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專利名稱：微腔板及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微腔板(micro-chamber plate)及其制造方法，更具體地涉及一種便 于實時測量和分析從包含引物(primer)或探針的多個反應溶液(選擇性地綁定到每個對 應的基因)的反應獲得的熒光以便分析包含多個基因的生物樣本而不會交叉污染的微腔 板及其制造方法。
背景技術(shù)：
微腔板是這樣一種容器，其中發(fā)生了多達數(shù)微升的微小反應。這種微腔板可以由 硅晶片、玻璃、金屬或塑料構(gòu)成。微腔板是一種其中所述微腔以2維形式排列的板。在該板 中，用于樣本輸入的入口位于一側(cè)，而另一側(cè)由透明材料制成以便觀察內(nèi)部反應。為了測量基因量，開發(fā)出了實時聚合酶鏈反應(PCR)與PCR共同執(zhí)行，PCR方便了 對與基因量成比例增加的熒光的測量。在實時PCR中，在每個周期內(nèi)測量從PCR產(chǎn)品產(chǎn)生的熒光，并且確認給出至少所需 熒光的特定周期，這導致對某一具體基因的早期濃度的量化。當PCR完成時，實時PCR不需要電泳(electrophoresis)，而是隨著PCR —起進 行，并且有助于產(chǎn)品的量化，準確來講，其實現(xiàn)了具有至少109濃度范圍中的具體核酸序列 的基因的量化(“A-Z of Quantitative PCR" edited by Stephen A. Bustin 2004—2006 International University, " RealtimePCR" edited by M. Tevfik Dorak 2006 Taylor & Francis Group)。已經(jīng)開發(fā)了用于分析多個樣本的實時PCR的多種裝置，通過使用標準96孔板或 384孔板(Roche Light cycler 480, ABI 7500,7900)來分析96個或384個基因的設備對 它們進行舉例說明。Roche提供的實時PCR設備要求10_50微升的樣本量，這是一個很大的量。為了解決以上問題，提出了不同的方法，通過利用MEMS (微電子機械系統(tǒng))技術(shù)減 少樣本量在短時間段內(nèi)分析多個樣本。一個例子是使用微腔陣列板的方法。使用微腔陣列板的方法由以下步驟組成在微腔中加載反應樣本；密封每個微腔 以隔離每個反應溶液；誘發(fā)反應并對其進行分析。具體地講，樣本溶液被添加到微腔中。用于細胞培養(yǎng)的透明微腔板被覆蓋了半 透明隔膜以將微腔彼此隔離開。在每個微腔中僅培養(yǎng)一個細胞。接著，培養(yǎng)基(culture medium)被去除，向其添加Taqman反應溶液，并用清油進行密封以防止蒸發(fā)。用溫度循 環(huán)(temperature cycling)來測量板底部上的熒光(YASUDA, Kenji EP 1，541，678 Al, JP 2002245900NUCLEIC ACID ANALYSIS CHIP AND NUCLEIC ACID ANALYZER)。根據(jù)上述方法，要使用微量吸管將不同的溶液加載到每個微腔中，這耗費了很 長的時間。具體地講，為了將樣本注入到至少1536個微腔中，必須有微型自動分配器 (dispenser) 0在注入每種溶液之后，必須清洗該微型自動分配器，這將消耗很長時間。因 此，實際上很難使用超過384個板。
第二，為了克服上述問題，E.Tamiya集團的Hdenori Nagai提出了一種反應器， 其中通過光刻和化學蝕刻由硅晶片構(gòu)成了微腔陣列(Anal. Chem. 2001 73，1043-1047， Development of a Microchamber Array forPicoliter PCR)。所述反應器使用顯微鏡載物片蓋玻片來防止PCR溶液的蒸發(fā)。但是，當蓋玻片被 拿開時，存在反應溶液發(fā)生交叉污染的機會。因此，防水隔膜被插入在蓋玻片和晶片之間。 接著，首先去除蓋玻片，然后在反應溶液干燥之后去除抗水隔膜，之后進行分析。上述處理 是比較麻煩的。因此，該反應器在實時基因量化放大方面的可用性是有限的。第三，為了克服根據(jù)上述量化放大的問題，同一實驗室的Y. Matsubara等人開發(fā) 了一種微腔陣列，其通過以下步驟來制備使用微陣列裝置在晶片上的凹形微腔中加載每 禾中引物；以及使其干燥(7thInternational Conference on Miniaturized Chemical and BiochemicalAnalysis Systems October 5-9,2003, Squaw Valley California USA)。在該微腔陣列中，芯片的上部被覆蓋了礦物油以完全密封該微腔，接著使用納米 噴射分配器將PCR反應混合物加載在礦物油上。根據(jù)該方法，通過光刻和化學蝕刻用硅晶 片(1x3英寸)制成了 1248個容量為50納升(0. 