專利名稱：抗鉤端螺旋體的單克隆抗體及鉤端螺旋體的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種抗鉤端螺旋體的單克隆抗體及鉤端螺旋體的檢測方法。
背景技術：
鉤端螺旋體病是一種嚴重的自然疫源性急性傳染病。世界各大洲均有流行，我國已有26個省、市、自治區發現病人或病畜及帶菌動物，已查出的帶菌動物有50多種，約有58％的縣有本病流行。該病多發生于夏秋季節，病勢急劇，感染方式和臨床表現具有復雜性，臨床分型包括黃疸出血型、腦膜腦炎型、肺出血型、腎功能衰竭型和流感傷寒型。該病原不僅使人患病，對家畜的危害也很大，是一種典型的人畜共患的傳染病。
鉤端螺旋體病的病原為鉤端螺旋體，簡稱鉤體，該病原屬鉤端螺旋體屬，該屬分二種，一種為問號鉤端螺旋體，包括所有的寄生性和致病性血清型；另一種為雙曲鉤端螺旋體，包括所有腐生性血清型。迄今鉤體的分類仍然主要以血清學反應為準，但這一血清學方法的準確性尚不理想、在已經檢定的血清型中存在著許多差異，主要問題之一是在不同的實驗室抗血清的制作方法缺乏標準化。而且現在的分類技術尚不能分辨出病原體在流行病學上的關鍵性的差別。
鉤端螺旋體從形態、和常規血清學方法很難正確判斷鉤體是否為致病病原，從而為該病原的檢測診斷帶來困難，雖然經過幾十年的努力，在鉤端螺旋體病的科研和防治方面已取得了一些成就，目前鉤體診斷方法主要有直接暗視野顯微鏡檢查法、改良鍍銀染色法、以多抗血清為基礎的免疫熒光檢查法、間接血凝試驗、反向被動血凝試驗、凝集試驗及凝集素吸收試驗、膨脹試驗、酶聯免疫吸附試驗等，但有關本病的流行預測，傳染源的消滅，家畜帶菌的排除，早期的快速診斷方法等都有待進一步的探索，而單克隆抗體是有一個抗體產生細胞與一個骨髓瘤細胞融合而產生的雜交瘤細胞經無性繁殖而來的細胞群所產生的，所以它的免疫球蛋白屬同一類別，質地純一，而且因為它是針對單一抗原決定簇的，因此特異性強，親和性也一致。制備針對不同致病鉤體的不同單克隆抗體，并用單抗組成特異性的鉤體檢測方法，有利于致病鉤體的分型和正確診斷，為該病的防治打下堅實的基礎。
發明內容
本發明的目的是提供一種抗鉤端螺旋體的單克隆抗體及鉤端螺旋體的檢測方法。
抗鉤端螺旋體的單克隆抗體是，5660 1-MAb對鉤體黃疸出血群賴型有特異性免疫反應，而與其它血清型的鉤體沒有免疫反應；56602-MAb對鉤體爪哇型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應；56606-MAb對鉤體秋季型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應；56609-MAb對鉤體流感傷寒群臨6型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應；56610-MAb對鉤體七日熱型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應。
檢測5種致病血清型鉤端螺旋體的TAS-ELISA方法的步驟為1)抗鉤體的兔抗血清100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，過夜；2)PBST洗滌三次后加1-10％的脫脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封閉200ul/孔于37℃封閉30-60min；3)加入檢測樣品100ul/孔。以標準血清型鉤體為陽性對照，以相應的健康樣品作陰性對照，37℃1-2h；4)洗滌后加用封閉液稀釋的單抗腹水100ul/孔，37℃1-2h；5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋HRP標記兔抗鼠IgG二抗結合物(Sigma)100ul/孔，37℃1-2h；6)PBST洗滌后加OPD-H2O2底物于室溫顯色5-30min，2mol/L H2SO4終止反應后，肉眼觀察底物顏色變成橙黃色的孔為陽性或用550型酶聯免疫檢測儀測492nm的OD值，以P/N＞2.1作為陽性判斷標準。
由于鉤端螺旋體的抗原結構復雜，血清型又多，用常規以多抗血清為基礎的血清學方法分型復雜繁瑣，不利于本病的早期快速診斷，用雜交瘤技術所產生的抗鉤體的單克隆抗體，能特異、快速地對鉤體血清型進行鑒定。因此本發明提供的抗5種致病血清型鉤體的5種單克隆抗體，對準確、快速分型、抗原的純化及用于臨床病人與動物鉤體病的診斷均具有重要意義。本發明還提供一種可特異檢測5種致病血清型鉤體的靈敏、快速正確的診斷檢測方法，即TAS-ELISA檢測方法。目前鉤體診斷方法雖然均取得了一定的效果，但這些方法均有不足之處，有的陽性檢出率不高，靈敏度低；有的操作技術復雜；有的需一定設備條件；有的判斷結果需有一定經驗，并受菌量、時間因素的限制；有的特異性不高，假陽性率高，結果不正確，且多數方法費時費力。而本發明提供的以單抗為基礎的TAS-ELISA檢測診斷方法具有快速、方便、靈敏正確、特異性好、結果可肉眼觀察等優點，有利于其的推廣應用。
具體實施例方式
鉤端螺旋體是一種重要的人畜共患的病原菌。在自然界人和50多種動物都為其宿主或寄主，是嚴重危害人畜安全的自然疫源病原之一。目前鉤體病總體發病率及死亡率均已顯著下降，但許多地區流行因素依然存在，稍有疏忽，就可能引起該病爆發流行。
目前致病鉤體分型和檢測診斷的常規方法均存在不足之處，而單抗具有特異性、均質性、穩定性、能大量生產、能正確分型和檢測等優點，因此開展致病鉤體的單抗和以單抗為中心組合成正確、快速的檢測方法研究具有重要意義。
本發明制備分別抗5種致病血清型鉤體的5種單抗及相應的檢測診斷方法。我們用滅活的這5種血清型鉤體制備出抗相應血清型鉤體的單抗，并建立了相應正確、靈敏、快速、方便的TAS-ELISA方法，從而為鉤體病的防治打下基礎。
