專利名稱：抗體文庫篩選的方法
技術領域：
本發明涉及篩選分子文庫的方法，尤其是噬菌體展示文庫，以鑒別或選擇其中一種或多種成員，所述成員是一種或多種靶體的候選結合伴侶(partners)，尤其是細胞表面分子的候選的結合伴侶。本發明進一步涉及到從其它文庫成員中分離所述靶體的備選結合伴侶的經改進的方法。
背景技術：
噬菌體抗體展示技術被證明是一項非常適于抗體的篩選和選擇以確定目標抗原的技術(綜述見Hoogenboom等人，1998，Immunotechnol.，41-20)。大量的方案依賴于可以獲得純化和/或重組的抗原，所述抗原在被固定至固體載體上之后被篩選。
探測細胞表面的分化和鑒別某些細胞類型或疾病相關的狀態特有的細胞表面分子的結合伴侶是開發標靶向治療的最有前途的方法。然而，對這些結合伴侶的鑒別往往是挑戰性的實驗。
鑒別細胞表面分子的結合伴侶的常規方法是基于將細胞在含有復合的噬菌體展示單鏈Fv(scFv)文庫的懸浮液或培養基中孵育，隨后進行幾次清洗(通常5次或更多)以及對結合的噬菌體的酸或堿洗脫(例子見Hoogenboom等人，1999，Eur.J.Biochem.，260774-784；Ridgeway等人，1999，Cancer Reserch，592718-2723；Wong等人.，2001，Cancer Immunol.Immunother.，5093-101)。在這之前，通常通過對不相關的細胞類型進行陰性淘洗除去不相關的結合伴侶。最近更加改進的和更加高通量的方法是將所述細胞固定至硝化纖維素薄膜之后，用噬菌體展示文庫篩選細胞(Radosevic等人，2003，J.Immunol.Methods，272219-233)。
使用噬菌體展示文庫對細胞表面結合蛋白的篩選、選擇和分類的常規方法的可選擇的和節省時間的方法已被Giordano等人闡述，且被稱為BRASIL方法(Biopanning and Rapid Analysis of SelectiveInteractive Ligands，2001，Nature Med.，111249-1253)。這個方法基于對游離的和細胞結合的噬菌體的單步驟的有機相分離，相對于所述常規方法的清洗步驟(即自由噬菌體從細胞中清洗除去的步驟)而言，該方法的清洗步驟具有的本質優點是避免了密集勞動、效率低以及造成細胞和潛在配體流失。
發明內容
令人驚奇地，人們現在發現，與BRASIL方法教導的相反，篩選、選擇和鑒別細胞表面分子結合伴侶的顯著改進的方法涉及在有機相分離之前，使所述細胞至少經受一次清洗步驟。與如上所述的常規的清洗和洗脫方法相比，所述方法還表現出顯著的進步。
概括而言，本發明因而提供一種篩選分子文庫以鑒別或選擇其中一種或多種成員的方法，所述成員是一種或多種靶體的候選的結合伴侶，所述方法包括(a)用一種或多種靶體接觸表達文庫；(b)使所述靶體經受至少一次清洗的步驟；(c)通過有機相的分離，從未結合的所述表達文庫成員中分離出與表達文庫的一種或多種成員結合的所述靶體，從而從其他文庫成員中分離出所述靶體的候選的結合伴侶。
可選擇地被認為，本發明提供一種在表達文庫中從其他未結合的文庫成員中分離出與靶體結合的候選結合伴侶的方法，該方法包括在此限定的步驟(a)至(c)。
根據本發明的，被篩選的分子文庫可為任何蛋白質表達文庫，即任何肽或多肽表達文庫。適宜的表達文庫的例子為公知且在本領域中已被描述，并且包括展示文庫如噬菌體展示文庫(例如，Winter等人，WO90/05144；McCafferty等人，WO92/01047)，細菌(例如，Samuelson等人，2002，J.Biotechno.96，129-154)，共價或非共價展示文庫例如核糖體展示文庫(例如出版的科羅拉多(Colorado)大學董事會(Regents)的WO92/02536，大學研究公司(University ResearchCorporation)的WO93/03172以及川崎(Kawasaki)的WO91/05058)或PROfusion文庫(Phylos公司)，其中所述表達蛋白質與編碼其的mRNA連接，或者共價或非共價展示系統借此所述表達蛋白質與編碼其的DNA連接(例如通過如在Actinova有限公司的WO98/37186中描述的系統中的共價連接或通過如在WO04/022746中描述的順式展示(cis-display)系統中的順式作用蛋白質)，或者酵母展示系統(例如，Wittrup，K.D.等人，WO99/36569；Wittrup，K.D.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12，395-399；Lee，S.Y.等人(2003)Trends in Biotechnol.21，45-52中描述的那些)，或者細菌雙雜交系統(例如，Chien等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88,9578)。可容易地被使用的表達文庫的可選擇類型例如細菌表達文庫或其他文庫，其中蛋白質作為可溶的片段被表達和分泌。化學的文庫也可被篩選，例如合成的肽文庫。在本發明中使用的優選的文庫為噬菌體展示文庫。
由所述表達文庫表達的蛋白質可為任何適宜的長度，只要所述的長度足以能夠使得蛋白質作為(或潛在地作為)靶體的結合伴侶。因此，所述蛋白質可為短的線性肽段(例如，在長度上達到5-50或7-30個氨基酸的數量)，或可折疊的而不是線性的較長的肽段或多肽。與如Giordano等人所描述的現有技術BRASIL方法相反，見前，相對于短肽文庫而言，本發明的方法對于篩選包括較長多肽的表達文庫，更具體地為抗體表達文庫表現出有用的優勢。
因此，表達文庫的所述蛋白質可由整個基因或其片段編碼，例如，編碼所述表達文庫成分的核苷酸可為cDNA或mRNA文庫或其片段，例如由特定的細胞類型產生，或者可為基因組DNA文庫或片段。
優選的表達文庫表達多肽結合伴侶，所述多肽結合伴侶為候選的配體、受體、酶、基質、抗原等等，或者其片段，更加優選的表達文庫表達抗體分子或抗體片段，所述抗體分子或抗體片段可隨后被用于篩選與一種或多種已知或未知目標抗原結合的候選物。所述抗體表達文庫可表達任意適宜形式的抗體，且可包括整個抗體分子或抗體片段如單鏈抗體(例如scFv)、Fab、Fv、Fab’2、雙價抗體(diabodies)，雙特異性抗體(bispecific antibodies)、微型抗體(minibodies)、重鏈或輕鏈、cameloid抗體、四元體(tetrabodies)、單域抗體、三元體等等。抗體片段的優選形式為scFv片段。
所述抗體分子或片段可為任何Ig同種型，如IgG、IgM或IgA等等，且所述表達文庫可包括一種或多種這些抗體的亞型。
許多抗體文庫為已知并在本領域中被描述，且任何這些都可使用本發明的方法進行篩選。
當本文提到表達文庫時，該術語可被用于提示在核苷酸或蛋白質水平的文庫，即在所編碼的蛋白質的表達發生之前或之后。然而顯而易見，該表達文庫必須在蛋白質水平，以為了發生與靶體的相互作用。
構建這些表達文庫和編碼它們的核苷酸的方法在本領域中公知且被描述，且任何公知的表達文庫或新開發的表達文庫可在此使用。例如，這些文庫可包括天然產生的多肽或其片段，或者可整體或部分地隨機或合成。例如，對于抗體表達文庫，通過從來自健康捐獻者的原生的淋巴細胞種群(例如根據EP-A-368684中的描述)，或者從富集的淋巴細胞種群，例如從暴露于抗原或用疫苗或如腫瘤細胞免疫的患者中分離的淋巴細胞(例如根據Affitech AS的WO03/095491中的描述)，或者對特定抗原的淘洗而富集到的淋巴細胞種群中克隆核苷酸得到所述文庫。
所述表達文庫，尤其是所述抗體表達文庫可從任何適宜的來源中得到，尤其哺乳動物來源，更加優選地是人源。也可使用嵌合表達文庫或人源化表達文庫。所述文庫還可通過選擇天然產生的骨架且在適宜的位置所包括的隨機序列而產生。可選地，所述骨架可基于從各種天然產生的結構中得到的一種或多種一致的序列。
一般地，用于制備所述文庫結構成分的技術應該基于已知的基因工程技術。在這點上，編碼實際的蛋白質或肽的核苷酸序列被整合入適于所使用的表達系統類型的表達載體中，所述實際的蛋白質或肽將在表達文庫中表達且通常在不同的文庫成員之間改變，因此提供了文庫多樣性。用于噬菌體展示、共價和非共價展示、細菌表達等等的適合的表達載體為本領域公知常識且被描述(例子參見前面討論的表達文庫文獻)。如果選擇噬菌體展示為表達文庫，那么可使用或者噬菌體或者噬粒載體，盡管優選為噬粒載體。
一旦產生編碼不同文庫成員的核苷酸分子(即編碼在文庫成分之間變化的肽段)后，在篩選之前，使用標準的技術，例如通過包括以受控制的(例如，定點誘變)或隨機的方式增加、刪除和/或取代一個或多個核苷酸的突變，或者通過結構域交換、盒式誘變(cassettemutagenesis)、鏈重組(chain shuffling)等等，所述核苷酸分子還可被進一步分化。合成的核苷酸可用于產生各種分化的核苷酸序列。因此，可以化學合成編碼所述表達的多肽核苷酸的全部或部分，或衍生于各種有機體或細胞類型。
所述文庫的結構成分可選擇地另外包括其他適合的成分，例如復制起點、啟動轉錄的可誘導的或非誘導的啟動子、增強子、抗生素抗性基因和標記、常規標簽或報導分子、通過例如PCR能擴增所述結構成分的引物結合位點，或其他所需的序列元件。適當的來源和這些附加的成分在所述文庫結構成分中定位以使得它們執行所需的功能屬于本領域普通技術人員的常規實踐。
在本發明中使用的表達文庫中，包含標記或報導分子可以特別有用。這些標記或報導分子可直接地或間接地被檢測，且包括例如可被抗體識別的短序列標簽、放射性標記、熒光標記或能被酶檢測的標記。可使用的其他標記包括結合配對的一方，如鏈霉素親和素生物素。這些標記為存在于所有文庫結構成分中的典型的一般標記，且能用于檢測文庫成員的存在。此外，檢測的信號強度還可用于確定存在的特殊文庫成員的含量。該存在的文庫成員的定量在測定靶體對文庫成員的親合力中可證明非常有用。可選地或另外，如果例如構成所述文庫分子的一種或多種核苷酸用不同的標簽標記，或固定至不同大小或不同標記的珠體上，可獲得關于成員內容的信息，例如核苷酸的序列。
在本發明的一個實施例中，其中本發明的方法與AffiSelect(親和選擇)方法結合(見下文)，那么在文庫結構成分和表達文庫成員(候選的結合伴侶)中對常規標簽或標記的包含尤為重要，且這些標簽用于促進文庫成分(候選的結合伴侶)與固體相結合。適合的標簽和標記在說明書中關于AffiSelect方法的下文中描述。
此處使用的術語“靶體”是指意在從表達文庫中鑒別出結合伴侶的相關實體或分子，且所述實體或分子附著在或以某種方式相關聯至易于通過有機相分離的部分，例如當應用適合的分離條件，優選為離心力時，將穿過有機相且在有機相底部采集到的部分。這些靶體可為已知或未知的意在鑒別候選的結合伴侶的分子。
這些靶體還必須能夠結合于所篩選的蛋白質表達文庫成員或與其相互作用。因而所述靶體是能與蛋白質或肽結合的實體，且可以是蛋白質/肽、糖肽、碳水化合物、脂類、糖脂、化學小分子、核苷酸等，其附著于適當的部分或以某種方式與其相關聯(例如，存在于適當部分的表面)，所述適當的部分可通過有機相例如細胞或固相，尤其是微粒固相，例如珠體而被分離出來。因而，這些靶體可以是附著于整個細胞或作為整個細胞的組分的細胞表面分子，或是細胞膜片段，或是分子，例如附著于固相的游離的、裸露的、獨立的或純化的分子，或附著于固相的細胞膜片段。優選的靶體為蛋白質或肽，例如抗原。更加優選的靶體為細胞表面分子(即原位存在于細胞表面的分子或細胞膜片段)，且尤其是細胞表面蛋白質或肽，例如細胞表面抗原。
在本發明的實施例中，當所述靶體是附著于固相表面的分子時，那么這個分子可從任何適合來源中得到，即可為天然產生的蛋白質、碳水化合物、脂類、糖脂等等，所述分子從其天然環境中被分離或純化出，或可以是重組的或合成的分子，例如重組蛋白質或肽或合成的化學分子。在這方面，分離、純化的或重組的抗原是特別優選的靶體。
此處使用的術語“細胞”是指相關的任何類型的生物微粒，其能通過有機相被分離。例如該術語包括原核細胞諸如細菌、病毒(尤其是凝聚的病毒微粒，例如通過抗體或化學修飾而凝聚的微粒，或相對于水相，更優選用有機相包被的病毒微粒)、真核細胞(包括低等真核細胞諸如酵母細胞和高等真核細胞諸如哺乳動物細胞，尤其是人類細胞)。正常情況下密度不足以通過有機相而被分離的生物微粒被基本排除在此處使用的術語“細胞”之外。細胞的片段也包含在這個術語的范圍內，例如膜片段、細胞壁片段、細胞壁蛋白質、膜蛋白質等等，只要它們保留或被賦予了通過有機相能被分離的能力。(例如，對于細胞壁蛋白質和膜蛋白質，它們可能需要被凝聚以有助于通過有機相而分離)。
