專利名稱：：一種舒肝解郁的中藥組合物制劑及質量控制方法
技術領域：
：本發明涉及一種中藥組合物制劑及質量控制方法，特別涉及一種舒肝解郁，安神定志的中藥組合物制劑及其質量控制方法。
背景技術：
：抑郁癥以心煩，焦慮、失眠、健忘為典型癥狀。抑郁癥嚴重困擾患者的生活和工作，給家庭和社會帶來沉重的負擔。世界衛生組織、世界銀行和哈佛大學的一項聯合研究表明抑郁癥已經成為中國疾病負擔的第二大疾病。目前，抑郁癥的臨床治療藥物普遍存在副作用，而傳統中藥在治療疾病時具有副作用低的特點，因此用中藥來治療抑郁癥已經成為了一個新的治療思路。由梔子(炒)、白術(炒)、柴胡、大棗、石菖蒲等十六味中藥組合而成的本發明組合物顆粒劑作為舒肝解郁，安神定志的中藥，效果甚佳。
發明內容本發明第一個目的在于提供一種舒肝解郁，安神定志的中藥組合物；本發明的第二個目的在于提供該中藥組合物的制備方法；本發明的第三個目的在于提供該中藥組合物制劑的質量控制方法。本發明目的是通過如下技術方案實現的本發明一種舒肝解郁，安神定志的中藥組合物制劑的原料組成為柴胡20-60重量份、大棗10-50重量份、石菖蒲20-60重量份、半夏(制)10_50重量份、白術(炒)10—50重量份、浮小麥80-120重量份、遠志(制)20-60重量份、甘草(炎)10-50重量份、梔子(炒)20-60重量份、百合80-120重量份、膽南星20-60重量份、郁金20-60重量份、龍齒80-120重量份、酸棗仁(炒)30-70重量份、茯苳30-70重量份、當歸10-50重量份。本發明一種舒肝解郁，安神定志的中藥組合物制劑的原料組成優選為柴胡40重量份、大棗30重量份、石菖蒲40重量份、半夏(制)30重量份、白術(炒)30重量份、浮小麥100重量份、遠志(制)40重量份、甘草(炙)30重量份、梔子(炒)40重量份、百合100重量份、膽南星40重量份、郁金40重量份、龍齒100重量份、酸棗仁(炒)50重量份、茯苓50重量份、當歸30重量份。上述中藥組合物的制備方法為以上十六味藥材，加水煎煮1-5次，每次1-5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至干，粉碎，加入常規輔料，按照常規工藝，制成臨床或藥學上可接受的劑型，包括但不限于片劑、膠囊齊u、散齊u、軟膠囊齊u、滴丸、蜜丸、丸齊u、顆粒齊u、蜜煉膏齊u、緩釋制齊u、速釋制齊u、控釋制劑、口服液體制劑。本發明公開了一種舒肝解郁，安神定志的中藥組合物制劑的質量控制方法，該方法包括如下含量測定和/或鑒別中的一種或多種A、含量測定色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以5-25:75-85比例的乙腈-水為流動相；檢測波長為210-250nm;對照品溶液的制備精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每lml含6-39yg的溶液，作為對照品溶液；供試品溶液的制備取中藥組合物制劑適量，研細，取約0.2-1.2g，精密稱定，精密加甲醇、乙醇、水中的一種或一種以上的混合溶劑12.5-100ml，稱定重量，超聲處理15-45分鐘，放冷，用相應溶劑補足減失的重量，搖勻，用0.2-0.45iim的濾膜濾過，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2-12iU，注入液相色譜儀，測定；鑒別B:取中藥組合物制劑10-40g加水5-80ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一種或一種以上的混合溶劑輕輕振搖提取3-5次，每次20-80ml，合并有機溶液層，水浴濃縮至約0.5-2ml，作為供試品溶液；另取白術對照藥材0.5-2g加水20-80ml的水煎煮15-45分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一種或一種以上的混合溶劑輕輕振搖提取l-3次，每次10-40ml，合并醚層，水浴濃縮至約0.5-2ml，作為白術對照藥材溶液.吸取上述兩種溶液各105-50y1點于同一硅膠G板上，以5-15:l-2比例的石油醚(609(TC)-醋酸乙酯混合溶劑為展開劑，展開，取出，涼干，噴以5-20%的硫酸乙醇溶液，95-12(TC烘烤2-20分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察，供試品色譜中在與白術對照藥材的相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點；鑒別C:取中藥組合物制劑10-40g，加無水乙醇、甲醇、乙醇中的一種或一種以上的混合溶劑10-100ml，超聲處理15-45分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇0.5_2ml，作為供試品溶液；另取梔子苷對照品，制成每lml無水乙醇、甲醇、乙醇中的一種或一種以上的的混合溶劑含0.2-2mg對照品的溶液，作為對照品溶液；吸取供試品溶液5-25iU、對照品溶液l-i5yi分別點于同一硅膠G薄層板上，以(io-i:i-3:i:i)為體積比例的醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水混合溶劑為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以1-10%香草醛濃硫酸溶液，95-12(TC加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。上述質量控制方法優選包括如下含量測定和/或鑒別中的一種或多種含量測定色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(15:85)為流動相；檢測波長為238nm;對照品溶液的制備精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每lml含0.03mg的溶液，作為對照品溶液；供試品溶液的制備取中藥組合物制劑，研細，取約1.Og，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45ym的濾膜濾過，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10iU，注入液相色譜儀，測定；鑒別方法白術薄層鑒別取中藥組合物制劑20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液。另取白術對照藥材lg加水40ml煎煮30分鐘，放冷，上清夜用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液.吸取上述兩種溶液各30iU點于同一硅膠G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以io^的硫酸乙醇溶液，i05t:烘烤io分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察，供試品色譜中在與白術對照藥材的相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點。梔子薄層鑒別取中藥組合物制劑20g，加無水乙醇50ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml溶解，作為供試品溶液。另取梔子苷對照品，制成每lml乙醇含lmg對照品的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液15ii1、對照品溶液5ii1分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以5^香草醛濃硫酸溶液，11(TC加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。上述質量控制方法中藥組合物制劑優選原料組成為柴胡40重量份、大棗30重量份、石菖蒲40重量份、半夏(制)30重量份、白術(炒)30重量份、浮小麥100重量份、遠志(制)40重量份、甘草(炙)30重量份、梔子(炒)40重量份、百合100重量份、膽南星40重量份、郁金40重量份、龍齒100重量份、酸棗仁(炒)50重量份、茯苓50重量份、當歸30重量份的顆粒劑，并通過如下方法制備以上十六味，加水煎煮三次，第一次3小時，第二、三次各2小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至干，粉碎，加入蔗糖適量，制成顆粒，干燥，制成顆粒劑。