一.克隆抗體的制備1.免疫原的制備鉤體黃疸出血群賴型菌株、爪哇型菌株、秋季型菌株、流感傷寒群臨6型菌株、七日熱型菌株的活鉤體在8％兔血清改良Korthof培養基30℃培養3-4周，將這些培養物經2％甲醛溶液滅活48小時，12000rpm離心10分鐘。沉淀用滅菌0.01mol/L PBS pH7.2離心洗滌三次，最后用少量滅菌PBS溶解沉淀備用。
2.免疫動物選擇體重18-20g BALB/C雌性小鼠，分別用鉤體賴型、爪哇型、秋季型、臨6型、七日熱型菌的制備抗原免疫。在400倍暗視野下鏡檢，將每視野達100個菌體的以上者各取1ml與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經背腹部皮下多點注射0.5ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次皮下多點注射0.5ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進行腹腔注射，3天后取脾細胞進行融合。
3.細胞融合取上述免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)按5-10∶1的比例，在無血清的RPMI-1640(Gibco)培養基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養基，用分子量為3350的50％PEG(Sigma)作為融合劑，在37℃下水浴下加入0.5-0.7ml，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640培養基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養基懸浮，分裝到96孔含有飼養細胞的細胞板中，37℃，5％CO2的細胞培養器皿中培養。
4.雜交瘤細胞及陽性孔的篩選細胞培養器皿中培養5天后，用HAT培養基換液一次，第10天用HT培養基換液，等到融合細胞覆蓋孔底10％-50％時，常規間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲50多個對上述5種血清型鉤體有反應的陽性孔。
5.陽性孔的特異性檢測及特異性陽性孔的克隆陽性孔的特異性鑒定采用間接ELISA方法，具體為福爾馬林滅活的用包被液稀釋成1-30ug/mL的不同血清型鉤體50ul/孔包被ELISA板，37℃過夜，使其全部干燥后，吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10％的脫脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封閉30-60min；加入陽性孔培養上清50ul/孔，37℃1-2小時；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍的辣根過氧化物酶標記兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)50ul/孔，37℃1-2小時，PBST洗滌四次后，用OPD-H2O2底物顯色，2mol/L H2SO4終止反應后，用酶標儀讀取OD492的值，以與陰性OD值比值大于2.1為陽性。獲分別對上述5種血清型鉤體有特異性反應的陽性孔各一個。篩選出的特異性陽性孔用常規的有限稀釋法克隆，獲分別對上述5種血清型鉤體有特異性反應的雜交瘤細胞株各一株。細胞株進一步擴大培養，用于制備單抗腹水和液氮凍存。
6.單克隆抗體腹水制備及純化取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7-10天后腹腔注入5-10×105個雜交瘤細胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，2000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹水加2倍體積0.06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4℃澄清1小時，12000rpm離心20min，收集上清，再用50％飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小時，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4℃流動透析24小時后即獲純化的腹水抗體，-70℃保存。
7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價測定將單抗腹水與Sigma公司的標準抗BALB/C小鼠IgG，IgG1，IgG2a，IgG2b、IgG3，IgM抗體，作雙向瓊脂擴散試驗，結果為，56601-MAb亞類為IgG1，56602-MAb為IgG3，56606-MAb為IgG1，56609-MAb為IgG1，5661 0-MAb為IgG2a。用常規間接ELISA方法檢測單抗腹水效價，結果為上述5株腹水效價均在10-6-10-7之間。
一.一種檢測鉤端螺旋體的TAS-ELISA方法的建立1.TAS-ELISA方法的操作流程1)抗鉤體的兔抗血清(本所自制)100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，過夜；2)PBST洗滌三次后加1-10％的脫脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封閉200ul/孔于37℃封閉30-60min；3)加入檢測樣品100ul/孔。以標準血清型鉤體為陽性對照，以相應的健康樣品作陰性對照，37℃1-2h；4)洗滌后用封閉液稀釋的單抗腹水100ul/孔，37℃1-2h；5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋HRP標記兔抗鼠IgG二抗結合物(Sigma)100ul/孔，37℃1-2h；6)PBST洗滌后加OPD-H2O2底物于室溫顯色5-30min，2mol/L H2SO4終止反應后，肉眼觀察底物顏色變成橙黃色的孔為陽性或用550型酶聯免疫檢測儀測492nm的OD值，以P/N＞2.1作為陽性判斷標準。
