專利名稱：使用表面增強拉曼納米粒子標記物的體內腫瘤靶向和光譜檢測的制作方法
技術領域：
本公開總體涉及表面增強拉曼光譜納米粒子，及其細胞檢測用途。
背景
用于體內分子成像和靶向治療的生物相容的納米粒子的開發是當前在許多科學、工程和生物醫學學科中引起相當大興趣的領域。基本原理是納米尺寸的粒子具有離散分子或宏觀材料所沒有的功能和結構特性。當與生物分子靶向配體如單克隆抗體、肽或小分子偶合時，這些納米粒子可用來以高特異性和親和性靶向惡性腫瘤。在直徑為10-nm至100-nm的"介觀"尺寸范圍內，納米粒子還具有大表面積以偶合至多種診斷的(例如，光學的、放射性同位素的或磁性的)和治療的(例如，抗癌的)劑。最近的進 展已經導致用于藥物遞送的生物可降解納米結構、用于磁共振成像的氧化
鐵納米晶體、用于多重分子診斷和體內成像的量子點和用于短干擾RNA (siRNA)遞送的納米級載體的發展。
膠體金已經被安全地用來治療類風濕性關節炎半個世紀，而且最近的 研究表明，在全身注射后聚乙二醇化的金納米粒子(用聚乙二醇或PEG保 護層包被的膠體金)展現了優秀的體內生物分布和藥物代謝動力學特性。 與含鎘的量子點及其他的毒性或免疫原性的納米粒子相反，金膠體在體內 有少量或沒有長期毒性或其他有害作用。單個分子和單個納米粒子的表面 增強拉曼散射(SERS )的發現已經吸引了對于增強機理的基礎研究和在超 靈敏光檢測和光譜學上的潛在應用二者的相當大的興趣。許多研究人員已 經證明，增強因子大到1014-1015,其導致與熒光有機染料可比的或甚至更 大的拉曼散射截面。在室溫下，這種巨大的增強允許位于單個納米粒子表 面或兩個粒子接合處的單個分子的光譜;險測和鑒別。關于單個分子SERS 的結構和機理方面已經取得進展，但仍不清楚的是，這種大的增強作用可 如何用于分析化學、分子生物學或醫學診斷的應用。 一個主要問題是SERS 所固有的界面性質，其要求分子吸附在粗糙金屬表面上。對于生物分子如 肽、蛋白質和核酸，表面增強拉曼數據特別地難獲得，難解釋并幾乎不可 能再現。
概述
開發了 一種基于超靈敏的表面增強拉曼散射(SERS )光譜學的新的細 胞成像技術的實施方案作為診斷和治療工具。本公開的實施方案涉及自發 地組裝的SERS納米標記物，其含有用于體外和體內應用的耐久和多用途 的保護涂層。圖像亮度測量可顯示SERS納米標記物比量子點標記物高至 少兩個數量級。雙功能的聚乙二醇聚合物充當金納米粒子核心與連接于納 米結構上的靶向或治療劑之間的連接體。
公開了納米粒子、其制備方法和使用所述納米粒子的實施方案來檢測 靶分子的方法。其中，示范性的納米粒子的一個實施方案包括表面增強拉曼光譜活性的復合納米結構。所述表面增強拉曼光譜活性的復合納米結構 包含核心、報道分子和封裝物質。所述報道分子4定合于所述核心。所述報 道分子可選自但不限于異硫氰酸酯染料、多硫有機染料、多雜硫有機染料、 苯并三唑染料及其組合。所述封裝物質被置于所述核心和所述報道分子 上。所述被封裝的報道分子具有可測量的表面增強拉曼光譜特征。
簡短地描述，本公開的實施方案特別地涵蓋納米結構、制備納米結構 的方法、通過將本公開的納米結構遞送到細胞、組織或整個動物或人之上 或之內的特定扭而成^象的方法。本乂>開涵蓋包括金屬納米粒子核心、拉曼 報道子和置于其上的保護層的納米結構。
因此，^/>開的一方面涵蓋表面增強拉曼光語活性的復合納米結構， 其包括核心金屬納米粒子、置于所述核心表面上的拉曼報道分子和置于所 述核心和報道分子表面的封裝保護層，其中被封裝的報道分子具有可測量 的表面增強拉曼光鐠特征。
在本公開的實施方案中，拉曼報道分子可選自異硫氰酸酯染料、多硫 有機染料、多雜硫有機染料、苯并三唑染料及其組合。
在本公開的實施方案中，報道分子選自噻菁(thiacyanine )染料、二 "塞菁(dithiacyanine)染料、硫碳菁(thiacarbocyanine)染料和二硫碳菁
(dithiacarbocyanine )染料。在其他的實施方案中，報道分子選自孔雀石 綠異硫氰酸酯、四甲基若丹明-5-異硫氰酸酯、X-若丹明-5-異硫氰酸酯、 X-若丹明-6-異硫氰酸酯和3,3'- 二乙基硫二碳菁碘化物
(3,3'-diethylthiadicarbocyanine iodide )。
在本公開的一個實施方案中，所述核心是金，并可具有小于約200納
米的直徑。
在本^Hf的納米結構的實施方案中，封裝物質可以是巰基聚乙二醇。
在本公開的其他實施方案中，納米結構還可包括能夠選擇性地結合細 胞上的靶的靶特異性探針。
在這些實施方案中，所述乾特異性探針可選自由抗體、多肽、多核苷 酸、藥物分子、抑制劑化合物及其組合組成的組，并且其中所述靶向探針具有對靶細胞表面上至少一個標志物的親和性。
在一個實施方案中，靶特異性探針是免疫球蛋白或其片段，而且在本 公開的實施方案中所述探針可以被置于疏水保護結構上。在一個實施方案 中，所述探針是靶向胂瘤的配體。
^^>開的另 一個方面涵蓋制備根據^^開所述納米結構的方法，其包 括提供金納米粒子，將所述金納米粒子引至拉曼報道子以借此將拉曼報道 分子置于納米粒子的表面而形成納米粒子4艮道子復合物，以及將保護結構 層置于所述納米粒子4良道子復合物的表面上，其中所述報道分子具有可測 量的表面增強拉曼光譜特征。
在本公開此方面的一個實施方案中，所述方法還可包括將細胞靶特異 性探針置于保護結構層上，其中所述探針選自抗體、多肽、多核香酸、藥 物分子、抑制劑化合物或其組合。
^^開的再一個方面涵蓋生物樣品成^^的方法，其包括將至少一個納 米結構遞送到被培養的細胞或動物或人受治療者，其中所述納米結構包括 核心金屬和金、納米粒子、置于所述核心表面上的拉曼報道分子和置于所 述核心和報道分子上的封裝保護層，其中被封裝的報道分子具有可測量的 表面增強拉曼光i普特征，允許納米結構接觸靶生物細胞或組織，使用放射 源激發報道分子，并測量對應于報道分子的納米結構的表面增強拉曼光譜 的譜，由此檢測靶細胞或組織的納米結構的存在。
在本公開此方面的 一個實施方案中，納米結構還可包括靶特異性探 針，其中所述靶向探針可選擇地將納米粒子結合到靶向的細胞，從而允許
輩巴向的細"包的4全測。
在本/〉開的另一個實施方案中，所述靶細胞是在動物或人受治療者的 組織中。
在本公開此方面的實施方案中，所述靶細胞可以是動物或人受治療者 的癌細胞，并且所述靶特異性探針可選自由抗體、多肽、多核苷酸、藥物 分子、抑制劑化合物及其組合組成的組，其中所迷靶向探針具有對靶細胞 表面上標志物的親和性。
8在本公開的一個實施方案中，所述靶特異性探針是靶向肺瘤的配體。 附圖簡述
在與附圖 一起查看下述^/〉開的各種實施方案的詳細描述后，本公開 進一步的方面將被更容易地理解。
圖1A展示原始的金膠體、拉曼報道分子編碼的粒子和使用巰基聚乙 二醇(巰基PEG)層穩定的粒子的制備順序和圖式結構。大約1.4-1.5xl04 個報道分子(例如孔雀石綠)被吸附在每個60-nm的金粒子上，其中所述 金粒子進一步被3.(^104個巰基PEG分子所穩定。
圖1B展示從圖1A中所示原始的、拉曼編碼的和PEG穩定的金納米 粒子獲得的光吸收。
圖1C展示從圖1A中所示原始的、拉曼編碼的和PEG穩定的金納米 粒子獲得的透射電鏡術(TEM)。
圖1D展示從圖1A中所示原始的、拉曼編碼的和PEG穩定的金納米 粒子獲得的動態光散射尺寸數據。
圖2A-2F展示聚乙二醇化的SERS納米粒子和近紅外發射的量子點在 650-750 nm光譜區內的對比。
圖2A和2B顯示在相同實驗條件下SERS納米粒子(圖2A)和QD705 (圖2B)的光吸收和發射i普。
圖2C和圖2D顯示單個金納米粒子(圖2C)和單個量子點(圖2D) 的SERS和熒光圖像，其被分散在載玻片上并在相同條件下(EM-CCD相 機，633 ± 3 nm激發和655 nm長通發射)被獲得。顯示在圖2D中的斑點 是光學干涉條紋，其在低亮度下變得可見。
圖2E和圖2F顯示SERS納米粒子和量子點之間的亮度區別的線繪圖 (圖2E)和統計分析(圖2F)。拉曼和量子點信號的標準偏差(S.D.)用誤 差棒指出。
圖3A和3B展示使用抗體偶合的SERS納米粒子進行的癌癥細胞靶向
9和光"i普檢測。圖3A顯示使用SH-PEG和異功能PEG ( SH-PEG-COOH)的混合物 制備把向的SERS納米粒子。抗EGFR特異性的scFv抗體片段的共價偶合 發生在異功能PEG的暴露末端。圖3B顯示從EGFR陽性癌細胞(Tu686 )和EGFR陰性癌細胞(人類 非小細胞肺癌NCI-H520 )獲得的SERS光譜，連同對照數據和標準標記物 光譜。所有光譜都得自785-nm激光激發的細胞懸液，并通過從納米標記 物染色的細胞的光譜減去未處理細胞的光譜而被修正。拉曼報道分子是二 乙基硫三碳菁(diethylthiatricarbocyanine) ( DTTC ),而且它的不同光譜特 征由波數表示(cm")。圖4展示從被注射至活體動物皮下和深層肌肉位點的聚乙二醇化的金 納米粒子獲得的體內SERS光譜。注射位點和激光束位置由圓圈在動物上 標明。圖5A-5C展示通過使用識別腫瘤生物標志物EGFR的scFv抗體偶合 的金納米粒子進行的體內癌癥靶向和表面增強拉曼檢測。圖5A和5B顯示從腫瘤和肝臟位置使用被把向的(圖5A)和未被耙 向的(圖5B)納米粒子獲得的SERS光譜。攜帶人頭頸鱗狀上皮細胞癌 (Tu686 )異種移植腫瘤(直徑3-mm )的兩只棵小鼠接受90 pi的scFv EGFR 偶合的SERS標記物或聚乙二醇化的SERS標記物(460 pM )。通過尾靜脈 單次注射施用所述粒子。注射5小時后獲取SERS光i普。圖5C是顯示聚焦于腫瘤位點或肝臟解剖位置的激光束的照片。用2-s 信號整合和785 nm的激發從腫瘤位點和肝臟位點獲得體內SERS光譜。所 述光譜被扣除本底并移位以獲得更好的視覺效果。拉曼報道分子是孔雀石 綠，其具有與圖5A和5B中所標明的截然不同的光譜特征。所述激光功率 是約20 mW。圖6展示在主要器官中被耙向的和未被耙向的金納米粒子的生物分布 數據，其中所述數據是在注射5個小時后通過電感耦合等離子體質譜法 (ICP-MS)測量的。注意被耙向的和未被把向的納米粒子之間腫瘤堆積的差別。基于每個研究組中的四只動物(n = 4)計算S.D.誤差棒。
