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一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條，所述試紙條含有襯板和依次排列在襯板上的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、纖維素膜和吸水墊，所述金標(biāo)結(jié)合墊內(nèi)吸附有辛硫磷金標(biāo)抗體，所述纖維素膜上有隱形檢測(cè)線和隱形對(duì)照線，所述隱形檢測(cè)線用辛硫磷半抗原偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制，所述隱形對(duì)照線用兔抗鼠IgG抗體印制。本發(fā)明具備特異性強(qiáng)，敏感性高，簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)藥殘留免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]辛硫磷(Tolclofosnethyl)是一種廣譜的有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑,用于防治忙藏谷物中的害蟲(chóng)和各種葉類(lèi)作物上的害蟲(chóng)，也用來(lái)防治蚊成蟲(chóng)、蠅類(lèi)、水生幼蟲(chóng)和衛(wèi)生害蟲(chóng)。其作用機(jī)理是抑制乙酰膽堿酯酶的活性。乙酰膽堿是神經(jīng)遞質(zhì)，過(guò)量的乙酰膽堿過(guò)度刺激乙酰膽堿受體，導(dǎo)致靶生物死亡。然而，一些不是預(yù)定目標(biāo)的生物也遭到了毒害，包括人、魚(yú)等其他生物。
[0003]目前，對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法主要是儀器分析方法和酶聯(lián)免疫分析方法(ELISA)等。儀器分析方法包括高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)、氣相色譜法(Gas chromatography, GC)、薄層色譜法(Thin layer chromatography,TLC)、液-質(zhì)串聯(lián)法(HPLC-MS)和氣-質(zhì)串聯(lián)法(GC-MS)等，這些儀器分析方法雖然可以達(dá)到較高的檢測(cè)靈敏度，但需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備及專(zhuān)業(yè)操作人員，加之樣品前處理繁瑣費(fèi)時(shí)、檢測(cè)費(fèi)用高，難以滿(mǎn)足快速、在線檢測(cè)的需要。ELISA (Enzyme Linked ImmunosorbentAssay)方法是常用的免疫檢測(cè)方法，但是其卻有操作步驟相對(duì)較多，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果不夠直觀，不能在線進(jìn)行檢測(cè)等缺陷。因而ELISA方法的應(yīng)用受到很大的限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了克服上述辛硫磷快速檢測(cè)技術(shù)的不足，研制出一種特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便的辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條。本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了上述試紙條的制備方法。
[0005]技術(shù)方案:本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條，所述試紙條含有襯板和依次排列在襯板上的樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊、纖維素膜和吸水墊，所述襯板為不吸水的韌性材料，所述的韌性材料用硬質(zhì)塑膠條或不吸水硬紙條制成，所述金標(biāo)結(jié)合墊內(nèi)吸附有辛硫磷金標(biāo)抗體，所述纖維素膜上有隱形檢測(cè)線和隱形對(duì)照線，所述隱形檢測(cè)線用辛硫磷半抗原偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制，所述隱形對(duì)照線用兔抗鼠IgG抗體印制。所述吸水墊為吸水能力較強(qiáng)的吸水濾紙或?yàn)V油紙。
[0006]其中，上述辛硫磷金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的辛硫磷單克隆抗體。
