專利名稱：用于分析液體樣本中的微粒的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于對保持在樣本保持設備中的液體樣本中的微粒進行圖像分析的方法和裝置。
背景技術：
分析液體樣本中的微粒，例如確定微粒的濃度和類型，在許多不同的工業領域諸如農業、醫藥等等中非常重要。研究液體樣本中的微粒的傳統方法是利用視覺，且很可能借助于顯微鏡，如果微粒小的話。通常通過用顯微鏡觀察專用計數室諸如BUrker室中的樣本，通過手動過程獲得微粒濃度。計數室具有以明確界定的小的容積劃分該室的格柵。可以使得微粒沉淀在計數室的底部以便允許顯微鏡聚焦在該室中的所有微粒上，由此便于計數。因此，在可能執行計數前，樣本需要沉淀幾分鐘。然后，通過計數格柵中的每一盒的微粒的數量，確定微粒計數。由需要在執行分析方面富有經驗的分析員來手動地獲得微粒計數，以便能執行可靠的分析。該分析耗時。此外，由于手動地執行，因此，分析結果可能隨執行分析的人員不同而改變。因為計數相對少的微粒以及現有的計數室的容積通常也不精確，因此，分析也是不精確的。存在一些現有的自動分析方法，用于確定液體樣本中的微粒濃度。可能通過基于感知阻抗的Coulter原理，確定微粒濃度和大小，特別是用于生物微粒諸如細胞的微粒濃度和大小。在US 5，262，302中描述過用于通過Coulter原理計數白細胞的方法。根據 Coulter原理的測量裝置昂貴，因此，是相當大的投資。由此，醫院或實驗室將不愿投資于一個以上的裝置。這意味著分析將需要在集中的地點執行以及病人將需要等待分析結果。在W098/50777中，公開了用于估算牛奶中的體細胞的數量的方法。該方法包括在樣本隔室中施加一定容積的樣本，以及將從樣本隔室通過的電磁信號傳送到檢測元件陣列上。處理所檢測到的電磁信號的強度以及將結果與樣本中存在的細胞的數量關聯。國際申請WO 2008/010761公開了用于樣本中的微粒的計數和分類的裝置和方法。該方法包括下述步驟獲得樣本的至少一個放大的數字圖像；識別圖像中對焦成像的微粒；以及確定這些微粒的類型和數量。當動物細胞是微粒時，使用由細胞質和細胞膜充當透鏡所導致的細胞邊緣處的光學現象，來識別對哪些細胞進行了焦點對準的(對焦)成像。 還公開了可以在樣本中的不同焦平面處獲得圖像。然而，未提及這些焦平面應當離開多遠。還期望加速和簡化用于對液體樣本諸如生物樣本中的微粒進行分析的現有的自動方法。提供快速、簡單和相對廉價的分析方法以便在護理場所(at a point of care)提供分析是特別有利的。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡單的分析，使能確定樣本中的微粒的容積計數以及識
5別不同的微粒，所述樣本諸如血液樣本，所述微粒諸如白細胞、血小板或細菌。因此，根據本發明的方面，提供一種用于分析液體樣本中的微粒的方法，該樣本保持在樣本保持設備中，該方法包括通過圖像采集設備，在樣本保持設備內不同焦平面處采集所述樣本的多個圖像；以及通過圖像分析器，分析所述圖像，用于識別在所分析的圖像的任何一個中對焦成像的樣本的微粒；以及對所識別的微粒的每一個，識別在所述分析圖像的哪一個中識別出該微粒，以及使用各自的圖像分析那些微粒，其中那些微粒在所分析的圖像的任何一個中已經被識別為對焦成像，而所述各自圖像中的各自的微粒已經被識別為對焦成像；其中，在不同的、基本上平行的焦平面處采集所述多個圖像，所述平面彼此分開一距離，所述距離小于10微米；其中，對每一微粒，通過如下步驟來實現對所對焦成像的微粒的所述識別；找到可辨別微粒的圖像；確定由微粒占據的圖像的區域和不能辨別出微粒的圖像的區域間的光強的最大差值；確定可辨別出相同微粒的其他圖像中的光強的相應差值；以及識別光強的差值最高的圖像；由此將該微粒視為在該識別的圖像中被對焦。