圖7A和7B展示未包被的(左欄)和PEG-SH包被的(右欄)Au-MGITC 復合物的穩定性對比。頂圖是在水(實線)和PBS (虛線)中未包被的(左) 和包被的(右)Au-MGITC的UV-Vis吸收光譜；中圖是在PBS中未包被 的(左)和包被的(右)Au-MGITC的TEM圖像；底圖是在PBS中未包 被的(左)和包被的(右)Au-MGITC的DLS尺寸分布。MGITC是孔雀
石綠異硫氰酸酯(rrc)的縮寫。
圖8展示單個癌細胞的SERS光鐠和相關的表面等離子體成像。上圖 scFv偶合的金納米粒子標記的活的Tu686細胞(EGFR陽性)和H520 6 細胞(EGFR陰性)的反射模式暗視野圖像。所述圖像由奧林巴斯Q-Color 5CCD相機在250毫秒曝光時間下獲得。下圖從箭頭所標明的單個細胞 獲得的SERS光i普。拉曼報道染料是二乙基硫三碳菁(DTTC)。
圖9展示普通的PEG包被的納米粒子和與大小匹配的非特異性蛋白 (27-KD重組GFP)偶合的PEG納米標記物的體內分布和腫瘤攝取數據 的比較。所述數據是在注射5個小時后使用對金元素的電感耦合等離子體 質譜(ICP-MS)分析而獲得的。
圖IO展示透射電子顯微照片，其顯示EGFR靶向的金納米粒子的腫 瘤攝取、它們在細胞內細胞器如內體中的的聚集和定位。插圖是細胞器內 金納米粒子的展開圖。Nu指的是細胞核。
圖11展示顯示肝臟Kuffper細胞對金納米粒子的非特異性攝取的透射 電子顯微照片，其主要顯示位于早期和晚期內體(如箭頭所指)的單個金 納米粒子。
圖12顯示參與主動和被動腫瘤靶向的聚乙二醇化的SERS納米粒子的 示意圖。對照和凈皮耙向的納米粒子二者都能通過EPR作用(增強的通透和 保持作用)在腫瘤中堆積，但只有^皮耙向的納米粒子能識別EGFR陽性癌 細胞并由受體介導的胞吞作用快速地進入這些細胞。
圖13比較本公開的SERS納米結構和量子點QD705的光穩定性。
圖14展示SERS信號強度與連接于60nm金表面的巰基聚乙二醇的數量的關系曲線。
圖15展示使用PEG-SH層封裝金納米粒子的"閉鎖作用"(lock-out effect),其中(i )不含PEG-SH包被；(ii海個納米粒子有30,000個PEG-SH; (iii)每個納米粒子有300,000個PEG-SH;以及(iv)在加入的4良道染料 被鎖在納米粒子外面前連接的PEG-SH。
圖16展示PEG包被防止連接在納米粒子的報道分子和在PEG層外表 面上的染料之間的相互干擾。(a)單獨的Au-MGITC; ( b )單獨的Au-RBITC; (c) RBITC被鎖在外面；和(d)共吸附于納米粒子上的2種染料。
圖17展示PEG包被的粒子的長期穩定性。
圖18展示Au-MGITC-PEG-SH的SERS光譜，其被再分散于(圖a) 純水、(圖b) 10xPBS、(圖e) pH12的水溶液、(圖d) pH2的水溶液、 (圖e)乙醇、(圖f)甲醇、(圖g) DMSO中，然后被轉回水中。報道染 料是孔雀石綠異硫氰酸酯(MGITC)，其具有截然不同的光譜特征，如所 標記的。激發波長633 nm;激光功率5 mW。
本公開的方法和系統的一些示范性實施方案的細節在下面的描述中 被闡明。在檢驗如下的描述、附圖、實施例和權利要求后，本公開的其他 特征、目的和優點對本領域技術人員將是明顯的。所有這種額外的系統、 方法、特性和優點都意于包含在此描述中、在^^開的范圍內，并被隨附 的權利要求保護。
詳細描述
在更詳細地描述本公開之前，應理解的是，本公開不被所描述的特定 的實施方案所限制，并且當然同樣可進行變化。還應理解的是，本文所用 術語僅是為了描述特定的實施方案，且不是意圖限制，因為本公開的范圍 將只被所附權利要求限制。
當提供值的范圍時，應理解的是，在該范圍上限和下限之間的每個居 間值(除非上下文有明確的相反說明，所述居間值是到下限單位的十分之 一)和在所述范圍內的^"f可其他所述的或居間值，都涵蓋在_^/>開內。這
12些更小范圍的上限和下限可被獨立地包含在該更小范圍內并也涵蓋于本 公開內，所述范圍內可有任何特別被排除的限值。當所述范圍包括所述限 值中的一個或二個的時候，排除了那些被包括的限值之一或全部兩個的范 圍也被包括在^^開內。
除非另外定義，本文所用所有技術和科學術語具有與本公開所屬的領 域普通技術人員通常所理解的意義相同的意義。雖然與本文所描述的方法 和材料相似或等同的任何方法和材料也可以用于本公開的實施或檢驗，但 現在仍描述優選的方法和材料。
別地和單獨地指出各單獨的出版物或專利通過引用而被并入，以及為了公
任何出版物的引用是因為其在提交日期之前公開，并不應該解釋為承認本 公開由于在先公開而不可以早于此出版物的日期。進一步地，所提供的出 版日期可能與實際的出版日期不同，這需要單獨地確認。
對于閱讀本公開的本領域技術人員明顯的是，本文所描述和展示的每 個單獨的實施方案具有離散的組分和特性，其可以容易地與其他任何實施 方案的特性分開或合并，而不違反本公開的范圍或^"神。可以以所述的事
件順序或其他任^r邏輯上可能的順序實施任^r所述的方法。
除非另外指出，^^開的實施方案將使用在本領域技術內的醫學、有 機化學、生物化學、分子生物學、藥理學以及類似學科的技術。這些技術 在文獻中得到充分的解釋。
必須注意的是，如本說明書和所附權利要求所用，單數形式"一種(a )"、
"一種(an)"和"所述(the)，，包含復數的對象，除非上下文另外清楚地規 定。因此，例如提到"一種支持物"包括多個支持物。在本說明書和隨后的 權利要求中，將提及許多術語，其將被定義為具有如下含義，除非有明顯 相矛盾的意愿。
如本文所用，除非另外說明，下面的術語具有賦予他們的意義。在本 公開中，"包括(comprise)"、"包括(comprises)"、"包含(containing)"和"具有(having)"以及類似詞具有在美國專利法中賦予它們的意義，并 且可以表示"包含(includes)"、"包含(including)"以及類似含義；當應
用于本/>開所涵蓋的方法和組合物時，"基本上由......組成(consisting
essentially of)，，或"基本組成為(consists essentially)"以及類似表達指的是 像本文所公開的那樣的組合物，但其可含有額外的結構基團、組合物組分 或方法步驟(或如上討論的其類似物或衍生物)。然而，與本文所公開的 相應組合物或方法的結構基團、組合物組分或方法步驟等相比，這種附加 的結構基團、組合物組分或方法步驟等不顯著地影響所述組合物或方法的 基本的和新穎的特性。當應用于本公開所涵蓋的方法和組合物時，"基本上
由......組成(consisting essentially of )"或"基本組成為(consists essentially)"
以及類似表達具有在美國專利法中所賦予的意義，而且此術語是開放式 的，其允許多于所列舉的那些的存在，只要所列舉的那些的基本的和新穎 的特性沒有因多于所列舉的那些的存在而改變，但其不包括現有技術實施 方案。
在描述各種實施方案之前，提供并應使用如下定義，除非另外指出。
定義
本文所用術語"拉曼光散射"指的是當某些分子被光照時，阻留住光子 的一小部分所述分子在釋放被阻留的光子后不恢復到它們原始的振動能 級，而是降到基礎電子狀態的不同振動能級。因此，從這些分子發射的射 線將處于不同的能級并因此具有不同的波長。這被稱為拉曼散射。
如果此分子降到基礎電子狀態的較高振動能級，所發射出的光子具有 比所吸收的光子更低的能量或更長的波長。這被稱為斯托克斯(Stokes) 位移拉曼散射。如果一個分子在吸收光子之前已經處于較高振動狀態，它 可以將此多余的能量賦予發射的光子從而恢復到基態。在此情況下，所發 射的射線具有更高的能量(和更短的波長)并被稱為反斯托克斯位移拉曼 散射。在處于正常狀態的分子的任何集合中，處于基態的分子數量總比處 于激發態的分子多得多，因此入射光子與受激分子相互作用并在^6並撞后以 比其荷載的能量更多的能量羊皮散射的幾率非常小。因此，以比入射光子頻率更高的頻率(反斯托克斯頻率)散射的光子相對于以比入射光子頻率更 低的頻率(斯托克斯頻率)散射的光子來說是微不足道的。因此，通常被 分析的是斯托克斯頻率。
本文所用術語"表面增強拉曼散射(SERS)"指的是當分子被帶到極接 近于(但不必接觸于)特定的金屬表面時，可觀測到的拉曼光散射的強度 的顯著增加。所述金屬表面需要被"粗糙化，，或包被微小的金屬粒子。
金屬膠體也顯示此種信號增強作用。強度的增加可以是幾百萬倍或更 多的級別的。SERS作用的原因尚未完全了解；然而，現在的想法設想至 少兩種單獨的因素貢獻于SERS。首先，金屬表面含有微小的不規則體。 這些不規則體可被認為是球體(在膠體中，它們是類似球體的或幾乎如 此)。直徑為入射光波長的約1/10的那些粒子被認為對所述作用貢獻最大。 入射光子誘發跨越粒子的場，其中所述粒子由于是金屬而具有非常不穩定 的電子。
在金屬表面或粒子的某些構型中，可以使表面電子群以集體的方式振 蕩，以對施加的振蕩電磁場作出響應。這種集體振蕩的電子群被叫做"等離 子體振子"。入射光子提供此振蕩電磁場。入射光對分子中振蕩的偶極矩的 誘導是拉曼散射的來源。表面等離子體振子的共振振蕩的作用是在金屬表 面附近導致電磁場強度的大幅度增強。這導致在散射分子中誘導的振蕩偶 極子的增強，并因此增加拉曼散射光的強度。所述作用是增加粒子附近的 入射光的表觀強度。
被認為貢獻于SERS作用的第二個因素是分子成像。與金屬表面極為 貼近的含有偶極矩的分子將誘發其自身在具有相反極性的表面上的圖{象 (即在等離子體振子上的"陰影"偶極子)。認為所述圖像中的貼近增強分子 散射光的功率。分子的這種偶聯可具有對表面等離子體振子的感應或扭曲 的偶極矩，并極大地提高了激發概率。這種結果是表面吸收的分子散射的 拉曼光效率的非常大的增加。
SERS作用可通過與共振拉曼作用組合而被提高。如果激發光頻率與 被光照的分子的主要吸收帶共振，那么表面增強拉曼散射作用更強烈。所 導致的表面增強共振拉曼散射(SERRS)作用能導致拉曼散射信號強度增強七個數量級或更高。