[0007]其中，上述偶聯(lián)辛硫磷半抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一種或幾種。
[0008]在試紙條的吸水墊上設(shè)有手柄端保護(hù)膜，在樣品墊上設(shè)有樣品浸入端保護(hù)膜。所述的保護(hù)膜為不透明的膠膜，樣品墊、金標(biāo)結(jié)合墊對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有待測(cè)樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向樣品墊一側(cè)約0.5厘米處。
[0009]其中，上述樣品墊用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜中的一種或幾種制成。
[0010]其中，上述纖維素膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜中的一種或幾種。
[0011]上述辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備方法包括以下步驟:
[0012]I)辛硫磷半抗原的合成；
[0013]2)辛硫磷半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到辛硫磷半抗原偶聯(lián)的載體蛋白溶液；
[0014]3)辛硫磷金標(biāo)抗體的制備；
[0015]4)金標(biāo)結(jié)合物墊的制備；
[0016]5)兔抗鼠IgG抗體的制備；
[0017]6)辛硫磷半抗原偶聯(lián)的載體蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗體包被纖維素膜；
[0018]7)試紙條的組裝。
[0019]所述步驟I)辛硫磷半抗原的合成方法如下:
[0020]81)0-乙基-0-(苯乙腈酮肟)硫代磷酰氯的合成:稱(chēng)取2-羥亞胺基-2-苯乙腈
3.1g用乙腈溶解；常溫下，將溶液逐滴加入20mL乙腈溶解的O-乙基硫代磷酰氯3.83g、粉狀K2CO3 8.7g混合溶液，滴完后，繼續(xù)反應(yīng)I小時(shí)，反應(yīng)完畢后真空過(guò)濾，蒸去溶劑，得黃色油狀物，柱層析，用體積比8:1的石油醚/ 二氯甲烷洗滌，蒸去溶劑得淡黃色油狀液體6.2g ；
[0021]82)辛硫磷半抗原:0_乙基-0-(苯乙腈酮肟)-N-(丁酸)硫代磷酸酯的合成:稱(chēng)取4-氨基丁酸0.54g、K0H 0.78g，溶解于6mL甲醇中，冰水浴冷卻至0_10°C，攪拌下緩慢加入溶解于6mL甲醇溶液的步驟(81)得到的黃色油狀液體1.25g，保溫反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完畢后，用體積比7:1的石油醚/乙醚洗漆，水層調(diào)pH = 3.0后用乙醚提取，無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，得淺黃色油狀物O-乙基-0-(苯乙腈酮肟)-N-(丁酸)硫代磷酸酯1.2g。
[0022]有益效果:現(xiàn)對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具備以下優(yōu)點(diǎn):
[0023]I)特異性強(qiáng)，敏感性高。本膠體金試紙條以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中的膠體金顆粒與抗體分子之間無(wú)共價(jià)鍵，兩者通過(guò)異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金的標(biāo)記對(duì)單克隆抗體的特異性和親和力影響很小，而且有較高的標(biāo)記率。因此，試紙條很好的保留了單克隆抗體的特性，具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量可達(dá)到40ppb。
[0024]2)簡(jiǎn)便、快速。在使用本膠體金試紙條時(shí)，無(wú)需任何其他輔助儀器，可現(xiàn)場(chǎng)操作，只要將檢測(cè)樣加入樣品墊，在5至10分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。
[0025]3)結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。膠體金試紙條的檢測(cè)結(jié)果以纖維素膜上的顯色情況來(lái)判斷。如果樣品中有待測(cè)物時(shí)，待測(cè)物和金標(biāo)抗體結(jié)合形成抗原一金標(biāo)抗體復(fù)合物，并且繼續(xù)上移，遇隱形檢測(cè)線T線不顯色或者顯色很弱即表示檢測(cè)樣品陽(yáng)性或者弱陽(yáng)性；如果樣品中沒(méi)有待測(cè)樣品時(shí)，金標(biāo)抗體繼續(xù)上移，遇隱形檢測(cè)線T線顯示一條清晰紅線即表示檢測(cè)樣品陰性。隱形對(duì)照線C線顏色的有或無(wú)表示此試紙條的有效或無(wú)效。結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單明了。
