞的CTL殺傷實驗。表位肽免疫的HLA-A*0201轉基因小鼠脾細胞殺傷負載相同表位肽的脾細胞的效應(每組5只小鼠)，效應細胞/靶細胞(E/T)=l或5。
【具體實施方式】
[0031]本發明人經過深入而廣泛的研究，首次揭示一組具有較高免疫原性的結核分枝桿菌抗原PPE68特異性HLA-A*0201限制性表位肽。所述表位肽是PPE68來源的、HLA_A*0201限制性的CTL表位肽，可誘導高水平的CTL反應。
[0032]本發明公開了四條結核分枝桿菌抗原PPE68特異性HLA_A*0201限制性表位肽(PPE68133_141，PPE68166_174，PPE68126_134 和 PPE68148_156)。表位肽均由九個天然氨基酸殘基組成，其序列分別為:ALTEMDYF1、KLEPMASIL、GINTIPIAL和ALAMEVYQA。本發明的優點在于:本發明表位肽是結核分枝桿菌抗原PPE68來源的、HLA-A*0201限制性的⑶8+T細胞(CTL)表位，可誘導高水平的⑶8+T細胞。
[0033]CTL亦叫TC細胞(cytotoxic T cell)，是白細胞的亞部，為一種特異T細胞，專門分泌各種細胞因子參與免疫作用。本領域公知，CTL對病毒、腫瘤細胞等抗原物質具有殺傷作用，可與自然殺傷細胞構成機體抗病毒、抗腫瘤免疫的重要防線。
[0034]本發明涉及結核分枝桿菌抗原PPE68特異性HLA_A*0201限制性表位肽及應用。本發明表位肽是結核分枝桿菌抗原PPE68來源的、HLA-A*0201限制性的⑶8+T細胞(CTL)表位，可誘導高水平的CD8+T細胞。
[0035]本發明人首先通過對結核分枝桿菌抗原PPE68采用T細胞表位預測軟件SYFPEITHI預測，選擇合成了多條有可能與HLA-A*0201分子結合并誘導機體產生CTL反應的抗原肽，通過MHC-肽復合物穩定性實驗，篩選出與HLA-A*0201分子具有高結合力的表位肽PPE68133_141，PPE6816 _174，PPE68126_134和PPE68148_156，并對其免疫原性進行評估，發現結核痊愈者PBMC中存在肽特異性CTL，而且這些肽可以在HLA-A*0201轉基因小鼠脾細胞和淋巴結細胞中誘導出肽特異性的HLA-A*0201限制性的CTL。
[0036]如本文所用，所述的“HLA_A*0201限制性的CTL表位肽”是指具有SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽(如表1)或其衍生肽，其是PPE68特異性的，具有誘導發生細胞毒性T細胞(CTL)反應的功能。所述的“HLA-A*0201限制性的CTL表位肽”在文中也簡稱為“本發明的表位肽”或“所述的表位肽”。本文所述的“CTL表位肽”是指含有CTL表位的氨基酸序列的蛋白；該蛋白或含有該蛋白的組合物可引發哺乳動物免疫應答。本發明中，術語“多肽”、“蛋白”可互換使用。
[0037]表1
[0038]
【權利要求】
1.一種分離的多肽，其特征在于，所述的多肽是選自如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2,SEQID NO: 3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽來源于結核分枝桿菌。
3.權利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制備誘導發生細胞毒性T淋巴細胞反應的藥物組合物。
4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的細胞毒性T淋巴細胞分泌IFN-Y的細胞。
5.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的細胞毒性T淋巴細胞是HLA-A*0201限制性的細胞毒性T淋巴細胞。
6.權利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于制備診斷或防治結核分枝桿菌感染性疾病的藥物組合物。
7.—種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有: 有效量的權利要求1所述的一種或多種多肽；和 藥學上可接受的載體。
8.權利要求7所述的 藥物組合物的用途，其特征在于，用于制備誘導發生細胞毒性T淋巴細胞反應的藥盒。
9.權利要求7所述的藥物組合物的用途，其特征在于，用于制備診斷或防治結核分枝桿菌感染性疾病的藥盒。
10.一種藥盒，其特征在于，所述的藥盒中含有:一種或多種權利要求1所述的多肽；或權利要求7所述的藥物組合物。
【文檔編號】G01N33/68GK103965289SQ201310047705
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月6日 優先權日:2013年2月6日
【發明者】文金生, 李強, 郭江龍, 李靜, 王思娜 申請人:溫州醫學院
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