本文所用術語"拉曼報道分子"可指小的有機化合物，例如以前用作拉 曼光譜報道分子的苯硫酚、巰基苯甲酸和雙吡啶。這些分子產生簡單的拉 曼光譜，但它難以或不可能在可見光激發波長實現共振拉曼增強。結果，
被報道的SERS強度相對較低，即使在高(毫摩爾)的報道分子濃度下。 含有異硫氰酸酯(-N=C=S )基團或多個硫原子的有機染料強烈地吸附在核 心粒子上，并可以與封裝作用相容。例如，強的SERS光鐠已經獲得自(b) 孔雀石綠異硫氰酸酯(MGITC )、 ( c )四甲基若丹明-5-異硫氰酸酯(TRITC )、 (d) X-若丹明-5 (和-6)-異硫氰酸酯(XRITC)和(a) 3,3'-二乙基硫二 碳菁^典化物(DTDC)。這些分子中的三個含有異硫氰酸酯基團，而第四個 在環結構上具有兩個硫原子。
異硫氰酸酯基團或硫原子提供"親和標記物"以結合至金表面，產生穩 定的硫凌4A。對于不含有這種親和標記物的分子如結晶紫和若丹明6G， 可以觀察到強的SERS光i普，但信號在用例如硅石包被后消失。此外，這 些染料中的大多數在可見光譜中具有強的電子躍遷，因此共振拉曼增強可 用來進一步增加信號強度。在嚴沖各意義上，這些分子應該被稱作"共振拉曼 報道分子"，以將它們同苯硫酚和其他非共振拉曼報道分子區別。在多數情 況下，相對于表面增強自身，共振拉曼提供約2-3個數量級的額外增強。 熒光和非熒光染料二者都能用作共振拉曼報道分子，因為熒光發射能被金 粒子有效地猝滅，而不干擾拉曼測量。 一系列苯并三唑染料對于表面增強 共振拉曼散射是才及好的；由于多個氮原子的存在，這些分子可以為光譜的 編碼和多重應用提供一類新的共振拉曼報道分子。
本文所用術語"保護層"指的是可以完全地或部分地封裝納米粒子從而 防止粒子聚集的層。生物相容的層可包括但不限于巰基聚乙二醇聚合物， 其中所述巰基將所述聚合物連接至下層的納米粒子。所述聚合物的遠端可 具有與靶特異性的配體偶聯的反應基團。所述保護層可被完整地或部分地 置于，也就是定位于或沉積于金屬納米粒子和報道納米結構的表面之上或 外周。
本文所用術語"量子點"(QD)指的是半導體納米晶體或人工原子，它是含有100至1,000個之間的任何數量的電子并在約2-10 nm范圍的半導 體晶體。 一些QD的直徑可以在約10-20 nm之間。QD具有高量子產率， 這使它們對光學應用特別有用。QD是通過形成激發子而發熒光的熒光團， 其中所述激發子可被認為是通常的熒光團的激發態，但具有更長的達到 200納秒的壽命。此特性為QD提供低的光漂白。
本文所用術語"多肽"或"蛋白"旨在涵蓋不論是從自然中分離的，具有 病毒、細菌、植物或動物(例如哺乳動物，如人類)來源的還是合成的蛋 白、糖蛋白、多肽、肽以及類似分子，以及其片段。優選的蛋白或其片段 包含但不限于抗原、抗原表位、抗體或抗體的抗原反應性片段。
本文所用術語"核酸"指的是DNA和RNA，其不論是從自然中分離的， 具有病毒、細菌、植物或動物(例如哺乳動物，如人類)來源的，合成的， 單鏈的，雙鏈的，包括天然或非天然存在的核苷酸的，還是化學纟務飾的。
本文所用術語"癌癥，，將被賦予它的普通意義，并且是其中異常細胞失 控地分裂的疾病的總稱。癌癥細胞可侵入附近的組織并能通過血流和淋巴 系統擴散到身體其他部位。
有幾種主要癌癥類型，例如，癌是開始于皮膚或界分或覆蓋內部器官 的組織的癌癥。肉瘤是開始于骨骼、軟骨、脂肪、肌肉、血管或其他結締 或支持組織的癌癥。白血病是開始于造血組織例如骨髓并引起大量異常血 細胞被生產和進入血流的癌癥。淋巴瘤是開始于免疫系統細胞的癌癥。
當正常細胞失去它們作為特定的、受控的和協調的單位的行為能力 時，就形成了腫瘤。 一般地，實體瘤是異常的組織塊，其通常不含有囊腫 或液體區域(一些腦腫瘤具有嚢肺和充滿液體的中央壞死區)。單個腫瘤 甚至可以在它內部具有不同細胞群，其具有錯誤的不同過程。實體瘤可以 是良性的(非癌性的)或惡性的(癌性的)。不同類型的實體瘤以形成它 們的細胞類型來命名。實體瘤的例子是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血癌) 一般不形成實體瘤。
代表性的癌癥包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、結腸直腸癌、子宮內膜 癌、頭頸癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、
17前列腺癌、睪丸癌、子宮癌、子宮頸癌。
本文所用的心血管疾病將被賦予它的普通意義，并包括但不限于高血 壓、糖尿病、冠狀動脈病、瓣膜心臟病、先天性心臟病、心律不齊、心肌
病、CHF、動脈粥樣硬化、發炎的或不穩定的血小板相關的狀況、再狹窄、
梗塞、血栓形成、手術后凝血障礙以及中風。
本文所用炎性疾病將被賦予它的普通意義，并可包括但不限于自身免 疫性疾病如關節炎、類風濕性關節炎、多發性硬化、系統性紅斑狼瘡，其 他疾病例如哞喘、牛皮癬、炎性腸綜合癥，神經退行性疾病例如老年癡呆 癥、帕金森氏病、亨廷頓氏病、血管性癡呆以及其他病理狀況例如癲癇、 偏頭痛、中風和外傷。
描述
與;^^開的目的一致，如本文所實施的和大致描述的，<^^>開的實施 方案涵蓋表面增強拉曼光譜學(SERS)活性的復合納米結構、制造這些納 米結構的方法和使用這些納米結構的方法。所述SERS活性的復合納米結 構是可辨別的并能進行個體;^測。在這點上，SERS活性的復合納米結構 可被修改以使SERS活性的復合納米結構與某些靶分子相互作用，其允許 檢出所述靶分子。此外，SERS活性的復合納米結構可用來編碼系統并使 系統多重化。SERS活性的復合納米結構可用在很多領域例如但不限于流 式細胞術、化學陣列系統、生物分子陣列系統、生物感測、生物標記、高 速篩選、基因表達研究、蛋白研究、醫學診斷、診斷庫和微觀流體系統。
^^開所提供的SERS活性的復合納米結構包括但不限于核心、置于 其上的報道分子和封裝保護物質或層。在一個實施方案中，所述核心物質 是金屬。在一個實施方案中，所述核心是金或銀。在一個實施方案中，所 述核心是金。所述報道分子可被置于(鍵合于)核心上，而所述封裝物質 覆蓋并保護核心和報道分子。在根據本公開的SERS納米結構的親水保護 表面上，可能有大量的官能團，其可被衍生并可允許診斷劑和治療劑二者 或靶特異性探針的連接。對于小分子配體例如合成的有機分子、短的寡核
18苷酸和肽，相同配體的很多拷貝能被連接到單個納米粒子上，導致多價的
SERS-納米粒子-靶結合。
這種納米粒子各自可包括SES活性金屬納米粒子，與金屬表面極為貼 近的亞單層、單層或多層的光譜活性種類，以及封裝保護殼。這將光譜活 性的分子("報道分子")放在金屬納米粒子和封裝劑之間的界面上。在通 常的和有利的實施方案中，SERS納米結構包括(i)金屬納米粒子核心(例 如金或銀)，(ii)具有獨特振動特征的拉曼活性的報道分子，以及(iii) 保護性封裝劑，其將報道分子"鎖"在適當位置并且還提供高度生物相容的 表面。基本上是SERS無活性的保護性包被也穩定所述粒子以對抗聚集， 并且防止不希望的核素的竟爭性吸附。
雖然不期望被理論所限制，所述核心在光學上增強SERS光譜，而報 道分子提供截然不同的光譜SERS特征。將封裝物質置于核心和報道分子 上實質上不對所述^艮道分子的光鐠SERS特征產生影響，而同時保護核心 和報道分子。不像其他SERS粒子，本公開所述SERS活性的復合納米結 構具有強的SERS強度(在約一秒內1 mW的激光功率下具有多于約10,000 個計數)。在一些實施方案中，SERS活性的復合納米結構具有可測量的 表面增強共振拉曼光i普特征。
對SERS高度有效的本文所公開的此類核心-殼膠體納米粒子(例如 SERS活性的復合納米結構)適合于單粒子水平上的復合檢測和光譜學。 具有幾乎最優化的金核心和保護殼，^/>開的SERS活性的復合納米結構 在水性電解質和有機溶劑二者中都是穩定的，并產生強的單粒子SERS光 譜。閃爍或強度波動仍被觀測到，表明SERS信號可以由位于核心和殼之 間界面的單個分子產生。 一個令人吃驚的發現是，含有異硫氰酸酯 (-N=C=S )基團或多個硫原子的有機染料與封裝步驟是相容的，并且是優 秀的拉曼報道分子基團，這是由于它們豐富的振動光譜以及聯合的表面增 強和共振增強的可能性。
與多數以前的SERS研究相反，本文所述的表面增強拉曼信號不是來 自靶分子，而是來自嵌入SERS活性的復合納米結構的拫道染料。尤其是 這種設計避免了表面吸附、底物變化和不好的數據重復性的問題。此發展開放了使用SERS在單個細胞和組織標本中的多個生物標志物進行光譜標 記的新的可能性，其包括拉曼活化的流式細胞術和細胞分選。與其他生物
標記例如熒光染料和半導體量子點相比，SERS活性的復合納米結構含有 內在的信號增強機制，并在環境條件下提供豐富的光譜信息。此外，拉曼 散射極短的壽命預防了光漂白、能量轉移或激發態的猝滅。
納米粒子核心可以是本領域已知的金屬納米粒子。如本文所用，術語 "納米粒子"、"納米結構"、"納米晶體"、"納米標記物"和"納米成分"可互換 地用來指含有或不含額外的層例如封裝保護層的金屬粒子，所述粒子具有 從約1 nm至1000 nm包括約1 nm至1000 nm之間任何整數值的尺寸。在 一些實施方案中，金屬納米粒子核心可以是直徑約為20-200 nm的球形或 接近球形的粒子。在一些實施方案中范圍是約2nm至50nm,在一些實施 方案中在約20nm至50nm的范圍內。各向異性的納米粒子可以具有長度 和寬度。在一些實施方案中，各向異性的納米粒子的長度是與產生納米粒 子的縫隙平行的尺寸。在各向異性的納米粒子的情況下，在一些實施方案 中，所述納米粒子能具有約350 nm或更小的直徑(寬度)。在一些實施 方案中，所述納米粒子能具有約250 nm或更小的直徑，以及在一些實施 方案中約100nm或更小的直徑。在一些實施方案中，寬度可以是約15nm 至300nm。在一些實施方案中，納米粒子可以具有約10-350nm的長度。