所述細胞可為天然產生的細胞或細胞的混合物(例如，從活體組織或來自哺乳動物受試對象的一些其他樣品中得到的細胞)，或細胞系(包括無限生長分裂的細胞和基因工程細胞系，例如用編碼特定靶體的核苷酸轉化或轉染的細胞，或用靶體的文庫例如cDNA文庫，轉化或轉染的大量細胞，隨后所述靶體表達在所述細胞的表面)，等等。優選的靶體的文庫是由疾病相關實體產生的文庫，例如疾病相關細胞或者與病理相關因子如病毒或細菌。特別優選的文庫為腫瘤細胞文庫或病毒性細胞文庫(例如，c-DNA文庫)以使腫瘤或病毒相關蛋白質的候選結合伴侶能夠得以鑒別。適合用于轉染的真核細胞(或其他細胞類型)在本領域中公知且被記載，例如COS細胞，且可以使用其中的任意一種。也可使用過量表達所述靶體的細胞。
在本發明中使用的優選的“細胞”為真核細胞或其膜片段。特別優選的細胞是這些與疾病狀態相關的細胞，例如癌癥細胞或細胞系，例如乳腺癌或肺癌細胞或細胞系，或從疾病患者中得到的淋巴細胞(例如，外周血淋巴細胞)，或感染了病毒并因此在其表面遞呈病毒蛋白質的細胞。
在本發明的方法中使用的細胞可從任何適合的來源中得到，例如該細胞可直接來自哺乳動物受試對象或可從體外培養得到。如果使用體外培養，那么所述細胞可以在懸浮液中或以單層培養，且以活的或固定的狀態用于本發明的方法中。通常優選地使用活細胞，因為在所述細胞表面的靶體以其天然的形式存在，這意味著選出的候選的結合伴侶識別天然形式的靶體，因此增加了這些候選的結合伴侶用于治療或診斷的機會。在本發明的方法中通常優選的是使用新鮮分離的細胞，而不是冰凍的或貯藏的細胞。然而，對組織切片和冰凍材料進行淘洗也是可能的。
在本發明的一個實施例中，當靶體附著于固相的表面時，可使用任何適合的固相，只要其能通過有機相被分離。本領域普通技術人員可容易的選擇能達到這個效果的適合密度、大小和形狀的固相。然而，可以看到的是特別優選微粒固體支持物以達到這個效果。特別優選的支持物為任選的磁性或至少可磁化的珠體，例如可使用帶有超順磁性微粒的聚合珠體。在本領域中這些支持為公知并有文獻記載，且選擇在本發明中使用的最適合的載體屬于本領域普通技術人員的常規實踐。
尤其優選微粒支持物，例如珠體，因為其易于在體外凝聚且有利于自動控制。例如如果珠體為磁性的，其通過磁場可從樣品中分離并隨后被清洗。可選地，如果珠體為帶標記的，例如帶有熒光標簽，該珠體可通過流式細胞儀而被分離。合適的標簽化、非標簽化和磁性的珠體可從Dyno Specialty Polymers AS公司，利尼史特朗(Lillestrm)，挪威和戴諾生物科技有限公司(Dynal Biotech ASA)商業獲得。此處描述的可在本方法中使用的磁珠的具體的例子是來自戴諾生物科技有限公司，挪威的M-450、M-270、M-280珠體。此處描述的可在本方法中使用的非磁性珠的具體例子是5μm的甲基丙烯酸縮水甘油酯微珠(Bangs Laboratories公司，卡梅爾(Carmel)，印第安納州(IN))。將生物分子靶體附著于固相的方法在本領域中公知并記載。
此處與術語“靶體”結合使用的“一種或多種”是指一種或多種靶體的不同的類型，例如一種或多種不同的細胞表面分子或多肽。換句話說，本發明的方法可用于篩選一個靶體或者大量靶體或靶體文庫(例如能用于文庫對文庫的篩選，這尤其有用)的候選的結合伴侶。如果篩選中涉及大于一個的靶體，這些靶體可以附著于或相關聯于相同或不同的易于通過有機相分離的部分。例如，可以看到的是如果靶體是附著于整個細胞的細胞表面分子或其膜片段，那么有希望能鑒別大量不同細胞表面分子的候選的結合伴侶(換句話說，這是進行篩選靶體文庫的候選結合伴侶情況的一個例子，即一種文庫對文庫的篩選形式)。當然，如果需要，這個步驟可朝向選擇特定細胞表面分子的候選結合伴侶，例如，在下列情況下，具有免疫決定性靶體的細胞，或選擇的已知細胞或被選擇以過量表達相關靶體的細胞或被設計以過量表達該靶體的細胞。靶體文庫的另外一個例子為轉染的且在細胞中表達的c-DNA文庫或其他基因文庫，例如在真核細胞中轉染和表達的消減的腫瘤c-DNA文庫。
當然，在篩選反應中各靶體可以多拷貝形式存在(事實上，這通常為優選的)，例如，如果靶體為細胞表面分子，那么其多拷貝優選地存在于相同的細胞上和/或相同或不同類型的多個細胞上。
在本發明一個尤為優選的實施例中，所述表達文庫為抗體文庫(更加優選為噬菌體展示抗體文庫)且所述靶體為細胞表面分子(細胞表面抗原)。該篩選方法被稱為基于細胞的抗體篩選(Cell BasedAntibody Selection，(CBAS))。
使所述靶體與所述表達文庫進行接觸的步驟可以根據條件以任何適合的方式進行，反之亦然，以使得所述表達文庫中的適合的候選結合伴侶能與存在的靶體相互作用或結合。該條件通常基于所述表達文庫、靶體和與靶體相關聯的所述部分的性質而變化。然而，本領域普通技術人員可容易地確定有助于結合的適合的條件。該“接觸”步驟通常發生在溶液中或在水基質中或一些其他的環境中，以使得所述表達文庫-靶體混合物與所述有機相不能融合，因為這將有利于隨后的有機相分離步驟。因此，如果所述靶體存在于單層培養的細胞上，或者從哺乳動物受試對象獲得的細胞上，例如哺乳動物的器官或組織，那么在與所述表達文庫接觸之前，這些細胞通常通過合適的技術被收獲并在含水基質中被重新懸浮。然而，使所述表達文庫與單層細胞接觸也是可能的，之后這些細胞通過適合的方法被收獲和在含水基質中被重新懸浮。
示例性的“接觸”條件可包括在冰上或在4℃下孵育30分鐘至4小時。可選地，在室溫或37℃下可以進行接觸步驟且在一些情況下為優選的。所述表達文庫-靶體混合物可選擇地經受輕搖、混合或旋轉。此外，可添加其他適合的試劑，如阻斷劑以降低非特異性結合。例如可使用1-4％BSA或其他適合的阻斷試劑(如牛奶)。然而應當意識到的是，根據所述篩選方法的目的，本領域普通技術人員可改變和調整所述接觸條件。例如，如果升高孵育溫度，例如至室溫，這可增加鑒別靶體不同亞型的結合物的可能性，例如易于內在化的細胞表面蛋白質的結合物。另外對這些條件的修改屬于本領域普通技術人員的實踐范圍。
本發明的方式中使用的表達文庫的大小和多樣性，以及包括在接觸步驟中的靶體拷貝的總量可變化。例如，在本發明的優選實施例中，當表達文庫為噬菌體展示文庫時，優選地使用滴度在108-1013范圍內的噬菌體，更加優選地在1011范圍內。
可通過改變與靶體相關聯存在的部分的數量而方便地改變靶體的拷貝數。例如，當靶體為附著于固相的細胞表面分子，或多肽等等，那么可通過升高或降低存在于接觸混合物中的細胞或固體支持物的量，或通過升高或降低附著于單獨的固體支持物的多肽等的量，來調節靶體的量。此外，所需的靶體的量可通過反復實驗而被容易地確定，但是例如當靶體為細胞表面分子時，可方便地使用105-107的細胞。
通過反復實驗法也可容易地確定靶體的適合濃度，但是例如當靶體為細胞表面分子時，可方便地使用1×105-2×106細胞/ml的濃度。
在適合的條件下使靶體與所述表達文庫接觸，以發生所述靶體和適合的文庫成員之間的結合/相互作用，在此之后，且在有機相分離之前，進行所述清洗步驟(b)。非常值得注意的是所要求的篩選方法不排除在所述方法其他時刻進行的額外的清洗步驟，例如在步驟(a)之前，例如在制備用于與所述表達文庫接觸的靶體的中，或在步驟(c)之后如所述靶體或表達文庫成員的進一步分析中。然而，在使所述表達文庫與所述靶體接觸的步驟之后以及在有機相分離之前，不涉及清洗步驟的方法屬于例外情形(例如，BRASIL方法，Giordano等人，見前)。
根據所述靶體和其所附著的部分的性質，可以任何適合的方法實施所述清洗步驟。例如，如果所述靶體附著于細胞或細胞的膜片段，那么通過在一定條件下將所述表達文庫-靶體混合物離心而方便地進行所述的清洗，以使得所述細胞形成團塊，除去上清液，隨后將所述團塊重新懸浮在適合的水基質中(例如與進行所述接觸步驟相同的基質)。這些使細胞成團塊和重新懸浮的步驟將構成一個清洗步驟。該條件通常也適于對與微粒固相相關聯的靶體的清洗。然而，如果所述靶體與例如磁性固相相關聯，那么可通過向進行所述接觸步驟的容器施加磁場、除去上清液以及將固相重新懸浮在適合的水基質中而方便地進行所述清洗步驟(b)。清洗微粒固相的適合的方法為本領域普通技術人員所公知。此外，這些磁性分離和重新懸浮的步驟構成一次清洗步驟。
在本發明的方法中至少進行一次清洗步驟(b)，例如可進行至少1次、至少2次、至少3次，或至少1次清洗步驟。優選地進行小于5次的清洗步驟，即優選地在步驟(b)中進行1、2、3或4次清洗步驟。更加優選地在所述方法的步驟(b)中進行1或2或3次且更加優選地2次清洗步驟。這些清洗步驟的優選次數具有額外的優點，而且所述方法相比于包含至少5次清洗步驟的常規方法仍然為顯著地更為快速和所需勞力更少。
這些清洗步驟將導致部分的非結合表達文庫成員除去，即未與靶體相互作用或未特異性相互作用的成員。隨后非結合的表達文庫成員的另一部分在所述方法的步驟(c)中除去，即有機相分離步驟。
為了有利于所述有機相分離，在清洗步驟(b)之后，使含在適合的極性基質例如含水基質中的所述靶體與有機相接觸。所述含水基質可覆蓋在所述有機相的頂部或所述有機相位于所述含水基質的頂部。在前一種情況中，當被離心時，所述結合的靶體在所述有機相中聚集且優選地成團塊，而非結合的文庫成員保留在含水基質中。在后一種情況中，當被離心時，含未結合的表達文庫成員的含水基質向上穿過所述有機相，同時所述結合的靶體在有機相下聚集且優選地成團塊。可選擇地，還可將兩相混合，其隨后在離心時分離。由此，獲得相同的結果。
此處使用的術語“有機相”是指不可與水或其他極性基質或含水基質混合的流動相。作為適于在本發明中使用的有機相，當經受適合的條件，例如離心時，所述有機相可使結合的靶體-表達文庫成員復合物從非結合的表達文庫成員中分離，例如使所述結合的靶體-表達文庫成員復合物通過并將排除所述表達文庫的未結合成員，也就是排除所述表達文庫的非復合的或游離的成員。顯然任何這樣的實驗系統并非100％完美。因此，適合的有機相是排除大量或絕大部分表達文庫未結合成員的有機相，或者是基本排除表達文庫未結合成員的有機相。
此外，選擇適合的有機相，以使得其對所述靶體、所述靶體所附著的部分、所述表達文庫成員和混合物中在所述靶體和文庫成員之間的結合反應的破壞或損害最小。尤其是對于所述靶體、表達文庫成員和兩者間的結合反應。例如，應當對有機相進行選擇，以使得一旦從所述有機相中收集到這些成分，則它們適于在任何適合的下游分析步驟中使用。然而，通常為了使所述有機相可能對混合物中生物分子的任何負面影響最小化，所述生物分子接觸所述有機相的時間通常保持在最低值。
，本領域普通技術人員可以基于上述功能要求容易確定在所要求的方法中使用的適合的有機相。可在所要求的方法中使用的有機相的例子為基于鄰苯二甲酸酯的有機相，諸如在Giordano等人(見前)討論的內容，例如雙丁基鄰苯二甲酸酯∶環己烷(9∶1[v∶v])或者雙丁基鄰苯二甲酸酯∶鄰苯二甲酸二異辛酯(4∶6[v∶v])，或水不可混合的油諸如Versilube F50油(Alfa Chemicals有限公司，沃瑞漢姆(Woringham))。實際上，為了將表達文庫-靶體復合物(具體地為噬菌體-靶體復合物)從未結合的表達文庫成員(具體地為未結合的噬菌體顆粒)中分離，使用與水不能混合的油構成本發明的另一方面。
通過有機相的分離通常通過以適當速度離心至使所述靶體成團塊狀或至少使所述靶體聚集而進行，所述靶體(結合的靶體)在有機相中與表達文庫的一種或多種成員結合，然而所有的，或大部分的，或大量的未結合表達文庫成員保留在含水的相中。影響分離的適合的離心條件取決于所述靶體(以及其其所附著的部分)和使用的具體有機相的性質。然而，當使用細胞且細胞表面分子為靶體時，示例性的條件可為在室溫或4℃下10000-11000g離心5-10分鐘。
在離心步驟(c)之后，所述結合的靶體可從有機相中收集且可選地進行下一步分析。如果需要，通過冰凍所述有機相并轉移含有所述結合靶體的團塊，例如通過在適合的位置切割離心管可以有助于該收集步驟。后接解凍步驟(在收集到結合靶體后的某些時刻)的這種冰凍步驟對所述結合的靶體-表達文庫成員復合物的下游分析通常不具有負面影響。然而，應當提醒的是在任何包含該步驟的實驗程序之前，應當在恰當的實驗中對此加以核查。
