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專利名稱：快速檢測燕窩中亞硝酸鹽的試劑盒及其在燕窩檢測中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及亞硝酸鹽的檢測，特別是食品中亞硝酸鹽的檢測，具體是快速檢測燕窩中亞硝酸鹽的試劑盒及其在燕窩檢測中的應用。
背景技術：
亞硝酸鹽，是一類無機化合物的總稱。主要指亞硝酸鈉(英文名Sodium nitrite, CAS號7632-00-0,分子式=NaNO2)。亞硝酸鈉為白色至淡黃色粉末或顆粒狀，味微咸，易溶于水。外觀及滋味都與食鹽相似，在工業(yè)、建筑業(yè)中使用廣泛。亞硝酸鹽能夠使肉與肉制品呈現(xiàn)良好的色澤，并具有防腐保鮮作用。在我國肉制品加工生產(chǎn)中經(jīng)常被大量使用。由于價格低廉，許多燕窩產(chǎn)品、不少蔬菜腌制品和瓜子炒貨產(chǎn)品都非法使用亞硝酸鹽，導致亞硝酸鹽嚴重超標。
亞硝酸鹽可與食物或胃中的仲胺類物質(zhì)反應生成亞硝胺，而亞硝胺是國際確認對人體的食管癌、鼻咽癌、胃癌、膀胱癌發(fā)病密切相關。此外，該類物質(zhì)還可通過胎盤可致使胎兒畸形及中毒死亡。亞硝酸鹽的人中毒劑量為0. 3-0. 5g，致死量為3g。世界各國對亞硝酸鹽的使用范圍和使用量都有明確嚴格的規(guī)定。我國對食品中的亞硝酸鹽含量也有明確的限量規(guī)定，其中蔬菜細g/kg、醬腌菜20mg/kg、肉制品最高30mg/ kg，其他食品均小于10mg/kg，而燕窩的限量規(guī)定是30 mg/kg。燕窩為雨燕科動物金絲燕及多種同屬燕類用唾液與絨羽等混合凝結所筑成的巢窩，形似元寶，窩外壁由橫條密集的絲狀物堆壘成不規(guī)則棱狀突起，窩內(nèi)壁由絲狀物織成不規(guī)則網(wǎng)狀，窩碗根卻堅實，兩端有小墜角，一般直徑6-7厘米，深3-4厘米。主要產(chǎn)于我國南海諸島及東南亞各國。燕窩因采集時間不同可分為三種。1.白燕金絲燕為產(chǎn)卵育雛做的第一個窩，完全用唾液組成。雪白透明，個大壁厚，漲發(fā)率高，為燕窩上品，古代曾列為貢品，故又稱宮燕。2.毛燕金絲燕做的第二個窩，由于唾液已消耗較多，金絲燕只好用身上的絨毛和唾液筑窩。窩壁里夾雜著較多的黑毛，品質(zhì)較次。3.血燕金絲燕做的第三個窩，此時唾液幾乎耗盡，只好用剛吃進去的，未及消化的小魚、海藻做窩。窩中雜著血絲，個小壁薄，毛多，質(zhì)地最差。燕窩的營養(yǎng)較高，其主要成分是人體必需的多種高級蛋白質(zhì)，含氮物質(zhì)、膳食纖維、礦物質(zhì)，維生素及獨特的表皮生長因子，具很好的滋補養(yǎng)生作用。燕窩營養(yǎng)分析燕窩含促進細胞分裂的激素和表皮生長因子，能促進細胞再生，增強免疫能力，增加身體對X光及其他放射線損害的抵御能力，燕窩獨特的蛋白質(zhì)成分和大量生物活性分子有助人體組織生長發(fā)育，病后復原，可以養(yǎng)陰，潤燥、養(yǎng)顏、延緩衰老，并且清虛熱，治虛損，對咯血吐血、久咳痰喘，陰虛發(fā)熱等導致津液脫失的病癥有良好效果。燕窩以碗大壁厚，根腳小，羽毛少，棱條粗狀，色澤白而有澤為上品。作為中國人的傳統(tǒng)保健品，燕窩(尤其是血燕)價格高昂，然而，卻潛伏著重大安全隱患。如浙江省工商局2011年8月15日召開的新聞發(fā)布會宣布，抽檢發(fā)現(xiàn)，燕窩市場中血燕的亞硝酸鹽含量嚴重超標，問題血燕產(chǎn)品多達3萬多盞，含量最高達11000毫克/千克。 據(jù)悉，這些血燕產(chǎn)品主要進口自馬來西亞等國家。