納米粒子可以是各向同性的或各向異性的。納米粒子包括膠體金屬的 中空或實心的納米條，；茲性、順f茲的、導電的或絕纟彖的納米粒子，合成的 粒子，水凝膠(膠體或條)以及類似粒子。本領域普通技術人員將理解的 是，納米粒子能以多種形狀存在，其包括但不限于球形、棒狀、圓盤狀、 錐體、立方體、圓柱體、納米螺旋體、納米彈簧體、納米環形體、棒狀納 米粒子、箭形納米粒子、淚滴狀納米粒子、四腳狀納米粒子、棱柱狀納米 粒子和多個其他的幾何和非幾何形狀。
報道分子可包括以下分子，例如但不限于含有異硫氰酸酯基團的有機 染料分子(下文中的"異硫氰酸酯染料")、含有兩個或多個硫原子的有機 染料分子(下文中的"多疏有機染料")、含有兩個或多個各含硫原子的雜 環的有機染料分子(下文中的"多雜硫有機染料，，)和苯并三唑染料。此外，報道分子可包括在可見光譜具有強的電子躍遷的共振拉曼報道分子，以使 可用共振拉曼增強進一步放大信號強度。共振拉曼報道分子包括但不限于 有機染料、生物分子、卟啉和金屬卟啉。特別地，共振拉曼報道分子可包
括但不限于孔雀石綠異硫氰酸酯、四甲基若丹明-5-異硫氰酸酯、X-若丹明 -5-異硫氰酸酯、X-若丹明-6-異硫氰酸酯和3,3'-二乙基硫二碳菁硤化物及其 組合。 一種特別有利的報道分子是孔雀石綠。
進一步地，報道分子可包括但不限于噻菁染料、二噻菁染料、硫碳菁 染料(例如，硫碳菁染料、硫二碳菁染料和硫三碳菁染料)和二硫碳菁染 料(例如二硫碳菁染料、二硫二碳菁染料和二硫三碳菁染料)及其組合。
此外，所述報道分子可包括3,3'-二乙基-9-甲基硫碳菁碘化物； 二乙基-2,2'喹啉并三碳菁殃化物；3,3'-二乙基硫噻菁碘化物
(diethylthiacyanine iodide); 4-乙酰胺基-4'-異硫氰酸均二苯乙烯-2,2'-二磺 酸(4-acetamido-4'-isothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid )， 二鈉鹽；二 苯曱酮_4-異硫氰酸酯；4,4'-二異硫氰酸二氫均二苯乙烯-2,2'-二磺酸，二鈉 鹽；4,4'-二異硫氰酸均二苯乙烯-2,2'-二磺酸，二鈉鹽；異硫氰酸N-(4-(6-二甲氨基-2-苯并呋喃基)苯酯；7-二甲氨基-4-甲基香豆素-3-異硫氰酸酯； 曙紅-5-異硫氰酸酯；赤蘚紅-5-異硫氰酸酯；熒光素-5-異硫氰酸酯；(S)-l-對-異硫氰酸芐基二乙烯三胺五乙酸；Oregon Green 488異硫氰酸酯；四 甲基若丹明-5-異硫氰酸酯；四甲基若丹明-6-異硫氰酸酯；四甲基若丹明-5-
(和_6)-異硫氰酸酯；X-若丹明-5-(和-6)-異硫氰酸酯及其組合。
苯并三唑染料可包括但不限于偶氮苯三唑-3,5-二甲氧基苯胺和二甲氧 基_4-(6'-偶氮苯三唑)苯酚。
如上所述，所述報道分子可具有異硫氰酸酯基團或兩個或多個硫原子 (例如，異硫氰酸酯染料、多硫有機染料和多雜硫有機染料)，其能夠形 成在偶聯劑和封裝物質的沉積作用中穩定的硫凌鍵。此外，這些報道分子 在可見和近紅外光鐠(約400-850 nm)中具有強的電子躍遷，以至于共振 拉曼增強可用來增加信號強度。
SERS活性的復合納米結構可有利地具有直徑小于約250納米(nm)、 約10至150 nm和約30至90 nm的球形直徑或大致球形的直徑。核心直徑可以是約10至200 nm、約20至100 nm和約40至80 nm。封裝劑厚度 可以是約1至50 nm、約2至50 nm和約5至10 nm。總之，封裝劑直徑 越大，所提供的保護越好。但是，隨著直徑的增加，SERS活性的復合納 米結構的總尺寸增加。可基于特殊應用來確定適當尺寸的選擇。
一般來說，報道分子可覆蓋約1%至75%的核心表面(例如，報道分 子吸附在約1%至75%的核心粒子表面上)、約15%至50%的核心12表面、 約15%至30%的核心12表面和約20%至25%的核心12表面。
在包括偶聯劑的實施方案中，偶聯劑可覆蓋約1%至100%的核心表面、 約40%至60%的核心12表面和約45%至50%的核心表面。在一個實施方 案中，報道分子可覆蓋約1%至75%的核心表面、約15%至50%的核心12 表面、約15%至30%的核心12表面和約20%至25%的核心表面。
SERS活性的復合納米結構可通過一種或多種途徑制備。例如，SERS 活性的復合納米結構可通過將核心與報道分子在報道分子與核心鍵合的 條件下混合而制備。特別地，核心可與具有約2.5xl0-SM至1.25xl(^M和 約7.5xl(X8M的濃度的報道分子混合約1至30分鐘。然后，在一個實施方 案中，偶聯劑與具有置于其上的報道分子的核心混合。特別地，偶聯劑可 被加至終濃度約2.5xlO^M約1至30分鐘。隨后，具有置于其上的報道分 子的核心(而且在一些實施方案中具有置于其上的偶聯劑)可與封裝物質 在pH約9至11下混合約24至96小時。關于SERS活性的復合納米結構 的制備的更多細節描述于本文呈現的實施例中。
本公開涵蓋置于核心拉曼報道復合物表面上的保護囊的用途。值得深 思的是，許多物質可用來封裝核心4艮道分子。最有利地，保護層包括巰基 聚乙二醇，借此所述聚合物借助于巰基偶合至下面的核心。聚合物的遠端 可包括活性基團例如但不限于羧基或胺基，其可與把特異性實體例如但不 限于免疫球蛋白或其片^:形成偶聯。
SERS活性的復合納米結構可被連接至探針分子。SERS活性的復合納 米結構還可被連接至結構(例如，在測定中)或自由漂浮(例如，在微觀 流體系統或流式細胞術中)。探針分子可以是能夠直接或通過連接子間接 地連接到SERS活性的復合納米結構的任何分子。例如，靶特異性探針可被連接至保護性封裝物質例如巰基聚乙二醇。探針分子可通過穩定的物理
和/或化學締合連接至SERS活性的復合納米結構。
被考慮用于本公開的實施方案的有利的靶特異性探針分子可具有對 期望進行纟全測的一種或多種乾分子的親和性。例如，如果把分子是核酸序 列，那么所選的探針分子應該是基本上互補于所述靶分子序列的，以使靶 和探針的雜交發生。術語"基本上互補"意思是，探針分子對輩巴序列是充足 地互補的以在所選反應條件下雜交。
在一個實施方案中，探針分子具有對一種或多種靶分子(例如，癌細 胞)的親和性，其中所述耙分子的檢測(例如，確定在血管(身體)中的 存在和/或近似位置)是期望的。例如，如果把分子是核酸序列，那么所選 的探針分子應該是基本上互補于所述靶分子序列的，以使靶和探針的雜交 發生。術語"基本上互補"意思是，探針分子對耙序列是充足地互補的以在 所選反應條件下雜交。
探針分子和靶分子可包括但不限于多肽(例如，蛋白例如但不限于抗 體(單克隆或多克隆))、核酸(單體和寡聚體二者)、多糖、糖、脂肪酸、 類固醇、噤呤、嘧啶、藥物(例如小的化合物藥物)、配體或其組合。有 利地，探針可以是相容于并能夠結合于細胞表面上的耙分子的抗體或配 體，其中所述細胞例如但不限于癌細胞。
_^/>開的納米結構可包括至少兩種不同類型的探針，其中每種都是例 如靶向特定細胞的靶向探針。
^/^開提供靶向樣品或受治療者(例如，哺乳動物、人、貓、狗、馬 等)中的一種或多種靶細胞的方法。例如，使用根據本乂/^開的納米結構， 納米結構可用來檢測動物中的腫瘤細胞。
還應該注意的是，納米結構可以作為治療的一部分(例如，藥物遞送)、 作為遞送到一種或多種把(例如，癌癥)的指示或其組合而用于狀況和/ 或疾病的檢測，其中所述狀況和/或疾病例如但不限于癌癥、胂瘤、腫瘤性 疾病、自體免疫性疾病、炎癥性疾病、代謝狀況、神經性和神經退行性疾 病、病毒性疾病、皮膚病、心血管疾病、傳染性疾病及其組合。
23應注意的是，可以用納米結構和/或微觀結構預先標記細胞(例如，在體外和在體內)。例如，可使用納米粒子-嵌段共聚物微觀結構在體外通過免疫染色、吸附作用、存"主射、細胞吸收以及類似方式對細胞進行標記。然后可在體外監視，或在體內追蹤所述細胞，使用作為追蹤物的納米粒子、熒光、^茲性及其組合以及類似方法，而可通過連接在SERS納米結構外表面的探針來修飾基因的表達。
^^開提供在樣品中檢測一種或多種靶分子的方法。所述方法包括將靶分子(例如，通過靶特異性探針分子)連接在納米結構上并測量所述納
米結構的SERS光譜，其中一全測到對報道分子特異性的SERS光譜表明對探針分子具有特異性的靶分子的存在。SERS活性的復合納米結構可用來檢測化學陣列系統和生物分子陣列系統中一種或多種靶分子的存在。此外，SERS活性的復合納米結構可用來提高各種類型系統中的編碼和多重能力。
在一個實施方案中，流式細胞儀可用于多重測定過程，以使用一種或多種SERS活性的復合納米結構檢測一種或多種耙分子。流式細胞術是一
SERS活性的復合納米結構)。流式細胞4義水動力地將SERS活性的復合納米結構的液體懸浮液集中成細流以至于SERS活性的復合納米結構基本上成一路縱隊流動并穿過4企驗區。當它們流過4企驗區時，集中的光束例如激光光束照亮SERS活性的復合納米結構。流式細胞儀中的光檢測器在光與SERS活性的復合納米結構相互作用時測量光的某些特性。常用的流式細胞儀可測量SERS活性的復合納米結構在一種或多種波長的發射。
可以使用SERS活性的復合納米結構和對一種或多種耙分子具有親和性的一種或多種探針檢測一種或多種所述靶分子。每種SERS活性的復合納米結構具有對應于探針的報道分子。在被引入流式細胞儀之前，將對于特定靶分子具有特異性的SERS活性的復合納米結構與可包括一種或多種靶分子的樣品混合。SERS活性的復合納米結構與相應的靶分子相互作用(例如，4走合或雜交)，其中所述靶分子與所述探針具有親和性。
接著，將SERS活性的復合納米結構引入流式細胞儀。如上所述，流式細胞儀在暴露于第一能量之后能夠檢測SERS活性的復合納米結構。檢
測到對應于某種報道分子的某種拉曼光譜表明靶分子存在于樣品中。可以通過多種方法獲得含有拉曼光譜信息的細胞圖像。可以將顯微鏡
偶連到CCD照相機以便可獲得物體的完整圖像。然后，在樣品和照相機之間插入波數過濾設備，例如單色器或液晶可調濾波器。在任何一個時間，過濾設備只允許窄帶寬的散射輻射到達照相機。采集多個圖像，其中每個覆蓋小光譜范圍的散射輻射。在軟件中將來自圖像中每點的光鐠組合。在另一個極端，可通過單色器分散來自圖像中單個點的光，而該點的完整光譜可在陣列檢測器獲得。然后將物體掃描以使圖像中每點被分別獲得。然后在軟件中將拉曼圖像組合。在另一種方法中，可以構建一種線掃描設備，其使用線輻射激發樣品。所述線在空間上沿著CCD照相機的一個軸成像，而其光譜同時沿著正交軸*。照相機的每個讀數獲得線中每個空間像素的完整光譜。為了完成圖像，越過樣品掃描所述線。