圖1:光譜圖(a-梔子苷對照品b-本發明組合物顆粒劑供試品c-梔子對照藥材d-梔子陰性對照品)圖2:色譜圖(a-梔子苷對照品、b-本發明組合物顆粒劑供試品、c-梔子陰性對照品、d-梔子對照藥材、l-梔子苷對照品)圖3:梔子苷標準曲線本發明組合物顆粒劑對抑郁模型大鼠游泳絕望行為有明顯的對抗作用，使逃避電擊的潛伏期明顯縮短，絕望狀態顯著減輕。本發明具有很好的抗抑郁的效果。經實驗證明本發明含量測定方法檢測專屬性好、穩定性高、重現性好、精密度高，更加適合工業化的生產，真正確保了臨床用藥的安全、有效、可靠。下面實驗例和實施例用于進一步說明但不限于本發明。本發明所有實驗例所選用的制劑均為根據本發明實施例1制得的本發明顆粒劑，但是本發明實驗結果并不僅限于該顆粒劑。實驗例1:藥效學實驗1、對多種不良剌激致抑郁癥模型大鼠的影響實驗方法SD大鼠67只，雌性，體重175210g，按體重分為5組。實驗前將大鼠單個置于盛有2/3自來水的塑料桶內(桶高42cm，<30cm，水溫19°C)，游泳15min訓練1次并熟悉環境。然后按表1所示劑量每天上午灌胃給藥1次，按下列順序給予不良剌激禁食不禁水48h(2d)-電擊5min(36V，10mA，上下午各1次)(ld)-禁水不禁食24h(ld)-冰水游泳5min(ld)-夾尾懸吊5min(ld)，完成1輪剌激共6d。恢復ld，第7d稱體重后，每籠2只(個別3只)飼養，禁食，并喂以1%蔗糖水溶液，測定2處蔗糖水飲用量(獎賞反應)。第8d恢復正常供食和供水，第9d開始同樣方法第二輪剌激。完成第2輪剌激后同法測定蔗糖水飲用量。并連續2d給藥后30min，將小鼠置于水桶內，lmin后開始記時，并用秒表記錄5min內大鼠累計漂浮在水面上不動的時間。經多種不良剌激聯合作用后大鼠體重增長速度明顯下降，一般狀態略差，活動減少，在第1輪剌激的7d中體重增長只有正常的一半左右，第2輪剌激的7d中體重增長約為正常組的2/3，給藥組大鼠的體重在第1輪剌激中和對照組相比有增加的趨勢，至第2輪剌激完成后給藥組大鼠的體重明顯比對照組高。大鼠在剛放入水桶中試圖逃逸，經多次努力失敗后出現絕望行為，表現為靜止不動地漂浮在水面，靜止不動時間長短可以代表大鼠絕望(抑郁)的程度。抑郁模型組大鼠的游泳不動時間比正常對照組大鼠明顯增加，本發明組合物顆粒劑對抑郁模型大鼠游泳絕望行為有明顯的對抗作用。在連續2次的測試中均使游泳不動時間明顯縮短，大劑量組第1次和第2次測試游泳不動時間分別降低50%和45%，中小劑量組也明顯縮短游泳不動時間，劑量關系明確，見表l。糖水飲用量反映動物對獎賞的反應程度，抑郁癥的模型動物對獎賞的反應性下降，糖水飲用量顯著降低。本實驗中模型大鼠的飲水量在經過第1輪和第2輪剌激后僅為正常組的71%和59%。本發明組合物顆粒劑可以明顯增加動物的糖水飲用量，提高對獎賞的反應，并有一定的劑量關系，見表1。2、對小鼠電擊絕望狀態的影響實驗方法ICR小鼠80只，雌性，體重1821g，按體重分成6組。按表2劑量每天灌胃給藥1次，第3次給藥后將小鼠(除第l組外)置電激怒箱內，調節電壓36V，電流0.7mA，波寬10ms，頻率20Hz，電擊5min，連續電剌激3d形成暫時的抑郁模型。在第6d調電壓24v，電流0.4mA，其余參數和訓練時一致，并在電激怒箱放1±央4X4X3cm的小木塊。給藥后30min將小鼠放入電激怒箱內，立即給予電剌激，記錄小鼠從電擊開始到跳到(逃避)小木塊上時間。第2d同樣方法再測試1次。小鼠連續3d接受不能逃避的電擊后，在隨后可逃避的電擊條件下也失去了逃避的能力，形成獲得性無助狀態，逃避電擊潛伏期明顯延遲。本發明組合物顆粒劑使逃避電擊的潛伏期明顯縮短，絕望狀態顯著減輕。見表2。與模型組比較*P<0.05，**P<0.01;正常組比較#P<0.05，抑P<0.013、對阿撲嗎啡致小鼠強迫嗜咬的影響實驗方法ICR小鼠78只，雄性，體重2023g，按體重分為5組，按表3劑量給藥。在第5d灌胃給藥后30min尾靜脈注射鹽酸阿撲嗎啡10mg/kg(0.lml/10g體重)，并立即將小鼠置于鋪有皺紙(8K復印紙，皺褶高約lcm)的塑料籠內，每籠3只，lh后取出皺紙，測量皺褶邊緣破損的長度，計算紙上被咬上小孔數量。并將每cm破損長度折算成IO孔，合并計算每鼠嗜咬孔數。大劑量的阿撲嗎啡引起哺乳動物如人和狗嘔吐反應，但不誘導嚙齒類動物嘔吐，而是引起強迫嗜咬行為，這和它對中樞多巴胺能神經元的剌激有關。一些抗抑郁藥物能增強阿撲嗎啡致小鼠強迫嗜咬行為。在本實驗中，本發明組合物顆粒劑不同劑量均能明顯增強阿8際邁，爲澳溫離卿，組別劑量(g/kg)動物數電擊逃避潛伏期(s)1輪刺激后2輪剌激后正常對照組106.6±1.85.4±i.5模型對照組1434.5±10.8##23.5±9.1##萬拉法新組(陽性藥)60mg/kg1423.3±8.7"15.0±4.9**本發明組合物顆粒劑(小)0.91424.6±11.5*19.0±6.3本發明組合物顆粒劑(中)1.81420.5±7.5**15.0±3.4*本發明組合物顆粒劑(大)2.71419.2土8.8"14.9±7.(T表1發明組合物顆粒劑對抑郁模型大鼠游泳絕望狀態和對獎賞反應的影響組別劑量動物數5min內不動時間(min)飲水量(ml/只"—1)(g/kg)(籠數)1輪刺激后2輪刺激后1輪刺激后2輪刺激后正常對照組11(5)2.01±0.662.45±0.5736.4±7.4肌2±6.7模型對照組12(6)2.56±0.7431.3士0.57s25.7±8.Is23.7±6.4"萬拉法新組(陽性藥)60mg/kg11(5)1.74±0.77*2.03±0.7(T33.7±8.332.4±6:1*本發明組合物顆粒劑(小)0.911(5)2.02±0.952.31±0.7132.6±5.430,1±4.4本發明組合物顆粒劑(中)1.811(5)1.63±0.91*2.02±0.64**30.4±4.232.6±5.9'本發明組合物顆粒劑(大)2.711(5)1.28±0.88"1.73±0,73"3.18±6.034.3±3.9*'a:括弧內為測飲水量時每組內的籠數；與模型組比較承P〈0.05,林P〈0.01;正常組比較共P〈0.05，##P<0.01表2本發明組合物顆粒劑對小鼠電擊絕望狀態的影響CN101773641As廿，t0044u^^丑f^f婢s^i!遄際疏爲4&,絲a:沐執〔0045u謝3抖沐S降^遂暨簿逢X嘗SJ^^丑，毀、J:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與模型組比較*P<0.05，**P<0.014、對大鼠長期隔離飼養引起的攻擊行為的影響實驗方法SD大鼠30只，雄性，體重150180g，在塑料籠內(30X16cm)單籠飼養，自由進食和飲水，連續飼養3個月后，在每籠內放1只雄性小鼠，觀測大鼠對小鼠的攻擊行為(銜叼、撕咬)和結果(殺死)。挑選有明顯攻擊行為或能將小鼠殺死的大鼠18只，繼續飼養lw，同法測定大鼠的攻擊性，然后每天在每籠加含本發明組合物顆粒劑80g/kg(每lkg飼料中拌入浸膏12g)的飼料20g，按400g體重計算相當于4g/kg生藥。在下午俟含藥飼料被吃完后再添加正常飼料，連續3w，在給藥第7d、14d、21d同樣方法測定大鼠的攻擊行為，然后改為常規飼料繼續飼養2w，每周測定大鼠攻擊性1次。大鼠長期單獨隔離飼養，會形成明顯的抑郁癥狀，表現為進攻性。給予本發明組合物顆粒劑后動物的攻擊行為逐漸減少，第2w、3w攻擊行為比給藥前顯著降低，程度減輕。在停止給藥后攻擊行為又逐漸增加。結果見表4。表4本發明組合物顆粒劑對隔離喂養大鼠攻擊行為的影響(出現反應的動物數)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>與給藥前比較**P<0.01，微P<0.001;與給藥3w比較#P<0.05實驗例2:梔子苷含量測定方法實驗1、測定方法的選擇根據文獻報道，梔子的含量測定方法有薄層色譜_紫外分光光度法，薄層色譜掃描法，高效液相色譜法等。本實驗采用高效液相色譜法測定梔子苷含量，分析速度快，靈敏度高，專屬性強，應用范圍廣，重現性與準確性均優于薄層色譜_紫外分光光度法、薄層色譜掃描法。2、檢測波長的選擇通過梔子苷、本發明組合物顆粒劑、梔子藥材、缺梔子陰性對照溶液的全波長掃描光譜比較可以看出梔子苷在238nm處有紫外最大吸收，且在238nm下梔子苷峰形對稱，梔子陰性對照溶液無干擾。故選擇該波長為檢測波長。結果見圖l。3、流動相的優選本發明曾以乙腈_水，甲醇_水、甲醇_磷酸水等系統作為流動相作了系列比較。結果表明，采用乙睛-水(15:85)作為流動相，在該色譜條件下，桅子苷峰峰形及分離度較好，梔子苷峰與之相鄰峰的分離度不低于2.0。梔子苷的保留時間約為14.7min，梔子苷與供試溶液中其它組分達到基線分離，陰性對照液溶液圖譜在梔子苷峰位置無吸收峰，陰性對照無干擾。結果見圖24、色譜柱考察為了保證色譜條件的廣泛適用性，考察不同品牌色譜柱對梔子苷的分離，試驗結果表明DiamonsilC18(5iim，250mmX4.6mm)、AgilentZORBAXExtend-C18(5iim，250mmX4.6mm)、AgilentZORBAXEclipseXDB(5iim，250mmX4.6mm)均對梔子苷有良好的分離。