本發明的方法可涉及另外的附加步驟。例如，在使所述表達文庫與所述靶體在所述方法的步驟(a)中接觸之前，通過將所述表達文庫與一種或多種非相關的實體(非靶體)例如非相關的生物分子實體，或非相關的細胞接觸，可預淘洗所述表達文庫以除去一些非需要的表達文庫成員或降低所述文庫的多樣性。這種預淘洗也被稱為“陰性淘洗”。例如，所述表達文庫可用不相關的細胞，或其膜片段進行預淘洗，例如所述細胞不表達所需的相關靶體或以低水平表達靶體。例如，如果所述方法被設計成鑒別與特定癌細胞類型結合的表達文庫成員，可通過將所述表達文庫與不同或不相關的細胞類型接觸而進行預淘洗，例如不同類型的腫瘤細胞或非腫瘤細胞例如外周淋巴細胞或內皮細胞或其他不相關的細胞。所述預淘洗步驟的目的是除去部分的不與相關的靶體結合的表達文庫成員。所述預淘洗步驟為所述方法的步驟(a)，(b)和(c)的附加步驟，因而所要求的方法的步驟(a)，(b)和(c)不包含該預淘洗步驟。所述預淘洗步驟可通過任何適合的方法進行，例如通過常規的方法或甚至如上所述的BRASIL方法。然而，優選地所述預淘洗步驟采用前面概括的步驟(a)，(b)和(c)進行，除了在步驟(a)中所述表達文庫與非相關實體(非靶體)接觸且應當保留非結合的表達文庫成員。因此，應當保留而不是丟棄來自任何清洗步驟(b)的上清液，且在分離步驟(c)中保留未通過有機相分離的未結合的文庫成員。隨后，被刪減的該表達文庫被用于進行本發明的方法。
可以對相同或不同的非相關單位實體進行一輪或多輪預淘洗。
可以認為本發明的方法的步驟(a)至(c)構成了相對于表達文庫成員的靶體的一輪淘洗。盡管在第一輪淘洗的分離步驟(c)之后，所述結合的靶體可從有機相中被收集且可選擇地進行進一步的分析，然而通常，為進一步降低所述表達文庫的多樣性和獲得適當富集的所述靶體的候選結合伴侶種群以能夠進行生產性的和時效性的進一步分析，可進行一輪或多輪的進一步的淘洗。
進一步的淘洗回合通常涉及到從所述方法的步驟(c)獲得結合靶體、從靶體中分離、分開、洗脫或離析出所述表達文庫成員(可選地擴大或放大所述表達文庫成員)，并對所述表達文庫成員實施另一輪所述方法的步驟(a)至(c)。進行這些操作的最佳方法將根據使用的表達文庫而改變。例如，對于噬菌體展示文庫，可用與細菌一起孵育所述靶體-結合噬菌體復合物。這將從所述靶體中洗脫出噬菌體并感染細菌，以使得所述噬菌體微粒被放大而備用，例如用于所要求的方法的步驟(a)中。
如果有多輪淘洗，本領域普通技術人員能容易的確定所必需或最佳的淘洗次數。例如，如果所述表達文庫為噬菌體展示文庫，或實際上為非噬菌體文庫，針對來自所述方法步驟(c)的對應于靶體的候選結合伴侶進行的簡單的多克隆ELISA分析可給出陽性候選物存在的比例以及是否需要另一輪的淘洗的提示。關于這點，與靶體(例如，設在相關的細胞上)而不是與非靶實體(例如，由不相關的細胞提供)(作為比較對照)結合的文庫成員(例如，噬菌體)的增加足以顯示已進行了足夠次數的淘洗回合。因為各輪淘洗(所述方法的步驟(a)至(c)的每一輪的重復)可造成所需的表達文庫成員的損失，淘洗的輪次通常保持為最低值。實際上，單獨基于清洗步驟，此處描述的改進的方法相對于BRASIL方法和常規方法具有進一步的優勢，因為在比較實驗中可以看出幾輪淘洗之后能獲得適當的富集。例如，在此描述的試驗中，相對于3輪(常規方法)或4輪(BRASIL方法)，本發明的改進的方法在2輪淘洗后就表現出適當的富集。
因此，所述方法的步驟(a)至(c)可重復一次或多次，例如達4至5次。然而，在本發明優選的實施例中，在所述候選結合伴侶和/或所述靶體經受進一步分析之前，僅進行1，2或3輪淘洗(即1，2或3輪步驟(a)至(c))。
對比實驗還表明，此處描述的改進的方法可造成所述靶體的結合伴侶的數量有所增加的鑒定結果，即可造成陽性克隆的數量有所增加的鑒定結果。例如，在3輪淘洗之后，相比于BRASIL方法的12％和常規方法的28％，由本發明的方法選擇的候選結合伴侶對靶體表現出41％的陽性。
因此，可選擇的看來，本發明提供一種鑒別靶體的結合伴侶的改進的方法，所述方法包括進行此處限定的一輪或多輪步驟(a)至(c)。
當然，如果最初篩選的表達文庫含相對少數的成員或者是例如富集的文庫，如像在WO03/095491(見前)中描述的那樣從暴露于免疫刺激原(immunochallenge)的患者中分離的抗體文庫，那么不需要進一步的淘洗輪回。另外，本領域普通技術人員可以容易地知道這些情況，例如采用前面描述的方法。
一旦進行了任何適合的進一步的淘洗輪次，那么所述結合的靶體從步驟(c)的有機相中收集并可進行進一步的分析或使用。所述進一步的分析或使用通常需要將所述候選結合伴侶從所述靶體中分開，移除、離析或洗脫，且優選地所述候選結合伴侶獨立于所述靶體而被表達或被產生。因此，本發明的方法可包括可選的步驟(d)，其中所述候選結合伴侶從所述靶體中被分開、移除、洗脫，或優選地被分離，或獨立于所述靶體而被表達或被產生。例如，在表達文庫為噬菌體文庫且所述靶體為細胞表面分子的情況中，所述進一步的分析或使用通常涉及通過感染細菌而分離候選結合伴侶以及將編碼所述候選結合伴侶的DNA克隆至合適的表達載體中。這種感染步驟還可以擴增候選結合伴侶。對于非噬菌體文庫，在該階段通過適合的方法可擴增候選結合伴侶，例如通過對編碼所述候選結合伴侶的核苷酸進行PCR操作或將所述核苷酸轉化至適合的宿主細胞(就合適的表達載體而言)。
所述的進一步分析可涉及到對與靶體結合的表達文庫成員(即所述候選結合伴侶)和所述靶體本身或兩者之一的進一步分析。因此本發明的方法允許篩選和鑒別新型的表達文庫成員(新型的結合伴侶)和新型的靶體，例如新型的細胞表面分子或蛋白質，如新型抗原。
分析所述表達文庫成員(候選結合伴侶)的適合方法對于本領域普通技術人員而言眾所周知。通常地，在所述進一步的分析中的第一個步驟涉及分析或測試以確認所選擇的表達文庫成員(候選結合伴侶)確實與目標靶體結合。關于這點可使用任何適合的分析方法。然而，如前所述，關于這一點通常可使用多克隆ELISA分析。如前所述，該確認步驟還提供指示，所述指示是關于何時能夠富集到所選擇的文庫成員以結合所述相關靶體，以致可停止篩選且可開始對所選擇的克隆的更詳細的分析。
因此，一旦完成確認步驟，通常跟著進行單克隆的分析。這個分析可通過標準方法進行。例如對于噬菌體表達文庫而言，這種分析包括將噬菌體遞呈的多肽克隆成可溶解的形式(例如，將噬菌體遞呈的scFv克隆成可溶解的scFv或Fab形式)并采用溶解形式的多肽進行對細胞(Hoogenboom等人，1999，見前)或純化抗原(使用可溶解片段)的ELISA分析、過濾篩選分析(Radosevic等人，見前)、流式細胞儀(FACS)分析、Guava分析(Gills和Fishwild，Application noteMonoclonal Antibody Specificity using the Guava CellPaint Assay，GuavaTechnologies公司，2004)或免疫熒光分析(Wong等人，見前)、染色組織切片或細胞以及其他免疫組織化學方法。所有這些方法已在文獻中詳細記載，其中的一種或多種可用于分析所述克隆。可選擇地，直接的篩選方法，如在WO03/095491中所述的方法，或FMAT分析儀(8200檢測系統-應用生物系統(Applied Biosystems))可用于進一步研究所述克隆的特征。最后，被稱為AffiSelect的方法可用于進一步分析所述候選結合伴侶。這個方法的細節在下面獨立的部分討論。
對于非噬菌體表達文庫而言，當使用展示文庫時，那么編碼所述候選結合伴侶(其連同表達的多肽一起被選擇)的DNA可克隆至合適的表達載體(如果需要在PCR之后將RNA文庫成員轉變成DNA)，并且所表達的多肽可如上所述被分析。對于可溶解的肽或多肽文庫，在所述候選結合肽段上相關聯的標簽可用于鑒別所選擇的肽段的序列，它們或者在體外合成并如上所述進行分析，或者確定編碼所述肽段的DNA序列并將其插入到適合的表達載體中并且如前所述對表達的肽進行分析。因此，對所述候選結合伴侶的進一步分析，優選地涉及到所述候選結合伴侶的表達或產生，優選地以可溶解的形式，并分析或測試所述候選者對相關靶體的結合活性。可使用任何適合的結合分析方法。然而，優選的分析方法為一個或多個ELISA、過濾篩選分析、FACS、免疫熒光分析、免疫組織化學分析、Guava分析、8200細胞檢測分析或AffiSelect分析(見下文)。
作為陰性對照，還方便地相對于非目標實體對所述備選的結合伴侶進行篩選，例如不相關的細胞類型或在表面不表達靶體或以低水平表達靶體的細胞類型，或不相關的裸露或純化的分子，酌情而定。
在所有這些方法中(除了下面將詳細描述的AffiSelect方法)，通過使用能識別在表達文庫成員上某種類型的標簽或標記的試劑，有助于結合的候選結合體的檢測。例如，如果所述表達文庫為噬菌體文庫，可通過使用噬菌體包被蛋白質的抗體，例如，抗-Fd抗體進行檢測。如果使用其他類型的展示文庫或可溶性文庫，那么同樣地，通過使用整合入文庫成員中標簽的抗體，例如myc標簽的抗體進行檢測。在本領域中適合的標簽和檢測系統為公知并被描述。
在任何階段，通過對編碼DNA的限制性酶切并隨后進行測序或PAGE分析，可檢測所述候選結合伴侶的分化度。同樣，在本領域中這些方法為公知并被描述(Hoogenboom等人，見前，Ridgway等人，見前)。
在本發明的實施例中，當靶體為未知的分子時，例如未知的細胞表面分子，尤其是未知的腫瘤表面分子，那么其性質也可被容易地分析，并且使用從所述表達文庫鑒別出的特異性結合伴侶作為工具來識別靶體。當所述結合伴侶為抗體分子，例如scFv分子時，這尤為方便。例如，如上面討論的，來自所述表達文庫的這些結合伴侶通常被改造為含有標簽或標記，所述標簽或標記能有助于檢測，以及例如能被用于分析未知分子的組織分布，如通過與組織切片結合(Pereira等人，J.Immunol.Methods，1997，20311-24)。可選擇地，所述結合伴侶可固定至固相并用于純化所述未知分子，如通過親和層析。一旦完成純化，根據該分子性質通過適當的試驗可對所述未知分子進行鑒別。例如，如果所述未知分子為蛋白質，那么該純化后的蛋白質可被鑒別且采用本領域已知并已描述的方法通過肽段測序和克隆測定編碼其的DNA序列。可選擇地，通過使用經鑒定的結合伴侶篩選cDNA文庫可以容易地確定編碼未知蛋白質的DNA。關于這點，可使用來自適當來源的高度分化的cDNA文庫。然而，優選地，可使用較小的、經限制性酶切的cDNA文庫。例如，如果所述未知蛋白質被表達在特定細胞類型的表面，那么可方便地從這些細胞中制得cDNA文庫(如，cDNA展示文庫，諸如噬菌體展示文庫)并用所述結合伴侶進行篩選(例子見Ridgway等人，見前)，例如對在固體支持物上的展示文庫進行淘洗，在所述固體支持物上附著有經鑒定的結合伴侶。此外，如果從所述表達文庫中鑒別出的所述結合伴侶為抗體，那么可進行基于抗體的其他分析，諸如免疫沉淀、Western Bolt、表達譜或免疫組織化學，以分離或表征所述靶體。
因而，可以看出本發明的方法不僅可用于從適當的表達文庫中選擇和鑒別靶體的結合伴侶，其還可用于鑒別新型的和未知的靶體。因為其可導致鑒定出應用于治療和診斷的新型細胞靶，以及在治療和診斷中具有潛在用途的新試劑，即結合伴侶，所以非常重要。
因而，本發明還提供一種分離和/或鑒別未知靶體的方法，所述方法包括此處定義的步驟(a)至(c)(以及可選的附加步驟)，(d)分離與所述未知靶體結合的一種或多種表達文庫成員，以及(e)使用所述文庫成員分離和/或鑒別與其結合的所述靶體。
因而，本發明的方法可用于篩選、鑒別或分離靶體的結合伴侶，或新型的靶體本身，其可被分離、產生或生產以用于各種下游的使用。同樣地，使用本發明的方法鑒別或篩選結合伴侶/蛋白質或靶體構成本發明的另一方面。由此，本發明從另一方面提供從表達文庫中選擇、鑒別和/或分離作為靶體的特異性結合伴侶的文庫成員的方法，或者選擇、鑒別和/或分離靶體本身的方法，所述方法包括下列步驟使用上述定義的步驟(a)至(c)(以及可選的附加步驟)篩選表達文庫以選擇顯示一定性質的分子，以及可選地(e)鑒別和/或分離作為所述靶體的特異性結合伴侶的相關文庫成員，以及可選地(f)使用所述文庫成員鑒別與其結合的所述靶體。