通過在不同焦平面處采集多個圖像，能覆蓋更多容積的樣本，其中，這些微粒仍然被對焦成像。由此還可以使用更大的樣本保持設備，其中，可以增加垂直于焦平面的樣本深度。如果分析包括濃度確定，則這對較低濃度的微粒也可以實現，因為增加了分析的容積。在采集圖像前，不需要等待樣本沉淀。在微粒處于懸浮的狀態下就可以對樣本進行成像。通過在不同焦平面處采集多個圖像，以及確定在哪一圖像中對哪些微粒進行了對焦成像，也可以確定每個微粒在樣本中多深處。由此，例如可以將兩個或更多重疊的微粒彼此公開，因為它們存在于樣本中的不同深度處。另外，通過在不同焦平面處采集多個圖像以及確定在哪一圖像中對哪些微粒進行了對焦成像，可以確定垂直于焦平面的微粒尺寸，因為可以計算出每個微粒在多少個圖像中被對焦，這些圖像在不同但相鄰的焦平面處獲取。然而，這當然依賴于微粒相對于各焦平面間的距離足夠大。焦平面間的較小距離意味著可以更好對焦成像微粒，即使以更高的放大率。因此， 當減小焦平面間的距離時，也可以成像更小的微粒用于分析。并且，鑒于上面討論的在不同焦平面處采集多個圖像的優點隨著減小距離而放大，可以更詳細地成像和分析微粒。可以通過例如移動置于樣本和圖像采集設備間的透鏡或其他光折射器，實現從一個焦平面移向另一個。為了將焦平面移動諸如根據本發明的一小段距離，例如，可以將壓電電動機用于移動透鏡。這種電動機還具有能快速地并以高精度移動透鏡的優點。焦平面基本上彼此平行并且垂直于光軸，該光軸從圖像采集設備延伸并通過樣本。圖像分析器分析多個圖像以便識別對焦成像的微粒，諸如細胞。這允許對相對厚的樣本采集圖像，同時僅計數或者以另外方式分析對準焦點的微粒。通過確保僅計數對焦的微粒，即，當足夠清楚詳盡地成像微粒時，在樣本中可以執行對微粒的類型的識別，該樣本可以同時用來確定樣本中微粒的統計上可靠的容積計數。通過進一步減小焦平面間的距離，能放大減小焦平面間的距離的優點。因此，該距離優選小于5微米，更優選小于2微米，甚至1. 8微米或更小，特別是1. 6微米或更小。當識別出哪些圖像中對焦成像了哪些微粒時，優選將在不同焦平面處采集的不同圖像彼此相比較。特定微粒典型地在具有不同焦平面的幾個不同圖像中是可辨別的，其中， 所述圖像的焦平面彼此相鄰(即分開小于10微米的距離)。為識別在哪一圖像中該特定微粒得以在最佳焦點處成像，可以將各個圖像的對比度用作選擇標準。因此，確定由特定微粒占據的圖像的區域和無微粒可辨別的圖像的區域即背景間的光強的最大差值。用相同的方式研究可辨別出相同微粒的其他圖像。因此，能識別相對于特定微粒顯示最大對比度的圖像，以及將該微粒視為在該識別的圖像中被對焦。然后對在所采集的圖像的任何一個圖像中可辨別的所有微粒，重復相同的過程。此外，作為互補或替換，基于像素或樣本方差(variance)可以實現識別在所采集的圖像的哪一個圖像中對焦成像了哪些微粒。像素方差可以帶偏差(biased，S2n)或進行過偏差校正(S2im)。根據下述公式，計算偏差校正后的像素方差
權利要求
1.一種用于分析液體樣本中的微粒的方法，該樣本保持在樣本保持設備中，該方法包括通過圖像采集設備，在所述樣本保持設備內不同焦平面處采集所述樣本的多個圖像；以及通過圖像分析器，分析所述各圖像，用于識別在所分析的圖像的任何一個圖像中對焦成像的樣本的微粒，以及用于對每一個所識別的微粒，識別在所分析的圖像中的哪一個圖像中識別出所述微粒，以及使用各自的圖像分析那些微粒，其中那些微粒在所分析的圖像的任何一個圖像中已經被識別為對焦成像，而在所述各自的圖像中各自的微粒已經被識別為對焦成像；其中，在不同的、基本上平行的各焦平面處采集所述多個圖像，所述各平面彼此分開一距離，所述距離小于10微米；其中，對每一微粒，通過如下步驟來實現對所對焦成像的微粒的所述識別 找到可辨別所述微粒的圖像；確定由該微粒占據的圖像的區域與無微粒可辨別的該圖像的區域之間的光強的最大差值；確定可辨別出相同微粒的其他圖像中的光強的相應差值；以及識別光強差值最高的圖像； 由此將所述微粒視為在該識別的圖像中被對焦。