5、本發明組合物顆粒劑中梔子苷提取條件的考察為了確保測定結果真實、準確，本發明通過一系列考察，確保制備供試品溶液時將本發明組合物顆粒劑中的梔子苷提取完全。5.1提取溶劑的選擇根據梔子苷的理化性質，選擇甲醇、乙醇、50%甲醇進行考察，確定提取本發明組合物顆粒劑中梔子苷的最優溶劑取本發明組合物顆粒劑適量，研細，取約1.Og樣品三份，精密稱定，分別精密加甲醇、乙醇、50%甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷后用相應提取溶劑補足減失的重量，搖勻，0.45iim的濾膜過濾，取續濾液，即得。精密吸取上述3種供試品溶液10iiL注入液相色譜儀，結果見表5。表5不同提取溶劑的梔子苷提取率比較提取溶劑50%甲醇甲醇乙醇樣品稱樣量(g)1.01211.02311.0012峰面積422.16432.16382.16峰面積/樣品稱樣量417.11422.40381.70通過選用不同溶劑提取本發明組合物顆粒劑中梔子苷的含量，試驗結果表明甲醇較乙醇提取率高；雖然50%甲醇與甲醇提取率相近，但50%甲醇提取水溶性雜質較多，延長了色譜分離的時間，所以最終選擇甲醇作為提取溶劑。5.2提取方法的選擇中藥制劑常用的提取方法有超聲波提取法、回流提取法、冷浸法。通過試驗優選提取本發明組合物顆粒劑中梔子苷的最佳提取方法。方法一回流法提取取本發明組合物顆粒劑適量，研細，取約1.0g樣品，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，回流處理30分鐘，放冷后用甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45iim的濾膜過濾，取續濾液，即得。方法二超聲法提取取本發明組合物顆粒劑適量，研細，取約1.0g樣品，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷后用甲醇補足減失的重量，搖勻，O.45iim的濾膜過濾，取續濾液，即得。方法三冷浸法提取取本發明組合物顆粒劑約l.Og，研細，取約l.Og樣品，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，冷浸過夜，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45m的濾膜過濾，取續濾液，即得。精密吸取上述3種供試品溶液10L注入液相色譜儀，結果見表6。表6不同方法提取法提取梔子苷提取率的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>通過三種不同提取方法的比較發現超聲法、回流法提取梔子苷的效率較冷浸高。超聲法較回流法操作簡單，所以選擇超聲法提取本發明組合物顆粒劑中梔子苷。5.3提取溶劑量考察溶劑量是影響提取效率的一個很重要的影響因素，溶劑量越大，提取效率越高，但是溶劑量增加到一定量以后，提取效率增加不大。所以我們對提取的溶劑量加以考察取本發明組合物顆粒劑適量，研細，取約1.0g樣品三份，精密稱定，分別精密加甲醇12.5ml、25ml、50ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷后用甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45m的濾膜過濾，取續濾液，即得。分別精密吸取上述3個供試品溶液5iiL、10iiL、20iiL注入液相色譜儀，結果見表7。表7不同提取溶劑量提取梔子苷提取率的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>試驗結果表明，25mL甲醇即可將本發明組合物顆粒劑中梔子苷基本提取完全。5.4提取時間的考察提取時間對提取效率影響較大，提取時間短，提取效率不高，延長提取時間可以增加提取效率，但過長時間的提取耗時，而且對提高提取效率增加作用不大。所以我們對提取時間加以考察取本發明組合物顆粒劑適量，研細，取約1.0g樣品三份，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，分別超聲處理15、30、45分鐘，放冷后用甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45iim的濾膜過濾，取續濾液，即得。精密吸取上述3個供試品溶液10iiL注入液相色譜儀，結果見表8:表8:不同提取時間提取梔子苷提取率的比較提取時間15min30min45min樣品稱樣量(g)1.01221.00931.0062峰面積382.16427.16429.16峰面積/樣品稱樣量377.55423.22426.51由試驗結果可以看出15min提取時間較短所以提取不完全，30min、45min提取率相差不大，表明30min即可將制劑中梔子苷提取完全，所以確定提取本發明組合物顆粒劑中梔子苷的時間為30min。綜上試驗最后確定本發明組合物顆粒劑中梔子苷含量測定的色譜條件及對照品和供試品制備方法為色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈_水(15:85)為流動相；檢測波長為238nm。對照品溶液的制備精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每lml含30iig的溶液，作為對照品溶液。供試品溶液的制備取本品適量，研細，取約1.Og，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45iim的濾頭濾過，即得。實驗例3:梔子苷含量測定方法驗證實驗檢測儀器Agilent1100型高效液相色譜儀進樣器自動進樣器色譜柱安捷倫(ZorbaxC184.6X150mm，5iim)流動相乙腈-水(15:85)流速1.0ml/min檢測波長238nm柱溫室溫對照品來源梔子苷(購于中國藥品生物制品檢定所批號110749-200309)對照品溶液的制備精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每lml含0.03mg的溶液，作為對照品溶液。樣品批號:04012001、04012102、04012203供試品溶液的制備取本發明組合物顆粒劑適量，研細，取約l.Og，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45iim的濾頭濾過，即得。缺梔子空白溶液的制備按本發明組合物顆粒劑制備工藝制備缺梔子的空白樣品，并按供試品溶液的制備方法制備陰性對照液。測定方法分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液各lOiU，注入液相色譜儀，測定。試驗結果表明，對照品和供試品峰形良好，供試品分離良好。在對照品和供試品對應出峰處，陰性無干擾。1、方法學實驗1.l線性關系考察取梔子苷對照品溶液(32.16ug/ml)搖勻，分別精密吸取2、4、6、8、10、12yl注入高效液相色譜儀，測定峰面積并繪制標準曲線，表明梔子苷在0.0643-0.3S59ug間呈線性關系，其回歸方程為Area=1465.218577XAmt+2.1321944(r=0.9999)，數據見表9和附圖3。表9梔子苷標準曲線進樣量(ug)0.064320.128640.192960.257280.32160.38592峰面積94.3501189.9793286.0491383.5734473.5214564.42001.2穩定性實驗制備供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、12、24小時，依法測定，進樣體積10iU，結果表明，其在24小時內基本穩定，結果見表10。表10穩定性實驗時間(hr)02461224峰面積473.5214460.2303470.6952456.8952462.6896472.6592RSD(%)1.51.3精密度實驗精密吸取對照品溶液10iU，重復進樣5次，求得相對標準偏差<2%，結果見表11。表ll精密度實驗14<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1.4重現性實驗取同一批號(批號04012001)樣品5份，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液5份，對每份進行測定，求得相對標準偏差<2%，結果見表12。