因此，根據本公開，可以使用抗體偶合的SERS納米結構鑒定細胞或細胞群，其中所述SERS納米結構用可結合細胞亞群表達的細胞表面抗原受體的抗體制備。
本公開的SERS納米結構還可用來檢測細胞內的靶。可通過微注射、電穿孔、內吞作用介導的手段將SERS納米結構引入細胞，其中所述內吞作用介導的手段包括使用兩親性肽例如PEP-l,使用基于陽離子脂質的試劑例如Lipofectamine (Invitrogen )，以及使用膠束和轉染試劑例如轉鐵蛋白、甘露糖、半乳糖和Arg-Gly-Asp ( RGD )和其他試劑例如基于樹枝狀大分子的試劑SuperFect (Qiagen)。
可以使用細胞內間接方法來證明粒子結合到期望的靶上。證明探針特異性的最簡單方法是使用免疫熒光來證實SERS納米結構的位置。有多個商業上可得的熒光探針，其對于標記活細胞中的細胞結構(例如，線粒體、高爾基體和內質網)是有用的。通過偶合耙向相同結構的抗體，可以確定粒子中的哪部分主動標記它們的靶；以及多大比例是非特異性地結合的。證實SERS納米結構的位置的另 一種方法是使用熒光蛋白融合物例如GFP及其類似物。因此，^^>開涵蓋針對在醫學診斷中展示重要特性的成像劑的納米結
構。更特別地，本公開針對包括SERS納米結構的成像劑。本公開所述成
像劑在對患者總體成像時和/或特別地在診斷患者中病態組織的存在時是
有用的。通過選擇組成，SERS納米結構的激發和發射可被調節到在約633nm至1000 nm發生，其在組織吸收和散射的最小區域中。成〗象過程可通過向患者施用本公開的成像劑，然后使用能進行光譜成像的任何系統掃描患者來進行，其中所述系統例如光點掃描共聚焦顯^i:鏡、線掃描系統和光學相干斷層成像系統。本公開的SERS納米結構還可通過只檢測單個波段的任何成像系統、上面所列系統以及具有激發光源和過濾圖f^全測的任何熒光成像系統觀察。還包括時域方法，例如動態光散射光譜學和斷層成像、飛行時間成像、準彈性光散射光譜學、光子相關光譜學、多普勒光譜學和擴散波光譜學。所有這些技術允許基于光子的時間特征區別光子，和它們所在的位置。因為SERS納米結構具有不同于熒光物質等的時間特征，所以它們能通過這些方法與組織和其他標記區分開來。有用的設備參數是調制的光源和時間敏感的檢測器。調制可以是脈沖的或連續的。
掃描得到患者內部區域和/或該區域中任何病態組織的光語或圖像。患者的區域是指患者整體或患者的特殊區域或部分。成像劑可用于提供脈管系統、心、肝和脾的圖像，也可用于胃腸區域或其他體腔的成像，或用于本領域技術人員容易了解的其他方法，例如組織表征、血池成像等。
本公開還提供診斷體內病理學異常的方法，其包括向接觸病理學異常的體液中引入靶向參與病理學異常的分子的多個SERS納米結構，其中所述SERS納米結構與參與病理學異常的分子締合，還包括在體內為締合的SERS納米結構成像。所述方法通常適用于探針可到達的任何器官胃腸道、心、肺、肝、子宮頸、乳腺等。在一些實施方案中，SERS納米結構可通過內窺鏡(如在結腸鏡4全查術的情況中)或針引入，或與一次性吸管或套管一起使用。在其他實施方案中，SERS納米結構可直接地通過成《象探針本身被引入。例如，可將單條光纖或光線束引入活生物體用于成像，并已經在對神經、腦、微血管、細胞的成像以及對生物分布的表征中得到證明。凝膠包被的光纖在有關傳感器的文獻中是眾所周知的。SERS納米結構可以非共價地結合至;iy交，在引入后擴散進入相關組織中。可以預見到將sers納米結構固定在纖維外表面上的各種其他方法，以使它們擴散進它們所接觸的液相中。
^/>開還提供用SERS納米結構標記動物的方法，其包括將SERS納米結構引入動物。可通過任何適合的方法例如皮下植入或靜脈內將SERS納米結構引入動物，并用適當的儀器檢測。^^開還提供動物例如家畜或家養寵物的鑒定系統和相關方法，其使用植入皮或皮膚之下的SERS納米結構來鑒定所述動物。
在體內條件下，根據本公開的納米結構可通過被動靶向機制和主動靶向機制二者遞送到腫瘤。在被動模式下，大分子和納米尺寸的粒子通過增強的滲透和滯留(EPR)作用被優先地聚集在腫瘤部位。人們相信，該作用起因于兩個因素(a)產生血管內皮生長因子(VEGF)的血管生成性肺瘤，所述血管內皮生長因子使腫瘤相關的新血管系統具有超滲透性，并導致循環的大分子和小粒子的滲漏；和(b)缺乏有效的淋巴引流系統的腫瘤，其導致隨后的大分子或納米粒子的聚集。
因此，本^^開的一個方面涵蓋表面增強拉曼光譜活性的復合納米結構，其包括金屬核心(有利地為金)、納米粒子、置于所述核心表面的拉曼報道分子和置于核心和報道分子表面的封裝保護層，其中所述被封裝的報道分子具有可測量的表面增強拉曼光譜特征。
在本/>開的實施方案中，所述拉曼報道分子可選自異硫氰酸酯染料、多硫有機染料、多雜疏有機染料、苯并三唑染料或其組合。
在本〃〉開的實施方案中，所述報道分子可選自噻菁染料、二噻菁染料、硫碳菁染料或二硫碳菁染料。在其他的實施方案中，報道分子選自孔雀石綠異硫氰酸酯、四甲基若丹明-5-異硫氰酸酯、X-若丹明-5-異硫氰酸酯、X-若丹明-6-異硫氰酸酯或3,3'-二乙基硫二碳菁殃化物。
在^^開的一個實施方案中，所述核心是金，并可具有小于約200納米的直徑。
在本公開的納米結構的實施方案中，封裝物質是巰基聚乙二醇。在本公開的其他實施方案中，納米結構還可包括選擇性地結合細胞上的靶的靶特異性探針。
在這些實施方案中，所述耙特異性探針可選自由抗體、多肽、多核苷酸、藥物分子、抑制劑化合物及其組合組成的組，其中所述輩巴向探針具有對靶細胞表面上標志物的親和性。
在一個實施方案中，靶特異性探針是免疫球蛋白或其片段，而且在本公開的實施方案中所述探針可以被置于疏水保護結構上。在一個實施方案
中，所述^:針是靶向肺瘤的配體。
_^/>開的另 一個方面涵蓋制備根據^/^開所述納米結構的方法，其包括提供金納米粒子，將所述金納米粒子引至拉曼報道子，借此將拉曼報道子置于納米粒子的表面而形成納米粒子4艮道子復合物，以及將保護結構層置于所述納米粒子4艮道子復合物上，其中所述報道子具有可測量的表面增
強拉曼光i普特征。
在本發明此方面的一個實施方案中，所述方法還可包括將細胞靶特異性探針沉積于保護結構層上，其中所述探針選自抗體、多肽、多核苷酸、藥物分子、抑制劑化合物或其組合。
在本公開此方面的方法的一個實施方案中，所述核心金屬的納米粒子是膠體。在一個有利的實施方案中，所述核心金屬的納米粒子是金。
在本公開此方面的實施方案中，所述拉曼報道分子可選自異硫氰酸酯染料、多硫有機染料、多雜硫有機染料、苯并三唑染料或其組合。在^^開的其他實施方案中，所述報道分子選自噻菁染料、二嚷菁染料、硫碳菁染料或二硫碳菁染料。在本公開的此方法的其他實施方案中，報道分子選自孔雀石綠異硫氰酸酯、四甲基若丹明-5-異硫氰酸酯、X-若丹明-5-異硫氰酸酯、X-若丹明-6-異疏氰酸酯或3,3'-二乙基硫二碳菁碘化物。
在本^^開的一個實施方案中，封裝物質是巰基聚乙二醇。
_^/>開又一個方面涵蓋生物樣品成像的方法，其包括將至少一種納米結構遞送到培養的細胞或動物或人受治療者(其中所述納米結構包括核心金納米粒子、置于所述核心表面上的拉曼報道分子和置于所述核心和報道分子上的封裝保護層，其中所述被封裝的報道分子具有可測量的表面增強 拉曼光譜特征)，允許所述納米結構與被耙向的生物細胞或組織接觸，用 放射源激發報道分子并測量對應于所述報道分子的納米結構的表面增強 拉曼光譜，從而檢測所述納米結構在被把向的細胞或組織中的存在。
在本公開此方面的一個實施方案中，納米結構還可包括靶特異性探 針，其中所述靶向探針選擇性地將納米粒子結合到被耙向的細胞，從而允 許檢測被把向的細胞。
在本公開的另一個實施方案中，乾細胞是在動物或人受治療者的組織中。
在本公開此方面的實施方案中，所述靶細胞可以是動物或人受治療者 的癌細胞，而且所述靶特異性探針可選自由抗體、多肽、多核苷酸、藥物 分子、抑制劑化合物及其組合組成的組，其中所述靶向探針具有對靶細胞 表面上標志物的親和性。
在本公開的一個實施方案中，所述靶特異性探針是靶向紳瘤的配體。
下面具體的實施例僅僅被理解為說明性的，并不以任何方式限制本乂〉 開的其余部分。無需進一步闡釋，認為本領域技術人員能夠基于本文的描 述來最大限度地利用^^開。本文列舉的所有出版物借此以其整體通過引 用并入本文。
應該強調的是，本一^開的實施方案，特別地任何"優選的"實施方案， 只是實施的可能實例，其提出僅是為了清楚理解本^/Hf的原理。在實質上 不違反本公開精神和原理的基礎上，可以對本公開上述實施方案進行4艮多 變動和修改。所有這種修改和變動旨在包括于本文此公開的范圍內，而且 本公開受到如下權利要求的保護。
提出下面的實施例以便為本領域普通技術人員提供完整的公開和描
和要求保護的組合物和化合物。已努力確保數字(例如，量、溫度等)的 準確性，但應該考慮一些誤差和偏差。除非另外指出，部分是按重量計的
部分，溫度是。c,而且壓力是大氣壓或者接近大氣壓。標準溫度和壓力被
29實施例 實施例i
試*:在整個研究中使用超純水(181^^^111-1)。從商業來源獲得下述 化學品并不經進一步純化而使用濃度為每毫升2.6xlC^個顆粒的60-nm 杵檬酸鹽穩定的金粒子(TedPellaInc.)、近紅外發射的量子點(QD705, Invitrogen)、孔雀石綠異;S克氰酸酯(MGITC ) (Invitrogen ) 、 二乙基碌u三 碳菁殃化物(DTTC ) ( Exciton )、 mPEG-SH (分子量(MW)大約為5 kDa) (Nektar Therapeutics )、 HS-PEG-COOH ( MW大約為3 kDa ) ( Rapp Polymers )。人癌細胞系Tu686是從舌底的原發性腫瘤建立的。人癌細胞系 NCI-H520是從美國典型培養物保藏中心(ATCC)購入的。細胞培養基、 胎牛血清、血細胞計數器和細胞培養物供給是從Fisher Scientific購入的。 所有其他試劑是從Sigma-Aldrich獲得的，并具有可得的最高純度。