65X0. 65X0. 2mm)的微腔陣列芯片。使 用納升分配器在微腔中分配引物和Taqman探針溶液，之后進行干燥。整個芯片用礦物油涂 敷，因此每個微腔都被分開和密封。根據(jù)上述第三種方法制成的微腔陣列對于PCR是有利的，反應成分之間沒有交叉 污染。具體地講，根據(jù)該方法，將Taq DNA聚合酶和樣本DNA的混合溶液噴灑在礦物油(分 配在每個微腔中)的頂部，引起微腔中的每個反應成分的PCR而沒有交叉污染。然而，以上方法還存在以下問題。該方法需要微陣列納升分配器來注入溶液。分 配要花費很長時間。而且由于在移動板的過程中礦物油的流動，反應溶液之間發(fā)生交叉污 染的可能性很高。另外，溫度循環(huán)過程中在高溫下形成了氣泡。由于油和水溶液的疏水性 而引起的透鏡效果將水溶液變?yōu)榍蛐危@是另一個問題，造成了在光學測量期間激發(fā)光的 散射和色散并且發(fā)光，從而使得測量誤差更大。第四，開發(fā)了有助于比以上第三示例多得多的反應的PicoTiterPlate，盡管該 微腔也是通過類似于第三示例的化學蝕刻制成的(John H. Leamonet al. , A massively parallel PicoTiterPlate based platform for discretepico-liter-scale polymerase chain reactions. Electrophoresis 2003,24,3769-3777)。根據(jù)該方法，以39. 5pl的量同時發(fā)生了 300，000個獨立的PCR反應。但是，該方法需要用于固定引物/探針的載物片，這使得它不適于進行要求平坦 光學特性的實時量化PCR。第五，提出了“膜反應器(或DNA卡)”(美國專利第5948673號)以對微樣本起反應。膜反應器由三層薄膜組成。準確地講，下層膜形成了反應器的底部，中間膜形成了 反應器的側(cè)部，而上層膜形成了樣本入口。在使用吸液管注入了微樣本溶液之后，入口必須 被完全密封以便進行反應。如果入口沒有被完全密封，在PCR過程中反應溶液就可能蒸發(fā)。 為了同時處理上千個樣本，所述膜反應器必須變得很復雜。因此，這種反應器很難在實際中 使用。第六，在W0 02/40158和US 6，232，114中描述了具有標準ELISA板尺寸并且有助
5于1536個熒光分析反應的反應板。對于板而言，在板中穿透了多個孔，并且在板上附接了具有弱熒光的透明膜，從而 形成了多個反應容器。試劑被加載在這些容器中，并且用透明膜來密封這些容器，之后進行反應。該反應 板具有清潔的上部和下部。在一側(cè)照射激勵光，在另一側(cè)測量熒光。然而，該第六示例也有問題。為了分析多個基因，必須將不同的引物和探針加載到 每個微腔中。即，為了分析多個樣本，必須將數(shù)千個不同的溶液注入這些微小的微腔內(nèi)。因 此，需要類似于納升分配器的特殊設備并且此項任務要花費很長時間。另外，樣本注入故障 的高可能性是另一問題。由于微腔不能被完全充滿反應混合物，所以在溫度上升過程中會 在微腔的頂部產(chǎn)生水蒸汽，從而導致光學測量難以進行。因此，需要一種新穎的微腔板，其有助于均勻地將樣本注入到多個微腔中，排除了 反應溶液之間的交叉污染，防止在光學測量件的側(cè)面形成氣泡和凝結(jié)水蒸汽，由此有助于 對從反應產(chǎn)品產(chǎn)生的光進行實時分析。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種微腔板及其制造方法，其有助于 用少量樣本進行準確分析，其特征在于防止了反應溶液從用于實時PCR、恒溫酶反應或 LCR(連接酶鏈反應)的微腔進行蒸發(fā)；溶液的注入變得簡單，明顯減少了注入時間；防止了 不同微腔中的反應溶液之間的混合；并且排出了反應溶液中的微氣泡以便對光學值進行準 確測量。本發(fā)明的微腔板的構(gòu)成如下主體，其具有位于一側(cè)的可實現(xiàn)光學測量的光學測 量部分，位于另一側(cè)的用于樣本注入的入口部分，以及具有多個空間的微腔；透明層，用于 密封位于主體的一側(cè)的光學測量部分；以及注入層，用于在遮擋(block) 了另一側(cè)的入口 部分的情況下將包含樣本的試劑注入到微腔中。此處的微腔的特征在于在形成注入層之前，加載包含諸如用于核酸分析的引物 或探針的特定成分(A)的分析試劑。所述微腔還包括核酸放大酶、dNTP或緩沖劑。當完成注入包含樣本的公共試劑時，用粘性膜、水基包皮形成成分(water-based envelope forming component)、油或在常溫下為固體的固體成分對所述注入層(130)進行 密封。注入層由可打孔膜構(gòu)成。即，注入層的特征在于被打孔以便與每個微腔相連接。 孔的優(yōu)選數(shù)量是每微腔l-io個。注入層的特征還在于是用多孔材料制成的。透明層是由在0°C -100°C溫度下不變形的材料制成的，該透明層允許或阻擋特定 波長的光穿過。在該微腔板上，主體上的入口部分區(qū)域的突起在所述上部上形成了開放空間，試 劑或樣本被直接加載到微腔的上部的開放空間中。