表12重現性實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>平均含量(mg/袋)3.4214RSD(%)1.61.5回收率實驗精密稱取已知含量的同一批號(批號04012001)的樣品0.5g五份，分別置具塞錐形瓶中，精密量取梔子苷對照品溶液(80.4ug/ml)5ml，按供試品溶液的制備方法操作，測定其含量，并計算其回收率，測定結果見下表13。表13回收率實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2、含量測定對三批樣品進行了含量測定，發明結果見下表14:表14樣品的含量測定<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>根據以上數據，將含量限度定為本品每袋含梔子按梔子苷(C17H2401Q)計，不得少于2.74mg。實驗例4:白術薄層鑒別試驗白術藥材中含有揮發油，為白術的有效成分。白術揮發油中主要含有蒼術酮(atractylone)、白術內酯A、B(butenolideA，B)，另含3_P-乙酰氧基蒼術酮、3-P-羥基蒼術酮等。這類成分為脂溶性成分，極性低，易溶于低級性有機溶劑，如石油醚、氯仿、醋酸乙酯等。本處方藥味較多，成分復雜，本發明中利用薄層色譜檢測白術中的揮發油類成分，以此鑒定制劑中含有白術藥材。1、薄層色譜方法的選擇常見的薄層色譜有硅膠薄層層析、紙層析、聚酰胺薄層層析等。硅膠薄層適用于低極性成分，紙層析適用于大極性成分如多糖類成分，聚酰胺層析適用于含有羥基較多的成分，白術中成分多為揮發性成分，極性較小，所以選擇硅膠層析進行試驗。2、供試品的制備2.1白術有效成分的富集、純化本處方中藥味較多，成份復雜，提取溶劑為水，制劑中含的白術中低極性類成分在處方中所占比例較少，所以需要對制劑中的白術中的低極性成分進行富集、純化。常用低極性有機溶液萃取的方法提取低極性類成分。通過比較未富集、純化的樣品和經過富集、純化的樣品的薄層色譜，確定供試品需富集、純化的必要性方法一未富集、純化的樣品取本發明組合物顆粒劑20g加水40ml溶解，水浴濃縮至最小體積，作為供試品溶液1。方法二經過富集、純化的樣品取本發明組合物顆粒劑20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并石油醚層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液2。取白術對照藥材lg加水40ml，煎煮30分鐘，放冷，上清夜用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液.吸取上述三種溶液，供試品溶液1點樣最大量，供試品溶液2、白術對照藥材溶液點樣30iU點于同一硅膠G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，1051:烘烤IO分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察。供試品溶液1中所含成分復雜，濃縮最小體積為15ml，溶液非常粘稠、混濁，點樣量最大只能為5iU，且未在白術對照藥材相對應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，且雜質很多。供試品溶液2顆濃縮至lml，溶液清澈，無混濁，點樣量可以達到301，經富集、純化后一次點樣所承載的制劑量為未經富集、純化所制成供試品溶液的90倍，在白術對照藥材相對應的位置上顯相同顏色的熒光斑點。斑點位置確定，顯色清晰。大幅提高了白術藥材的檢出率。結果表明制備白術的供試品溶液需要富集、純化。2.2萃取溶劑的選擇萃取低極性類成分常用的有機溶劑為石油醚(6090°C)、氯仿、醋酸乙酯。通過試驗選擇最佳的萃取溶劑。方法一石油醚(6090°C):取本發明組合物顆粒劑20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并石油醚層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液1。方法二氯仿取本發明組合物顆粒劑20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用氯仿輕輕振搖提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并氯仿層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液2。方法三醋酸乙酯取本發明組合物顆粒劑20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用醋酸乙酯輕輕振搖提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并醋酸乙酯層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液3。取白術對照藥材lg加水40ml，煎煮30分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液.吸取上述四種溶液，試品溶液1、2、3、白術對照藥材溶液點樣30ii1點于同一硅膠G板上，以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤IO分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察。供試品1、2色譜中，在白術對照藥材相對應的位置上均顯相同顏色的熒光斑點，但氯仿相比石油醚(6090°C)毒性較大。供試品3雜質較供試品1、2多，在白術對照藥材相對應的位置有其他斑點，對鑒別有干擾。所以選擇石油醚(6090°C)為最佳萃取溶劑。2.3萃取次數的選擇萃取次數越多，樣品的提取率越大，但萃取一定次數以后，提取率增加不大。所以對萃取次數進行優選，選擇最佳的萃取次數。取本發明組合物顆粒劑20g三份，分別加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)輕輕振搖分別提取3次(40ml，40ml，30ml)、4(40ml，40ml，30ml，30ml)、5(40ml，40ml，30ml，30ml，30ml)次合并石油醚層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液1、2、3。取白術對照藥材lg加水40ml，煎煮30分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液.吸取上述四種溶液，試品溶液1、2、3、白術對照藥材溶液點樣30ii1點于同一硅膠G板上，以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤IO分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察。供試品1、2、3在白術對照藥材相對應的位置上均顯相同顏色的熒光斑點，供試品2、3斑點的熒光較供試品1更強烈、更清晰，但供試品2、3的熒光斑點的熒光基本相似，無差17別，表明萃取四次基本可將制劑中的白術成分基本萃取完全。所確定萃取的最佳次數為四次(40ml，40ml，30ml，30ml)。2.4供試品的點樣量薄層色譜的點樣量有一定要求，點樣量較小，斑點不清晰，點樣量太大，增加點樣困難，容易造成過載，斑點拖尾，降低分離度，增加分離的難度。所以需要對供試品濃的點樣量進行考察。取本發明組合物顆粒劑20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并石油醚層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液。取白術對照藥材lg加水40ml，煎煮30分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液。分別吸取供試品溶液10、30、50ii1，白術對照藥材溶液30y1點于同一硅膠G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察。點樣量為10iU的供試品在白術對照藥材相對應的位置上熒光斑點強度較低，不宜觀察；點樣量為30iU的供試品在白術對照藥材相對應的位置上熒光斑點明顯，斑點大小適中，無拖尾，前后無干擾；點樣量為50iU的供試品在白術對照藥材相對應的位置上熒光斑點較大，明顯拖尾，斑點與前后熒光斑點相連，而且點樣時由于點樣次數較多，破壞了硅膠薄層的表面。所以確定供試品的最佳點樣量為30iU。2.5白術對照藥材溶液提取溶劑量、提取時間的考察為了保證對照藥材的陽性對照效果，對照藥材溶液制備時需要與供試品溶液處理過程相同。由于對照藥材僅為一味藥材，且藥材提取量較小，所以對照藥材提取溶劑量、提取時間與供試品有所不同。