[0026]4)節(jié)省費(fèi)用，適用范圍廣，便于推廣。使用膠體金試紙條進(jìn)行檢測(cè)，比使用儀器和ELISA試劑盒檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)的費(fèi)用大幅降低。再者，試紙條的使用范圍廣，可滿(mǎn)足不同層次人員的需要，便于推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場(chǎng)前景和明顯的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
[0027]本發(fā)明的辛硫磷膠體金試紙條，無(wú)需專(zhuān)業(yè)操作人員及任何輔助類(lèi)儀器，根據(jù)反應(yīng)所顯現(xiàn)的條帶幾分鐘內(nèi)即可判定結(jié)果，不僅操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果直觀準(zhǔn)確、成本低，并且可以在室外進(jìn)行檢測(cè)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1辛硫磷快速檢測(cè)試紙條俯瞰結(jié)構(gòu)示意圖；
[0029]圖2辛硫磷快速檢測(cè)試紙條剖面結(jié)構(gòu)示意圖；
[0030]圖中，1:襯板,2:樣品墊,3:金標(biāo)結(jié)合墊,4:纖維素膜,5:隱形檢測(cè)線,6:隱形對(duì)照線，7:吸水墊，8-1:樣品浸入端保護(hù)膜，8-2:手柄端保護(hù)膜，9:標(biāo)識(shí)線；
[0031]圖3、羊硫憐快速檢測(cè)試紙條結(jié)果判定不意圖；
[0032]圖中，A為陰性樣品檢測(cè)結(jié)果，B為弱陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果，C為強(qiáng)陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果，D和E為試紙條失效。

【具體實(shí)施方式】
[0033]要制備辛硫磷快速檢測(cè)試紙條，首先要制備偶聯(lián)辛硫磷半抗原的載體蛋白，用于印制檢測(cè)線，進(jìn)而制備辛硫磷的金標(biāo)抗體，用于制備金標(biāo)抗體纖維棉，其次需要制備兔抗鼠IgG抗體，用于制備對(duì)照線。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0034]實(shí)施例1
[0035]一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條，所述試紙條含有襯板I和依次排列在襯板上的樣品墊2、金標(biāo)結(jié)合墊3、纖維素膜4和吸水墊7，所述襯板I為不吸水的韌性材料，所述的韌性材料用硬質(zhì)塑膠條制成，所述金標(biāo)結(jié)合墊3內(nèi)吸附有辛硫磷金標(biāo)抗體，所述纖維素膜4上有隱形檢測(cè)線5和隱形對(duì)照線6，所述隱形檢測(cè)線5用辛硫磷半抗原偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制，所述隱形對(duì)照線6用兔抗鼠IgG抗體印制。所述吸水墊7為吸水能力較強(qiáng)的吸水濾紙或?yàn)V油紙。辛硫磷金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的辛硫磷單克隆抗體。偶聯(lián)辛硫磷半抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA。在試紙條的吸水墊上設(shè)有手柄端保護(hù)膜8-2，在樣品墊2上設(shè)有樣品浸入端保護(hù)膜8-1。所述的保護(hù)膜為不透明的膠膜，樣品墊2、金標(biāo)結(jié)合墊3對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有待測(cè)樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向樣品墊一側(cè)約0.5厘米處。樣品墊2用玻璃纖維棉制成。纖維素膜為硝酸纖維素膜。
[0036]實(shí)施例2