廣東檢驗檢疫局“燕窩及其制品的真假鑒別方法研究”項目課題組近年來也從一些所謂“血燕”、“黃燕”等染色燕窩中檢出高濃度的亞硝酸鹽，有的含量甚至達到幾千毫克/公斤。而香港科大抽查市面47款燕窩樣本，發(fā)現(xiàn)全部含防腐劑亞硝酸鹽，最嚴重的一個血燕樣本每公斤含6400毫克亞硝酸鹽，較香港肉食亞硝酸鹽含量標準高出31倍。由此可見燕窩行業(yè)“亞硝酸鹽”含量超標問題的嚴重性。目前我國燕窩產(chǎn)品質(zhì)量標準仍為空白，燕窩產(chǎn)品中亞硝酸鹽含量標準也為空白。 國際上一般參照燕窩主產(chǎn)國之一馬來西亞標準(馬來西亞食用燕窩(EBN)標準指南MS 2334:2010)，其限量標準為亞硝酸鹽最高30mg/kg。目前，檢測燕窩制品中亞硝酸鹽的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC-MS)、離子色譜法(IC)、毛細管電泳法(CE)、分光光度法(spectrophotometry)等。 如安徽亳州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所黃艷梅等成功采用碳酸根體系等度淋洗，利用離子色譜陰離子分析柱對燕窩中亞硝酸鹽進行分離測定，以保留時間定性，標準曲線峰面積定量，22 分鐘同時完成8種陰離子的測定，取得較好的效果。作者還進行比對試驗，結果表明離子色譜法與分光光度法測定結果基本一致。浙江省臺州市食品藥品檢驗所的李兆奎等應用紫外分光光度法，以亞硝酸鈉為標準溶液的標準曲線法測定燕窩樣品中亞硝酸鹽的含量，檢測波長為538nm。結果亞硝酸鹽的線性范圍為0 10. 0 μ g，回歸方程Y=O. 0636x+0. 0032， r=0. 9993，平均加樣回收率 97. 7%, RSD=2. 0%(n=5)。HPLC法、GC-MS法、離子色譜法(IC)及CE法等方法檢測燕窩制品中亞硝酸鹽，優(yōu)點是檢測精確度高，但缺點是檢測時間長，操作復雜，需配置較貴重儀器，甚至還需配備各種型號的昂貴色譜柱，對操作人員也有一定要求，一些儀器還需專人及特定環(huán)境維護，檢測成本昂貴。而分光光度法同樣需要配置專門儀器及具有一定經(jīng)驗的操作人員，因而不容易推廣。目前，國際上日益重視應用格里斯(Griess)比色法來檢測食品中亞硝酸鹽含量該方法亞硝酸鹽方法檢出限為1 mg/kg，樣品經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后，在弱酸性條件下， 亞硝酸根與對氨基苯磺酸重氮化后，再與N - 1萘基乙二胺偶合形成紅色染料，即測得亞硝酸鹽含量。國內(nèi)外學者應用該方法做了大量嘗試，渤海大學生物與食品科學學院、錦州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所劉巖等開展了香腸類肉制品中亞硝酸鹽的快速檢測法，該快速檢測法的檢測結果與常規(guī)法相比，雖然存在誤差，但對香腸類肉制品中亞硝酸鹽含量的定性和半定量分析的結果是令人滿意的。韓山師范學院的鄭曉宏等通過實驗確定了微孔板式亞硝酸鹽試劑盒中顯色劑的混合比例(對氨基苯磺酸鹽酸萘乙二胺=1 1)及用量(0. 06mL，相對于微孔板的體積)。研制出一種利用微孔板快速檢測多個樣品中亞硝酸鹽含量的新儀器，具有使用試劑量少，污染小，檢出限低，靈敏度較高，操作簡單，方便攜帶等優(yōu)點，可用于火腿中亞硝酸鹽的測定。廣州康利有限公司等單位則推出了水質(zhì)亞硝酸鹽測定試劑盒，可測定礦泉水、地表水、地下水、生活污水、工業(yè)廢水、食品等樣品中亞硝酸鹽含量。北京六角體科技發(fā)展有限公司則開展了牛奶中亞硝酸鹽快速檢測試劑盒的商用開發(fā)，英國的Aquarium公司及美國的(iatwick Koi公司等也相繼推出了水池水樣中或腌制品中亞硝酸鹽含量測試試劑盒產(chǎn)