供試品萃取時選擇40ml水溶解樣品，而且40ml水為提取藥材量(lg)的40倍，所用溶劑量可以保證提取充分，所以制備供試品時選擇40ml水提取白術對照藥材。需要通過試驗確定提取時間。取白術對照藥材1g三份，加水40ml，分別煎煮15、30、45分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液1、2、3。分別吸取白術對照藥材溶液1、2、3各30iil點于同一硅膠G板上，以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，105°〇烘烤10分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察。白術對照藥材溶液1、2、3均顯熒光斑點。比較熒光斑點情況，白術對照藥材溶液1的熒光斑點較暗淡，不易觀察；白術對照藥材溶液2、3的熒光斑點明亮清晰，且無顯著差異。表明提取30min白術中成分基本提取完全，所以確定白術對照藥材的最佳提取溶劑量為40ml水，提取30min。2.6白術對照藥材萃取次數的考察取白術對照藥材lg三份，分別加水40ml，煎煮30分鐘，放冷，上清液用石油醚(6Q9(TC)分別輕輕振搖提取1、2、3次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液1、2、3。分別吸取白術對照藥材溶液1、2、3各30ill點于同一硅膠G板上，以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，105°〇烘烤10分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察。白術對照藥材溶液1、2、3均顯熒光斑點。比較熒光斑點情況，白術對照藥材溶液1的熒光斑點較暗淡，不易觀察；白術對照藥材溶液2、3的熒光斑點明亮清晰，且無顯著差異。表明提取30min白術中成分基本提取完全，所以確定白術對照藥材的最佳提取溶劑量為40ml水，提取30min。2.7白術對照藥材點樣量的確定取白術對照藥材lg加水40ml，煎煮30分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液.分別吸取白術對照藥材溶液10iil、30ia、50ii1點于同一硅膠G板上，以石油醚(6090°C)醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤IO分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察。白術對照藥材溶液點樣量為10iU時，熒光斑點強度較低，不宜觀察；白術對照藥材溶液點樣量為30iU時，白術對照藥材薄層上熒光斑點清晰，大小適中，無拖尾，前后無干擾；白術對照藥材溶液點樣量為50iU時，白術對照藥材薄層上熒光斑點較大，與前后熒光斑點相連，且明顯拖尾，另外，由于點樣大，點樣次數較多，易對硅膠薄層表面造成破壞。因此，確定白術對照藥材溶液的最佳點樣量為30iU。2.8展開劑溶劑的選擇薄層層析展開劑溶劑的選擇，應根據化合物的性質及"相似相溶"的原則選擇合適的展開溶劑。白術成分極性較小，而且提取時選擇石油醚(609(TC)為提取溶劑，因此所以選擇石油醚(609(TC)和極性稍大的醋酸乙酯為展開劑，通過實驗選擇合適的比例，使所需成分得到分離。取本發明組合物顆粒劑20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并石油醚層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液。取缺白術的白術陰性制劑20g按供試品制備方法制備缺白術陰性對照溶液。取白術對照藥材lg加水40ml，煎煮30分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液。取5塊硅膠G薄層板，每塊薄層均點樣供試品、白術對照藥材、缺白術陰性對照溶液各30iU，分別以石油醚(6090。C)、石油醚(6090。C)-醋酸乙酯(10:1)、石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)、石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(10:5)、醋酸乙酯為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察。結果如下薄層板1以石油醚為展開劑，由于展開劑極性太低，供試品、對照藥材中白術成分均未展開；薄層板2以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(10:1)為展開劑，極性較低，展開不充分，供試品中白術成分未與其他斑點分離；薄層板3以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，極性適中，對照藥材品中目標斑點Rf值為0.45，且與其他成分分離良好，供試品中在白術對照藥材相對應的位置上顯相同顏色的熒光斑點，且該白術成分目標斑點與其他成分斑點分離良好，陰性無干擾；薄層板4、5分別以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(10:5)、醋酸乙酯為展開劑，由于展開劑極性太大，供試品、對照藥材中白術成分Rf值較大，與其他成分斑點重疊，分離失敗。所以確定白術硅膠薄層最佳的展開劑為石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)。2.9顯色條件的選擇白術中的成分日光下沒有顏色和紫外下也沒有熒光，所以薄層層析后不能直接觀察，需要利用通用型顯色劑顯色后觀察。常用的通用型顯色劑為10%的硫酸乙醇溶液、5%香草醛硫酸溶液、碘蒸汽。取本發明組合物顆粒劑20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并石油醚層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液。取白術對照藥材lg加水40ml，煎煮30分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液。取3塊硅膠G薄層板，每塊薄層均點樣供試品、白術對照藥材溶液各30iU，以石油醚(609(TC)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干。方法一薄層1噴以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分鐘；方法二薄層2噴以5%香草醛硫酸溶液加熱至斑點顯色；方法三薄層3置碘缸中約3分鐘后取出，揮盡板上吸附的碘。方法一薄層在日光下觀察，供試品色譜中在與白術對照藥材相對應的位置上沒有觀察到明顯顏色的斑點，但在紫外(365nm)下在與白術對照藥材相對應的位置上有明顯相同顏色的熒光斑點，斑點清晰，前后無干擾。方法二薄層在日光下觀察，供試品中斑點較多，在與白術對照藥材相對應的位置上有其他斑點干擾，紫外(365nm)下供試品色譜中在與白術對照藥材相對應的位置上沒有觀察到明顯顏色的斑點。方法三薄層在日光、紫外(365nm)下，供試品中斑點均較少，在與白術對照藥材相對應的位置上沒有觀察到明顯顏色的斑點。因此可以確定白術薄層層析的顯色條件為噴以10%的硫酸乙醇溶液，1051:烘烤IO分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察。綜上試驗最后確定本發明組合物顆粒劑中白術的薄層色譜鑒別條件為供試品溶液的制備取中藥組合物制劑20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液。另取白術對照藥材lg加水40ml煎煮30分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各30iU點于同一硅膠G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10X的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察，供試品色譜中，在與對照藥材色譜的相應位置上顯相同顏色的熒光斑點。實驗例5:梔子薄層鑒別試驗梔子苷(geniposide)是梔子化學成分中一種重要的環烯醚鵬類化合物，《中國藥典》2005年版一部以梔子苷作為梔子的薄層色譜鑒別的對照品。本試驗通過鑒別梔子苷驗證制劑中是否加入梔子藥材。梔子苷為環烯醚萜苷類成分，極性較大，易溶于甲醇、乙醇等20極型溶劑，可利用硅膠G薄層板進行薄層鑒別。