該微腔板的特征還在于在一側(cè)上形成有借以加載包含樣本的公共試劑的供應部 分，另外還在其上形成有樣本供應層以通過密封的開放空間來排出氣體。微腔優(yōu)選地是圓柱體或長方體，但絕不限于此。微腔的大小優(yōu)選地是寬度0. 3-3mm、深度 0. 5-5mm。該微腔板被放置在容納(harbor)包含樣本的公共試劑的單獨容器中以使包含試 劑的樣本可以被加載到微腔中。該微腔板的特征在于是由保護透明層的第一保護部分或保護注入層的第二部分 構(gòu)成的。第一保護部分或第二保護部分是用可分離的粘性膜或可附著材料制成的。該微腔板的特征在于是由多個微腔構(gòu)建成的。本發(fā)明的微腔板的制造方法包括以下步驟a)制備主體，該主體具有形成在一側(cè) 的用于光學測量的光學測量部分和形成在另一側(cè)的用于樣本注入的入口部分以及被多個 開放空間彼此分開的微腔(Sa) ；b)在主體上的光學測量部分上形成透明層(Sb) ；c)通過 主體上的入口部分來分配特定成分(A)以將不同的特定成分(A)加載到微腔板中(Sc)；以 及d)在微腔板的另一側(cè)形成注入層(Sd)。該微腔板的制造方法還可以包括以下步驟e)在d)形成注入層(Sd)之后形成保 護注入層的第一保護部分或保護透明層的第二保護部分(Se)。使用本發(fā)明的微腔板來分析樣本的方法使用了通過以上制造方法而制備出的微 腔板，并且嚴格來講包括以下步驟i)通過微腔板的注入層向微腔中注入包含樣本的公 共試劑(Si) ；ii)當完成注入包含樣本的公共試劑之后密封該注入層的上部(Sii)；以及 iii)使包含樣本的公共試劑與特定成分發(fā)生反應(Siii)。在該方法中，根據(jù)形成注入層的 材料，密封注入層的上部的步驟可以省略。在注入包含樣本的公共試劑的步驟(Si)中，將包含樣本的公共試劑注入到微腔 中是在離心力的作用下以及在減小或增大的壓力下進行的以便進行有效注入。在注入包含樣本的公共試劑的步驟(Si)中，如果多個樣本或試劑被依次注入，則 在每次注入之間還要包括調(diào)節(jié)微腔板的壓力的步驟(Siv)。調(diào)節(jié)壓力的步驟(Siv)由用于將殘留氣泡從微腔中排出的解除(cancelation)減 壓或加壓處理構(gòu)成。在密封步驟(Sii)中，當完成注入包含樣本的公共試劑時，使用粘性膜、水基包皮 形成成分、油或在室溫下為固體的固體成分來執(zhí)行注入層的密封。由于該方法僅僅要求很少量的樣本，所以本發(fā)明的微腔板及其制造方法能夠減少 反應溶液的量，并且由于溫度調(diào)節(jié)很容易(因為微腔板很薄)，所以減少了分析時間，以及 由于通過防止分離的微腔中的溶液通過彼此接觸而被污染以及防止微腔中產(chǎn)生的氣泡殘 留在其中而造成光學測量的不準確測量，所以提高了分析效率。本發(fā)明的微腔板及其制造方法還具有容易將樣本溶液注入到微腔中的優(yōu)點，這有 助于對大量樣本進行同時處理，并且得到了使分析程序簡單而容易的簡單處理過程。另外，根據(jù)本發(fā)明，多微腔板被形成為一體，但每個微腔板都可以具有不同的試 劑，從而能夠在短時間內(nèi)進行大量樣本的同時比較和分析。


本發(fā)明的以上和其他目的、特征和優(yōu)點將從隨后結(jié)合附圖對優(yōu)選實施方式的描述 中變得明了，其中圖1是例示本發(fā)明的微腔板的斜視圖2是例示圖1所示微腔板的截面圖；圖3是例示本發(fā)明的微腔板的另一截面圖；圖4是例示本發(fā)明的微腔板的另一斜視圖；圖5是例示圖4所示微腔板的截面圖；圖6是例示本發(fā)明的微腔板的另一斜視圖；圖7是例示本發(fā)明的微腔板的另一斜視圖；圖8是例示本發(fā)明的微腔板的另一斜視圖；圖9是例示圖8所示微腔板的截面圖；圖10是例示本發(fā)明的微腔板的另一截面圖；圖11是例示本發(fā)明的微腔板的另一斜視圖；圖12是示出本發(fā)明的用于實時PCR的分析系統(tǒng)的圖；圖13是示出本發(fā)明的微腔板制造方法的流程圖；圖14是示出本發(fā)明的微腔板制造方法的流程圖；圖15是示出使用本發(fā)明的微腔板的分析方法的流程圖；圖16是示出使用本發(fā)明的微腔板的分析方法的另一流程圖；而圖17是示出使用本發(fā)明的微腔板的分析方法的另一流程圖。**對圖中主要部分的標號的描述#1000 本發(fā)明的用于實時PCR的分析系統(tǒng)100:微腔板110:主體111 微腔Lm 微腔板的寬度Dm 微腔板的深度112:入 口部分113:光學測量部分114:開放空間部分115:分隔壁部分120 透明層130:注入層140 樣本供應層141 供應部分150 第一保護部分160 第二保護部分170 主體連接部分200 壓力調(diào)節(jié)裝置300 溫度調(diào)節(jié)裝置400 旋轉(zhuǎn)裝置A 特定成分Sa Se 本發(fā)明的微腔板制造方法的每個步驟
Si Siv 使用本發(fā)明的微腔板的分析方法