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但燕窩組成與其它普通食品或水樣有顯著差異，燕窩中除蛋白質(zhì)外，還有含氮物質(zhì)、膳食纖維及礦物質(zhì)等組分，樣品前處理及檢測步驟相對特殊，不可能照搬水樣、牛奶或火腿中亞硝酸鹽檢測方法及試劑盒，而且由于燕窩較其它食品價格相對昂貴的多，因而取樣應盡可能少，本試劑盒采用大孔樹脂富集亞硝酸鹽組成，盡可能減小燕窩樣品的消耗，并提高測定準確度。但目前尚未見專門快速檢測燕窩中亞硝酸鹽含量的試劑盒產(chǎn)品，相關檢測技術仍很薄弱。國內(nèi)針對燕窩中亞硝酸鹽的快速檢測方法及試劑盒產(chǎn)品更是空白。而燕窩作為我國的傳統(tǒng)保健品，每年需求量很大，其中潛伏的亞硝酸鹽危害也很大。因此，研制專門針對燕窩制品中亞硝酸鹽含量的快速檢測方法具有重要的經(jīng)濟和社會意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測燕窩中亞硝酸鹽的試劑盒。本發(fā)明的快速檢測燕窩中亞硝酸鹽的試劑盒，包括盒體和試劑，其中盒體內(nèi)置海綿支架，海綿支架上有孔和凹槽，裝有Griess溶液A即檢測液A的棕色試劑瓶、裝有Griess 溶液B即檢測液B的棕色試劑瓶、裝有蛋白質(zhì)沉淀劑即檢測液C的棕色試劑瓶安插在海綿支架的孔中，玻璃樣品杯、滴管、透明玻璃比色管、透明玻璃亞硝酸鹽富集柱放于海綿支架的凹槽中，用黑色塑料袋封好的比色卡置于盒體中。所述的檢測液A是對氨基苯磺酸的水和冰乙酸溶液，檢測液B是N-I-萘基乙二胺溶液乙酸溶液，檢測液C是硫酸鈉飽和溶液和飽和硼砂溶液的混合液，檢測液A、檢測液B 和檢測液C均置棕色試劑瓶中。本發(fā)明優(yōu)選檢測液A是按照4 g對氨基苯磺酸溶于700 mL水和300 mL冰乙酸中的比例配制而成；檢測液B是按照0.1 g N-I-萘基乙二胺加100 mL 60%乙酸的比例溶解而成；檢測液C是按照硫酸鈉飽和溶液和硼砂飽和溶液=32 :68 ml/ ml混合而成。將檢測液A與檢測液B等體積混合，即可制備得到Griess試劑。本發(fā)明中，透明玻璃亞硝酸鹽富集柱底部安置砂芯濾板，柱中的填料選自國產(chǎn) D201大孔樹脂、美國Amberlite IRA-900樹脂或德國Lewatit MP-500樹脂，填料充填量為 2. 0-3. 0 克，
本發(fā)明提供的比色卡上建立由淺至深的色標，并標注對應的亞硝酸鈉含量依次為0. 1、 0. 25、0· 5、1· 0、3· 0、5· 0、7· 0、9· 0、11· 0、13· 0、15· 0、17· 0、20· 0、21· 0、23· 0、25· 0、27· 0、 30.0、50. 0、100· 0、200· 0、380. 0 mg/kg。比色卡的制備方法，包括下述過程預先配置不同濃度的亞硝酸鈉標準溶液，各吸取上述溶液依次滴加在白色卡片紙上，分別滴加對氨基苯磺酸和N-I-萘基乙二胺溶液，使其反應并呈現(xiàn)深淺不同的顏色，標注各顏色對應的亞硝酸鹽濃度后，將此卡片塑封，即為比色卡；或者對此卡片拍照印制再過塑成為比色卡。在實際應用上，本發(fā)明的試劑盒的盒體可選用ABS、PVC、PE、PP等材質(zhì)，滴管選用玻璃材質(zhì)，也可以用一次性塑料滴管替代，