實施例2
合4':根據文獻的步驟合成具有約60nm靶直徑的金膠體。在使用前 將所有玻璃儀器嚴格地清潔并用水潤洗。在50mL玻璃燒瓶中將30mL的 0.01%的HAuCU水溶液在磁力攪拌下煮沸。煮沸后，迅速注射180(iL的 1%檸檬酸鈉。在幾分鐘內，淺黃色溶液轉變成深紫色并快速發展成紅色。 將所述膠體煮沸約15分鐘以保證完全還原，允許其冷卻到室溫并在使用 前重新組成至30 mL。
為了使用嵌入的拉曼報道子(即，報道分子)制備SERS活性的復合 納米結構，將約O.l g混合床離子交換樹脂與新鮮配制的金膠體攪拌以除 去過量的離子。通過過濾或小心的傾析將樹脂除去，并用等量的水稀釋所 述膠體。在快速攪拌中加入拉曼報道子至不超過約7.5xl(T8M的濃度，并 允許平衡約15分鐘。
使用掃描分光光度計(Shimadzu, Columbia, MD)獲得UV 可見吸收光譜。使用Philips CM200電子顯微鏡拍攝高倍放大的透射電子顯微照片，并記錄在TVIPS 2kx2k CCD上。使用分散拉曼光譜系統 (Solution 633， Detection Limit, Laramie, WY)記錄大量的拉曼光譜。 單粒子光語使用倒置光學顯微鏡(Diaphot200, Nikon, Melville, NY)獲 得，其裝備有氬/氪混合氣體離子激光器(Lexel 3500, Fremont, CA)以 用于647 nm激發。
首先使用寬視野照明篩選感興趣的區域，并使用安裝在顯微鏡前口的 視頻速率強化的CCD(ICCD, PTI, Inc., Lawrenceville, NJ)對拉曼活 性的粒子進行定位。然后使用共聚焦光學器件聚焦于單個SERS活性的復 合納米結構，并且通過顯微鏡物鏡(平場100x,油浸，NA= 1.25)采集 反向散射的拉曼信號。使用三重帶通濾波器(Chroma Tech, Brattleboro, VT)阻擋激光線和外來信號。使用安裝在單級分光計(型號270M, Spex, Edison, NJ)上的CCD才企測器(TKB512, Princeton Instruments, Trenton, NJ)獲得光譜特征。
實施例3
炎乙二寧化的朋i^勿求在f將新鮮制備的報道子溶液(3-4 pM)以1:6的報道子溶液/膠體體積比率逐滴地加入迅速混合的金膠體中， 其有助于所述報道分子在金粒子表面的均勾分布。優化報道分子對金粒子 的摩爾比率以獲得最大的SERS強度和最小的膠體聚集。例如，優化的表 面覆蓋值是每顆60nm金粒子14,000個孔雀石綠異硫氰酸酯分子，以及每 顆相同尺寸的金粒子約15,300個結晶紫分子。應該注意的是，上述參數 (即，儲存報道子的濃度、儲存報道子溶液對金納米粒子溶液的體積比率 以及將報道子加入金中的速率)都影響所得的標記物的聚集狀態。當把報 道子溶液加入金膠體時，我們觀察到比把金加入報道子時更高的SERS信
號
10分鐘后，將巰基-PEG溶液(10 pM)逐滴地加入拉曼編碼的膠體， 其最低比率為每顆60-nm金粒子30,000個PEG-SH分子。該表面覆蓋對應 于金粒子表面上的完整的PEG單層，并對于在各種條件下穩定金膠體以避 免聚集是必要的。簡單的幾何計算顯示，每個巰基-PEG分子占據了金表面 上0.35 nm2的足跡面積(footprint area),這與報道的刷狀構象中的PEG-SH的文獻數據一致。重要地，過量10至20倍的PEG-SH的加入沒有導致膠 體穩定性或聚合物包被層厚度的任何變化。
實施例4
射求在子^4在使用一次性聚丙烯酸小杯將UV-Vis吸收光譜記錄 在Shimadzu (UV-2401 )分光計上。使用HitachiH7500高倍放大電子顯翁L 鏡拍攝透射電子顯微照片(TEM)。將納米粒子樣品(5(il)滴在銅制200 目載網(grid)上，其中所述載網被紫外線預處理以減少靜電。30分鐘后， 用濾紙將溶劑吸干，并應用磷鴒酸染色溶液(按重量計1%,調節至pH6) 30秒。在4。C下將新鮮胂瘤組織標本在含有2.5%戊二醛的0.1 M二甲胂酸 鹽緩沖液(pH7.4)中固定。在O.l M二甲胂酸鹽緩沖液中將所述組織潤 洗三次每次15分鐘，用1%的Os04緩沖液進行后固定，然后脫水并在樹 脂(Epon)中包埋。使用超薄切片機(ultratomemachine)生產超薄切片(大 約60 nm )并放在銅制載網上進行TEM成像。
使用Brookhaven 90Plus粒子尺寸分析儀器獲得DLS數據。連續地測 量每種樣品三次。使用633 nm( 3 mW )或785 nm( 40 mW )的激發將SERS 光譜記錄在緊湊型拉曼系統上(Advantage Raman Series, DeltaNu)。使用 785-nm激光激發將體內SERS光譜收集在手持式拉曼系統(Inspector Series, DeltaNu)上。焦點處的激光束直徑為35 jim,所以據估計探針體 積在633 nm激發下是約23 nl而在785 nm激發下是約19 nl。 SERS強度 被歸一化至環己烷和聚苯乙烯的拉曼光譜以糾正光學準直和儀器響應中 的變化。Advantage和Inspector拉曼系統二者的光i普分辨率約為5 cm—1 。
對于單個SERS納米粒子和量子點成像，將窄帶寬激光激發濾波器 (633 ± 3 nm)和長通發射濾波器(655LP, Chroma Tech)應用于Olympus
1X71倒置顯微鏡。使用連接至顯微鏡的電子倍增(EM) CCD照相機 (Hamamatsu，型號C9100-12),以750 ms曝光時間拍攝圖像，并取50
張圖像的平均。長曝光時間和圖像平均的使用消除了單個納米粒子的任何
信號波動。對于SERS和量子點信號強度的定量比較，使用CCD照相機響
應曲線校正波長依賴性因素。
實施例5
32與scFv應#好森A對人EGFR具有特異性的抗體片段scFv B10是 使用建立的固相生物淘選方法從YUAN-FCCC人原初噬菌體展示文庫中 分離的。在天然條件下使用N產NTA-瓊脂糖柱(Qiagen)從細菌提取物中 純化了大量scFv。使用十二烷基硫酸鈉(SDS ) -PAGE確定蛋白純度超過 95%。在快速混合下，向聚丙烯管中的2.2 ml Au-MGITC (或Au-DTTCI) 溶液逐滴地加入異功能連接子HS-PEG-COOH (430 pl和1 pM)。通過改 變所用的連接子的量，每顆金粒子的羧基數量被控制在大約5,000。混合 15分鐘后，將金納米粒子暴露于大量的PEG-SH ( 1.6 ml， 10 jxM)以填充 未被異功能PEG覆蓋的區域，產生很好地屏蔽的和穩定的粒子表面。在羧 酸官能團上共價偶合配體之前，通過三輪離心(1,000g)和在PBS中的重 懸浮純化金粒子。
為了活化粒子表面的-COOH基團以進行共價偶合，將新配制的濃度為 40 mg/ml的乙基二甲基氨基丙基碳二亞胺(EDC )溶液(5 |il)和硫代-NHS (5 jil， 110 mg/ml)在25。C劇烈地混合15分鐘。通過三輪離心(l,OOOg ) 和在PBS中的重懸浮，使用Nanosep 10K MWCO OMEGA膜(Pall Life Sciences)將過量的EDC和硫代-NHS與活化的納米粒子分離。然后將含 有活化羧基的純化的金粒子與scFv抗體(11.2 nmol)在25。C反應2h,并 將反應混合物儲存在4。C過夜。通過三輪離心和在PBS中的重懸浮，使用 100K MWCO OMEGA膜將過量的scFv配體除去。基于在280 nm的蛋白 吸收測量，我們估計，每顆金粒子具有約600個scFv分子。通過使用熒光 標記的scFv配體在更高靈敏度下確定偶合比率而進一步確認了此值。完全 功能化的納米粒子通過UV-Vis、 TEM和DLS被表征，而且它們的膠體穩 定性和光學特性與對照納米粒子標記物基本上相同。
實施例6
勿應5EKS ^f《將Tu686和H520細胞培養在分別補充有10%熱滅 活的胎牛血清和抗生素(鏈霉素，青霉素G和兩性霉素B )的DMEM/Ham 氏F-12 ( 1 :1 )和RPMI-1640中，并維持在37。C和含5% C02的加濕型培 養箱中。細胞在35-mm盤中生長到連成一片。在桌面式結合培養箱中在 25。C的無菌條件下進行細胞染色步驟。將活細胞與偶合scFv的SERS納米粒子(15 pM,于PBS中)溫和地混合30分鐘，然后通過輕輕的刮除進行 收獲。細胞經受四輪水冷的PBS的洗滌，并在SERS測量前重懸浮于500 jil PBS。將一部分細胞與聚乙二醇化的對照SERS標記物孵育以評估非特異 性結合和內化作用。另一部分細胞既不接受對照SERS標記物也不接受 EGFR-SERS標記物，并用作對照以評估背景細胞散射。將SERS光鐠歸一 化至由Coulter計數器所確定的細胞數量。
為了進行定量對比，我們減去單純的細胞散射光譜以生成圖3中的示 差譜。所有光譜都是在細胞懸浮液中取得的。基于lxl()6個細胞/ml的細胞 密度，我們估計，激光探測體積含有大約20至30個標記的細胞。在3天 時間里重復4全驗未固定細胞樣品時或當細胞被固定在曱醛溶液中時，我們 沒有觀察到光譜特征或強度的變化。這些細胞懸浮液的測量避免了納米粒 子標記和細胞異質性的問題，并纟皮發現是高度可重復的。
實施例7
^^7f神移潛々謬沖^SE7議健康的棵小鼠接受了 50飛摩爾的聚乙二 醇化的SERS納米粒子，其被施用于兩種位置(i )皮下注射(皮下1-2 mm); 和(ii)深度肌肉注射(皮下1 cm )。使用NIR拉曼分光計(Inspector Series, DeltaNu)檢驗了不同位置。獲得3秒后的皮下SERS光譜，21秒后的肌 肉光錯，并也獲得21秒后的對照光i普(在遠離注射位置的區域獲得)。