一旦鑒別了編碼具有特定性質的結合伴侶或靶體的適當的核苷酸片段，如果需要，編碼所述多肽的核苷酸可經歷親和力成熟，例如試驗和鑒別具有進一步改進性質的結合伴侶。在重復篩選循環之前，可通過實施任何常規的誘變形式，包括但不限于以受控制(如定點誘變)的或隨機的方式增加、刪除和/或取代一個或多個核苷酸，錯配PCR、結構域交換、盒式突變以及鏈重組等而實施該親和力成熟。如果需要，該親和力成熟可在前述確認步驟之后、進行單克隆分析之前進行。
當使用本發明的方法選擇、鑒別、分離和/或純化了一種或多種結合伴侶或靶體時，可生產出這些候選物，或其部分、片段、變體，或衍生物，且如果需要，可與至少一種制藥學可接受的載體或賦性劑配成制劑。生產出的該分子，或其部分、片段、變體，或衍生物也包括在本發明的范圍內。可選擇地，這些分子可采取編碼所述蛋白質分子的核苷酸的形式，所述核苷酸可被依次整合到適當的表達載體和/或含在合適的宿主細胞中。因而，編碼所述結合伴侶或靶體的核苷酸，或者含有所述核苷酸分子的表達載體構成本發明的另一方面。
一旦根據本發明對特定的結合伴侶或靶體，或者其部分、片段、變體，或衍生物進行了選擇、鑒別等，通過在適當的宿主細胞或系統中表達，并相應地從該宿主細胞或系統中或從生長培養基或其上清液中分離所述結合分子，酌情而定，可容易地使用編碼該選擇的結合伴侶或靶體的表達載體生產足夠量的分子。可選擇地，所述結合分子或靶體可通過其他適當的方法生產，例如通過化學合成編碼所述結合分子的核苷酸，以及在合適的宿主中或在體外轉錄系統中表達。
這樣，本發明在更進一步的方面提供一種生產特異性結合伴侶或靶體的方法，包括下列步驟根據如上所述的本發明的方法鑒別或選擇靶體的特異性結合伴侶或靶體本身，生產所述經鑒別的結合伴侶或靶體，或其部分、片段、變體或衍生物，以及可選地用至少一種制藥學上可接受的載體或賦性劑將所述生產的結合伴侶或靶體配成制劑。
所述結合伴侶或靶體的變體或衍生物包括勝肽衍生物(peptoid)的等價物、具有非肽的合成骨架的分子，以及與最初鑒別的多肽相關或從其中得到的多肽，其中所述氨基酸序列已通過對單獨或多個氨基酸的取代、增加和/或刪除而被修改，其可選擇地或額外地包括用已被化學修飾的氨基酸取代或增加，例如通過去糖基化或糖基化。這些衍生物或變體可方便地具有與其源自的最初的多肽至少60、70、80、90、95或99％的序列一致性。
當所述結合伴侶為抗體分子時，所述變體或衍生物進一步包括抗體分子從一種形式到另一種形式的變換(例如，從Fab變換至scFv，反之亦然，或本文其他部分描述的抗體分子的任何形式之間的變換)，或者抗體分子至特定類型的抗體分子的變換(例如，抗體分子變換至IgG或其亞型，如IgG1或IgG3，它們尤其適于作為治療抗體)。
所述變體或衍生物進一步包括結合伴侶分子或靶體與其他的功能成分的聯合，例如所述功能成分可在所述結合伴侶或靶體的下游應用中有用。例如，所述結合伴侶或靶體可與功能成分相關聯并被功能成分導向至身體特定位點，或與可檢測的部分相關聯用于例如在成像或其他診斷中的應用。
顯然，對于這些部分、片段、變體，或衍生的結合伴侶分子或靶體的主要要求是它們保持其最初的在結合力方面的功能活性或具有改進的功能活性。
使用本發明的方法分離、檢測、選擇、鑒別或生產的所述結合伴侶分子(優選地，抗體分子)或靶體可用于需要靶體特異性的結合伴侶(如特定抗原特異性的抗體)的任何方法中。因而，所述結合伴侶(優選地為抗體分子)或靶體可用作分子工具，且本發明在另一方面提供一種包含此處定義的這些結合伴侶分或靶體分子的試劑。此外，這些分子可用于體內治療或預防應用、體內或體外診斷應用，或體外分析。
以或者從所述表達文庫中分離的形式，或者經改造或變換的形式，例如可適當地將scFv分子變換成IgG或者多聚體肽，所述結合伴侶可用于治療應用。通過誘導表現出與所述靶體/配體呈激動結合或拮抗結合的治療性分子的生物活性，可影響治療效果，例如，通過阻止天然配體結合(因而抑制腫瘤的生長和/或傳播)，誘導細胞凋亡(如腫瘤或病毒感染的細胞)，抑制生長或促進從基質中分離。根據所述靶體/配體本身的，或其多聚體(一些受體通過交叉連接被激活)的性質，可達到該治療效果。
當被選擇或鑒別等的結合伴侶為抗體多肽時，這些可用于體內治療和預防應用，例如使特定易感染個體被動免疫(例如，免疫受損的患者、兒童、孕婦的胎兒、處于地方病區域的人們，等等)。例如，如果所述抗體能中和感染性或疾病相關因子，那么其可用藥于適當的對象以抗擊疾病。可選擇地，抗體(或其他形式的結合伴侶)可附著于其他有治療效應分子上，如細胞毒素因子(小分子或蛋白質)、前毒素(pre-toxin)或其他藥物，并被導向病變組織或特定細胞類型，如腫瘤細胞或病毒感染性細胞。通過應用在因子中設計的其他功能，像激活巨噬細胞、補體或細胞毒T細胞的能力，例如通過將scFv變化為Ig，產生雙特異性分子，例如連接腫瘤細胞和殺傷細胞，之后因子獲得了所述激活能力，可以達到進一步的治療效果。
可選擇地這些抗體(或實際上和關聯于特定組織或身體位點，或細胞類型如腫瘤細胞或病毒感染細胞的靶體相互作用的其他類型的多肽)可帶標記，例如染料、熒光或放射性標記或酶可檢測的標記，并用于體外或體內診斷，例如通過成像或標準的免疫組織化學步驟。其他優選的用途包括治療診斷(theranostic)用途(即在診斷和治療中都使用的抗體或結合伴侶)。此外，該抗體分子或其他結合伴侶可用于親和層析過程以分離靶體。
尤其地，細胞表面表達的蛋白質的抗體為成功開發新的診斷和治療藥物提供一種被詳細描述的的出發點。在癌癥領域尤其是這樣，其中對特異性的細胞表面標志以及與其結合的抗體的了解無疑是藥品的研發中的瓶頸，而本發明方法可用于鑒別或選擇新型的細胞表面標志(靶體)和抗體(結合伴侶)。目前，僅僅知道非常有限數量的細胞表面表達的與腫瘤相關的或腫瘤特異性的抗原決定部位。因而，這些類型的每個新型抗原決定部位-當然還有與其結合的特異性抗體-將在癌癥的治療中提供新的可能。可能的應用包括用于基于ADCC(抗體依賴的細胞介導的細胞毒)的治療的裸露的全IgG抗體產品，重組的低聚-特異性/低聚化合價的結構成分，用于組織特異性和靶向治療的融合蛋白免疫毒素和放射性標記抗體片段，以及用于體外和體內診斷的偶聯染料或放射標記的抗體。
所述靶體，或其片段可用作疫苗，尤其用于癌癥和感染疾病的治療(當然依賴于涉及的靶體)中的疫苗。所述靶體采以肽、蛋白質或小分子藥物的形式，可用作激動劑和拮抗劑，例如其可阻止或誘導像凋亡或調節細胞生長的功能。所述靶體還可用作進一步篩選的靶子，以鑒別更多的能起上述作用的分子。在一些情況中，所述靶體或其片段還可對本身起作用，如與其天然與其結合的分子的競爭性結合。
如果這些使用中需要，例如用于治療的IgG1或IgG3類型的轉換、用于成像的適合標記的整合或增加等等，對抗體分子的適當和合適的修改為本領域普通技術人員公知。
使用本領域普通技術人員能夠設計的適當的試驗，可容易地鑒別用于如上所述的各種使用的最合適的抗體。例如，在抗體或結合伴侶的高親和力或親合力非常之重要的應用中，使用標準的分析技術(如Biacore分析)可在候選的抗體中容易地測試這些標準。此外，當已鑒定出抗特異性感染因子，如細菌、病毒等的抗體時，可進行適當的試驗以評價何種抗體能最有效中和所述感染因子。例如，對于細菌而言，可評價對所涉及細菌的殺菌和調理吞噬(opsonophagocytic)活性。類似地，對于病毒而言，可進行病毒的中和研究以鑒別最佳的候選物。
因而，本發明在更進一步的方面提供一種如此處所定義的抗體表達文庫的應用以分離、檢測、鑒別、選擇或生產一種或多種特異性結合于一種或多種目標抗原的抗體分子，例如與特定的疾病、細胞、組織或外源因子相關的一種或多種目標抗原。例如，可通過用所述目標靶體篩選所述抗體表達文庫來進行。
本發明又在另一方面提供了這種經分離、檢測、鑒別、選擇或生產的抗體分子(或其他結合伴侶)，或靶體用于治療或體內診斷或用于如前所述任何其他應用。這種抗體分子(或其他結合伴侶)，或靶體在生產用于治療(尤其是癌癥或感染疾病的治療)或體內診斷或用于如前所述任何其他應用的藥劑或組合物中的使用也包括在本發明的范圍內。還提供了患者的治療方法，包括該抗體分子(或其他結合伴侶)或靶體的合適劑量的給藥。
當所述的抗體分子(或其他結合伴侶)或靶體用于如前所述的用途和方法時，它們可以任何適合的方式給藥。例如，該抗體分子(或其他結合伴侶)或靶體可在需要作用的位點局部給藥，或者可附著于或者是相關聯至有助于將所述抗體分子(或其他結合伴侶)或靶體導向至身體內適當位置的單元。
含有此處定義的所述抗體分子(或其他結合伴侶)或靶體，連同一種或多種制藥學上可接受的載體或賦型劑的藥物組合物構成本發明的又一個方面。
又一個方面是為對患者進行的診斷或成像方法，包括以此處定義的抗體分子(或其他結合伴侶)或靶體向患者適量給藥，并檢測在患者體內所述抗體分子的存在、定位和/或含量。
如果適當，從本發明所述的表達文庫中經鑒別、選擇等操作得到的所述抗體分子(或其他結合伴侶)或靶體可同樣地用于在體外進行的診斷方法，例如，針對從患者體內獲得或衍生于病人的組織樣品或一些其他類型的樣品如血液實施檢測。
進行處理或診斷等操作的疾病優選為癌癥、由感染性因子造成的感染性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病或變性的疾病。
此處使用的術語“治療”或“處理”包括預防治療。術語“治療”和“處理”包括疾病或感染的抗擊或治愈，也包括疾病或感染或者與此相關癥狀的控制或緩和。
AffiSelect(親和選擇)方法AffiSelect方法提供一種通過檢測其配體(或至少通過檢測與該配體相關聯的實體)而不是檢測所述文庫成員(候選結合伴侶)以間接地鑒別所述文庫成員(候選結合伴侶)的新技術。在篩選抗復雜配體如活細胞的小文庫時尤其有價值，盡管本方法的適用性不限于這些應用。
因而，一言以蔽之，AffiSelect方法提供一種篩選分子文庫(在這種情況中是指將要經受進一步分析的所述候選結合伴侶)以鑒別和/或選擇文庫中的一種或多種，作為一種或多種配體(靶體)的候選結合伴侶的成員，所述方法包括a)使候選結合伴侶的表達文庫在溶液中與一種或多種配體接觸；b)將已經與所述表達文庫的一種或多種成員結合的配體捕獲至固相；以及c)檢測配體的存在，因而檢測所述表達文庫的一種或多種所述配體的候選結合伴侶的成員的存在。
因而，當與本發明的篩選方法結合使用，以為了對經鑒定的所述候選結合伴侶作進一步分析時，AffiSelect方法包括以下步驟i)使一種或多種所述候選結合伴侶在溶液中與一種或多種靶體接觸；ii)將已經與一種或多種所述候選結合伴侶結合的靶體捕獲至固相；以及iii)檢測靶體的存在，因而檢測靶體的一種或多種候選結合伴侶的存在。
因此，結合在本發明的篩選方法的描述中使用的術語，在下面AffiSelect方法的討論中，對表達文庫的任何提及可被認為是指將接受進一步分析的一種或多種候選結合伴侶，以及對配體的任何提及可被認為是指靶體。
對在AffiSelect方法中使用的表達文庫(在這種情況中是指將接受進一步分析的候選結合伴侶)的主要要求之一是當它們開始與抗被篩選物的配體(靶體)接觸時，其必須在溶液中。“在溶液中”是指當所述表達文庫開始與抗篩選物的配體接觸時，所述表達文庫不附著于固相，即初始的表達文庫為非固定化表達文庫。
在AffiSelect方法中使用的表達文庫(候選結合伴侶)結構成分(并且也指構成本發明方法步驟(a)中所篩選的表達文庫的候選接合伴侶結構成分)可選地額外含有其他適當的成分，例如復制起點、誘導或非誘導的初始轉錄的啟動子、增強子、抗生素抗性基因和標記、常規標簽或報導分子、能通過如PCR擴增的所述結構成分的引物結合位點，或其他所需的序列元件。適當來源和在所述文庫結構成分內定位這些附加的成分，以使得其表現出所需的功能屬于本領域普通技術人員的常規實踐范圍。
在所述文庫的結構成分內以及在所述表達的文庫成員(候選結合伴侶)中所包含的常規標簽或標記在AffiSelect方法中使用的表達文庫中尤為重要，且這些標記被用于在所述方法的捕獲步驟中幫助將文庫成員(候選結合伴侶)結合至固相，即用于幫助捕獲步驟。在這點上，可使用任何適合的標記，只要其能有助于將所述文庫成員(候選結合伴侶)結合至固相。然而這些標記為親和分子時較為方便，所述親和分子通過與直接或間接固定在所述固相上的伴侶親和分子結合，可以有助于與固相結合。典型的標記為c-myc標簽(例如其能通過抗c-myc抗體而被捕獲)或His標簽(例如其能通過鎳(Nickel)表面而被捕獲)或生物素(例如其能通過鏈霉素親和素分子而被捕獲)，或噬菌體表面蛋白質如gp8(例如其可通過抗gp8抗體而被捕獲)，或可被抗體識別的抗原肽標簽如FLAG或HA。這些標記或標簽也可方便地被直接或間接地檢測。這些標記或標簽是典型地存在于在全部所述文庫結構成分中的常規標簽，且能用于將所述文庫成員捕獲至固相上。這些標記或標簽并不需要AffiSelect方法的檢測步驟(因為通過檢測配體而不是所述文庫成員進行檢測，見下面更詳細的描述)。然而，如果需要，這些標記可用于檢測文庫成員的存在。在測定文庫成員的配體的親和力中，它們的存在尤為有效。
