專利名稱：腦淀粉樣血管病的預防和治療的制作方法
腦淀粉樣血管病的預防和治療相關申請的交叉引用無。
背景技術：
突變型人淀粉樣前體蛋白(APP)在各種轉基因小鼠中的過度表達導致了數種 阿爾茨海默氏癥(AD)型損害[綜述見D. Games等，JAlzheimers Dis 9，133-49 (2006)； J. Gotz等，Mol Psychiatry 9，664-83 (2004)]。這些包括實質β淀粉樣蛋白(Αβ)斑塊、 神經炎病理、突觸丟失和神經膠質增生的發展。許多報道顯示，在臨床前研究中，主動(見 D. Schenk 等，Nature 400，173-7 (1999) ；D. L. Dickstein 等，Faseb J20，426-33 (2006)) 和被動的(見 F. Bard 等，Nat Med 6，916-9 (2000) ；M. Buttini 等，J Neurosci 25， 9096-101(2005) ；D. M. Wilcock 等，JNeuroinflammation 1，24(2004))Aβ 免疫治療方法 對減少或消除這些病理有效(見 R. P. Brendza & D. Μ. HoIzman，Alzheimer Dis Assoc Disord20，118-23(2006) ;CA. Lemere 等，Rejuvenation Res 9，77-84 (2006))。此外，許 多研究在各種認知試驗中顯示出改進(見D.M. Wilcock等，同上；C. Janus等，Nature 408，979-82 (2000) ；D. Morgan 等，Nature 408，982-5 (2000))。這些發現得到了從入選 Αβ免疫治療臨床試驗的患者的記憶測試和腦部神經病理學檢查得到的相關發現的支持 (ΑΝ1792)，見 J. A. Nicoll 等，Nat Med 9，448-52 (2003) ；I. Ferrer 等，Brain Pathol 14， 11-20(2004) ；S. Gilman 等，Neurology 64，1553-62 (2005)。近來，AD病理學的另一常見方面，血管Αβ (Vai3)已成為APP轉基因動物臨床 前研究的詳細研究主題。尤其是，有報道稱，被動免疫與Μβ和微出血的增加有關(見 D.M. Wilcock 等，同上；Μ.Μ. Racke 等，J Neurosci 25，629-36 (2005))。然而，所預示的臨 床意義仍不清楚，特別是鑒于這些相同研究的某一些中的有利行為后果(見D. MWilcock 等，同上)，未處理和已處理轉基因小鼠中，血鐵黃素陽性血管的血管形態學缺乏超微結構 的差異(見 G.J. Burbach 等，Neurobiol Aging 28，202-12 (2007))，以及特別是，在正在進 行的臨床試驗中，缺乏大出血或中風相關的因果關系的證據。另外，對Μβ最終受Αβ免疫 治療方法影響的程度知之甚少；例如，慢性治療模式的后果度量是否與更急性的研究不同。 例如，盡管較長的治療事實上可以預防或逆轉血管淀粉樣蛋白，但尚不可知報道過的VAi3 增加是否代表了與Αβ清除相關的暫時現象。最后，轉基因小鼠中的VAi3效應還可能根據 所采用的APP突變種而不同，因為Αβ 40與Αβ 42產生的相對程度很可能影響Aβ的聚集 特性以及某些抗體、尤其是那些具有C末端表位的抗體的結合效率。發明概述本發明提供治療性治療CAA的方法。該方法包括向患有或懷疑患有CAA的患者 施用有效方案的藥劑。在一些方法中，該藥劑是對Αβ的N末端具有特異性并從而治療 患者的抗體。任選，該藥劑是結合在Αβ的1-5位殘基內的抗體。任選，該抗體是人源化、 人或嵌合的抗體。任選，該人源化抗體是3D6。任選，該3D6人源化抗體是巴比紐珠單抗 (bapineuzumab)。任選，該人源化抗體是12A11。在一些方法中，該藥劑是Aβ的片段。任選，該片段始于Aβ的1位殘基，終于Aβ