[0037]與實(shí)施例1基本一樣，區(qū)別在于，所述的韌性材料用不吸水硬紙條制成，所述吸水墊7為吸水能力較強(qiáng)的濾油紙。偶聯(lián)辛硫磷半抗原的載體蛋白為雞卵清白蛋白0VA。樣品墊2用尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜制成。纖維素膜為純纖維素膜。
[0038]實(shí)施例3
[0039]與實(shí)施例1基本一樣，區(qū)別在于，所述的韌性材料用硬質(zhì)塑膠條制成，吸水墊7為吸水能力較強(qiáng)的吸水濾紙。偶聯(lián)辛硫磷半抗原的載體蛋白為人血清白蛋白HAS。樣品墊2用聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜制成。纖維素膜為羧化纖維素膜。
[0040]實(shí)施例4
[0041]1、辛硫磷半抗原(O-甲基-0-(對(duì)-二甲磺酰氨基苯基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯)的合成
[0042]①O-甲基-0-(2, 6- 二氯-對(duì)-甲苯基)硫代磷酰氯的合成。稱(chēng)取2，6_ 二氯對(duì)甲酚3.7g (約21mmol)用乙腈溶解；常溫下，將溶液逐滴加入20mL乙腈溶解的O-甲基硫代磷酰氯3.83g (約23.2mmol)、粉狀K2C03 8.7g (約63mmol)混合溶液，滴完后，繼續(xù)反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)完畢后真空過(guò)濾，蒸去溶劑，得黃色油狀物。柱層析，用石油醚/ 二氯甲烷(8:1，體積比)洗滌，蒸去溶劑得淡黃色油狀液體6.3g。
[0043]②O-甲基-0-(2，6-二氯-對(duì)-甲苯基)-N_(丁酸)硫代磷酸酯的合成。稱(chēng)取4-氨基丁酸0.54g (約5.2mmol)、KOH 0.78g (約11.4mmol)，溶解于6mL甲醇中，冰水浴冷卻至0-10°C,攪拌下緩慢加入溶解于6mL甲醇溶液的(I) 1.18g,保溫反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用石油醚/乙醚(7:1，體積比)洗滌，水層調(diào)pH = 3.0后用乙醚提取，無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，得淺黃色油狀物O-甲基-O- (2，6- 二氯-對(duì)-甲苯基)-N- ( 丁酸)硫代磷酸酯 0.9g。
[0044]2、辛硫磷半抗原與載體蛋白偶聯(lián)
[0045]利用活潑酯法(Active Ester method,簡(jiǎn)稱(chēng)AE法)將具有羧基末端(-C00H)的半抗原偶聯(lián)到大分子的蛋白質(zhì)上。分別稱(chēng)取0.1mmol半抗原與0.1mmol NHS，用600 μ I DMF溶解于反應(yīng)裝置中；稱(chēng)取0.1mmol DCC，用400μ I DMF溶解；將DCC/DMF溶液緩慢滴加到上述反應(yīng)裝置中。在磁力攪拌下室溫密封反應(yīng)7小時(shí)。反應(yīng)終液置4°C冰箱冷卻2小時(shí)以上，經(jīng)8000rpm離心5分鐘,取上清活潑酯液十分緩慢的加入到5ml 15mg/ml的BSA蛋白中，反應(yīng)在磁力攪拌下室溫?cái)嚢?小時(shí)。待反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液置于透析袋內(nèi)，于0.02mol/LpH6.8的PB緩沖液中4°C攪拌透析，每四小時(shí)換一次透析液，共透析60小時(shí)。透析結(jié)束后將透析袋中的液體取出，經(jīng)4°C 12000rpm離心5分鐘，取上清分裝保存于_20°C冰箱中。
[0046]同法，用OVA或HAS代替BSA制備人工抗原HAPTEN-0VA或HAPTEN-HAS。
[0047]3、抗辛硫磷單克隆抗體的制備
[0048]以50 μ g?100 μ g每只的抗原量免疫6?8周齡健康的雌性BALB/c小鼠。每次間隔時(shí)間為2?3周，最后一次超強(qiáng)免疫后3天，無(wú)菌條件下取出小鼠脾細(xì)胞，將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以5:1的細(xì)胞數(shù)量用PEG介導(dǎo)的方法融合。融合后置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)孔1/3?1/2時(shí)，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行3次優(yōu)先稀釋克隆，然后擴(kuò)大培養(yǎng)，建立雜交瘤細(xì)胞株。將特異性的細(xì)胞株移入高密度細(xì)胞培養(yǎng)器(CELLINE 350)中培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液并用Protein A進(jìn)行抗體純化，之后用超濾離心管去鹽，冷凍抽干獲得干粉狀抗體，并于_20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0049]4、金標(biāo)抗體和金標(biāo)結(jié)合物墊的制備