一旦獲得了核苷酸水平的適合的表達文庫(備選結合伴侶)結構成分，則其可在適當的表達體統中被表達，用于篩選以及用于本方法的步驟(i)。表達的適當條件和方法為本領域普通技術人員所公知。
在AffiSelect方法中使用的靶體可采以在前文對本發明的篩選方法中所描述的任何形式。因此，例如，所述靶體可以是作為整個細胞的一部分或作為細胞膜片段的細胞表面分子，也可以是附著于適當固相的相關的單獨靶體。優選地，所述靶體為細胞表面分子。方便地，因為AffiSelect方法被用于進一步分析由本文所描述的有機相分離篩選方法初步鑒定的候選結合伴侶，所述靶體可與它們一樣被用于這些方法的步驟(a)。
無論所述配體(靶體)為細胞表面分子或附著于適當固相的相關分子，為在AffiSelect方法中使用，所述配體含有報導部分或與之相關聯以能夠檢測所述配體。這些報導部分優選地為核苷酸分子、更加優選地為DNA分子，其隨后能通過基于核苷酸的方法檢測。檢測的一個優選方法是通過PCR，但是可使用任何適當的方法，例如標記探針的雜交。可選擇地，所述配體可附著于非磁性熒光珠，或附著于具有可在顯微鏡下或通過Coulter CounterZM儀(Coulter Electronics公司)進行計數/檢測的可區別型號的另一類珠體。因而，可以看出這些報導部分可采以大量的各種不同的形式，只要能夠檢測所述報導部分。
這些報導部分可與所述配體(靶體)內在相關聯。例如，如果所述配體(靶體)為細胞表面分子，那么優選地被檢測的報導部分可為DNA分子，如在表達/展示配體的細胞中存在的基因(即，報導基因)。因而，適合且優選的報導部分是在全部細胞類型中都存在的部分，例如，管家基因如β-actin(β-肌動蛋白基因)。
可選地，外源報導部分可與配體(靶體)相關聯。例如，對于細胞而言，外源的報導部分(如報導基因)可通過標準的方法被導入至細胞內，例如轉染，包括但不限于脂質轉染法、逆病毒系統或電穿孔。
如果所述配體(靶體)為裸露的分子，如裸露的多肽，那么可使用本領域公知且有描述的方法用適當的報導部分標記或與之相關聯，例如，如果所述配體與其的編碼核苷酸或其他基于核苷酸的標記相關聯，例如，根據前述，在該核苷酸分子范圍內可方便地提供所述報導部分。如果所述配體是分子，例如多肽，附著于特定固相上，那么，例如使用上文描述的類似方法，所述報導部分可獨立于所述多肽，附著于所述固相。尤其是，如果使用鏈霉素親和素珠，那么所述報導部分優選地為含有可有助于檢測所述報導部分的位點或區域的生物素化的DNA片段，例如能使所述報導基因的片段進行PCR擴增的引物位點或探針結合位點。那么各珠體可帶有生物素化的報導部分和生物素化的多肽(或其他配體)的混合物。
因而可以看出，在報導部分和所述配體(靶體)之間的這種“相關聯”可包括所述報導部分和所述配體之間的直接相互作用，即所述報導部分和所述配體是相同分子的一部分，例如所述配體蛋白質和所述報導部分相互連接作為同一分子整體的一部分。可選擇地，這些“相關聯”可為間接的，例如所述報導部分附著于或被包含于所述配體也附著于的部分內，例如被包含在表達或展示所述配體的細胞內，或被固定在所述配體所附著的固相上。
這些報導部分優選地為常規的報導部分，所述報導部分與被展示的所有配體(靶體)相關聯，因而可用作常規試劑以檢測任何和全部目標配體的存在(以及由此的備選結合伴侶的存在)。
在AffiSelect方法中使所述配體(靶體)與所述表達文庫(候選結合伴侶)接觸的步驟，反之亦然，可在一定條件下以任何適當的方法進行，以使得合適的候選結合伴侶可與所存在的配體(靶體)相互作用或結合。這種條件通常根據所述表達文庫(候選結合伴侶)、所述配體(靶體)以及與配體(靶體)相關聯部分的性質而變化。然而，本領域普通技術人員可容易地確定有助于結合的適當條件。這種“接觸”步驟通常發生在適當的溶液或含水基質中。因而，如果所述配體存在于以單層培養的細胞上或從哺乳動物受試對象中獲得的，例如來源于哺乳動物器官或組織的細胞上，那么在與所述表達文庫接觸之前，那些細胞通常以適當的技術在含水基質中收獲并重新懸浮。
重要的是，人們發現在AffiSelect方法中，所述接觸步驟可在細菌的表達培養基中進行，例如L Broth，以及在標準水基質如PBS中。由于這意味著文庫成員(備選結合伴侶)可在細菌中表達(如通過在細菌表達培養基如L Broth中培養它們)以及可從表達平板中直接克隆以在AffiSelect篩選方法中使用，因而是重要的，也是令人吃驚的。優選地，在所述配體(靶體)被加入之前，及所述文庫成員的表達已被誘導之后，這些細菌表達培養基被制成等滲透壓的(例如，至大約140mM NaCl，(LB通常約171mM NaCl))。當所述配體(靶體)是位于活細胞而不是珠體上的細胞表面分子時，將所述細菌基質制成等滲透壓的步驟尤為優選。
示例性的“接觸”條件可包括在冰上或在4℃下孵育30分鐘至4小時。然而，這些條件可依所述配體、表達文庫等的性質而適當的變化。所述表達文庫-配體混合物可選擇地并優選地經受輕柔的搖晃、混合或旋轉。此外，可加入其他適當的試劑如阻斷試劑以降低非特異性結合。例如可使用1-4％BAS或其他合適的阻斷試劑(如牛奶)。然而，應當意識到的是本領域普通技術人員依所述篩選方法的目的可改變所述接觸條件。例如，如果增加孵育溫度，如至室溫，可增加鑒別與配體不同亞型的結合物的可能性，如與易于內在化的細胞表面蛋白質的結合物。對所述條件的這些調節亦屬于本領域普通技術人員的實踐范圍。
通過改變與所述配體相關聯部分的存在數量，可方便地改變配體(靶體)的拷貝數量。例如，當所述配體為細胞表面分子或附著于固相載體的分子，那么通過增加或降低細胞或固相載體在所述接觸混合物中的數量可調節目標配體的數量。通過反復實驗可容易地確定需要的配體量，但是，例如當所述配體為細胞表面分子時，使用5000至200000個細胞較為方便。實際上AffiSelect方法的優點在于其對于低至5000或1000個細胞(或甚至更低，例如使用PCR作為檢測方法潛在地能檢測單個細胞)進行操作也足夠敏感。關于這點，尤其是用來自哺乳動物受試對象，如病人的活細胞進行篩選時，這些細胞通常為稀有資源且不能夠大量獲得。因而，能在如此少量的細胞上進行篩選是重要的優點。已經顯示，當通過PCR進行檢測且所述候選結合伴侶為抗體時，僅需要40pg抗體就能檢測。這意味著AffiSelect方法適于分析以極低水平表達的配體分子的候選結合伴侶，例如當表達了低于1000個分子時。
在相同的反應容器或分析室(如分析孔)中可存在一個或多個類型的候選結合伴侶(即，一種或多種候選結合伴侶)以用于AffiSelect方法的接觸步驟(i)(以及所述方法的隨后步驟中)。然而，優選地在反應容器或分析室中僅存在一種類型的候選結合伴侶，以用于接觸步驟(i)。
一旦配體(靶體)在一定條件下與表達文庫(候選結合伴侶)接觸，以使得所述配體與所述表達文庫的一種或多種成員結合，隨后以這種方法結合的所述配體被捕獲至固相上以有助其從反應混合物的其他成員如非結合的配體中分離或移除或純化。換句話說，在捕獲步驟中，僅僅與表達文庫成員(候選結合伴侶)結合的配體(靶體)被捕獲至所述固相上。
關于這點，優選的固相為容易操作和清洗的微粒固相。磁性固相且尤其是微粒磁性微粒/珠體尤其優選。為了區別這些固相和配體(靶體)所附著的所述固相(如前所述)，這些固相被稱為“捕獲固相”。可以從利尼史特朗(Lillestrm)的Dyno Specialty Polymers AS公司，挪威和戴諾生物科技有限公司(Dynal Biotech ASA)商業獲得合適的磁性珠體。可用于此處描述的方法的磁性珠體的具體例子為來自挪威的戴諾生物科技有限公司(Dynal Biotech ASA)的M-450、M-270或M-280珠體。
配體(靶體)-文庫成員(候選結合伴侶)復合物可通過任何適當的方法被捕獲至固相。根據AffiSelect方法的優選的方法涉及到所述固相上的捕獲分子與表達文庫成員(候選結合伴侶)相關聯的伴侶分子或標簽的相互作用，即所述候選結合伴侶上的分子或標簽有助于所述捕獲步驟。以這種方式，僅僅與所述表達文庫成員結合的配體被捕獲至所述固相。如果需要，未與所述表達文庫成員結合的所有配體可通過一次或多次清洗所述固相的步驟被移除，或僅僅在捕獲發生之后從反應混合物中分離所述固相。因而，可以看出，由于通過表達文庫成員而不是所述配體促進捕獲步驟，從剩余的混合物中分離所述固相可以移除未與文庫成員結合的配體。
所述固相上的捕獲分子和所述表達文庫成員上的伴侶分子或標簽之間的相互作用方便地基于親和相互作用，盡管可使用任何其他適當的反應。例如，所述表達文庫的成員可被設計為表達親和相互作用的一個組分，且另一組分可通過任何適當的方法附著于固相。這種親和相互作用優選的例子為抗體-抗原相互作用、鏈霉素親和素-生物素相互作用。
鏈霉素包被的珠體可商業獲得，且通過在配體-文庫成員結合物中的文庫成員部分存在有生物素分子，這些珠體可用于捕獲配體-文庫成員結合物。可選擇地，如果表達文庫為噬菌體文庫，那么使用附著了抗噬菌體表面蛋白質的抗體的固相，如抗gp8，可容易地完成捕獲。可選擇地，所述文庫成員可被設計為表達能被親和伴侶識別的標簽，所述親和伴侶有助于與所述固相的結合。適當標簽的例子為能分別被抗c-myc抗體(或其他適當的抗體)和金屬離子(例如Ni2+)識別的c-myc(或其他抗原肽標簽)或His標簽，它們可以依次促進捕獲至所述固相。當使用抗體促進捕獲時，這些抗體可直接或間接地附著于所述固相，例如通過適當的二級或三級抗體如抗IgG抗體。根據使用的試劑，捕獲可以任何適當的方式實現。因而，這些抗體可附著于固相，隨后使所述固相與含配體(靶體)-文庫成員(備選結合伴侶)復合物的混合物接觸。可選擇地，在所述抗體與所述固相結合之前，可使所述抗體與反應混合物中的文庫成員結合(如通過二級抗體)以促進配體-文庫成員的捕獲。實際上，這是AffiSelect方法優選的實施例。本領域普通技術人員可容易地確定在溫度和時間方面的適當的捕獲條件。然而，示例性的條件可包括在室溫或4℃孵育10分鐘至2小時(取決于所述配體或文庫成員的穩定性)，優選地伴隨輕柔的搖晃、混合或旋轉。本領域普通技術人員可容易地確定為了促進所述配體-文庫成員復合物的捕獲，應包含的固相的量，或應包含的固相對配體的比例。
在AffiSelect方法中，可在任何適當的階段進行一次或多次清洗步驟。例如，如前所述，在步驟(ii)之后進行清洗步驟(或至少是分離步驟)以移除未與表達文庫成員(候選結合伴侶)結合的配體(靶體)。在步驟(i)之后也可對與所述配體相關聯的部分進行一次或多次清洗步驟(如清洗與配體相關聯的細胞或固相)，以移除未與配體結合的表達文庫成員。實際上，這些清洗步驟是優選的。在所述方法過程中的其他適當時候，也可對與配體相關聯的部分進行一次或多次清洗步驟，例如以除去非結合實體。本領域普通技術人員可容易地確定應包括多少清洗步驟。
通過直接檢測所述配體或至少通過檢測與配體相關聯的實體(非所述文庫成員)來進行檢測配體(靶體)存在的步驟。該步驟與現有方法形成對照，在現有方法中檢測步驟通常通過檢測與配體結合的所述文庫成員而不是檢測配體而進行。通過檢測位于配體上或與所述配體相關聯的報導部分的存在，可方便地進行對配體/靶體(以及由此的配體-文庫成員復合物的存在，因為非復合的配體不能與固相結合、已經通過捕獲步驟移除)存在的檢測。適合的報導部分如前所述。如前面的描述，所述報導部分通常存在于全體配體上或與之相關聯，即為全體配體的常規標記。因而，由于在各配體上(或與之相關聯)存在相同的報導部分，陽性信號的存在顯示配體-文庫成員結合物的存在，以及由此的作為配體的候選結合伴侶的文庫成員的存在。然而，應當注意的是，如果所述報導部分位于細胞內，即在配體為細胞表面分子的實施例中，那么在進行檢測之前，其必須被暴露，如通過細胞溶解或其他細胞裂解方法。因此，在本發明的這些實施例中，當使用AffiSelect方法進行候選結合伴侶的進一步分析的情況中，陽性信號的存在進一步提示了與有關的靶體潛在結合的候選結合伴侶的存在。如果在檢測反應中發現多于一種的候選結合伴侶，那么可進行進一步的分析以確定何種候選結合伴侶與所述靶體結合。然而，優選地，如前所述在檢測反應中僅出現一種類型的候選結合伴侶，因此陽性信號的出現提示存在有與有關靶體潛在地結合的候選結合伴侶溶解/破裂細胞的適當的方法，以暴露例如存在于包含在細胞中的核苷酸中的所述報導部分，在本領域中公知且已被描述。在AffiSelect方法中使用的優選地裂解緩沖液試劑含真核細胞的蛋白酶K，在檢測步驟之前，其消化蛋白質并可從DNA中除去組蛋白。在裂解緩沖液中也可以包括其它蛋白酶以用于AffiSelect方法。