7的5-10位殘基之一。任選，該片段是Αβ 1-7。任選，該Αβ片段與可藥用的佐劑一起給藥。 任選，該Αβ片段與幫助該片段誘導針對該片段的抗體的載體相連。任選，該載體與Aβ片 段的C末端相連。本發明的一些方法進一步包括確定患者患有CAA，其中確定步驟在給藥步驟之前 發生。在一些方法中，確定步驟確定患者罹患CAA的臨床癥狀。在治療性治療CAA的一些方法中，患者腦中缺乏阿爾茨海默氏癥的特征性斑塊。 任選，患者腦中缺乏阿爾茨海默氏癥的特征性斑塊和患者缺乏阿爾茨海默氏癥的癥狀。在 治療性治療CAA的一些方法中，患者已有心臟病發作或中風。任選，該方法包括施用劑量為約0. 01至約5mg/kg的抗體。任選，該方法包括施用 劑量為約0. 1至約5mg/kg的抗體。任選，該方法包括施用約0. 5mg/kg的劑量。任選，該方 法包括施用約1. 5mg/kg的劑量。任選，該方法包括施用約0. 5至約3mg/kg的劑量。任選， 該方法包括施用約0.5至約1.5mg/kg的劑量。任選，該方法包括多次施用抗體。任選，該 抗體每周一次至每季一次給藥。任選，該抗體每13周給藥一次。任選，該抗體經靜脈內或 皮下給藥。任選，抗體按照足以使患者抗體的平均血清濃度維持在1-15 μ g抗體/ml血清的 范圍內并從而治療患者的方案給藥。任選，平均血清濃度在I-IOyg抗體/ml血清的范圍 內。任選，平均血清濃度在1-5 μ g抗體/ml血清的范圍內。任選，平均血清濃度在2-4 μ g 抗體/ml血清的范圍內。任選，抗體按照足以使抗體的平均血清濃度維持至少一年的方案 給藥。任選，抗體的平均血清濃度維持至少6個月。在藥劑是抗體的一些方法中，任選進一步包括測量血清中抗體的濃度，以及如果 測得的濃度落在范圍之外，則進行方案調整。在藥劑是抗體的一些方法中，任選進一步包括 測量血清中抗體的濃度，以及如果測得的濃度落在范圍之外，則進行方案調整。任選，抗體按照足以使患者抗體的平均血清濃度維持在1-15 μ g抗體/ml血清的 范圍內并從而治療患者的方案經靜脈內給藥。任選，每月一次靜脈內施用0. 5-1. Omg/kg的 劑量。任選，每月一次靜脈內施用0. 1-1. Omg/kg的劑量。任選，抗體經皮下給藥。任選，抗體以每周一次至每月一次的頻率經皮下給藥。任 選，抗體每周一次或每兩周一次皮下給藥。任選，抗體以約0. 01至約0. 35mg/kg的劑量皮 下給藥。任選，抗體以約0.05至約0.25mg/kg的劑量皮下給藥。任選，抗體以約0. 015至 約0. 2mg/kg的劑量每周一次至每兩周一次皮下給藥。任選，抗體以約0. 05至約0. 15mg/kg 的劑量每周一次至每兩周一次皮下給藥。任選，抗體以約0. 05至約0. 07mg/kg的劑量每周 一次皮下給藥。任選，抗體經以0.06mg/kg的劑量每周一次皮下給藥。任選，抗體以約0.1 至約0. 15mg/kg的劑量每兩周一次皮下給藥。任選，抗體以約0. 01至約0. 6mg/kg的劑量和每周一次至每月一次的頻率皮下給 藥。任選，抗體以約0.05至約0.25mg/kg的劑量皮下給藥。任選，抗體以約0. 015至約 0. 2mg/kg的劑量每周一次至每兩周一次皮下給藥。任選，抗體以約0. 05至約0. 15mg/kg的 劑量每周一次至每兩周一次皮下給藥。任選，抗體以約0. 05至約0. 07mg/kg的劑量每周一 次皮下給藥。任選，抗體以0.06mg/kg的劑量每周一次皮下給藥。任選，抗體以約0.1至約 0. 15mg/kg的劑量每兩周皮下給藥。任選，抗體以約0. 1至約0. 3mg/kg的劑量每月一次皮 下給藥。任選，抗體以0. 2mg/kg的劑量每月給藥一次。