2.TAS-ELISA檢測方法最適條件的確定采用TAS-ELISA方陣試驗進行，即橫向加兔抗標準血清型鉤體血清(本所自制)用包被緩沖液從1∶100至1∶102400倍比稀釋；固定各種標準血清型鉤體2ug/ml；縱向加用PBST緩沖液從1∶5至1∶2048000倍比稀釋單抗腹水；HRP標記的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司說明書稀釋，1∶10000倍；按TAS-ELISA方法流程進行操作。結果為5個標準血清型的兔抗血清最適稀釋度均為1∶3000；56601-MAb，56602-MAb，56606-MAb，56609-MAb，56610-MAb的最適稀釋度分別為1∶5000，1∶8000，1∶4000，1∶10000，1∶5000。
3.TAS-ELISA方法檢測靈敏度的確定在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將10ug/ml的標準血清型鉤體用含1-3％BSA PBST倍比稀釋后進行TAS-ELISA測定，結果為TAS-ELISA檢測5種血清型鉤體的靈敏度均在0.1-1ng以上，說明本方法具有很好的靈敏度。
4.TAS-ELISA方法的特異性確定用適當稀釋的各種血清型鉤體作為抗原，在最適抗血清和單抗腹水工作濃度下進行TAS-ELISA試驗，結果為由56601-MAb組合成的TAS-ELISA方法只對賴型鉤體有特異性免疫反應，而與其它血清型的鉤體沒有免疫反應；由56602-MAb組合成的TAS-ELISA方法對鉤體爪哇型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應；由56606-MAb組合成的TAS-ELISA方法對鉤體秋季型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應；由56609-MAb組合成的TAS-ELISA方法對鉤體流感傷寒群臨6型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應；由56610-MAb組合成的TAS-ELISA方法對鉤體七日熱型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應。說明用TAS-ELISA方法檢測致病鉤體具有很好的特異性。
權利要求
1.一種抗鉤端螺旋體的單克隆抗體，其特征是，56601-MAb對鉤體黃疸出血群賴型有特異性免疫反應，而與其它血清型的鉤體沒有免疫反應；56602-MAb對鉤體爪哇型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應；56606-MAb對鉤體秋季型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應；56609-MAb對鉤體流感傷寒群臨6型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應；56610-MAb對鉤體七日熱型有特異性免疫反應，而與其他血清型的鉤體沒有免疫反應。
2.一種檢測5種致病血清型鉤端螺旋體的TAS-ELISA方法，其特征在于它的步驟為1)抗鉤體的兔抗血清100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，過夜；2)PBST洗滌三次后加1-10％的脫脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封閉200ul/孔于37℃封閉30-60min；3)加入檢測樣品100ul/孔。以標準血清型鉤體為陽性對照，以相應的健康樣品作陰性對照，37℃1-2h；4)洗滌后加用封閉液稀釋的單抗腹水100ul/孔，37℃1-2h；5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋HRP標記兔抗鼠IgG二抗結合物(Sigma)100ul/孔，37℃1-2h；6)PBST洗滌后加OPD-H2O2底物于室溫顯色5-30min，2mol/L H2SO4終止反應后，肉眼觀察底物顏色變成橙黃色的孔為陽性或用550型酶聯免疫檢測儀測492nm的OD值，以P/N＞2.1作為陽性判斷標準。
全文摘要
本發明公開了一種抗鉤端螺旋體的單克隆抗體及鉤端螺旋體的檢測方法。56601－MAb對鉤體黃疸出血群賴型有特異性免疫反應，56602－MAb對鉤體爪哇型有特異性免疫反應，56606－MAb對鉤體秋季型有特異性免疫反應，56609－MAb對鉤體流感傷寒群臨6型有特異性免疫反應，56610－MAb對鉤體七日熱型有特異性免疫反應，而5種單克隆抗體均與其他血清型的鉤體沒有免疫反應。本發明提供的抗5種致病血清型鉤體的5種單克隆抗體，對準確、快速分型、抗原的純化及用于臨床病人與動物鉤體病的診斷均具有重要意義。本發明提供的以單抗為基礎的TAS－ELISA檢測診斷方法具有快速、方便、靈敏正確、特異性好、結果可肉眼觀察等優點，有利于其的推廣應用。
文檔編號G01N33/577GK1514247SQ03116828
公開日2004年7月21日 申請日期2003年5月6日 優先權日2003年5月6日
發明者吳建祥, 陳正賢, 李桂新 申請人:浙江大學
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