如前所述，在AffiSelect方法中PCR是優選的檢測方法。然而，可使用其他適當的檢測報導部分的方法，如探針雜交、熒光珠體、不同大小的珠體等等(見前文)。PCR之所以為優選的是因為該方法的高度的敏感性(即使一個配體(或細胞)也可使用PCR檢測)，還因為其可以獲得關于所述配體的信息，例如序列信息(例如，如果所述配體與編碼其的核苷酸相關聯)，或所述配體的鑒定，例如，如果所述配體帶有能鑒別所述配體的DNA分子標簽，如帶不同大小的DNA分子標簽或者帶有能用于特異性鑒定所述配體的具有特異性序列的DNA分子標簽。
便利地是，所述PCR反應在溶液中進行(盡管其也可在固相上進行)，以及以標準方法檢測PCR產物的存在與否，諸如在瓊脂糖凝膠上(如E-gel 96系統，Invitrogen公司，可在20-30分鐘內分析96個樣品)。通常所述樣品在進行PCR(或其他檢測步驟)之前被充分混合。
通過本領域公知且已有描述的方法，根據所述報導部分的序列，選擇適當的PCR引物以擴增全部或部分的所述報導部分。如果分析孔的核苷酸量合適，例如，如果配體由使用適當的表達載體已被轉化至細胞的核苷酸編碼(其含有適當的報導部分)，或者所述配體與編碼其的DNA相關聯，那么可選擇PCR引物以擴增編碼所述配體序列以及所述報導部分的核苷酸。其優勢在于所述PCR產物可直接克隆至適當的載體進行測序，由此導致對所述配體序列的確定。
通過PCR或別的方式，陽性信號的檢測對需要進一步研究的固相具有指示性。例如，如果在分析板孔的溶液中進行PCR，陽性信號表示所涉及的一個孔或多個孔含有配體(靶體)的至少一種潛在結合伴侶，其隨后接受進一步的分析和研究。例如，在該孔中出現的細菌克隆(或其他文庫成員)可接受徹底的篩選，如通過細胞-ELISA以鑒別表達配體的候選結合伴侶的所述克隆(文庫成員)。隨后，可進行適當的分析以進一步在基因和蛋白質水平對所述結合伴侶進行鑒別和定性。
通過與背景信號或已知的陰性信號進行比較，可方便地測定由PCR或其他方法產生的陽性信號。對所述陽性、背景，和/或陰性信號進行測量和比較的方式和方法為本領域普通技術人員所公知。在當所述靶體為細胞表面分子的實施例中，通過在不相關或陰性細胞上例如，在其表面不表達所述靶體的細胞，或僅以極低水平表達所述靶體的細胞上進行篩選而提供用于比較的優選的陰性信號。
下面，參考附圖在隨后非限制性的實施例中對本發明進行更詳細的描述，其中圖1表示根據本發明的方法在哺乳動物腫瘤細胞中選出的候選抗體克隆1(scFv1)和2(scFv2)的FACS分析，并說明這些克隆都與哺乳動物腫瘤細胞結合，因而說明兩克隆的靶抗原都在哺乳動物腫瘤細胞中表達。
圖2表示評價候選抗體克隆1(第1列)和2(第2列)與不同細胞系結合的FACS分析結果的表格。該結果示出克隆1對所測試的乳癌細胞系具有特異性，而克隆2與不同來源的腫瘤細胞系結合。
圖3表示在使用2次清洗和有機相離心(org)以及外源凝集素包被磁性珠(beads)淘洗1-4回合(R1-R4)之后，用稀釋噬菌體對肺癌細胞系A-549上進行的多克隆噬菌體ELISA。
圖4表示AffiSelect PCR結果的一個實施例，在當被測試的scFv表達物與細胞結合的情況中(A-549，HUVEC和PBL)，AffiSelect PCR的結果示出擴增的β-actinDNA。根據三種細胞類型顯示了相同的scFv表達物樣品的結果(以相同的順序)。
圖5表示在使用2次清洗和有機相離心之后發現的一種scFv的FACS結果。根據在淘洗和預淘洗步驟中使用的相同的細胞類型(A-549，HUVEC和PBL)對該scFv進行測試。
圖6表示用scFv2鑒別抗原的熒光篩選結果。5個腫瘤cDNA表達樣品表現出對scFv包被的過濾器的高度結合性(圓圈)。這些樣品在PBS/3％BSA包被的過濾器上為陰性(未顯示)。
具體實施例方式
材料和方法細胞兩種人乳腺癌細胞系(PM-1和MT-1，由挪威奧斯陸的挪威腫瘤醫院，腫瘤生物學部(Department of Tumorbiology，Norwegian RadiumHospotal(DNR))惠贈)，肺癌細胞系(A-549，ATCC CCL-185，由Viventia Biotech Inc.惠贈；SW900，ATCC HTB-59，由DNR的腫瘤生物學部惠贈)，以及內皮細胞系(HUVEC，ATCC CRL-1730，由Viventia Biotech Inc.惠贈)被用于淘洗實驗。兩種乳癌細胞系培養于添加了10％FCS(Gibco BRL公司)，2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES(Cambrex公司)的RPMI-1640培養基(Cambrex公司)中。A-549培養于添加了10％FCS和2mM谷氨酰胺的Ham’s F12(Bio Whittaker公司)中。所述內皮細胞系培養于添加了10％FCS，15mg/l內皮生長因子添加劑(Sigma公司)和50mg/l肝素(Sigma公司)的RPMI-1640培養基中。細胞在37℃、5％CO2和濕潤的環境中培養。對于各種實驗細胞用PBS清洗，用含1mM EDTA的PBS收獲，用PBS清洗一次并計數。對于淘洗實驗，細胞或者重新懸浮于PBS/3％BSA(Sigma公司)或PBS/4％脫脂牛奶(Merck公司)中。
外周血淋巴細胞(PBL)是通過使用lymphoprep(Axis-Shield公司；詳見制造商的操作手冊)從新鮮的人血或血液黃層(buffy coats)中分離。細胞用PBS清洗一次，計數，以及重新懸浮于PBS/3％BSA或PBS/4％脫脂牛奶中。
外源凝集素包被磁珠根據制造商的操作手冊，將M-450環氧樹脂珠體與外源凝集素(WGA小麥胚芽，Triticum vulgaris，Calbiochem公司)連接。簡而言之，清洗環氧樹脂珠體，隨后在含有10μg外源凝集素/107珠體的0.1M硼酸緩沖液中，pH8.5孵育，在室溫下旋轉過夜。珠體用PBS/0.1％BSA清洗三次，并以4×108珠體/ml在4℃下、于PBS/0.1％BSA/0.02％疊氮鈉中貯存。
噬菌體單鏈抗體(scFv)展示文庫IgM scFv文庫被用于淘洗實驗由6個健康的捐贈人的PBL構建所述IgM scFv文庫，在N末端移動連接子的HindIII位點，造成21個氨基酸的連接序列，之后，被克隆至基于pSEX81的噬粒展示文庫中(Welschof等人，1997，PNAS，941902-1907，Lset，等人，2005，J.Immunol.Methods 29947-62)。
淘洗/接觸步驟為移除與普通細胞蛋白結合的噬菌體，將3.75×1012的噬菌體(150μl文庫，約2.5×1013cfu/ml)與2×105-2×106/ml非腫瘤細胞在被阻斷的試管中4℃下旋轉1hr(陰性預淘洗)進行孵育。PBS/3％BSA或PBS/4％脫脂牛奶被用作阻斷劑。
在一個方案中，PBL被用于陰性預淘洗步驟。在陰性預淘洗之后，所述PBL用阻斷溶液清洗兩次，之后，所述減少的噬菌體文庫加上兩次清洗的上清液與乳腺癌細胞如上所述(淘洗)進行孵育。
在另一個方案中，兩個陰性預淘洗步驟依次進行。在第一預淘洗步驟中，所述文庫如上所述與PBL進行孵育。在所述第一預淘洗之后，所述PBL用阻斷溶液清洗兩次，隨后，作為第二陰性預淘洗步驟，所述減少的噬菌體文庫加上兩次清洗的上清液與HUVEC在阻斷的試管中4℃下旋轉1-2hr進行孵育。對所述第二陰性預淘洗進行兩次清洗之后，所述上清液加上兩次清洗的上清液與肺癌細胞按照上面的描述(淘洗)進行孵育。
清洗/分離測試四種方法以從細胞結合的噬菌體中分離出游離噬菌體1)根據BRASIL方法的單步驟有機相分離(Giordano等人，2001，見前)淘洗之后，2×150μl的腫瘤細胞懸浮液被直接地在2×300μl有機相溶液(雙丁基鄰苯二甲酸酯∶環己烷9∶1[v∶v]；d＝1.03g ml-1)頂部分層。在以10,000g離心10min后，在室溫下(RT)，試管在液氮中進行速凍，隨后該試管的底部被切割，細胞團塊被轉移至另一個(被阻斷)試管中。
2)如方法1，但在重新懸浮于300μl PBS/0.4％BSA以及有機相離心之前，有用1ml PBS/0.4BSA一次或兩次的清洗步驟。
3)經典方法淘洗之后，所述腫瘤細胞被離心沉積(500g，5min，4℃)，且所述團塊用1ml PBS/0.4％BSA沖洗5次。
4)使用磁珠淘洗之后，所述腫瘤細胞被離心沉積(500g，5min，4℃)，以5×106個細胞/ml重新懸浮在PBS/0.1％BSA中，并與外源凝集素包被珠(1∶4的細胞∶珠體比率)在4℃下，旋轉孵育20分鐘。使用磁鐵，用1ml PBS/0.1％BSA將所述珠體清洗10次，并被重新懸浮于200μlPBS/0.1％BSA中。
感染將細胞團塊或珠體加入至10ml對數生長期的大腸桿菌XL1blue中，并在37℃下以60rpm孵育15min，隨后以200rpm進行45min。細菌以不同的濃度涂布于LBTAG平板(添加30μg/ml四環素(T)，100μg/ml氨芐青霉素(A)和100mM葡萄糖(G)的LB)用于評估，以及涂布于兩塊矩形大平板(243×243×18mm；Nunc公司)以用于隨后的包裝。所有的平板在37℃下孵育過夜。
包裝刮獲兩塊大平板的細菌。該細菌在液體培養基中繁殖，這些細胞中的噬粒與M13輔助噬菌體(Stratagene公司)被包裝成噬菌體顆粒，在30℃過夜。第二天，用PEG/NaCl沉淀噬菌體，并重新懸浮于1mlPBS中，其中的100μl噬菌體(約1013cfu)被用于新一輪的淘洗。
多克隆噬菌體ELISA在4℃下用PBS/3％BSA阻斷30min之后，腫瘤細胞和PBL與來自各輪淘洗的100μl噬菌體(1∶10-1∶106稀釋)在4℃下孵育1hr。在用PBS清洗3次之后，所述細胞與100μl兔抗-Fd(Sigma公司；1∶4000)抗體在4℃下孵育1hr。在用PBS清洗3次之后，以單克隆辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔Ig抗體(Dake公司；1∶4000)和底物ABTS(Calbiochem公司)進行ELISA。在405nm測量光吸收。(相對于多克隆噬菌體，當以單噬菌體進行ELISA分析時，使用類似的方法)。
大腸桿菌中scFv的表達和純化來自淘洗回合的，在腫瘤特異性結合上表現出增長(多克隆噬菌體ELISA)的scFv被克隆至分泌型載體pHOG21(Kiprivanov等人，1997，J.Immunol.Methods，20067-77)內，且如前所述，單獨的scFv克隆被表達在大腸桿菌XL-1-Blue中(Drsam等人，1997，FEBSLetters，4147-13)或者在96深孔板(100-200微升體積)中。用1mMIPTG(Sigma公司)在30℃過夜進行深孔板表達。第二天，所述平板以4000rpm，4℃離心10min，且該上清液(含表達后的scFv)被用于進一步的實驗。在所述表達樣品用于AffiSelect的情況下，被克隆的scFv DNA的多克隆集合被轉化入符合要求的XL-1 Blue大腸桿菌中，并且涂布于LB-TAG 22×22cm生物分析板(Corning公司)上。用QPix2自動儀(Genetix，ltd.，英國)挑選單個克隆置入含添加～4％甘油的LB-TAG生長培養基[30μg/ml四環素(T)，100μg/ml氨芐青霉素(A)和1％(w/v)葡萄糖(G)]的384孔平板中并在37℃下培養過夜。單個的scFv克隆被重新接種于含LB-TAG培養基的384孔平板中，且以100μM IPTG誘導表達。第二天，在離心平板之前，將50μl PBS/3％BSA加入至各孔(含100μl表達物)中。