具體實施例方式下面結(jié)合附圖來詳細描述本發(fā)明的微腔板(100)及其制造方法。圖1是例示本發(fā)明的微腔板(100)的斜視圖；圖2是例示圖1所示微腔板(100) 的截面圖；圖3是例示本發(fā)明的微腔板(100)的另一截面圖；圖4是例示本發(fā)明的微腔板 (100)的另一斜視圖；圖5是例示圖4所示微腔板(100)的截面圖；圖6是例示本發(fā)明的微 腔板(100)的另一斜視圖；圖7是例示本發(fā)明的微腔板(100)的另一斜視圖；圖8是例示本 發(fā)明的微腔板的另一斜視圖；圖9是例示圖8所示微腔板的截面圖；圖10是例示本發(fā)明的 微腔板的另一截面圖；圖11是例示本發(fā)明的微腔板的另一斜視圖。圖1-圖6是例示本發(fā)明的微腔板(100)的圖。本發(fā)明的微腔板(100)的構(gòu)成如 下包括具有光學測量部分(113)和入口部分(112)的多個微腔(111)的主體(110)；分別 形成在主體(110)每一側(cè)的透明層(120)；以及注入層(130)。主體(110)是形成微腔板(100)的基本結(jié)構(gòu)，其包括用于加載樣本、反應溶液或溶 劑的多個微腔(111)。主體(110)可以由硅晶片、玻璃、金屬或塑料制成。微腔(111)具有形成在腔的一 側(cè)以便進行光學測量的光學測量部分(113)以及形成在另一側(cè)的借以加載分析必需的材 料的入口部分(112)。透明層(120)用于密封主體(110)的形成有光學測量部分(113)的一側(cè)，優(yōu)選地 由對于光學測量透明的材料制成。此處，微腔板(100)在分析過程中被加熱。因此，板優(yōu)選地用具有阻熱性的材料制 成。透明層(120)優(yōu)選地用在0°C -100°C不發(fā)生變化的材料制成。透明層(120)阻擋特定波長的光以便進行光學測量或僅僅允許特定波長的光透 過，假設透明層被設計為用于更準確的光學測量。注入層(130)形成在主體(110)上形成有入口部分(112)的一側(cè)以遮擋入口部分 (112)。通過注入層(130)將包含樣本的公共試劑加載到微腔(111)中。注入層(130)通過遮擋入口部分(112)來防止內(nèi)部材料蒸發(fā)，并且優(yōu)選地由可打 孔材料或多孔材料制成以將試劑加載到微腔(111)中。可打孔材料可以是膜型材料，膜型注入層(130)被打孔以與微腔(111)相連接。孔的數(shù)量是每個微腔(111) 1-10個。膜的材料從由Teflon、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、 PVC和PET構(gòu)成的組中選擇。孔的寬度是10 u m-lmm,更多情況下100-500 u m。優(yōu)選地調(diào)節(jié)壓力以便通過注入層(130)成功注入。注入層(130)可以使用多孔材料而無需進行打孔。在此通過微孔隔膜、網(wǎng)孔型材 料以及非編制織物來舉例說明多孔材料。多孔材料的小孔大小優(yōu)選地是0. 1-100 ym。當通過注入層(130)完成樣本注入時，用粘性膜、水基包皮形成成分、油或在室溫 下為固體的固體成分來覆蓋注入層(130)以防止樣本蒸發(fā)或排出，并防止不同微腔(111) 中的樣本之間發(fā)生混合。如果注入層(130)由可打孔膜材料制成，則優(yōu)選地用諸如乙烯基 膠帶(vinyl tape)的粘性膜帶來覆蓋注入層(130)的上部。如果注入層(130)由多孔材 料制成，則對注入層(130)涂抹目前銷售的用于PCR的礦物油(Sigma)以通過注入層(130)穿透油成分。本發(fā)明的微腔板(100)在形成注入層(130)之前還可以在其微腔(111)中包含特 定成分(A)(如包含用于核酸分析的引物或探針的熒光分析試劑)，如果需要，還可以包含 核酸放大酶、dNTP、緩沖劑或穩(wěn)定劑(與反應溶液、引物和酶良好混合以使其穩(wěn)定并減少在 容器上的粘附的材料，例如多羥基化合物、碳水化合物、牛白蛋白和PEG)。該特定成分(A) 根據(jù)其構(gòu)成以干燥相、半干燥相或液相被使用。因此，在形成透明層(120)之后一側(cè)被密封的微腔(111)包含了樣本特定成分 (A)。S卩，在形成注入層(130)之前預先加載具有獨特功能的材料，從而制成了微腔板。為了用微腔板來分析樣本，通過離心力或在減小或增大的壓力下將包含樣本的公 共試劑注入到微腔(111)中(下文將詳細說明)。附圖中例示了本發(fā)明的微腔板(100)的實例。圖1和圖2例示了由主體(110)上具有規(guī)則間距(Lm)的圓形截面的多個微腔 (111)組成，其中注入層(130)和透明層(120)與主體(110)分離地附接。微腔(111)具有0. 3-3mm(Lin)的寬度以及0. 5-5mm(Din)的深度。本發(fā)明的微腔板 (100)可以具有數(shù)量巨大的微腔，意味著可以對大量樣本進行同時分析。另外，深度(Dm) 非常淺，意味著其可以具有很高的熱導率，減少了分析時間而增大了分析精度。事實上，可以在標準的80x125mm板的主體(110)上形成24，576個寬度(Lm)為 0. 3-2. 25mm的微腔(111)，這適用于0. 1_5 y m微樣本的反應。因此，本發(fā)明的微腔板(100) 的特征在于，用少量的反應溶液進行大量基因的同時量化分析。圖3是例示本發(fā)明的微腔板(100)的另一示例的截面圖。在圖3(a)所示的微腔 板(100)中，主體(110)和透明層(120)是一體的，省略了形成分離的透明層(120)的處理。 盡管透明層(120)和主體(110)是一體的，但是透明層(120)必須被適當?shù)匦纬梢员氵M行