1、供試品提取溶劑的選擇以甲醇、乙醇、無水乙醇作為提取溶劑，通過實驗比較、確定供試品最優的提取溶劑方法一取本發明組合物顆粒劑20g，加無水乙醇50ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml，作為供試品溶液。方法二取本發明組合物顆粒劑20g，加乙醇50ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml，作為供試品溶液。方法三取本發明組合物顆粒劑20g，加甲醇50ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml，作為供試品溶液。取梔子苷對照品，制成每lml乙醇含lmg對照品的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液15ia、對照品溶液5iU分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以5%香草醛濃硫酸溶液，ll(TC加熱至斑點顯色清晰。三種方法供試品色譜中在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，但方法二中由于乙醇含有一定水，提取時雜質較多，制成供試品溶液非常粘稠，造成點樣困難，且供試品色譜中其他成分斑與梔子苷斑點未完全分離，干擾了梔子苷的檢測。以甲醇作為提取溶劑，供試品制備效果雖然與方法一相近，但由于甲醇毒性較大，所以最終確定無水乙醇為供試品的最優提取溶劑。2、供試品提取溶劑量的選擇超聲提取提取效率高、操作方便，所以選擇超聲提取法提取。通過試驗確定供試品最佳提取溶劑量。取本發明組合物顆粒劑20g三份，分別加無水乙醇、25、50、100ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml，作為供試品溶液1、2、3。取梔子苷對照品，制成每lml乙醇含lmg對照品的溶液，作為對照品溶液。分別吸取供試品溶液1、2、3各15ii1、對照品溶液5y1分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以5%香草醛濃硫酸溶液，1l(TC加熱至斑點顯色清晰。供試品1、2、3色譜中，在梔子苷對照品相對應的位置上均顯相同顏色的斑點，供試品2、3色譜中，斑點的熒光強于供試品l，且供試品2、3斑點的熒光基本一致，表明50ml無水乙醇基本可將制劑中的梔子苷基本萃取完全。因此，確定最佳提取溶劑量為50ml無水乙醇3、供試品提取時間的選擇取本發明組合物顆粒劑20g三份，各加無水乙醇50ml，分別超聲處理15、30、45分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml，作為供試品溶液1、2、3。取梔子苷對照品，制成每lml乙醇含lmg對照品的溶液，作為對照品溶液。分別吸取供試品溶液1、2、3各15ii1、對照品溶液5y1分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以5%香草醛濃硫酸溶液，1l(TC加熱至斑點顯色清晰。供試品1、2、3色譜中，在梔子苷對照品相對應的位置上均顯相同顏色的斑點，供試品2、3色譜中，斑點的熒光強于供試品l，且供試品2、3斑點的熒光基本一致，表明超聲30min可將制劑中的梔子苷萃取完全。因此，確定最佳提取時間為30min。4、供試品及對照品最優點樣量的選擇取本發明組合物顆粒劑20g，加無水乙醇50ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml，作為供試品溶液。取梔子苷對照品，制成每1ml乙醇含lmg對照品的溶液，作為對照品溶液。分別吸取供試品溶液5、15、25y1、對照品溶液1、5、10y1分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:1:1)為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以5%香草醛濃硫酸溶液，ll(TC加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液點樣量為5iU時，供試品色譜中，在與梔子苷對照品相對應的位置上斑點強度較低，不宜觀察；供試品溶液點樣量為15iU時，供試品色譜中，在與梔子苷對照品相對應的位置上斑點明顯，斑點大小適中，無拖尾，前后無干擾；供試品溶液點樣量為25時，供試品色譜中，在與梔子苷對照品相對應的位置上熒光斑點偏大，斑點與前后斑點相連，明顯拖尾，而且點樣時由于點樣次數較多，破壞了硅膠薄層的表面。因此，確定供試品的最佳點樣量為15iU。梔子苷對照品溶液點樣量為liU時，梔子苷對照品熒光斑點強度較低，不宜觀察；點樣量為5iU的梔子苷對照品熒光斑點明顯，斑點大小適中，無拖尾；點樣量為lOiU的梔子苷對照品熒光斑點偏大，明顯拖尾。因此，確定供試品的最優點樣量為15yl，梔子苷對照品的最優點樣量為5iU。5、最優展開劑比例的選擇梔子苷極性較大，所以展開劑選擇極性較大的丙酮、水與醋酸乙酯進行搭配，調節極性。加入甲酸，既能夠調節極性又起到抑制拖尾、優化斑點形態的作用。通過試驗選擇最優的展開劑比例。取本發明組合物顆粒劑20g，加無水乙醇50ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml，作為供試品溶液。取梔子苷對照品，制成每lml乙醇含lmg對照品的溶液，作為對照品溶液。取缺梔子的梔子陰性制劑20g按供試品制備方法制備缺梔子陰性對照溶液。取4塊硅膠G薄層板，每塊薄層均點樣供試品、缺梔子陰性對照溶液15iU、梔子對照品5iU，分別以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(io:3:i:1)、醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)、醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:5:i:1)、醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:io:i:i)為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以5%香草醛濃硫酸溶液，ll(TC加熱至斑點顯色清晰。薄層板i以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(io:3:i:i)極性較低，展開不充分，供試品色譜中梔子苷斑點不能與其他斑點分離；薄層板2以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)為展開劑，極性適中，對照品色譜中斑點Rf值為o.51，且與其他成分分離良好，供試品色譜中，在與梔子苷對照品相應的位置上有相同顏色的斑點，且該半點與其他成分斑點分離良好，陰性無干擾；薄層板3、4分別以醋酸乙酯_丙酮_甲酸_水(5:5:i:1)、醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:io:i:i)為展開劑，由于展開劑極22性太大，梔子苷Rf值較大，供試品色譜中梔子苷與其他成分斑點重疊，分離失敗。因此，確定梔子苷硅膠薄層最佳的展開劑為醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)。6、顯色條件的選擇梔子苷沒有顏色，紫外下也沒有熒光，所以薄層層析后不能直接觀察，需要利用通用型顯色劑顯色后觀察。常用的通用型顯色劑為10%的硫酸乙醇溶液、5%香草醛硫酸溶液、碘蒸汽。取本發明組合物顆粒劑20g，加無水乙醇50ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml，作為供試品溶液。取梔子苷對照品，制成每lml乙醇含lmg對照品的溶液，作為對照品溶液。取3塊硅膠G薄層板，每塊薄層均點樣供試品溶液15ii1、梔子對照品5iU，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)為展開劑，展開，取出，涼干。方法一薄層1噴以10%的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分鐘；方法二薄層2噴以5%香草醛濃硫酸溶液，ll(TC加熱至斑點顯色清晰；方法三薄層3置碘缸中約3分鐘后取出，揮盡板上吸附的碘。方法一、三薄層在日光、紫外(365nm)下觀察，供試品色譜中在與梔子苷對照品相對應的位置上均沒有觀察到明顯顏色的斑點；方法二薄層在日光下觀察，在與梔子苷對照品相對應的位置上有明顯相同顏色的斑點，斑點清晰，無干擾。