將Tu686細胞(5《106個)經皮下注射到約6至8周大的雌性棵小鼠 (NCr無胸li(NC rathymic), nu/nu)的背部兩側區域。將小鼠分成兩組進 行被動和主動靶向研究。當腫瘤尺寸達到3 mm直徑時，棵小鼠通過尾靜 脈注射分別接受45飛摩爾的scFv EGFR偶合的SERS標記物和聚乙二醇 化的對照SERS標記物。5小時后，通過注射70 pl的氯胺酮和甲苯噻喚混 合溶液將小鼠麻醉，并使用用20 mW激光功率使用拉曼分光計在785 nm 進行檢驗。對于被靶向或未被把向的SERS納米粒子，激光光束^皮聚焦在 腫瘤或肝臟解剖區域。使用大約9mm的焦距，以完全無接觸和非侵入性 的方式獲得SERS光語。結果被顯示在圖5A-5C中。在光譜數據采集后， 將小鼠殺死以收集主要器官用于ICP-MS生物分布分析。每種新鮮組織樣 品的一小塊還^t立即固定于0.1 M的二甲胂酸鹽緩沖液中以制備TEM薄切片(圖10和11 )。
簡短地，用乙醇將主要器官組織潤洗三次然后凍干并稱取到清潔的小
瓶中以進行酸消化。用強酸消化2天后，將樣品純化并稀釋35倍以進行 ICP-MS分析(電感偶合等離子體-質錯法)。將實驗獨立進行五次以進行統 計分析。每次使用具有新配制的SERS標記物的兩只小鼠，其中 一只用于 主動靶向而另一只用于被動靶向。 一組動物用于更長期的毒性研究。
實施例8
襲乙二舉化^<SE7^射求赤記游^設-V"弄4在圖1A-1D顯示含有嵌 入的光譜標記物的聚乙二醇化的金納米粒子的設計和制備以及它們的示 意結構。還顯示了它們的光吸收鐠(圖1B)、透射電子顯々鼓(TEM)結構 (圖1C)和流體動力學尺寸數據(圖1D)。原始的金粒子(60-nm直徑) 是用拉曼報道子編碼，并由巰基-PEG層穩定的。之前的實驗顯示，具有約 60-80 nm核心尺寸的金納米粒子在紅光(630-650 nm)和近紅外(785 nm) 激發下對于SERS是最有效的(Krug等，(1999) J. Am. Chem. Soc. 121: 9208-9214 )。
此光譜區域被稱作光學成像的"清晰窗(clear window)",因為血紅蛋 白(血液)和水吸收光譜是最小的。除SERS作用以外，我們還使用在633 nm或785 nm下具有電子躍遷的報道分子實現了共振拉曼增強。金等離子 體共振光譜基本上保持不變(<l-nm紅移)，即使在金粒子被大量分子(約 1.4-1.5xl04)包被并被PEG分子層穩定時(圖1B)。我們注意到，單分子 SERS只發生在特定的活性位點或連接處，而且它對腫瘤^r測不是必需的。 事實上，因大量報道分子吸附在粒子表面，所得的總信號強度超過了單分 子SERS的信號強度。通過TEM陰性染色，清楚地觀察到作為大約5 nm 白色薄層的PEG包被，而粒子的"濕"流體動力學直徑在聚乙二醇化之后增 加了 20 nm,如在緩沖鹽水中流體動態光散射(DLS)所測量的。在60 nm 的核心粒子尺寸下，為了實現完全保護以避免鹽誘導的膠體聚集，每個金 納米粒子上最少30,000個巰基-PEG分子(MW = 5 kDa)是必要的。此表 面覆蓋對應于每個PEG分子上約0.35 nm2的足跡面積，這與另一個研究組 報道的吸附在刷狀構象的膠體金上的巰基-PEG的數據一致。在此屏蔽層被
35完成之后，使用額外的多至10至20倍過量的巰基-PEG對于包被厚度具有 很小的作用，如TEM和DLS 二者所測。
實施例9
通過在各種條件下測量聚乙二醇化的金納米粒子的SERS信號(頻率 和強度二者)研究了它們的穩定性，其中所述條件包括濃鹽(l-2M)、強 酸(0.1 MHC1)、強堿(1 MNaOH)和有機溶劑(甲醇、乙醇和二甲基亞 砜或DMSO)圖A和B。在沒有PEG保護下，金納米粒子在這些苛刻的 條件下迅速地"墜落"(即，聚集和沉降)。在有PEG保護下，金粒子和它 們的SERS光譜完全穩定，只是在pH 1-2下有很小的相對強度變化(由于 金表面上報道分子的質子化作用和相對方向的改變)。
巰基-PEG包被的強烈SERS信號的觀察結果是違反直覺的，因為預期 粒子表面上的報道分子被巰基化合物取代(已知其自發地在金上形成單 層)。還令人吃驚的是，即使不帶錨固的異硫氰酸根(-N=C=S)， 一系列的 拉曼報道子例如結晶紫、尼羅藍、堿性品紅和甲酚紫也不被巰基-PEG取代。 事實上，結晶紫和其他染料的SERS信號被巰基-PEG強力地保護，并在 25"穩定>11個月。這些報道染料的共同特性是，它們是正電性的，并含 有離域7t電子。相反，帶負電荷的有機染料例如熒光素鈉在本研究使用的 檸檬酸鹽穩定的金粒子(也是負電性的)上只發出微弱的和不穩定的SERS
信號。因此，我們相信，靜電相互作用和離域7C電子二者對于強染料吸附
都是重要的，很可能地在不與巰基-PEG吸附進行竟爭的金表面位點上。還 可能的是，巰基-PEG層通過立體屏蔽和電子相互作用來保護和穩定所吸附 的報道染料。
對于細胞和體內成像應用，我們比較了聚乙二醇化的金納米粒子和近 紅外量子點的激發和發射光譜特性。金納米粒子提供了更豐富的光譜信 息，而且它們的發射峰(半峰全寬FWHM = 1-2 nm)比量子點的發射峰 (FWHM = 40-60 nm)窄20-30倍(圖2A和2B )。在相同的實驗條件下， 聚乙二醇化的金粒子在650-750 nm光鐠范圍內比近紅外發射量子點亮 >200倍(在粒子對粒子的基礎上)(參見圖2C和2D中的單個粒子圖i象， 以及圖2E和2F中的統計數據)。聚乙二醇化的金納米粒子具有約80 nm(直徑)的流體動力學尺寸，并且在所測試的3-6天中對被培養的細胞完 全無毒。在沒有表面增強拉曼信號時，近紅外金納米殼最近在光學相干斷 層成像術以及光熱腫瘤切除中用作對比度增強劑，但此方法不提供光i普編 碼或多重的分子特征。
實施例10
;#敘應的^漆趁》秋對于癌細胞沖全測，使用巰基-PEG (約85%)和異 功能PEG ( SH-PEG-COOH)(約15%)的混合物制備被把向的金納米粒子。 異功能PEG被共價地偶合至scFv抗體(MW = 25 kDa )，即圖3A中所圖 示的以高特異性和親和性結合EGFR的配體。UV-Vis吸收和熒光數據表明， 約600拷貝的scFv配體被偶合至每顆金納米粒子。圖3B顯示通過將scFv 偶合的金納米粒子與人癌癥細胞一同孵育而獲得的細胞結合和SERS光 譜。人頭頸癌細胞(Tu686)是EGFR陽性的(每個細胞104-105個受體)， 并被強SERS信號所檢測。相反，人非小細胞肺癌(NCI-H520)未表達 EGFR,其顯示4艮少或沒有SERS信號。為了確認靶向特異性，我們以十倍 過量的游離scFv EGFR抗體對Tu686癌細胞進行預孵育，然后加入EGFR 標記的SERS納米粒子以進行竟爭性結合研究。洗滌三輪后，細胞只顯示 可忽略的SERS信號。還測試和確認了以雙位點夾心形式偶合到二抗的 SERS納米粒子的結合特異性。關于對照癌細胞(EGFR陰性)和對照納米 粒子(普通的PEG包被的納米標記物和用非特異性IgG抗體功能化的PEG 納米標記物)，光i普顯示了微弱但可重復的背景，如圖3B所示。低背景可 能是由混合溶液中的在細胞分離中未被完全除去的殘留SERS納米粒子所 致，但還可存在來自非特異性結合或納米粒子內化的貢獻。將紅外染料(二 乙基硫三碳菁碘化物或DTTC )用作光語報道子，并在785-nm激發下獲得 了表面增強共振拉曼散射(SERRS)。此共振條件不導致光漂白，因為通 過將能量有效地轉移到金屬粒子而保護所吸附的染料不被光降解。共振作 用還可增加表面增強拉曼信號10至100倍，使之對于單個癌細胞的拉曼
分子分布研究足夠靈敏(圖8)。此靈敏度對于研究通過手術去除的癌組織 標本的異質特性以及循環捕獲自外周血樣品的腫瘤細胞是重要的。單細胞
分布研究具有很大的臨床重要性，因為EGFR是用于單克隆抗體和基于蛋白激酶的療法的被證實的蛋白靶。實施例11
#力^#恕/^^,游體內光成像和光鐠學的主要挑戰是有限的穿透
深度，這是由于動物組織中的光散射和吸收。為了確定是否可從#:埋在動
物組織中的聚乙二醇化的金納米粒子獲得SERS光語，我們向活體動物的皮下和深層肌肉部位注射了小劑量的納米粒子。從皮下以及肌肉注射獲得高分辨率的SERS信號，如圖4所示。
健康的棵小鼠通過皮下(皮膚下l-2mm)或肌肉(皮膚下大約lcm)注射接受了 50 jj!的SERS納米粒子標記物(1 nM)。在3秒后獲得皮下光謙，在21秒后獲得肌肉光譜，并也在21秒后獲得對照光i普(在遠離注射位置的區域獲得)。在0.1秒后從PBS溶液中的SERS納米粒子獲得參考光譜。用所示因子(xl、 x30或x210)調節光譜強度以進行比較。拉曼報道分子是孔雀石綠，其具有在427、 525、 727、 798、 913、 1,169、 1,362、 1,581和1,613 cm"的光i普特征。這些特征與動物皮膚拉曼信號截然不同(參見皮膚光譜)。激發波長，785 nm;激光功率，20 mW。
體內SERS光譜與體外(鹽溶液)獲得的相同，雖然絕對強度被減弱l-2個數量級。基于高信噪比，我們估計，體內SERS胂瘤檢測可實現的穿透深度是大約1-2 cm (也通過深度組織注射研究而確認)。
對于體內腫瘤靶向和光鐠學，與scFv抗體偶合的金納米粒子被注射(通過尾靜脈)到含有人頭頸腫瘤(Tu686)的棵小鼠全身。圖5A和5B顯示在納米粒子注射后5小時通過將近紅外的785-nm激光束聚焦在紳瘤位點或其他解剖部位(例如，肝或腿)獲得的SERS光譜。在^皮耙向的和未^C扭向的納米粒子之間觀察到肺瘤信號強度相當大的區別，而來自非特異性肝吸收的SERS信號是相似的。此結果表明，scFv偶合的金納米粒子能夠在體內靶向EGFR陽性腫瘤。時間依賴性的SERS數據進一步表明，納米粒子逐漸地聚集在腫瘤中4-6小時，而且多數聚集的粒子在腫瘤中停留>24-48小時。
實施例12
38謬力的辨求在f為、^T;^勿^磁^;t炎使用電感耦合等離子體質i普法(ICP-MS)的定量生物分布研究揭示，被靶向的金納米粒子在胂瘤中的聚集有效性比未被耙向的粒子的增加10倍，如圖6所示。ICP-MS數據還證實了肝和脾的非特異性粒子吸收，但腦、肌肉或其他主要器官中很少有或沒有聚集，這與所報道的被注射進健康小鼠31的金納米殼的生物分布數據相似。超微結構TEM研究進一步揭示，SERS納米粒子被EGFR陽性肺瘤細胞吸收，并被定位在細胞內的細胞器例如內體和溶酶體中，如圖10和11所示。在體內被內吞的納米粒子具有晶體狀的多面結構，這與在體外和體內被編碼的金納米粒子上獲得了幾乎相同的SERS光譜的發現一致。聚乙二醇化的金粒子在體循環中以及在被細胞內的細胞器吸收后顯示是完整的和穩定的。在注射金粒子2-3個月后未在動物體內觀察到毒性或其他生理并發癥。 (