光學測量。在圖3(b)中，在主體(110)的形成有光學測量部分(113)的一側(cè)上形成了臺階結(jié) 構(gòu)，而透明層(120)形成在該臺階區(qū)域上。在生成透明層(120)的過程中，需要注意不要生 成突起。本發(fā)明的微腔板(100)的微腔(111)除了以上圖中提出的圓形形狀之外，還可以 具有不同類型的截面形狀，如方形、多邊形等，而且寬度(Lm)也可以做大小修改。可以通過不同方法將包含樣本的公共試劑加載到之上形成了注入層(130)的微 腔板(100)的微腔(111)中。首先，將微腔板(100)自身放置在填充有包含要加載樣本的公共試劑的容器中。第二，本發(fā)明的微腔板(100)在上部通過主體(110)的入口部分(112)區(qū)域的突 起而具有開放空間(114)，并且還生成了樣本供應層(140)。因此，包含樣本的公共試劑被 直接提供到該開放空間(114)中。第三，如圖4和圖5所示，該微腔板在一側(cè)具有借以提供包含樣本的公共試劑的供 應部分(141)，并且形成了樣本供應層(140)以遮擋該開放空間(114)。因此，在形成樣本 供應層(140)之后，通過供應部分(141)將包含樣本的公共試劑加載到注入層(130)的上 部中并遞送到每個微腔(111)中。第四，如圖6所示，樣本供應層(140)是按照以上第三實例中所述那樣形成的，但供應部分(141)位于主體(110)的一側(cè)。在額外形成了樣本供應層(140)的情況下，可以保護包含樣本的公共試劑，并且 可以精確地調(diào)節(jié)供應量，從而實現(xiàn)了保護注入層(130)的效果。樣本供應層(140)由不排出包含樣本的公共試劑但排出內(nèi)部生成的氣體的材料 制成，這樣，樣本供應層就起到了防止從微腔(111)排出包含樣本的公共試劑而是排出殘 留氣泡的作用。如果微腔(111)中殘留了氣泡，則光由于殘留氣泡而色散，導致光學測量的準確 度下降。本發(fā)明的微腔板(100)被設計為將殘留氣泡從微腔(111)中排出，從而有利于克 服常規(guī)問題。微腔板(100)不僅可以被用于實時PCR而且可以用于恒溫酶反應或LCR(聚合酶 鏈反應)。通過改動微腔板中加載的特定成分(A)，其應用可以被擴展。圖7例示了本發(fā)明的微腔板(100)的另一示例。微腔(111)在必要時可以被運輸， 其可以額外地具有用以保護透明層(120)的第一保護部分(150)和用以保護注入層(130) 的第二保護部分(160)。如果有必要，第一保護部分(150)和第二保護部分(160)可以有多個。在額外形 成了樣本供應層(140)的情況下，第二保護部分(160)形成在注入層(130)或樣本供應層 (140)的上部。第一保護部分(150)由可分離的粘性膜或可附接的材料制成以便進行光學測量。 第二保護部分(160)可以由粘性膜制成以防止內(nèi)部溶液的排出以及防止污染。作為保護 膜，優(yōu)選地使用具有適當強度以保護基底膜不被損壞，且易于分離而不會損壞基底膜，并且 分離時不留下雜質(zhì)的粘性膜。板的蓋子可以使用可附接材料。圖8-圖11例示了本發(fā)明的多微腔板(100)的示例。這些多微腔板包括在本發(fā)明 的微腔板的范圍內(nèi)。為了更好地理解，當一個單位微腔板(100)被復數(shù)地形成并組合到一 起時，其被稱為多微腔板(100')，用附圖標記100'來表示。如圖8和圖9所示，本發(fā)明的多微腔板(100')由多個微腔板(100)組成，每一個 微腔板(100)都包括主體(110)，具有均包括光學測量部分(113)、入口部分(112)的多個 微腔(111)；形成在主體(120)的每一側(cè)的透明層(120)；以及注入層(130)。由多個微腔板(100)組成的多微腔板(100')也具有與微腔板(100)相同的特 性，在下文中參照附圖進行說明。如圖8和圖9所示，多微腔板(100')配備有用于將相鄰的微腔板(100)連接到 主體(110)上形成有注入層(130)之處的主體連接部分(170)。在此，透明層(120)和主 體(110)是一體的。主體連接部分(170)的形狀并不受限制，能將主體連接部分(170)連 接到相鄰微腔板(100)即可。多微腔板(100')是通過集成多個微腔板(100)而制成的。也就是說，微腔板 (100)是作為一個單位而起作用的。多微腔板(100')的每個微腔板都包含4-16個微腔 (111)，而多微腔板包含8-96個微腔板(100)。形成多微腔板(100')的每個微腔板(100)都包含特定成分(A)并通過注入層 (130)被提供了不同的公共試劑。優(yōu)選地多微腔板(100')的每個微腔板(100)都通過入 口部分(112)區(qū)域的突起在上部具有開放空間(114)。因此，包含樣本的公共試劑被直接提供到形成在注入層(130)的上部的開放空間(114)中。