在本發明的一些方法中，進一步包括監測CAA響應給藥步驟的體征或癥狀的變 化。本發明的一些方法進一步包括施用有效治療CAA的第二藥劑。本發明提供了實現CAA預防的方法。該方法包括向易患CAA的患者施用有效方案 的藥劑。該藥劑是對Αβ的N末端具有特異性的抗體，或者，該藥劑在向患者給藥后誘導這 樣的抗體，從而實現患者的預防。本發明提供了藥劑在治療或預防阿爾茨海默氏癥中的應 用，其中所述藥劑是對Αβ的N末端具有特異性的抗體或在向患者給藥后誘導這樣的抗 體。本發明提供了減少患者的血管淀粉樣蛋白的方法。該方法包括按照有效去除血 管淀粉樣蛋白和減少腦微出血發生率相關的治療方案施用對Αβ的N末端具有特異性的 抗體。一些方法進一步包括通過MRI監測患者的腦微出血。一些方法進一步包括通過PET 掃描，監測患者的血管淀粉樣蛋白的去除。任選，在一些方法中，治療方案是長期治療方案。 任選，在一些方法中，治療方案包括0. 01-5mg/kg患者體重和每周一次至每季一次給藥的 抗體劑量。任選，在一些方法中，抗體的劑量為0. l-5mg/kg。任選，在一些方法中，劑量為 約0. 5mg/kg。任選，在一些方法中，劑量為約1. 5mg/kg。任選，在一些方法中，劑量為約0. 5 至約3mg/kg。任選，在一些方法中，劑量為約0.5至約1.5mg/kg。任選，在一些方法中，劑 量每13周施用一次。任選，在一些方法中，抗體經靜脈內或皮下給藥。任選，藥劑是結合在 Αβ的1-5位殘基內的抗體。任選，抗體是人源化、人或嵌合的抗體。任選，該人源化抗體是 3D6。任選，3D6人源化抗體是巴比紐珠單抗(bapineuzumab)。任選，人源化抗體是12A11。本發明提供了治療阿爾茨海默氏癥的方法。該方法包括以減少或抑制血管致淀 粉樣變(amyloidogenic)病理的發展、使微出血最少化、和/或減少或抑制A β斑塊的發展 的藥劑量，施用對Αβ的N末端具有特異性的抗體。任選，在一些方法中，抗體結合在Αβ 的1-5位殘基內。任選，抗體是人源化、人或嵌合的抗體。任選，人源化抗體是3D6。任選， 3D6人源化抗體是巴比紐珠單抗(bapineuzumab)。任選，人源化抗體是12A11。本發明提供了治療阿爾茨海默氏癥的方法，其包括以減少或抑制血管致淀粉樣 變病理的發展、使微出血最少化、和/或減少或抑制神經炎病理的發展的劑量，施用對Αβ 的N末端具有特異性的抗體。任選，在一些方法中，抗體結合在Aβ的1-5位殘基內。任選， 抗體是人源化、人或嵌合的抗體。任選，人源化抗體是3D6。任選，3D6人源化抗體是巴比 紐珠單抗(bapineuzumab)。任選，人源化抗體是12A11。本發明提供了治療阿爾茨海默氏癥的方法，其包括以減少或抑制血管致淀粉 樣變病理、使微出血最少化、和/或改善患者認知功能的劑量，施用對Αβ的N末端具有 特異性的抗體。任選，在一些方法中，抗體結合在Αβ的1-5位殘基內。任選，抗體是人 源化、人或嵌合抗體。任選，人源化抗體是3D6。任選，3D6人源化抗體是巴比紐珠單抗 (bapineuzumab)。任選，人源化抗體是12A11。任選，在一些治療阿爾茨海默氏癥的方法中，減少或抑制血管致淀粉樣變病理是 對血管Αβ累積的預防或清除血管Αβ。本發明進一步提供了適用于上述方法的診斷試劑盒。這樣的試劑盒包括與具有 Αβ的1-10位殘基的表位特異性結合的抗體。一些試劑盒帶有標簽，描述抗體在體內診斷 或監測阿爾茨海默氏癥中的用法。本發明進一步提供了適用于上述方法的治療CAA的藥劑盒。這樣的藥劑盒包括含有制劑的小玻璃瓶。本發明的一些藥劑盒包括含有制劑的小玻璃瓶，該制劑包含約0. 5至 3mg/kg的人源化抗Αβ抗體。本發明的一些藥劑盒包括含有制劑的小玻璃瓶，該制劑包含