2.一種用于分析液體樣本中的微粒的方法，所述樣本保持在樣本保持設備中，所述方法包括通過圖像采集設備，在所述樣本保持設備內不同焦平面處采集所述樣本的多個圖像；以及通過圖像分析器，分析所述各圖像，用于識別在所分析的圖像的任何一個圖像中對焦成像的樣本的微粒，以及用于對所識別的每一個微粒，識別在所述分析的圖像的哪一個圖像中識別出所述微粒，以及使用各自的圖像分析那些微粒，其中那些微粒已經在所分析的圖像的任何一個圖像中被識別為對焦成像，而在各自的圖像中各自的微粒已經被識別為對焦成像；其中，在不同的、基本上平行的焦平面處采集所述多個圖像，所述各平面彼此分開一距離，所述距離小于10微米；其中，對每一微粒，通過如下步驟實現對所對焦成像的微粒的所述識別 找到可辨別所述微粒的圖像；限定所找到的圖像的區域，所述區域包括所述微粒及其最近的圍繞物； 確定所限定區域的像素方差；確定可辨別出相同微粒的其他圖像的相應區域的像素方差；以及識別像素方差最高的圖像； 由此將所述微粒視為在該識別的圖像中被對焦。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述距離小于5微米，優選小于2微米。
4.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，所述方法進一步包括疊加所述多個圖像，由此獲得了包含在不同焦平面中對焦成像的所有微粒的疊加圖像。
5.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，每一焦平面僅采集一個圖像。
6.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，采集至少10個，優選至少100個，以及更優選至少200個圖像。
7.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，將樣本保持設備配置成呈現用于成像的液體樣本，以便樣本具有至少100微米，優選至少200微米，更優選至少500微米的、垂直于所述焦平面的深度。
8.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，將樣本保持設備配置成呈現用于成像的液體樣本，以便樣本具有1毫米或更小的、垂直于所述焦平面的深度。
9.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，所述液體樣本是生物樣本。
10.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，所述液體樣本是血液樣本。
11.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，所述微粒是真核細胞，優選是哺乳動物細胞，更優選是人體細胞。
12.如權利要求1-10的任何一個所述的方法，其中，所述微粒是細菌、病毒或血小板。
13.如權利要求1-10的任何一個所述的方法，其中，所述微粒具有小于20微米，優選小于10微米，更優選小于2微米的最大直徑。
14.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，分析已經識別為對焦成像的那些微粒包括確定微粒的類型和數量，所述類型由微粒的物理特征來區分，由此確定樣本中的不同類型的微粒的比率。
15.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，在采集圖像前，已經通過染色劑染色了待分析的微粒。