為了形成開放空間(114)，如圖8和圖9所示，可以生成突起到主體(110)的入口 部分(112)的頂部的分隔壁部分(115)。圖8和圖9例示了在其微腔板(100)中加載了相同的特定成分㈧的微腔(111) 的示例，其中分隔壁部分(115)和主體(110)是一體的。可以配備一個分隔壁部分(115) 來劃分微腔板(100)，其可以是多種形式，只要它能夠形成開放空間以便將試劑注入到每個 微腔板(100)中即可。S卩，本發(fā)明的多微腔板(100')具有這樣的優(yōu)點通過在主體(100)的微腔(111) 中加載特定成分(A)而此時每個微腔板(100)被加載了不同的特定成分(A)，可以同時分析 不同的樣本。如圖10所示，本發(fā)明的多微腔板(100')由側(cè)面開放的主體(110)中包含特定成 分(A)的多個微腔(111)組成。透明層(120)形成在一側(cè)，注入層(130)形成在另一側(cè)。本發(fā)明的微腔板(100)通過主體(110)的入口部分(112)區(qū)域的突起而在上部中 具有開放空間(114)，并且額外生成了樣本供應層(140)以遮擋開放空間(114)。因此，公 共試劑被直接提供到開放空間(114)中。在樣本供應層(140)中，可以形成供應部分(141)來提供樣本。可以通過使主體 連接部分(170)的一側(cè)突起來生成開放空間(114)。圖10例示了保護透明層(120)的第一保護部分(150)和保護樣本供應層(140) 的第二保護部分(160)的生成。圖8-圖10例示了成行連接的微腔板(100)的示例。如圖11所示，本發(fā)明的多微 腔板(100')可以具有成行連接的多個微腔板(100)。多微腔板(100')通過可借以加載不同試劑的主體(110)的入口部分(112)區(qū)域 的突起而在該入口部分的頂部具有開放空間(114)，并且其特征在于，通過直接將公共試劑 或樣本注入到形成在入口部分(130)的頂部的開放空間(114)中而最終將樣本遞送到微腔 (111)中，能夠一次分析多種樣本。本發(fā)明的用于實時PCR的分析系統(tǒng)(1000)的特征在于，使用具有上述特征的微腔 板(100)。圖12是例示了本發(fā)明的用于實時PCR的分析系統(tǒng)(1000)的圖。如圖12所示，用 于實時PCR的分析系統(tǒng)(1000)配備了壓力調(diào)節(jié)裝置(200)或旋轉(zhuǎn)裝置(400)，并且還可以 配備溫度調(diào)節(jié)裝置(300)或光學測量裝置(500)。圖13是例示了本發(fā)明的微腔板(100)的制造方法的流程圖。本發(fā)明的微腔板 (100)的制造方法由以下步驟組成:a)制備主體(110) (Sa) ；b)形成透明層(120) (Sb) ；c) 分配特定成分(A) (Sc)；以及d)形成注入層(130) (Sd)。在步驟a)制備主體(110) (Sa)中，在一側(cè)形成用于進行光學測量的光學測量部分 (113)，在另一側(cè)生成用于樣本注入的入口部分(112)，而且還在主體(110)上形成被多個 開放空間劃分開的微腔(111)。在步驟b)中，形成了遮擋主體(110)的光學測量部分(113)區(qū)域的透明層(120)。 根據(jù)制備條件，主體(110)制備步驟(Sa)和透明層(120)形成步驟(Sb)可以統(tǒng)一且作為 一個程序來執(zhí)行。
在步驟c)分配特定成分(A) (Sc)中，將特定成分(A)加載到一側(cè)被透明層(120) 密封的微腔(111)中。此處的特定成分(A)除了引物或探針以外還可以包括核酸放大酶、 dNTP、緩沖劑或穩(wěn)定劑。在步驟d) (Sd)中，形成注入層(130)以遮擋包含特定成分(A)的微腔(111)的入 口部分(112)。在此，為了防止特定材料之間的交叉污染，形成注入層(130)以遮擋入口部 分(112)，從而防止內(nèi)部材料排出。此時，使用多孔材料或可打孔材料將包含樣本的公共試 劑一次提供到微腔(111)中。如圖14所示，本發(fā)明的微腔板(100)的制造方法還可以在形成注入層(130) (Sd) 的步驟之后包括步驟e)形成保護注入層(130)的第一保護部分(150)或保護透明層(120) 的第二保護部分(160) (Se)。本發(fā)明的微腔板(100)的制造方法可以增大分析效率，因為得益于形成在板上的 注入層(130)，它不需要諸如納米噴射分配器這樣的用于分配的特殊設備，并且該制造方法 有助于快速生產(chǎn)這種用于分析的微腔板(100)，因為它可以提供公共成分而沒有交叉污染。 在額外地配備了壓力調(diào)節(jié)裝置(200)或旋轉(zhuǎn)裝置(400)的情況下，本發(fā)明的方法還可以縮 短微腔板(100)的生產(chǎn)時間。圖15是例示了使用本發(fā)明的微腔板(100)的分析方法的流程圖。使用如上文描 述的本發(fā)明的微腔板(100)的該分析方法使用微腔板(100)，并且特征在于包括以下步驟 i)通過注入層(130)將包含樣本的公共試劑注入到微腔(111)中(Si)；以及ii)使包含樣 本的公共試劑與特定成分(A)發(fā)生反應(Sii)。