1.約IOmg至約25011^人源化抗六3抗體，ii.約4%甘露醇或約150mMNaCl，iii.約5mM 至約IOmM組氨酸，和iv.約IOmM蛋氨酸。一些藥劑盒包括監測施用制劑的患者的CAA的 說明書。任選，說明書包括i.通過MRI監測患者的腦微出血，或ii.通過PET掃描監測患 者的血管淀粉樣蛋白的去除。本發明進一步提供了適用于上述方法的治療阿爾茨海默氏癥的藥劑盒。這樣的 藥劑盒包括含有制劑的小玻璃瓶，該制劑包括i.約101^至約2501^人源化抗4 0抗體， ii.約4%甘露醇或約150mM NaCl, iii.約5mM至約IOmM組氨酸，和iv.約IOmM蛋氨酸。一 些藥劑盒含有監測施用制劑的患者的阿爾茨海默氏癥的說明書。任選，說明書包括i.通 過MRI監測患者的腦微出血，或ii.通過PET掃描監測患者的血管淀粉樣蛋白的去除。本發明進一步提供了適用于上述方法的治療CAA和阿爾茨海默氏癥的藥劑盒。這 樣的藥劑盒包括含有制劑的小玻璃瓶，該制劑包括i.約101^至約2501^人源化抗々3抗 體，ii.約4%甘露醇或約150mMNaCl，iii.約5mM至約IOmM組氨酸，和iv.約IOmM蛋氨 酸。一些藥劑盒包括監測制施用藥劑的患者的CAA和阿爾茨海默氏癥的說明書。任選，說 明書包括i.通過MRI監測患者的腦微出血，或ii.通過PET掃描監測患者的血管淀粉樣 蛋白的去除。任選，抗體以約0. 05至約0. 5mg/kg的劑量給藥。任選，抗體以約1至約40mg的 劑量和每周一次至每月一次的頻率給藥。任選，抗體以約5至約25mg的劑量和每周一次至 每月一次的頻率給藥。任選，抗體以約2. 5至約15mg的劑量和每周一次至每月一次的頻率給藥。任選，抗體以約1至約12mg的劑量每周一次至每兩周一次給藥。任選，抗體以約
2.5至約IOmg的劑量每周一次至每兩周一次給藥。任選，抗體以約2. 5至約5mg的劑量每 周給藥一次。任選，抗體以約4至約5mg的劑量每周給藥一次。任選，抗體以約7至約IOmg 的劑量兩周給藥一次。附圖簡述圖Ia顯示了硫磺素S染色，圖Ib顯示了 18月齡PDAPP小鼠的腦中線血管中Αβ 的3D6免疫標記。圖Ic顯示的是人AD組織，圖Id顯示的是具有3D6免疫標記的VA β的 PDAPP小鼠中柔腦膜和淺表實質的血管。比例尺=100 μ m。圖2a顯示了未處理的12月齡小鼠的腦，圖2b顯示了經對照處理的小鼠腦，圖 2c顯示了經3mg/kg 3D6處理的小鼠的腦，和圖2d顯示了經3mg/kg 266處理的、中線血 管中有3D6免疫標記的VAβ的小鼠腦。比例尺=50μπι。圖顯示了各組中帶有無至少許 VAβ (白色棒)和中度VAβ (交叉線棒)的動物的百分數。圖3a顯示了經對照處理的腦，圖3b顯示了經0. lmg/kg 3D6處理的腦，圖3c顯示 了經0. 3mg/kg 3D6處理的腦，和圖3d顯示了經3mg/kg3D6處理的、柔腦膜血管中有3D6免 疫標記的VAi3的腦。括弧和箭頭表示VAβ，比例尺=100 μ m。圖顯示了各組中帶有無至 少許VAβ (白色棒)和中度VAβ (交叉棒)的動物的百分數。圖4a顯示了 0. lmg/kg 3D6處理的小鼠中，包圍未受患的柔腦膜血管的完整■ 的圓形塊和帶的3D6免疫標記。