因此，確定梔子薄層層析的顯色條件為以5X香草醛濃硫酸溶液，11(TC加熱至斑點顯色清晰。綜上試驗最后確定本發明組合物顆粒劑中梔子的薄層色譜鑒別條件為供試品溶液的制備取中藥組合物制劑20g，加無水乙醇50ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml，作為供試品溶液。另取梔子苷對照品，制成每lml乙醇含lmg對照品的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液15ii1、對照品溶液5ii1分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以5^香草醛濃硫酸溶液，11(TC加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。下述實施例均能實現上述實驗例的效果。具體實施方式實施例1柴胡40g、大棗30g、石菖蒲40g、半夏(制)30g、白術(炒)30g、浮小麥100g、遠志(制M0g、甘草(炙)30g、梔子(炒)40g、百合100g、膽南星40g、郁金40g、龍齒100g、酸棗仁(炒)50g、茯苓、50g、當歸30g以上十六味，加水煎煮三次，第一次3小時，第二、三次各2小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至干，粉碎，制成顆粒。干燥，制成IOO袋，即得。實施例2柴胡50g、大棗30g、石菖蒲50g、半夏(制)30g、白術(炒)40g、浮小麥100g、遠志(制)40g、甘草(炙)30g、梔子(炒)40g、百合100g、膽南星40g、郁金40g、龍齒90g、酸棗仁(炒)40g、茯苓40g、當歸40g以上十六B未，加水煎煮三次，第一次3小時，第二、三次各2小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至干，粉碎，制成膠囊。實施例3質量控制方法鑒別(下述本品為實施例1制備的顆粒劑)(1)取本品20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液。另取白術對照藥材lg加水40ml煎煮30分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液.吸取上述兩種溶液各30iU點于同一硅膠G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，1051:烘烤IO分鐘以上，在紫外光(365nm)下進行觀察，供試品色譜中在與白術對照藥材相對應的位置上顯相同顏色的熒光斑點。(2)取本品20g，加無水乙醇50ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml，作為供試品溶液。另取梔子苷對照品，制成每lml乙醇含lmg對照品的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液15ia、對照品溶液5iU分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5:3:i:i)為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以5%香草醛濃硫酸溶液，電熱吹風至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。含量測定色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(15:85)為流動相；檢測波長為238nm。對照品溶液的制備精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每lml含O.03mg的溶液，作為對照品溶液。供試品溶液的制備取本品適量，研細，取約1.0g，精密稱定，精密加甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45iim的濾頭濾過，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10iU，注入液相色譜儀，測定，即得。本品每袋含梔子以梔子苷(C17H24010)計，不得少于2.0mg。權利要求一種舒肝解郁，安神定志的中藥組合物，其特征在于該藥物組合物的原料藥組成為柴胡20-60重量份、大棗10-50重量份、石菖蒲20-60重量份、半夏(制)10-50重量份、白術(炒)10--50重量份、浮小麥80-120重量份、遠志(制)20-60重量份、甘草(炙)10-50重量份、梔子(炒)20-60重量份、百合80-120重量份、膽南星20-60重量份、郁金20-60重量份、龍齒80-120重量份、酸棗仁(炒)30-70重量份、茯苓30-70重量份、當歸10-50重量份。2.如權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的原料藥組成為柴胡40重量份、大棗30重量份、石菖蒲40重量份、半夏(制)30重量份、白術(炒)30重量份、浮小麥100重量份、遠志(制)40重量份、甘草(炙)30重量份、梔子(炒)40重量份、百合100重量份、膽南星40重量份、郁金40重量份、龍齒100重量份、酸棗仁(炒)50重量份、茯苓50重量份、當歸30重量份。3.如權利要求1或2所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于該方法為十六味原藥材，加水煎煮1-5次，每次1-5小時，合并煎液，濾過，濾液濃縮至干，粉碎，加入常規輔料，按照常規工藝，制成片劑、膠囊劑、散劑、軟膠囊劑、滴丸、蜜丸、丸劑、顆粒劑、蜜煉膏劑、緩釋制劑、速釋制劑、控釋制劑、口服液體制劑。4.如權利要求1或2所述的藥物組合物的質量控制方法，其特征在于包括如下鑒別方法中的一種或多種鑒別A:取中藥組合物制劑10-40g加水5-80ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一種或一種以上的混合溶劑輕輕振搖提取3-5次，每次20-80ml，合并有機溶液層，水浴濃縮至約0.5-2ml，作為供試品溶液；另取白術對照藥材0.5-2g加水20-80ml的水煎煮15-45分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一種或一種以上的混合溶劑輕輕振搖提取1-3次，每次10-40ml，合并醚層，水浴濃縮至約0.5-2ml，作為白術對照藥材溶液.吸取上述兩種溶液各105-50y1點于同一硅膠G板上，以5-15:l-2比例的石油醚(609(TC)-醋酸乙酯混合溶劑為展開劑，展開，取出，涼干，噴以5-20%的硫酸乙醇溶液，95-120。C烘烤2-20分鐘，置365nm紫外光下進行觀察，供試品色譜中在與白術對照藥材的相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點；鑒別B:取中藥組合物制劑10-40g，加無水乙醇、甲醇、乙醇中的一種或一種以上的混合溶劑10-100ml，超聲處理15-45分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇0.5-2ml，作為供試品溶液；另取梔子苷對照品，制成每lml無水乙醇、甲醇、乙醇中的一種或一種以上的的混合溶劑含0.2-2mg對照品的溶液，作為對照品溶液；吸取供試品溶液5-25y1、對照品溶液i-i5iU分別點于同一硅膠G薄層板上，以io-i:i-3:i:i為體積比例的醋酸乙酯_丙酮_甲酸_水混合溶劑為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以1_10%香草醛濃硫酸溶液，95-12(TC加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。5.如權利要求4所述的藥物組合物的質量控制方法，其特征在于包括如下鑒別方法中的一種或多種鑒別A:取中藥組合物制劑20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取4次，各次的用量分別為40ml、40ml、30ml、30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液；另取白術對照藥材lg加水40ml煎煮30分鐘，放冷，上清夜用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液.