本發(fā)明的另一目的是提供快速檢測燕窩中亞硝酸鹽的試劑盒在燕窩檢測中的應用。該試劑盒，可以應用于檢測食品中亞硝酸鹽含量。該試劑盒在燕窩檢測中的應用的步驟如下(1)、將燕窩樣品搗碎研磨，隨后稱取0.1-0. 2克于玻璃樣品杯中，加入5-7毫升蒸餾水或純凈水，加入1. 0-2 ml檢測液C，攪拌均勻，靜置10-15分鐘，取上清液；
(2)、用滴管取2-3ml上清液至透明玻璃比色管，用滴管滴加等體積的檢測液A和檢測液B各3-4滴，得混合溶液；
(3)、往透明玻璃亞硝酸鹽富集柱中滴入2-3ml蒸餾水或純凈水，再將步驟(2)中的混合溶液倒入該玻璃富集柱中，10-15分鐘后，將該玻璃富集柱中的液體放入到玻璃樣品比色管中，對著自然光觀察，并與比色卡上的顏色比較；
(4)、如果玻璃樣品比色管中的顏色與比色卡某一色標一致，則表明該燕窩樣品的亞硝酸鹽含量與對應該色標所標示的亞硝酸鹽含量一致；如果比比色卡上某一色標深，但比鄰近的某一色標淺，則該燕窩樣品亞硝酸含量在這兩個色標對應的亞硝酸鹽含量之間。在實際檢測中，需要注意如下事項 1、燕窩樣品取樣量盡量準確；
2、取樣時，應取燕窩樣品中有代表性的部分； 3、對檢測超標的樣品應重復檢測一次再確定；
3、一般以填充2.0-3. 5克大孔樹脂為宜，大孔樹脂可活化后循環(huán)使用；
4、根據(jù)馬來西亞食用燕窩(EBN)標準指南MS2334:2010)，燕窩亞硝酸鹽最高30mg/ kg，判斷時應注意限量標準；
5、實驗用水最好采用蒸餾水，若沒有，則用去離子水或礦泉水替代； 6、使用后的玻璃比色管要及時用水沖洗多遍，再用蒸餾水洗凈，晾干備用； 7、若亞硝酸鹽含量超過最大色標，可用蒸餾水沖稀一定倍數(shù)，再按上述方法測試，最后進行結果換算。大孔樹脂活化的方法是將已使用過的樹脂取出，用水洗至流出清水后，用5%鹽酸浸泡4-8小時后，用水洗至pH 6，再用2-4% NaOH浸泡4_8小時，用水洗至pH 7_9，待用。本發(fā)明提供的試劑盒及檢測亞硝酸鹽的方法也適用于火腿、罐頭、腌制品等食品中亞硝酸鹽的檢測。該試劑盒基于國標GB/T5009. 33-2003《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定方法》等標準開發(fā)的一種快速檢測試劑盒，其開發(fā)原理是采用大孔樹脂富集亞硝酸鹽后，再應用改進型格里斯(Griess)比色法對燕窩中的亞硝酸鹽含量進行快速準確的測定。即在弱酸條件下亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，再與N — 1 一萘基乙二胺偶合形成紫紅色染料，與比色卡比較定量，并盡簡化前處理，提高檢測精度。而比色法原理是在相同條件下，預先配置標準溶液，按照溶液濃度與色階的對應程度，制成比色卡。取待測樣品溶液的有色溶液， 將其顏色與比色卡上的色階進行比較，用目測法即可判斷出待測樣品溶液的濃度。改進型格里斯(Griess)比色法中，反應原理如下式
權利要求
1.快速檢測燕窩中亞硝酸鹽的試劑盒，包括盒體和試劑，其特征在于盒體內(nèi)置海綿支架，海綿支架上有孔和凹槽，裝有Griess溶液A即檢測液A的棕色試劑瓶、裝有Griess 溶液B即檢測液B的棕色試劑瓶、裝有蛋白質(zhì)沉淀劑即檢測液C的棕色試劑瓶安插在海綿支架的孔中，玻璃樣品杯、滴管、透明玻璃比色管、透明玻璃亞硝酸鹽富集柱放于海綿支架的凹槽中，用黑色塑料袋封好的比色卡置于盒體中。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于檢測液A是對氨基苯磺酸的水和冰乙酸溶液，檢測液B是N-I-萘基乙二胺溶液乙酸溶液，檢測液C是硫酸鈉飽和溶液和飽和硼砂溶液的混合液，檢測液A、檢測液B和檢測液C均置棕色試劑瓶中。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于檢測液A是按照4g對氨基苯磺酸溶于700 mL水和300 mL冰乙酸中的比例配制而成；檢測液B是按照0. 1 g N-I-萘基乙二胺加100 mL 60%乙酸的比例溶解而成；檢測液C是按照硫酸鈉飽和溶液和硼砂飽和溶液=32 68 ml/ ml混合而成。