在注入包含樣本的公共試劑的步驟(Si)中，將包含樣本的公共試劑注入到微腔 板(100)的微腔(111)中。如果必要，可以重復該注入包含樣本的公共試劑的步驟(Si)。在注入包含樣本的公共試劑的步驟(Si)中，優(yōu)選地利用離心力在減小或增大的 壓力下快速進行這種注入以使得包含樣本的公共試劑被高效地加載到微腔(111)中。如果 注入層(130)在其頂部具有用來保護注入層(130)的第一保護部分(150)，則在消除第一保 護部分(150)之后進行通過注入層(130)注入包含樣本的公共試劑的步驟。在使包含樣本的公共試劑發(fā)生反應的步驟(Sii)中，包含樣本的公共試劑與對應 的特定成分㈧發(fā)生反應。在該步驟(Sii)中，反應是通過從PCR(聚合酶鏈反應)、LCR(連 接酶鏈反應)以及RT-PCR(實時聚合酶鏈反應)中選擇的方法來誘導的。不同于通常的PCR，實時PCR需要在放大過程的每個循環(huán)中進行光學測量處理。因此，如果使用本發(fā)明的微腔板(100)的樣本分析是用實時PCR進行的，則在每個 循環(huán)中光學測量(熒光測定)都是必需的，這意味著可能要增加適用于每個反應的額外步 馬聚o如圖16所示，當完成注入包含樣本的公共試劑時，使用本發(fā)明的微腔板(100)的 樣本分析方法可以額外地包括步驟iii)根據(jù)注入層的材料來密封注入層(130)的上部 (Siii)0在密封注入層(130)的步驟(Siii)中，在注入了包含樣本的公共試劑之后，對注 入層(130)的上部進行密封。當完成注入包含樣本的公共試劑時，用粘性膜、水基包皮形成 成分、油或在室溫下為固體的固體成分來密封注入層(130)，以保持微腔的內(nèi)部狀態(tài)(諸如 引物或探針、特定成分和包含樣本的公共試劑的混合物的條件或狀態(tài))。
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如圖17所示，根據(jù)使用本發(fā)明的微腔板(100)的分析方法，如果在注入包含樣本 的公共試劑的過程中，微腔(111)中殘留氣泡而未被排出，則殘留氣泡在光學測量過程中 會使光發(fā)生散射，從而降低分析準確度。因此，當攜帶公共試劑的多個樣本被依次注入時 (Si)，該分析方法可以額外地包括每次完成注入每個樣本時調(diào)節(jié)微腔板(100)的壓力的步 驟(Siv)。在調(diào)節(jié)壓力的步驟(Siv)中，進行減壓-解除或加壓以排出微腔(111)中殘留的 氣泡，如果必要可以重復該步驟。在此，壓力解除或加壓包括減壓_解除、加壓、減壓_解除_加壓的全部處理。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解以上描述中公開的概念和具體實施方式
可以被容易地利 用作為修改或設計用于實現(xiàn)本發(fā)明的相同目的的其他實施方式的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還 將理解這種等同的實施方式并不背離所附權(quán)利要求書中闡述的本發(fā)明的實質(zhì)和范圍。
權(quán)利要求
一種微腔板，該微腔板包括主體(110)，其具有位于一側(cè)的可實現(xiàn)光學測量的光學測量部分(113)和位于另一側(cè)的用于樣本注入的入口部分(112)，并且容納了通過多個開放空間彼此隔開的微腔(111)；透明層(120)，其用于密封位于所述主體(110)的一側(cè)的所述光學測量部分(113)；以及注入層(130)，其被設計為遮擋位于所述主體(110)的另一側(cè)的所述入口部分(112)而將包含樣本的公共試劑加載到所述微腔板(111)中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微腔板，其中，在形成所述注入層(130)之前，所述微腔 (111)加載了包含用于核酸分析的引物或探針的特定成分(A)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微腔板，其中，當完成注入包含樣本的公共試劑時，用粘性 膜、水基包皮形成成分、油或在常溫下為固體的固體成分來密封所述注入層(130)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微腔板，其中，所述微腔(111)還被加載了核酸放大酶、dNTP 或緩沖劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微腔板，其中，所述注入層(130)由可打孔膜制成，并且所述 注入層(130)被打孔以與所述微腔(111)相連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微腔板，其中，所述注入層(130)由多孔材料制成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微腔板，其中，所述透明層(120)由在0°C 100°C溫度下不 