圖4b顯示了 0. lmg/kg3D6處理的小鼠中，在部分清除過程中的小塊被腐蝕的VA β的3D6免疫標記。比例尺=50 μ m。圖5a和5b顯示，3D6的劑量較低時，大多數動物的VA β被部分清除或阻止而無微 出血的跡象。圖5c顯示在3mg/kg 3D6時，大多數動物的VA β被完全清除或阻止而無微出 血的跡象。圖5d和5e顯示3D6劑量較低時，部分清除部位的微出血。圖5f顯示在3mg/kg 3D6時，完全清除部位的微出血。箭頭指向巨噬細胞。比例尺=100μπι。圖6a顯示了 A研究中對照和處理組的血鐵黃素評定。圖6b顯示了 B研究中的對 照和處理組的血鐵黃素評定。定義術語“基本同一性”表示兩個多肽序列通過例如GAP或BESTFIT程序、采用缺省間 隙加權(default gap weights)進行最優對比時，共有至少65%的序列同一性，優選至少 80%或90%的序列同一性，更優選至少95%的序列同一性或更高(例如，99%的序列同一 性或更高)。優選不相同的殘基位置是因保守氨基酸取代而不同。為了序列比較，通常將一個序列作為參比序列，將測試序列與其進行比較。當采用 序列比較算法時，將測試和參比序列輸入計算機，指定子序列坐標，必要時指定序列算法 程序參數。然后序列比較算法根據指定的程序參數計算測試序列相對于參比序列的百分序 列同一性。序列比較的最優對比可以采用例如，Smith和Waterman, Adv. App 1. Math. 2 482(1981)的局部同源算法，Needleman 和 Wunsch，J. Mol. Biol. 48 =443(1970)的同源對比 算法,Pearson 和 Lipman，Proc. Nat ‘ 1. Acad. Sci. USA 85 2444 (1988)的相似性搜索法，通 過這些算法的計算機化實施(Wisconsin遺傳學軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA， Genetics Computer Group, 575 Science Dr. ,Madison, WI),或通過目檢(一般見 Ausubel 等，同上)進行。適用于確定百分序列同一性和序列相似性的算法的一個例子是BLAST算 法，其在Altschul等，J. Mol. Biol. 215 :403_410 (1990)中有描述。進行BLAST分析的軟件 可以通過國家生物技術中心(NCBI)網站公開獲得。盡管也可以使用自定義參數，但進行序 列比較時通常使用缺省程序參數。對于氨基酸序列，BLASTP程序所使用的缺省是字長(W) 為 3，期望(E)值為 10 以及 BL0SUM62 計分矩陣(參見，Henikoff 和 Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 10915 (1989))。出于將氨基酸取代分類為保守或非保守的目的，氨基酸分組如下1組(疏水側 鏈):正亮氨酸，111討，￡11￡1，財1，1卯，丨16;11組(中性親水側鏈):cys，ser，thr ;III組(酸 性側鏈)asp，glu ;IV組(堿性側鏈)aSn，gln，hiS，lyS，arg ;V組(影響鏈取向的殘基) gly，pro;和VI組(芳香族側鏈):trp, tyr, phe0保守取代包括同類氨基酸間的取代。非 保守取代由這些類別之一的成員與另一類的成員交換來構成。本發明的治療藥劑通常為基本上純的，無有害污染物。這表示藥劑通常具有至少 約(重量/重量)的純度，并且基本沒有干擾蛋白和污染物。有時，藥劑具有至少 約80% w/w，更優選至少約90%或約的純度。然而，采用常規蛋白純化技術，可 以獲得至少約99% w/w的同質肽。分子與靶“特異性結合”或“發生特異性免疫反應”的短語是指在其它生物劑的異 質群體存在下，決定該分子存在的結合反應。因此，在指定的免疫分析條件下，專門的分子 優先與特定靶結合，而不與樣品中存在的其它生物劑以顯著量結合。抗體在這樣的條件下