[0050]采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法，制備平均直徑在40nm的膠體金懸浮液。在回流條件下，把10ml 0.01%的氯金酸溶液加熱至沸騰,不停的攪拌,迅速加入1.1ml 1%的檸檬酸三鈉。當(dāng)反應(yīng)溶液顏色變成葡萄紅色時(shí)繼續(xù)加熱攪拌5min。冷卻至室溫后，加入
0.05%的疊氮化鈉4°C保存。膠體金在與抗體標(biāo)記前以0.2mol的K2CO3溶液調(diào)到pH為8.2左右，采用經(jīng)典N(xiāo)aCl滴定法確定膠體金溶液與辛硫磷抗體的最佳標(biāo)記量為5 μ g/ml。然后按最佳標(biāo)記量進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記I小時(shí)后，攪拌下加入10% BSA (使最終BSA濃度為1% )，孵育I小時(shí)后4°C 1000rpm離心25min，并去上清。再用和所用膠體金溶液同體積的2% BSA溶液重懸后4°C 1000rpm離心25min，重復(fù)兩次。最后，用1/5膠體金溶液體積的TB溶液(含3%85八、3%蔗糖、0.0111101/1硼酸鈉和0.05%疊氮化鈉)重懸，4°C保存。用XYZ-3000三維噴膜儀把4%的BSA溶液以8 μ 1/cm的量噴在玻璃棉上，使用干燥箱42°C干燥50min，再把金標(biāo)記抗體以7 μ 1/cm的量噴在玻璃棉上，干燥箱42°C干燥50min，真空干燥保存。
[0051]5、兔抗鼠IgG抗體的制備
[0052]將純化得到的IgG按50?100 μ g/kg體重經(jīng)皮下和肌肉注射家兔3?4次，末次注射10天后，以ELISA測(cè)定其血清效價(jià)達(dá)到1:2000以上時(shí)，心臟采血，分離收集高免血清。以飽和硫酸銨法提取兔抗鼠IgG抗體，用于膠體金層析檢測(cè)試紙條對(duì)照線的制備。
[0053]6、偶聯(lián)抗原和兔抗鼠包被纖維素膜
[0054]用XYZ-3000三維噴膜儀把濃度為1.3mg/ml的偶聯(lián)抗原以1.2 μ 1/cm的量噴在纖維素膜的偏下側(cè)，作為檢測(cè)線。用XYZ-3000三維噴膜儀把濃度為0.6mg/mL的兔抗鼠IgG以1.2 μ Ι/cm的量噴在纖維素膜的偏上側(cè)，作為對(duì)照線，兩線間隔5mm。
[0055]7、快速試紙條的組裝
[0056]把纖維素膜粘貼在襯板中間部位上，吸水墊粘貼在纖維素膜上側(cè)和纖維素膜重疊1mm。金標(biāo)結(jié)合物墊粘貼在NC膜下方重疊1mm。樣品墊粘貼在進(jìn)標(biāo)結(jié)合物墊下方重疊2mm。組裝好的試紙板用斬切機(jī)切成4.08mm寬的試紙條。
[0057]8、快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)反應(yīng)原理
[0058]當(dāng)待測(cè)樣品溶液加入試紙條或試紙卡測(cè)試端后，待測(cè)溶液通過(guò)虹吸作用帶動(dòng)待測(cè)物及金標(biāo)結(jié)合物墊中的金標(biāo)抗體一起向纖維素膜擴(kuò)散，并最終滲入吸水墊端。在擴(kuò)散過(guò)程中，如果樣品中有待測(cè)物時(shí)，待測(cè)物和金標(biāo)抗體結(jié)合，進(jìn)而占據(jù)了金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上檢測(cè)線(半抗原與載體蛋白的結(jié)合物)的結(jié)合，使檢測(cè)線不顯色或者顯色很弱即表示檢測(cè)樣品陽(yáng)性或者弱陽(yáng)性；如果樣品中沒(méi)有待測(cè)樣品時(shí)，金標(biāo)抗體在上移過(guò)程中，遇檢測(cè)線顯示一條清晰紅線即表示檢測(cè)樣品陰性。同樣，金標(biāo)抗體也與纖維素膜上的對(duì)照線(兔抗鼠IgG)結(jié)合，使對(duì)照線顯紅色。對(duì)照線顏色的有或無(wú)分別表示此試紙條的有效或無(wú)效。
[0059]實(shí)施例5:(應(yīng)用實(shí)施例)
[0060]1、檢測(cè)樣品液的制備
[0061]I)水檢測(cè)樣品溶液的預(yù)處理
[0062]取水樣離心(4000rpm，5min)或用濾紙過(guò)濾后，I比I (V/V)與10%甲醇PBS混勻，取150 μ I用于進(jìn)行檢測(cè)。
[0063]2)蘋(píng)果樣品液的制備