變形的材料制成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微腔板，其中，所述微腔板(100)通過所述主體(110)上的 所述入口部分(112)區(qū)域的突起而在上部包含開放空間(114)，并且公共試劑或樣本被直 接加載到形成在所述注入層(130)頂部上的所述開放空間(114)中以被遞送到所述微腔 (111)中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微腔板，其中，在板的一側(cè)形成有供應部分(141)用于引入 包含樣本的公共試劑，并且還形成有樣本供應層(140)以便排出氣體和遮擋所述開放空間 (114)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微腔板，其中，所述微腔板(100)被浸泡在填充有包含樣本 的公共試劑的分離容器中以使所述包含樣本的公共試劑被加載到所述微腔(111)中。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微腔板，其中，所述微腔(111)的寬度(L111)是0.3 3mm。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的微腔板，其中，所述微腔(111)的深度(D111)是0.5 5mm。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微腔板，其中，所述微腔板(100)還包含用于保護所述透明 層(120)的第一保護部分(150)或用于保護所述注入層(130)的第二保護部分(160)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的微腔板，其中，所述第一保護部分(150)或所述第二保護部 分(160)由可分離的粘性膜或可附接的材料構(gòu)成。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任意一項所述的微腔板，其中，所述微腔板(100)由作為一 個單元的多個微腔板構(gòu)成。
16.一種微腔板(100)的制造方法，該制造方法包括以下步驟a)制備主體(110)，該主體具有形成在一側(cè)的用于光學測量的光學測量部分(113)和 形成在另一側(cè)的用于樣本注入的入口部分(112)以及通過多個開放空間彼此區(qū)分開的微 腔(111) (Sa)；b)在所述主體(110)上的所述光學測量部分(130)上形成透明層(120)(Sb)；c)通過所述主體(110)上的所述入口部分(112)來分配特定成分(A)以將不同的特定 成分(A)加載到所述微腔板(100)中(Sc)；以及d)在所述微腔板(100)的另一側(cè)形成注入層(130)(Sd)。
17.一種使用權(quán)利要求1所述的微腔板(100)來分析樣本的方法，該包括以下步驟 i)通過所述微腔板(100)的所述注入層(130)向所述微腔(111)中注入包含樣本的公共試劑(Si)；以及 )使所述包含樣本的公共試劑與所述特定成分(A)發(fā)生反應(Sii)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的使用所述微腔板(100)來分析樣本的方法，其中，所述方法 還包括以下步驟iii)在完成注入包含樣本的公共試劑之后密封所述注入層(130)的上部 (Siii) ο
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的使用所述微腔板(100)來分析樣本的方法，其中，注入包含 樣本的公共試劑的步驟(Si)是在離心力的作用下以及在減小或增大的壓力下進行的以便 有效地將所述包含樣本的公共試劑注入到所述微腔(111)中。
20.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的使用所述微腔板(100)來分析樣本的方法，其中，所 述方法還包括以下步驟iv)如果多個樣本被依次注入，則在每次注入之間調(diào)節(jié)所述微腔 板(100)的壓力(Siv)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的使用所述微腔板(100)來分析樣本的方法，其中，調(diào)節(jié)所述 微腔板(100)的壓力的步驟包括減壓-解除或加壓處理以排出所述微腔(111)中殘留的 氣泡。
全文摘要
本發(fā)明涉及微腔板及其制造方法，更具體地涉及一種便于實時測量和分析從包含引物或探針的多個反應溶液(選擇性地綁定到每個對應的基因)的反應獲得的熒光以便分析包含多個基因的生物樣本而不會交叉污染的微腔板及其制造方法。
文檔編號G01N33/48GK101878427SQ200880118304
公開日2010年11月3日 申請日期2008年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者宋邱永, 樸翰浯 申請人:株式會社百奧尼