11與靶的特異性結合需要針對靶的特異性選擇抗體。有許多種免疫分析形式可以用來選擇與 特定蛋白發生特異性免疫反應的抗體。例如，常規用固相ELISA免疫分析來選擇與蛋白發 生特異性免疫反應的單克隆抗體。關于可以用來測定特異性免疫反應性的免疫分析形式和 條件的描述，參見，例如，Harlow 和 Lane (1988) Antibody，A Laboratory Manual (抗體實 驗室手冊)，Cold Spring Habor Publications,New York。實體之間的特異性結合意味著 親和力為至少IO6UO7UO8UO9M-1或IO10 M-1。大于愈1的親和力是優選的。術語“抗體”或“免疫球蛋白”用來包括完整抗體及其結合片段。通常，片 段與衍生它們的完整抗體競爭與抗原片段的特異性結合，包括單獨的重鏈、輕鏈Fab、 Fab' F(ab' )2、Fabc和Fv。片段通過重組DNA技術，或由完整免疫球蛋白的酶或化學分 離產生。術語“抗體”還包括一條或多條與其它蛋白化學結合、或者表示為與其它蛋白的融 合蛋白的免疫球蛋白鏈。術語“抗體”還包括雙特異性抗體。雙特異性或雙功能抗體是具有 兩個不同重/輕鏈對和兩個不同結合位點的人工雜交抗體。雙特異性抗體可以通過多種方 法、包括雜交瘤的融合或Fab'片段的連接來產生。參見，例如，Songsivilai和Lachmarm， Clin. Exp. Immunol. 79 :315_321 (1990) ；Kostelny 等，J. Immunol. 148，1547-1553 (1992)。APP695、APP751和APP7to分別指由人APP基因編碼的695、751和770個氨基酸殘基 的長鏈多肽。見 Kang 等，Nature 325,773(1987) ；Ponte 等，Nature 331,525(1988)；和 Kitaguchi等，Nature 331,530 (1988)。人淀粉樣前體蛋白(APP)內的氨基酸按照APP770 同種型的序列指定編號。諸如A β 39、Α β 40、Α β 41、A β 42 禾口 A β 43 的術語是指含有 1-39、1-40、1-41、1-42 和1-43位氨基酸殘基的Aβ肽。Hardy等，TINS 20，155-158 (1997)的
圖1說明了這些肽 的序列及其與APP前體的關系。例如，Αβ 42具有序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAHGLMVGGVVIATA β 41、A β 40和A β 39與A β 42的不同在于C末端分別缺少Ala、Ala-Ile和 Ala-Ile-Val。Αβ43與Αβ42的不同在于C末端存在著Thr殘基。“抗原”是抗體與其特異性結合的實體。術語“表位”或“抗原決定簇”是指B和/或T細胞應答的抗原上的位點。B細胞 表位可以由鄰接氨基酸或因蛋白質的三級折疊而并列的非鄰接氨基酸形成。由鄰接氨基酸 形成的表位在暴露于變性溶劑后通常保留，而由三級折疊而形成的表位在用變性溶劑處理 后通常丟失。表位通常包括具有獨特空間構象的至少3個、更通常至少5或8-10個氨基酸。 測定表位的空間構象的方法包括，例如，X射線晶體學和二維核磁共振。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in MolecularBiology (