4.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于透明玻璃亞硝酸鹽富集柱底部安置砂芯濾板，柱中的填料選自國產(chǎn)D201大孔樹脂、美國Amberlite IRA-900樹脂或德國Lewatit MP-500樹脂，填料充填量為2. 0-3. 0克。
5.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于比色卡上建立由淺至深的色標，并標注對應的亞硝酸鈉含量依次為 0. 1,0. 25,0. 5,1. 0,3. 0,5. 0,7. 0,9. 0,11. 0,13. 0,15. 0,17. 0、 20. 0、21· 0、23· 0、25· 0,27. 0,30. 0、50. 0、100· 0、200· 0、380. 0 mg/kg。
6.根據(jù)權利要求1或5所述的試劑盒，其特征在于比色卡的制備方法，包括下述過程預先配置不同濃度的亞硝酸鈉標準溶液，各吸取上述溶液依次滴加在白色卡片紙上，分別滴加對氨基苯磺酸和N-I-萘基乙二胺溶液，使其反應并呈現(xiàn)深淺不同的顏色，標注各顏色對應的亞硝酸鹽濃度后，將此卡片塑封，即為比色卡；或者對此卡片拍照印制再過塑成為比色卡。
7.權利要求1所述的試劑盒，在檢測食品中亞硝酸鹽含量的應用。
8.權利要求1所述的試劑盒在燕窩檢測中的應用，，其特征在于步驟如下(1)、將燕窩樣品搗碎研磨，隨后稱取0.1-0. 2克于玻璃樣品杯中，加入5-7毫升蒸餾水或純凈水，加入1. 0-2 ml檢測液C，攪拌均勻，靜置10-15分鐘，取上清液；(2)、用滴管取2-3ml上清液至透明玻璃比色管，再滴管滴加等體積的檢測液A和檢測液B各3-4滴，得混合溶液；(3)、往透明玻璃亞硝酸鹽富集柱中滴入2-3ml蒸餾水或純凈水，再將步驟(2)中的混合溶液倒入該玻璃富集柱中，10-15分鐘后，將該玻璃富集柱中的液體放入到玻璃樣品比色管中，對著自然光觀察，并與比色卡上的顏色比較；(4)、如果玻璃樣品比色管中的顏色與比色卡某一色標一致，則表明該燕窩樣品的亞硝酸鹽含量與對應該色標所標示的亞硝酸鹽含量一致；如果比比色卡上某一色標深，但比鄰近的某一色標淺，則該燕窩樣品亞硝酸含量在這兩個色標對應的亞硝酸鹽含量之間。
全文摘要
本發(fā)明的快速檢測燕窩中亞硝酸鹽的試劑盒，包括盒體和試劑，其中盒體內(nèi)置海綿支架，海綿支架上有孔和凹槽，裝有Griess溶液A即檢測液A的棕色試劑瓶、裝有Griess溶液B即檢測液B的棕色試劑瓶、裝有蛋白質(zhì)沉淀劑即檢測液C的棕色試劑瓶安插在海綿支架的孔中，玻璃樣品杯、滴管、透明玻璃比色管、透明玻璃亞硝酸鹽富集柱放于海綿支架的凹槽中，用黑色塑料袋封好的比色卡置于盒體中。該試劑盒可以應用于檢測食品特別是燕窩中亞硝酸鹽含量。本發(fā)明所述試劑盒及其用于燕窩檢測時具有取樣少、檢測限低、檢測范圍寬、樣品前處理簡單等特點。
文檔編號G01N21/78GK102507564SQ20111037110
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月21日 優(yōu)先權日2011年11月21日
發(fā)明者程金生 申請人:程金生