16.如權利要求15所述的方法，其中，在樣本保持設備內，液體樣本與染色劑接觸，染色劑采用干燥的形式，由此在樣本中溶解染色劑。
17.如權利要求15或16所述的方法，其中，所述染色劑是熒光染色劑。
18.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，所述圖像采集設備是數碼相機。
19.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，通過圖像采集設備采集的圖像是對液體樣本的放大而采集的，所述放大通過光折射器諸如透鏡來實現。
20.如上述權利要求的任何一個所述的方法，其中，通過將樣本的成像面積與由多個圖像所覆蓋的樣本的深度相乘，來定義樣本的成像容積。
21.一種測量裝置，用于分析液體樣本中的微粒，該裝置包括圖像采集設備，圖像分析器，配置成固定保持液體樣本的樣本保持設備的固定器，以及置于所述圖像采集設備和所述固定器之間的光折射器；其中，當所述樣本保持設備由所述固定器固定時，可在樣本保持設備內逐步移動焦平面，由此所述圖像采集設備適于在樣本保持設備內的不同焦平面處采集所述樣本的多個圖像，所述不同焦平面基本上彼此平行、以及彼此分開一距離，所述距離小于10微米；其中，配置所述圖像分析器來分析至少一個采集的圖像，用于識別哪些微粒被對焦成像，以及分析已經被識別為對焦成像的那些微粒；其中，對每一微粒，通過如下步驟實現對所對焦成像的微粒的所述識別找到可辨別所述微粒的圖像；確定由該微粒占據的圖像的區域與無微粒可辨別的該圖像的區域之間的光強的最大差值；確定可辨別出相同微粒的其他圖像中的光強的相應差值；以及識別光強的差值最高的圖像； 由此將所述微粒視為在該識別的圖像中被對焦。
22.一種測量裝置，用于分析液體樣本中的微粒，該裝置包括圖像采集設備，圖像分析器，配置成固定保持液體樣本的樣本保持設備的固定器，以及置于所述圖像采集設備和所述固定器之間的光折射器；其中，當所述樣本保持設備由所述固定器固定時，可在樣本保持設備內逐步移動焦平面，由此所述圖像采集設備適于在樣本保持設備內的不同焦平面處采集所述樣本的多個圖像，所述不同焦平面基本上彼此平行、并彼此分開一距離，所述距離小于10微米；其中，配置所述圖像分析器來分析至少一個采集的圖像，用于識別哪些微粒被對焦成像，以及分析已經識別為對焦成像的那些微粒；其中，對每一微粒，通過如下步驟來實現對所對焦成像的微粒的所述識別 找到可辨別微粒的圖像；限定所找到的圖像的區域，所述區域包括所述微粒及其最近的圍繞物； 確定所限定區域的像素方差；確定可辨別相同微粒的其他圖像的相應區域的像素方差；以及識別像素方差最高的圖像； 由此將所述微粒視為在該識別的圖像中被對焦。
23.如權利要求21或22所述的裝置，其中，所述距離小于5微米，優選小于2微米。
全文摘要
本發明涉及用于分析液體樣本中的微粒的方法，該樣本保持在樣本保持設備中，該方法包括通過圖像采集設備，在樣本保持設備內不同焦平面處采集所述樣本的多個圖像；以及通過圖像分析器，分析所述圖像，用于識別，如果有的話，在每一個圖像中，樣本的哪些微粒被對焦成像，以及分析已經被識別為對焦成像的那些微粒，其中，在不同的、基本上平行的焦平面處采集所述多個圖像，所述平面彼此分開一距離，所述距離小于10微米。本發明還涉及適用于本發明方法的裝置。
文檔編號G01N33/493GK102216954SQ200980102032
公開日2011年10月12日 申請日期2009年1月16日 優先權日2008年1月18日
發明者斯特蘭·林德博格, 湯姆·奧勒森, 馬丁·沃爾維克 申請人:海默庫伊公司
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