[0064]取待測(cè)樣品去皮，用攪拌機(jī)勻漿。稱(chēng)取10.0g樣品加入10.0ml乙腈，漩渦振蕩2分鐘，加入1.0g NaCl, 4.0g MgSO4，劇烈震蕩2分鐘，4000rpm離心10分鐘，吸取上清液2.0ml,溫和氮?dú)獯蹈?。用Iml PBS緩沖液(含5%甲醇)定容，用漩渦振蕩器振蕩2分鐘，取1.0ml液體12000rpm離心10分鐘，再?gòu)纳锨逯腥〕?50 μ I用于檢測(cè)。
[0065]3)包菜樣品液的制備
[0066]取待測(cè)樣品洗凈，晾干,用攪拌機(jī)勻漿。稱(chēng)取10.0g樣品加入10.0ml乙腈，漩渦振蕩2分鐘，加入1.0g NaCl,4.0g MgSO4,劇烈震蕩2分鐘，4000rpm離心10分鐘，吸取上清液
2.0ml，溫和氮?dú)獯蹈?。用Iml PBS緩沖液(含5%甲醇)定容，用漩渦振蕩器振蕩2分鐘，取1.0ml液體12000rpm離心10分鐘，再?gòu)纳锨逯腥〕?50 μ I用于檢測(cè)。
[0067]2、檢測(cè)及結(jié)果判斷
[0068]如圖3所示:將辛硫磷試紙條樣品端插入以上預(yù)處理的各待檢測(cè)樣品中，插入深度不超過(guò)標(biāo)記線9，待測(cè)溶液通過(guò)虹吸作用帶動(dòng)待測(cè)物及金標(biāo)結(jié)合墊中的金標(biāo)抗體一起向纖維素膜擴(kuò)散，并最終滲入吸水墊端。在擴(kuò)散過(guò)程中，如果樣品中有待測(cè)物濃度大于I60ppb時(shí)，阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上檢測(cè)線(半抗原與載體蛋白的結(jié)合物)的結(jié)合，使檢測(cè)線不顯色即表示檢測(cè)樣品為陽(yáng)性(如圖3C);如果樣品中待測(cè)物在40?160ppm時(shí)，阻止部分金標(biāo)抗體與纖維素膜上檢測(cè)線的結(jié)合，使檢測(cè)線顯示很弱的紅色即表示檢測(cè)樣品為弱陽(yáng)性(如圖3B);如果樣品中待測(cè)物濃度小于40ppb時(shí)，不能阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上檢測(cè)線的結(jié)合，使檢測(cè)線顯示一條清晰紅線即表示檢測(cè)樣品為陰性(如圖3A)。同樣，金標(biāo)抗體也與纖維素膜上的對(duì)照線(兔抗鼠IgG)結(jié)合，使對(duì)照線顯紅色，對(duì)照線顏色的有或無(wú)分別表示此試紙條的有效或無(wú)效(如圖3A、B、C為有效D、E為無(wú)效)。5分鐘判定檢測(cè)結(jié)果。
[0069]實(shí)施例6
[0070]1.特異性試驗(yàn)
[0071]按實(shí)施例5所述的方法進(jìn)行試驗(yàn)，將與辛硫磷結(jié)構(gòu)相似的五種農(nóng)藥(毒死蜱、殺螟硫磷、甲基對(duì)硫磷、辛硫磷、倍硫磷)的標(biāo)準(zhǔn)品配成1ppm,用本發(fā)明試紙條進(jìn)行檢測(cè)，纖維素膜上檢測(cè)線與對(duì)照線呈“ I I ”排列，即辛硫磷試紙條與毒死蜱、殺螟硫磷、甲基對(duì)硫磷、辛硫磷、倍硫磷這五種農(nóng)藥沒(méi)有交叉反應(yīng)。從而可以斷定此試紙條特異性很好，在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)不會(huì)受到其他樣品的干擾。
[0072]2.敏感性和均一性試驗(yàn)
[0073]按實(shí)施例5所述的方法進(jìn)行試驗(yàn),用本發(fā)明試紙條進(jìn)行檢測(cè)0ppb、20ppb、40ppm、80ppb、160ppb、320ppb、640ppb 的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù) 10 次，其中 160ppb、320ppb 和 640ppb的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果為纖維素膜上的對(duì)照線呈一條紅色線，即為陽(yáng)性；40ppm和SOppb的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果為纖維素膜上的對(duì)照線呈一條紅色線，檢測(cè)線呈一條很弱的紅色線，即為弱陽(yáng)性；0ppb和20ppb的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果為纖維素膜上的檢測(cè)線和對(duì)照線呈兩條紅色線。因此本發(fā)明檢測(cè)試紙條的靈敏度為40ppb。此10檢測(cè)顯色深度均一，檢測(cè)結(jié)果顯示一致。