用5種不同的方法檢測表達的scFv與細胞的結合性1)ScFv ELISA4℃以PBS/3％BSA阻斷30min之后，腫瘤細胞和PBL與scFv(100μl深孔表達物或10μg/ml純化的scFv)在4℃下孵育1hr。用PBS清洗3次之后，所述細胞與100μl鼠單克隆HRP標記的抗c-mys(Invitrogen公司；1∶4000)抗體在4℃下孵育1hr。用PBS清洗3次之后，以底物ABTS進行ELISA且在405nm測量光吸收。
2)8200細胞檢測系統(Applied biosystems公司)在含5×10e4腫瘤細胞(PM-1)或PBL和抗c-myc-FMAT Blue(AppliedBiosystems公司)或鼠抗c-myc抗體(Invitrogen公司；1.25μg/ml)與羊抗鼠IgG-Alexa Fluor R647(Molecular Probes公司；2.5μg/ml)的組合的384孔平板中檢測5μl 96深孔scFv表達物。在2-4小時的孵育之后，使用8200細胞檢測系統測量scFv與細胞的結合性。，以僅具有二級抗體的信號強度和不相關的scFv結合的信號強度作為陰性對照的。
3)AffiSelect通過使用所述AffiSelect方法，根據腫瘤細胞(A-549)，PBL和HUVEC檢測5μl 96深孔scFv表達物。為此，2.2×104細胞被離心成團塊(1600rpm，4℃，5min)且與5μl表達樣品和45μl PBS/3％BSA在4℃搖晃孵育1小時。所述細胞用150μl PBS/3％BSA清洗并離心(1600rpm，4℃，5min)。在向細胞團加入50μl抗c-myc抗體(Invitrogen公司；1∶500)后，所述細胞團在4℃搖晃孵育1小時。
細胞如前所述被清洗兩遍，并與25μl 5×106珠體/ml(細胞∶珠體＝1∶5)的M-450淘洗鼠IgG珠體(Dynal公司)懸浮液在4℃下搖晃孵育1小時。用磁體以100μl PBS/3％BSA清洗珠體兩遍之后，其被重新懸浮于100μl PBS/3％BSA中并轉移至PCR平板。
所述珠體樣品在含蛋白酶K(200μg/ml)，0.45％吐溫和0.45％NP40的30μl PCR緩沖液中，55℃下，孵育過夜，并之后貯存于-20℃備用。在95℃下，30min熱失活蛋白酶K之后，所述樣品置于磁體上，且使用人類β-actin特異引物，5μl上清液用于PCR。在這個分析中，孔內存在β-actin PCR產物表明可能存在與細胞結合的scFv表達克隆。
4)FACS在4℃下，50μl scFv深孔表達物與1-5×105個細胞染色1小時。以150μl PBS清洗3次并離心(1600rpm，5min，4℃)之后，所述細胞與50μl FITC標記的抗c-myc抗體(Invitrogen公司；1∶30)在4℃下培育1小時。細胞如前所述被清洗3次，用200μl PBS/1-2％甲醛(Sigma公司)固定并貯存在4℃等待FACS儀(Coulter公司)測量。
5)Guava(單細胞微量分析儀)如在FACS中描述的那樣，50μl scFv深孔表達物與1×105細胞染色1小時。為避免內在化，在一些情況下，在將細胞與scFv表達物進行孵育之前，細胞用50μl PBS/1-2％甲醛(30min，4℃)固定并用PBS清洗三次(1600rpm，5min，4℃)。結合的scFv的可視化以如在FACS中所述的用FITC標記的抗c-myc抗體進行或者用與抗c-myc抗體的組合進行(1小時，4℃；5μg/ml；Sigma公司)，隨后如在FACS中所述以PBS清洗3次，以及與FITC標記的抗鼠IgG抗體進行孵育(1小時，4℃；1∶200；Dako公司)。三次PBS清洗并如FACS中所述的固定之后，該樣品在4℃貯存等待Guava EasyCyte儀(GuavaTechnologies公司)測量。
細胞的過濾篩選實驗測試條(Test-strips)為了測定固定在硝化纖維素膜(Schleicher & Schuell公司)上的細胞的最優化濃度，測試條(約6×4cm)用在PBS中不同含量的細胞(5×104-5×106細胞/ml)在RT包被2hr。用PBS清洗兩次之后，該膜在RT用鼠單克隆抗MHC class I抗體(Dako公司；1∶600)孵育1hr。被包被的細胞通過與HRP標記的兔抗鼠Ig抗體(Dako公司；1∶10,000)進行孵育并用ECL測定儀(Amersham公司)而被直觀化。
測試分析之前在細胞ELISA中顯示陽性的scFv克隆在過濾篩選分析(filterscreening assay)(Stacy等人，2003，J.Immunol.Methods，283247-259)中進行測試。簡而言之，scFv克隆被排列在硝化纖維素過濾器上。在有IPTG存在的情況下表達過夜之后，測試所述scFV被與細胞包被的過濾器的結合性。所述過濾器用鼠單克隆抗MHC class I抗體(1∶600)進行孵育，且通過HRP標記的抗c-myc抗體(1∶10,000)和ECL測定儀而被直觀化。對5種不同的阻斷劑(PBS/2％BSA，PBS/4％脫脂牛奶，SuperBlock(Pierce)，Casein Blocking緩沖液(Sigma)，2％BlotBlock(BDH))所引起的背景信號的降低進行了測試。
抗原鑒定腫瘤cDNA文庫的構建和淘洗根據在先的記載(Foss等人，2004，Cancer Immunol.Immunother.，53431-438)，由腫瘤細胞系SW900構建cDNA噬菌體展示文庫。為了找到對應于scFv的相關抗原，對scFv包被的maxisorp試管(Nunc.公司)進行生物淘洗。簡而言之，用在PBS/3％BSA或PBS/4％牛奶中的10μg/mlscFv包被maxisorp試管，在4℃旋轉過夜。第二天，在被加入所述scFv包被的試管之前，所述cDNA噬菌體展示文庫在PBS/3％BSA或PBS/4％牛奶中阻斷15分鐘。在所述文庫以RT旋轉孵育2hr之后，該試管以PBS/0.05％吐溫清洗10次，隨后以PBS清洗10次。通過將該試管與500μl 100mM TEA(Sigma公司)旋轉孵育5分鐘，而洗脫結合的噬菌體。用500μl 1M Tris-HCl pH7.5中和該洗脫的噬菌體之后，500μl被用于感染10ml XL1-Blue(如前所述)。在如前所述的包裝之后，所述噬菌體被用于對scFv包被的試管進行新一輪的淘洗。在scFv包被的maxisorp平板(Nunc.公司)上以多克隆噬菌體ELISA來測試由3輪淘洗中回收的噬菌體。
表達的腫瘤cDNA克隆的過濾篩選通過PCR擴增在scFv特異性結合(多克隆噬菌體ELISA)上表現出增強的來自淘洗步驟的腫瘤cDNA，并被克隆入含HA標簽的改進的分泌型載體pHOG21中。腫瘤cDNA克隆被排列在硝化纖維素過濾器上，過夜后，檢測含IPTG的表達物，與scFv包被的過濾器的結合性(de Wildt，RM等人，Nat.Biotechnol.2000，18(9)，989-994)。該過濾器與鼠單克隆抗HA抗體(0.2μg/ml；Roche公司)進行孵育，結合性通過HRP-標記的兔抗鼠抗體(1∶10000；Dako公司)和ECL測定儀而被直觀化。
實施例1-測試BRASIL方法在與所述噬菌體文庫孵育1-2小時之后，兩種乳腺癌細胞系和PBL被離心穿過有機相，且在進行了有機相離心之后，對其在含水層(上面的相)和有機層(團塊)中的回收物進行檢測。作為陰性對照，1011個噬菌體被離心以評價進入所述有機相的游離噬菌體的數量。
檢測對人腫瘤細胞系(PM-1和MT-1)和PBL進行淘洗之后的回收物。表明PBL必須被新鮮分離。從冰凍的等分試樣中解凍的PBL在淘洗步驟中易于變粘。離心之后，在有機相的細胞團塊中測得75％(PM-1)，97％(MT-1)和71％(PBL)。其百分比太高以致不具有生物顯著性人們所期望的是整個天然抗體文庫的僅僅有少量的百分比將與給定的細胞類型的細胞表面蛋白質結合。穿過有機相的游離噬菌體的數量僅為2×10-5％，在以后可以忽略。
因此，證明BRASIL方法不實用僅使用有機相離心作為分離步驟，在所述細胞團塊中發現大量的(非特異性)結合物。
實施例2-從細胞結合的噬菌體中分離游離噬菌體的四種方法的比較1)基于BRASIL方法的單步驟有機相分離(Giordano等人，2001)在淘洗之后，2×150μl的腫瘤細胞懸浮液直接在2×300μl的有機相溶液(雙丁基鄰苯二甲酸酯∶環己烷9∶1[v∶v]；d＝1.03gml-1)的頂部分層。在以10,000g離心10min后，在室溫(RT)下，試管在液氮中進行速凍，隨后該試管的底部被切割掉，細胞團塊被轉移至另一個(阻斷)試管中。
2)如方法1，但在重新懸浮于300μl PBS/0.4％BSA以及有機相離心之前，有一次或兩次用1ml PBS/0.4BSA清洗的步驟。
3)經典方法淘洗之后，所述腫瘤細胞被離心沉積(500g，5min，4℃)，且所述團塊以1ml PBS/0.4％BSA沖洗5次。
4)磁珠淘洗之后，所述腫瘤細胞被離心沉積(500g，5min，4℃)，重新懸浮在PBS/0.1％BSA中，并與外源凝集素包被珠(1∶4的細胞∶珠體比率)在4℃下，旋轉孵育20分鐘。使用磁鐵，所述珠體在1ml PBS/0.1％BSA中被清洗10次，并被重新懸浮于200μl PBS/0.1％BSA中。
在第一次實驗中，新方法(2)與BRASIL方法(1)和5次清洗步驟的經典方法(3)進行了比較。使用的腫瘤細胞為PM-1乳腺癌細胞系，且使用PBL的陰性預篩選按照如材料和方法部分的描述進行。
在另一個實驗中，對方法(2)和使用外源凝集素包被的磁珠從細胞結合的噬菌體中分離游離噬菌體(方法4)進行了直接的比較。使用的腫瘤細胞為A-549肺癌細胞系，且使用PBL和HUVEC的陰性預篩選按照如材料和方法部分的描述進行。
方法1、2和3的比較在4輪淘洗、分離(視情況使用方法1、2或3)、轉染和包裝之后，對從4個輪中的每輪回收的噬菌體分別進行多克隆噬菌體ELISA以檢測與所述腫瘤細胞而非PBL結合的噬菌體的增加量。僅進行2輪淘洗后，在方法2中觀察到了這種增加，然而，方法1和方法3分別在第4和3輪之后才表現出富集。在亞克隆入表達載體pHOG21之后，對來自各方法第3輪的95個克隆進行scFv ELISA。不僅考慮富集的時間點(第2輪)，而且考慮相比較于方法1(第4輪，11/94)和方法3(第3輪，27/95)的scFv結合物(39/95)的數量，證明方法2為最佳的方法。
方法2和4的比較多克隆噬菌體ELISA的結果顯示，僅經過2輪淘洗，在方法2和4中都觀察到與腫瘤細胞結合的噬菌體的增加。不同的是，當與方法4相比(圖3)，在第3和4輪淘洗之后，方法2表現出增加的富集效果(將噬菌體稀釋10-2倍后，曲線上升)。
因此，方法2(即，本發明的方法)相對于現有技術的方法具有顯著的優點，尤其是在能進行更少的淘洗回合而鑒定更多的陽性克隆方面。
實施例3-在1或2次清洗后，采用有機相分離的成功的淘洗方案兩種淘洗方案成功地采用1或2次清洗和有機相分離的組合。
1)乳腺癌方案乳癌細胞系(PM-1)被用于淘洗噬菌體scFv展示文庫。按照在材料和方法部分的描述，用新鮮的人PBL進行陰性預淘洗。在這些實驗中，研究了在有機相離心之前清洗的影響和其與經典方法的比較(見上文)。
在一次清洗和有機相離心之后，測試單獨的噬菌體和來自第三輪淘洗的scFv在細胞ELISA和FACS測量方法中相對于PBL和所述腫瘤細胞系的特異性。發現了三種獨特的、腫瘤細胞系特異性的克隆(克隆1，2和3)。用8200細胞檢測系統和Guava分析儀測試單scFv的表達，又發現5種更為獨特的、腫瘤細胞特異性的克隆(數據未顯示)。在挪威腫瘤醫院(DNR，奧斯陸，挪威)，以FACS實驗對第一批的3種克隆進一步的研究，結果顯示一個scFv克隆(1)主要與乳腺癌細胞系結合，而其他scFv克隆(2)與不同來源的腫瘤細胞系結合，如，前列腺、神經膠母細胞瘤、肺和直腸的腫瘤細胞系(圖1和2)。結果還顯示兩類克隆在腫瘤細胞的目標抗原不是Her-2/neu、EGF-R或CEA，因此意味著其可識別一新型的腫瘤抗原。FACS和共聚焦顯微鏡的數據顯示，在這種情況下，scFv克隆1和2都與內在化的抗原結合。
因此，能夠觀察到本發明的方法能用于鑒定在細胞表面表達的分子的特異結合伴侶(在這里是scFv抗體片段)。
2)肺癌方案肺癌細胞系(A-549)被用于淘洗噬菌體scFv展示文庫。按照在材料和方法部分的描述，用新鮮的人PBL和內皮細胞系(HUVEC)進行陰性預淘洗。在這些實驗中，對有機相離心之前采用2次清洗的方法(方法2)和采用外源凝集素磁珠從細胞結合的噬菌體中分離游離噬菌體的方法(方法4)進行直接比較。