實施例13
^fjy殺斧T菜乙二寧化^5EKS的il定^:四種獨立的技術證實了濃PBS溶液中Au-MGITC-PEG-SH的高度穩定性。通過UV-Vis吸收光鐠法、TEM、 DLS和目視觀察4全驗了 PEG-SH包被的和未包被的Au-MGITC復合物，如圖7A和7B所示。將PBS加入未包被的Au-MGITC立即將膠體聚集并沉降，如UV-Vis吸收光譜中的動態光譜變化、TEM中的大型聚集物，和具有600-1000 nm流體動力學直徑的截然不同的粒子群的出現、以及從粉色到無色的明顯的顏色變化所證明。相反，用PBS處理的被PEG-SH包被的Au-MGITC顯示了 60 nm金的特征性等離子體共振峰的保存，TEM中觀察到大多數為單個粒子(含有由于溶劑蒸發所致的一小群簇狀物)，DLS中觀察到的粒子的單峰、窄尺寸分布，以及粉紅色。研究了在生物偶合和細胞標記步驟中遇到的許多條件的作用以了解它們對被PEG-SH包被的SERS標記物的光i普特征的影響。
將Au-MGITC-PEG-SH通過離心沉淀，再分散于新溶劑中，并通過SERS光譜法被檢驗。當Au-MGITC-PEG-SH #1再分散于10倍濃縮的PBSU.37MNaCl)、堿性水(pH12)、酸性水(pH2)、乙醇和甲醇中時，與水中的Au-MGITC的參考光譜相比沒有顯著的光譜變化(圖18)。注意到了在pH2下在1615、 1365和1172 cm"處的拉曼帶的相對峰強度的微小變 化，這可能是由于MGITC在金表面相對方向的改變，但在5 cm"的儀器 分辨率下沒有觀察到振動頻率的位移。Au-MGITC-PEG-SH在二甲基亞砜(DMSO)中的再分散掩蓋了報道 子的光i普特征，這是由于DMSO的強的拉曼截面。有趣地，在將DMSO 溶劑化的標記物儲存在環境條件下60天然后再分散于水中之后，原始的 MGITC光譜特征得到恢復(圖18,圖"g")。雖然未包被的Au-MGITC在 5次離心后聚結，但是PEG-SH包被的SERS標記物在上面所測試的任何 條件下未形成聚集物。實施例14卓個癥紐應^5EKS"^浮;^^;^爭蓐f #^謬Tu686和H520細胞在 8槽的載玻片上生長到連成一片。濃度為15 pM的scFv偶合的SERS標記 物被引入200 (iL細胞培養基中，然后輕輕混合30分鐘。在孵育時間段之 后，在成像前用PBS徹底洗滌細胞六次以除去游離的金納米粒子。使用 ExamineR顯孩i鏡(DeltaNu， Laramie， Wyoming)和20x物鏡獲得了反射 模式暗視野圖像。使用暗視野聚光鏡把來自鎢燈的窄束白光遞送到樣品 上。以此模式，在細胞膜上用SERS納米標記物染色的細胞展現了光亮的 金色，這是由于金納米粒子的高度散射特性。EGFR陰性的H520細胞顯 示了大部分的暗背景。Tu686 EGFR陽性的細胞展示了高水平的EGFR受 體結合，而H520 EGFR陰性的細胞只具有有限的EGFR表達。通過將顯 微鏡切換到以785 nm激光激發的拉曼模式獲得單細胞SERS光譜。使用 20x物鏡在焦平面上所得的激光光斑的尺寸是5xl0pm。圖8分別顯示了從每個光i普都是在IO秒的曝光時間下獲得的。 實施例15^被乾/^的^f,裙乂^SEKS勿求在f 為了研究SERS納米結構靶特異性抗體偶合的探針在活體動物中的行為，進行了如下檢 驗它們的特異性吸收和滯留、背景或非特異性吸收、血液清除和器官分 布。非特異性納米結構吸收和滯留主要發生在肝和脾，而在腦、心、腎或肺中有^^少或沒有SERS納米結構的聚集，如圖9所示。體內器官吸收和 分布的此種形式與葡聚糖包被的磁性氧化鐵納米粒子的相似。對于含有過 量COOH基團的聚合物封裝的SERS納米粒子，未觀察到腫瘤靶向，這表 明非特異性的器官吸收和快速的血液清除。對于含有表面PEG基團的聚合 物封裝的SERS納米粒子，器官吸收的速率下降而血液循環的時間長度增 加，這導致腫瘤中納米粒子的緩慢聚集。對于PEG封裝并與抗EGFR抗體 生物偶合的納米粒子，所述納米粒子由胂瘤異體移植物遞送和滯留，但非 特異性的肝和脾吸收仍然是明顯的，如圖6所示。
實施例16
遞《邊射逾子^凝^ OEM J的勿應力;€在研宏使用TEM檢驗腫 瘤、肝、脾和腎以確定金納米粒子在被細胞和組織吸收后沉積在何處。圖 10顯示在將靶向EGFR的金納米粒子注射到全身以實現體內腫瘤靶向時的 肺瘤組織切片的代表性TEM圖像。數據清楚地顯示，金納米粒子被內化 到腫瘤細胞中(最大可能是通過受體介導的內吞作用)，并被定位于細胞 內的細胞器例如內體和溶^中。
為了檢驗納米粒子的肝吸收，圖11顯示含有金納米粒子的Kupffer細 胞(覆蓋肝竇狀隙表面的巨噬細胞)，其中所述金納米粒子被捕獲在早期 和晚期的內體中。注意到被Kupffer細胞非特異性地吸收的納米粒子通常 是分離的結構，這與腫瘤細胞內的簇狀結構相反。在脾巨噬細胞內也鑒定 了顯著數量的金納米粒子。在所有其他器官中，發現金粒子只以4艮低的密 度存在。總的來說，高倍放大的TEM研究揭示，聚乙二醇化的金納米粒 子在體內條件下被吸收進細胞內的細胞器中，但它們的形狀和形態學保持 完整。
實施例17
5ERS勿求在f標記^^e^的被動炎桌^2動為命參見圖12。
應該強調的是，本/^開的上述實施方案只是實施的可能實例，其提出 僅是為了清楚理解此公開的原理。在實質上不違反本公開精神和原理的基 礎上，可以對本公開上述實施方案進行很多變動和修改。所有這種修改和 變動旨在包括于本文此公開的范圍內，而且受到如下權利要求的保護。
權利要求
1.一種表面增強拉曼光譜活性的復合納米結構，其包括核心金屬納米粒子；置于所述核心表面上的拉曼報道分子；和置于所述核心和報道分子表面的封裝保護層，其中被封裝的報道分子具有可測量的表面增強拉曼光譜特征。
2. 如權利要求1所述的納米結構，其中所述拉曼報道分子選自異硫氰酸酯染料、多硫有機染料、多雜硫有機染料、苯并三唑染料或其組合。
3. 如權利要求1所述的納米結構，其中所述報道分子選自噻菁染料、二噻菁染料、硫碳菁染料或二硫碳菁染料。
4. 如權利要求1所述的納米結構，其中所述報道分子選自孔雀石綠異硫氰酸酯、四甲基若丹明-5-異硫氰酸酯、X-若丹明-5-異硫氰酸酯、X-若丹明-6-異硫氰酸酯或3,3'-二乙基硫二碳菁砩化物。
5. 如權利要求3所述的納米結構，其中所述核心金屬納米粒子是金。
6. 如權利要求1所述的納米結構，其中所述核心具有小于約200納米的直徑。
7. 如權利要求1所述的納米結構，其中所述封裝物質是巰基聚乙二醇。
8. 如權利要求1所述的納米結構，其還包括選擇性地結合細胞上的靶的靶特異性探針。
9. 如權利要求8所述的納米結構，其中所述靶特異性探針選自由抗體、多肽、多核苷酸、藥物分子、抑制劑化合物及其組合組成的組，并且其中所述靶向探針具有對靶細胞表面上的標志物的親和性。
10. 如權利要求9所述的納米結構，其中所述靶特異性探針是免疫球蛋白或其片段。
11. 如權利要求8所述的納米結構，其中所述探針被置于疏水保護結構上。
12. 如權利要求8所述的納米結構，其中所述探針是靶向胂瘤的配體。
13. —種制備納米結構的方法，其包括提供金屬納米粒子；將所述金屬納米粒子引至拉曼報道子，借此將所述拉曼報道子置于納米粒子的表面而形成納米粒子4艮道子復合物；并且將保護結構層置于所述納米粒子4艮道子復合物表面上，其中所述報道分子具有可測量的表面增強拉曼光鐠特征。
14. 如權利要求13所述的方法，其還包括將細胞靶特異性探針置于保護結構層上，其中所述探針選自抗體、多肽、多核普酸、藥物分子、抑制劑化合物或其組合。
15. 如權利要求13所述的方法，其中所述核心金屬納米粒子是膠體。
16. 如權利要求13所述的方法，其中所述核心金屬納米粒子是金。
17. 如權利要求13所述的方法，其中所述拉曼報道分子選自異硫氰酸酯染料、多硫有機染料、多雜硫有機染料、苯并三唑染料或其組合。
18. 如權利要求13所述的方法，其中所述報道分子選自噻菁染料、二噻菁染料、硫碳菁染料或二硫碳菁染料。
19. 如權利要求13所述的方法，其中所述報道分子選自孔雀石綠異硫氰酸酯、四甲基若丹明-5-異硫氰酸酯、X-若丹明-5-異硫氰酸酯、X-若丹明_6-異硫氰酸酯或3,3'-二乙基硫二碳菁碘化物。
20. 如權利要求13所述的方法，其中所述封裝物質是巰基聚乙二醇。
21. —種生物樣品成像的方法，其包括將至少一種納米結構遞送到培養的細胞或動物或人受治療者，其中所述納米結構包括核心金納米粒子、置于所述核心表面上的拉曼報道分子和置于所述核心和報道分子上的封裝保護層，其中所述被封裝的報道分子具有可測量的表面增強拉曼光譜特征；允許所述納米結構與被靶向的生物細胞或組織接觸；用放射源激發所述報道分子；并且測量對應于所述報道分子的納米結構的表面增強拉曼光譜，從而檢測所述納米結構在被耙向的細胞或組織中的存在。
22. 如權利要求21所述的方法，其中所述納米結構還包括乾特異性探針，其中所述靶向探針選擇性地將納米粒子結合到被靶向的細胞，從而允許被靶向的細胞的檢測。
23. 如權利要求22所述的方法，其中所述把細胞是在動物或人受治療者的組織中。
24. 如權利要求21所述的方法，其中所述耙細胞是動物或人受治療者的癌細胞。
25. 如權利要求21所述的方法，其中所述耙特異性探針可選自由抗體、多肽、多核普酸、藥物分子、抑制劑化合物或其組合組成的組，并且其中所述靶向探針具有對靶細胞表面上的標志物的親和性。
26. 如權利要求21所述的方法，其中所述靶特異性探針是輩巴向腫瘤的配體。
全文摘要
公開了納米結構、制備納米結構的方法、檢測受治療者中靶的方法和治療受治療者中疾病的方法。其中，納米結構的實施方案包括金屬金表面增強的拉曼散射納米粒子、拉曼報道子和保護結構。所述保護結構可包括巰基聚乙二醇，并且靶特異性探針可連接到所述巰基聚乙二醇。
文檔編號G01N21/65GK101679022SQ200880018403
公開日2010年3月24日 申請日期2008年4月2日 優先權日2007年4月2日
發明者書明·聶, 多米尼克·安薩里, 奚美·錢 申請人:愛默蕾大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