吸取上述兩種溶液各30ii1點于同一硅膠G板上，以9:2的石油醚(6090°C)-醋酸乙酯為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，1051:烘烤IO分鐘，置365nm紫外光下進行觀察，供試品色譜中在與白術對照藥材的相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點；鑒別B:取中藥組合物制劑20g，加無水乙醇50ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml溶解，作為供試品溶液；另取梔子苷對照品，制成每lml乙醇含lmg對照品的溶液，作為對照品溶液；吸取供試品溶液15ia、對照品溶液5iU分別點于同一硅膠G薄層板上，以5:3:i:i的醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以5%香草醛濃硫酸溶液，電熱吹風至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。6.如權利要求1或2所述的藥物組合物的質量控制方法，其特征在于含量測定方法為色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以5-25:75-85比例的乙腈_水為流動相；檢測波長為210-250nm;對照品溶液的制備精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每lml含6-39i！g的溶液，作為對照品溶液；供試品溶液的制備取中藥組合物制劑適量，研細，取約0.2-1.2g，精密稱定，精密加甲醇、乙醇、水中的一種或一種以上的混合溶劑12.5-100ml，稱定重量，超聲處理15-45分鐘，放冷，用相應溶劑補足減失的重量，搖勻，用0.2-0.45iim的濾膜濾過，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2-12ii1，注入液相色譜儀，測定。7.如權利要求6所述的藥物組合物的質量控制方法，其特征在于含量測定方法為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以15:85的乙腈-水為流動相；檢測波長為238nm;對照品溶液的制備精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每lml含0.03mg的溶液，作為對照品溶液；供試品溶液的制備取中藥組合物制劑，研細，取約l.Og，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45i！m的濾膜濾過，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10iU，注入液相色譜儀，測定。8.如權利要求1或2所述的藥物組合物的質量控制方法，其特征在于該方法包括如下步驟含量測定以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以5-25:75-85比例的乙腈-水為流動相；檢測波長為210-250nm;對照品溶液的制備精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每lml含6-39i！g的溶液，作為對照品溶液；供試品溶液的制備取中藥組合物制劑適量，研細，取約0.2-1.2g，精密稱定，精密加甲醇、乙醇、水中的一種或一種以上的混合溶劑12.5-100ml，稱定重量，超聲處理15-45分鐘，放冷，用相應溶劑補足減失的重量，搖勻，用0.2-0.45ym的濾膜濾過，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2-12iil，注入液相色譜儀，測定；鑒別A:取中藥組合物制劑10-40g加水5-80ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一種或一種以上的混合溶劑輕輕振搖提取3-5次，每次20-80ml，合并有機溶液層，水浴濃縮至約0.5-2ml，作為供試品溶液；另取白術對照藥材0.5-2g加水20-80ml的水煎煮15-45分鐘，放冷，上清液用石油醚(6090°C)、氯仿、乙酸乙酯中的一種或一種以上的混合溶劑輕輕振搖提取1-3次，每次10-40ml，合并醚層，水浴濃縮至約0.5-2ml，作為白術對照藥材溶液.吸取上述兩種溶液各105-50y1點于同一硅膠G板上，以5-15:l-2比例的石油醚(609(TC)-醋酸乙酯混合溶劑為展開劑，展開，取出，涼干，噴以5-20%的硫酸乙醇溶液，95-12(TC烘烤2_20分鐘，置365nm紫外光下進行觀察，供試品色譜中在與白術對照藥材的相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點；鑒別B:取中藥組合物制劑10-40g，加無水乙醇、甲醇、乙醇中的一種或一種以上的混合溶劑10-100ml，超聲處理15-45分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇0.5_2ml，作為供試品溶液；另取梔子苷對照品，制成每lml無水乙醇、甲醇、乙醇中的一種或一種以上的的混合溶劑含0.2-2mg對照品的溶液，作為對照品溶液；吸取供試品溶液5-25iU、對照品溶液l-i5yi分別點于同一硅膠G薄層板上，以io-i:i-3:i:i為體積比例的醋酸乙酯_丙酮_甲酸_水混合溶劑為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以1_10%香草醛濃硫酸溶液，95-12(TC加熱至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。9.如權利要求8所述的藥物組合物的質量控制方法，其特征在于該方法包括如下步驟含量測定以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以15:85的乙腈-水為流動相；檢測波長為238nm;對照品溶液的制備精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇制成每lml含0.03mg的溶液，作為對照品溶液；供試品溶液的制備取中藥組合物制劑，研細，取約1.0g，精密稱定，精密加入甲醇25ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45i！m的濾膜濾過，即得；測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10ill，注入液相色譜儀，測定；鑒別A:取中藥組合物制劑20g加水40ml溶解置分液漏斗中，用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取4次(40ml，40ml，30ml，30ml)合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為供試品溶液；另取白術對照藥材lg加水40ml煎煮30分鐘，放冷，上清夜用石油醚(6090°C)輕輕振搖提取2次，每次30ml，合并醚層，水浴濃縮至約lml，作為白術對照藥材溶液.吸取上述兩種溶液各30iU點于同一硅膠G板上，以石油醚(6090°C)-醋酸乙酯(9:2)為展開劑，展開，取出，涼干，噴以10X的硫酸乙醇溶液，105t:烘烤10分鐘，置紫外光(365nm)下進行觀察，供試品色譜中在與白術對照藥材的相應的位置上顯相同顏色的熒光斑點；鑒別B:取中藥組合物制劑20g，加無水乙醇50ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇lml溶解，作為供試品溶液；另取梔子苷對照品，制成每lml乙醇含lmg對照品的溶液，作為對照品溶液；吸取供試品溶液15ia、對照品溶液5iU分別點于同一硅膠G薄層板上，以5:3:i:i的醋酸乙酯-丙酮-甲酸-水為展開劑，展開，取出，涼干后，噴以5%香草醛濃硫酸溶液，電熱吹風至斑點顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。全文摘要本發明公開了一種舒肝解郁的中藥組合物制劑及質量控制方法，該組合物由柴胡、大棗、石菖蒲、半夏、白術、浮小麥、遠志、甘草、梔子、百合等原料藥制成，該組合物制劑具有很好的抗抑郁的效果；本發明含量測定方法檢測專屬性好、穩定性高、重現性好、精密度高，更加適合工業化的生產，真正確保了臨床用藥的安全、有效、可靠。文檔編號G01N30/90GK101773641SQ20091007615公開日2010年7月14日申請日期2009年1月12日優先權日2009年1月12日發明者付建家,付立家申請人:北京亞東生物制藥有限公司
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