在兩次清洗和有機相離心之后，測試來自第3輪淘洗的scFv表達物在AffiSelect和細胞ELISA中相對于PBL、HUVEC和腫瘤細胞系A-549的特異性(圖4)。如在圖4的例子中所示，所檢測的8個抗腫瘤細胞系的scFv表達樣品顯示出PCR擴增出的β-actinDNA，然而采用HUVEC和PBL未觀察到這些產物。這顯示出，在這種情況下，8種被測試的scFv樣品結合于腫瘤細胞系，而不是HUVEC或PBL。在由FACS(圖5示出了一示例克隆)和Guava分析(數據未顯示)驗證腫瘤細胞系特異性的結合之后，發現10種獨特的、腫瘤細胞系特異性的克隆。
因此，再一次能夠觀察到本發明的方法能用于鑒定在細胞表面表達的分子的特異結合伴侶(在這里是scFv抗體片段)。
實施例4-測試不同品牌的PCR薄壁管對不同品牌0.5ml薄壁PCR管在有機相離心和冷凍后的切割過程中的穩定性進行檢測。
在測試的PCR薄壁管中，0.5ml薄壁的Eppendorf PCR管(#0030124.502)和Axygen PCR-05-C管(#321-05-051)是最佳的管。在速凍所述有機相之后，從V-形區域的正上方切割管體以避免該管裂開。
實施例5-有機相對噬菌體轉染的影響采用108和1011的噬菌體以及100和200μl的有機相來轉染10ml在對數生長期的大腸桿菌XL1-Blue(Stratagene公司)。在37℃，以60rpm，對細菌進行15min的孵育，此后以200rpm進行45min并在LBTAG平板上以不同濃度進行涂布。在37℃孵育過夜后，計算菌落的數量。
使用較低的噬菌體滴度(較之1011的108)進行操作時，有機相的存在對于轉染率具有負面影響(大約降低50％)。使用較高的噬菌體滴度時，未觀察到這種影響。
正如從結果和此處的討論中可見，采用以細胞篩選抗體表達文庫的所述方法，抗體的篩選不依賴于純化的和/或重組抗原的可獲得性，且甚至能發現新的細胞類型特異性的抗原。因此，使用本發明方法的細胞淘洗，結合細胞過濾器篩選或其他方法，如AffiSelect或8200細胞檢測系統(Applied Biosystems公司)的組合，為高通量的篩選和選擇抗細胞表面抗原的抗體，提供了技術平臺。
實施例6-對來自成功的淘洗方案的腫瘤特異性克隆的目標靶的鑒定，所述成功淘洗方案采用1或2次清洗后的有機相分離方法。
使用來自乳腺癌淘洗方案的兩種scFv克隆(克隆1和2，見圖1和2)鑒定其靶體，該乳腺癌淘洗方案采用1次清洗后有機相離心。
為了目標靶鑒定，由陽性細胞系(SW900；scFv1和2的高表達抗原)構建腫瘤cDNA噬菌體展示文庫。隨后，該文庫被用于對分別包被了scFv1和2的薄壁管進行淘洗。在3輪淘洗之后，由過濾器篩選來測試單個的腫瘤cDNA克隆的表達物對scFv1和2包被的過濾器的結合。在鑒定scFv2抗原的情況中，發現5個腫瘤cDNA克隆與scFv-2涂覆的過濾器結合(圖6)。序列分析顯示全部5種克隆對應于相同的核苷酸序列。
在鑒定scFv1抗原的情況中，12個腫瘤cDNA克隆表現出與scFv1包被的過濾器的結合(數據未示出)。
通過在scFv包被的平板上進行ELISA，驗證scFv與腫瘤cDNA克隆的結合。此外，scFv1和2現在都被用于免疫沉淀實驗、1維和2維的PAGE，多肽萃取和質譜分析中。
因此，可以看出，本發明的方法能進一步用于鑒定與所述結合伴侶相互作用的目標靶體(在這里為目標抗原)，所述結合伴侶經過本文所述的改進的有機相分離方法鑒定。
權利要求
1.一種篩選分子文庫以鑒別或選擇所述分子文庫中的作為一種或多種靶體的候選結合伴侶的一種或多種成員的方法，所述方法包括(a)使表達文庫與一種或多種靶體接觸；(b)使所述靶體接受至少一次清洗步驟；(c)通過貫穿有機相的分離，從所述表達文庫未結合的成員中分離與所述表達文庫的一種或多種成員結合的靶體，因而從其他文庫成員中分離所述靶體的候選結合伴侶。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述表達文庫是噬菌體展示文庫。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述表達文庫是抗體表達文庫。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述抗體表達文庫包括scFv抗體。
5.根據權利要求1至4中任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述靶體是細胞表面分子或者附著于固相的分子。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述細胞表面分子以完整細胞的組分或以細胞的膜片段的形式提供。
7.根據權利要求1至6中任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述靶體為抗原。
8.根據權利要求5至7中任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述細胞被編碼所述靶體的核酸轉化或轉染，或者被編碼靶體文庫的核酸轉化或轉染，或者是過量表達所述靶體的細胞。
9.根據權利要求5至8中任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述細胞為真核細胞。
10.根據權利要求5至9中任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述細胞與疾病狀態相關。
11.根據權利要求5至10中任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述細胞為癌細胞。
12.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述固相為微粒固相。
13.根據權利要求1至12中任一權利要求所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中提供了多于一種的靶體。
14.根據權利要求1至13中任一權利要求所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中進行至少2次、至少3次、或至少4次的清洗步驟。
15.根據權利要求1至13中任一權利要求所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中進行1、2、3或4次清洗步驟。
16.根據權利要求1至15中任一權利要求所述的方法，其特征在于，通過離心進行所述貫穿有機相的分離。
17.根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在所述方法步驟(a)之前進行的一次或多次預淘洗步驟，其中所述表達文庫與一種或多種非相關的實體進行接觸。
18.根據權利要求1至17中任一權利要求所述的方法，其特征在于，步驟(a)至(c)被重復一次或多次。
19.根據權利要求1至18中任一權利要求所述的方法，其特征在于，步驟(a)至(c)被重復1、2或3次。
20.根據權利要求1至19中任一權利要求所述的方法，其特征在于，與所述表達文庫的一種或多種成員結合的所述靶體被進行進一步的分析。
21.根據權利要求20所述的方法，其特征在于，所述進一步的分析是對所述候選結合伴侶和/或所述靶體的進一步分析。
22.根據權利要求1至21中任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述候選結合伴侶從所述靶體中被分開、移出、洗脫，或分離，或者獨立于所述靶體被表達或產生。
23.根據權利要求21或22中所述的方法，其特征在于，對所述候選結合伴侶的所述進一步分析包括如下步驟i)使一種或多種所述候選結合伴侶在溶液中與一種或多種靶體接觸；ii)將與一種或多種所述候選結合伴侶結合的靶體捕獲至固相；以及iii)檢測靶體的存在，因而檢測靶體的一種或多種候選結合伴侶的存在。
24.根據權利要求23所述的方法，其特征在于，所述靶體如在任一前述的權利要求中的定義。
25.根據權利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述候選結合伴侶包括有助于捕獲步驟(ii)的標簽或標記。
26.根據權利要求23至25中任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述的靶體含有報導部分或與之相關聯以能夠檢測所述靶體。
27.根據權利要求26所述的方法，其特征在于，所述報導部分為DNA分子。
28.根據權利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述靶體為細胞表面分子，且所述報導分子為存在于細胞內的DNA分子，在所述細胞上表達有所述靶體。
29.根據權利要求27或28所述的方法，其特征在于，所述DNA分子為外源管家基因或者為外源報導部分。
30.根據權利要求23至29中任一權利要求所述的方法，其特征在于，在步驟(ii)中所述的固相為磁性的且優選地為微粒。
31.根據權利要求23至30中任一權利要求所述的方法，其特征在于，通過在所述固相上的捕獲分子和與所述候選結合伴侶相關聯的標簽或分子之間的相互作用促進所述捕獲步驟。
32.根據權利要求23至31中任一權利要求所述的方法，其特征在于，通過檢測所述靶體上或與所述靶體相關聯的報導部分的存在而進行所述檢測步驟。
33.根據權利要求32所述的方法，其特征在于，所述檢測步驟通過PCR進行。
34.一種分離和/或鑒別未知靶體的方法，所述方法包括在權利要求1至33中的任一權利要求定義的步驟，且進一步包括(d)分離與所述未知靶體結合的一種或多種表達文庫成員，以及(e)使用所述文庫成員分離和/或鑒別與其結合的靶體。
35.一種從表達文庫中選擇、鑒別和/或分離作為靶體的特異性結合伴侶的文庫成員，或者選擇、鑒別和/或分離靶體的方法，所述方法包括在權利要求1至33中的任一權利要求定義的步驟以選擇顯示一定特性的分子，以及可選擇地(e)鑒別和/或分離作為所述靶體的特異性結合伴侶的相關文庫成員，以及可選地(f)使用所述文庫成員鑒別和/或分離與其結合的靶體。
36.根據權利要求34或35所述的方法，其特征在于，權利要求34所述的步驟(e)或權利要求35的步驟(f)包括使用所述文庫成員以篩選由所述未知靶體在其上表達的細胞制備的cDNA文庫。
37.根據權利要求1至36中任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述方法還包括生產或表達所述結合伴侶或靶體，或者其部分、片段、變體，或衍生物的步驟，以及可選地將所述結合伴侶或靶體與至少一種制藥學可接受的載體或賦性劑配成制劑的步驟。
38.使用權利要求1至37中的任一權利要求限定的方法鑒別、選擇、分離、生產、表達或配成制劑的結合伴侶或靶體。
39.使用權利要求1至37中的任一權利要求限定的方法鑒別、選擇、分離、生產、表達或配成制劑的結合伴侶或靶體在體外分析或在體外診斷分析中的用途。
40.使用權利要求1至37中的任一權利要求限定的方法鑒別、選擇、分離、生產、表達或配成制劑的結合伴侶或靶體在用于治療或體內診斷的藥物或組合物的生產中的應用。
41.一種對患者的治療方法，包括使用權利要求1至37中的任一權利要求限定的方法鑒別、選擇、分離、生產、表達或配成制劑的結合伴侶或靶體的適當劑量的用藥。
全文摘要
本發明提供一種篩選分子文庫以鑒別或選擇所述分子文庫中的作為一種或多種靶體的候選結合伴侶的一種或多種成員的改進方法，包括(a)使表達文庫與一種或多種靶體接觸；(b)使所述靶體接受至少一次清洗步驟；(c)通過貫穿有機相的分離，從所述表達文庫未結合的成員中分離與所述表達文庫的一種或多種成員結合的靶體，因而從其他文庫成員中分離所述靶體的候選結合伴侶。
文檔編號G01N33/68GK101052879SQ200580034143
公開日2007年10月10日 申請日期2005年10月7日 優先權日2004年10月8日
發明者馬里克·若澤·雅內克·格特魯德·斯塔薩, 赫勒爾德·雷厄瑟夫 申請人:奧菲技術科學院
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