[0074]3.穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0075]將試紙條放入鋁鉬袋中真空包裝，并且室溫保存，6個(gè)月后各項(xiàng)指標(biāo)均符合上1-2項(xiàng)指標(biāo)，即檢測(cè)其他相似農(nóng)藥無(wú)交叉反應(yīng)，靈敏度達(dá)40ppb，檢測(cè)顯色深度均一，反應(yīng)結(jié)果一致。
【權(quán)利要求】
1.一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述試紙條含有襯板(1)和依次排列在襯板(1)上的樣品墊(2 )、金標(biāo)結(jié)合墊(3 )、纖維素膜(4 )和吸水墊(7 )，所述金標(biāo)結(jié)合墊(3)內(nèi)吸附有辛硫磷金標(biāo)抗體，所述纖維素膜(4)上有隱形檢測(cè)線(5)和隱形對(duì)照線(6)，所述隱形檢測(cè)線(5)用辛硫磷半抗原偶聯(lián)的載體蛋白溶液印制，所述隱形對(duì)照線(6)用兔抗鼠IgG抗體印制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述辛硫磷金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的辛硫磷單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述的偶聯(lián)辛硫磷半抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條，其特征在于，在試紙條的吸水墊上設(shè)有手柄端保護(hù)膜，在樣品墊上設(shè)有樣品浸入端保護(hù)膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述的樣品墊用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜中的一種或幾種制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述的纖維素膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜中的一種或幾種。
7.權(quán)利要求1所述的一種辛硫磷膠體金快速檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)辛硫磷半抗原的合成； 2)辛硫磷半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到辛硫磷半抗原偶聯(lián)的載體蛋白溶液； 3)辛硫磷金標(biāo)抗體的制備； 4)金標(biāo)結(jié)合墊的制備； 5)兔抗鼠IgG抗體的制備； 6)辛硫磷半抗原偶聯(lián)的載體蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗體包被纖維素膜； 7)試紙條的組裝。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的辛硫磷金快速檢測(cè)試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟1)辛硫磷半抗原的合成方法如下: 81)0-乙基-0-(苯乙腈酮肟)硫代磷酰氯的合成:稱(chēng)取2-羥亞胺基-2-苯乙腈3.1 g用乙腈溶解；常溫下，將溶液逐滴加入20 mL乙腈溶解的0-乙基硫代磷酰氯3.83 g、粉狀K2C03 8.7 g混合溶液，滴完后，繼續(xù)反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)完畢后真空過(guò)濾，蒸去溶劑，得黃色油狀物，柱層析，用體積比8:1的石油醚/ 二氯甲烷洗滌，蒸去溶劑得淡黃色油狀液體6.2 g ； 82)辛硫磷半抗原:0_乙基-0-(苯乙腈酮肟)-N-( 丁酸)硫代磷酸酯的合成:稱(chēng)取4_氨基丁酸0.54 g、K0H 0.78 g，溶解于6 mL甲醇中，冰水浴冷卻至0_10 °C，攪拌下緩慢加入溶解于6 mL甲醇溶液的步驟(81)得到的黃色油狀液體1.25 g，保溫反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完畢后，用體積比7:1的石油醚/乙醚洗滌，水層調(diào)pH = 3.0后用乙醚提取，無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，得淺黃色油狀物0-乙基-0-(苯乙腈酮肟)-N- ( 丁酸)硫代磷酸酯1.2g°
【文檔編號(hào)】G01N33/531GK104237507SQ201410499865
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】韓志成 申請(qǐng)人:句容市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心