程)，Vol.66, Glenn E.Morris編著(1996)。識別相同表位的抗體可以在顯示一種抗體阻 斷另一種抗體與靶抗原結合能力的簡單免疫分析中鑒定。T細胞識別CD8細胞的約9個氨 基酸或CD4細胞的約13-15個氨基酸的連續表位。識別表位的T細胞可以通過測量抗原 依賴性增殖的體外分析鑒別，其測定是通過接觸過抗原的T細胞應答表位而摻入3H-胸苷 (Burke等，J. Inf. Dis. 170，1110-19 (1994))、通過抗原依賴性殺傷(細胞毒性T淋巴細胞 分析，Tigges等，J. Immunol. 156，3901-3910)或通過細胞因子的分泌。術語“免疫學的”或“免疫”應答是針對受者患者的淀粉樣肽建立體液(由抗體介 導)和/或細胞(由抗原特異性T細胞或其分泌產物介導)應答。這樣的應答可以是由施用免疫原誘導的主動應答，或由施用抗體或接觸過抗原的T細胞誘導的被動應答。細胞免 疫應答由與I類或II類MHC分子相關的多肽表位的呈遞引發，以活化抗原特異性CD4+T輔 助細胞和/或CD8+細胞毒性T細胞。應答還可包括單核細胞、巨噬細胞、NK細胞、嗜堿性粒 細胞、樹狀突細胞、星形細胞、小膠質細胞、嗜酸性粒細胞或固有免疫性的其它組分的活化。 細胞介導的免疫應答的存在可以通過增殖分析(CD4+T細胞)或CTL(細胞毒性T淋巴細胞) 分析測定(見Burke，同上；Tigges，同上)。體液和細胞應答對免疫原的保護或治療作用的 相對貢獻可以通過從免疫的同系動物中分別分離出抗體和T細胞，并在第二對象中測定保 護或治療作用來區別。“免疫原性劑，，或“免疫原”，任選與佐劑聯合，在施用于哺乳動物后能誘導對抗其 自身的免疫應答。術語“完全-D”是指具有彡75%、彡80%、彡85%、彡90%、彡95%或100%的
D-構型氨基酸的肽。術語“裸多核苷酸”是指未與膠體物質復合的多核苷酸。裸多核苷酸有時在質粒 載體中克隆。術語“佐劑”是指在與抗原聯合給藥時增強對抗原的免疫應答、但單獨給藥時并不 對抗原產生免疫應答的化合物。佐劑可以通過數種機制，包括募集淋巴細胞、刺激B和/或 T細胞、以及刺激巨噬細胞，來增強免疫應答。術語“有效劑量”的定義是足以達到或至少部分達到預期效果的量。術語“治療有 效劑量”的定義為足以治愈或至少部分遏制已患病患者的疾病及其并發癥的量。該應用的 有效量將取決于感染的嚴重度和患者自身免疫系統的一般狀態。由于例如測量誤差，所公開范圍的一些偏差是可允許的。這些偏差由關于范圍或 劑量的術語“約”來表明。術語“患者”包括接受預防性或治療性治療的人和其它哺乳動物對象。抗體間的競爭通過其中供試免疫球蛋白抑制參比抗體與共同抗原如Αβ的特 異性結合的分析進行測定。已知有很多類型的競爭性結合分析，例如固相直接或間 接放射免疫分析(RIA)，固相直接或間接酶免疫分析(EIA)，夾心競爭分析(見Stahli 等，Methods in Enzymology9 =242-253(1983))；固相直接生物素-親和素 EIA(見 Kirkland等，J. Immunol. 137 =3614-3619 (1986))；固相直接標記分析，固相直接標記夾 心分析(見 Harlow 禾口 Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (抗體，實驗室手冊)， Cold Spring Harbor Press (1988))；用 1-125 標記的固相直接標記 RIA(見 Morel 等， Molec. Immunol. 25(1) :7_15(1988)固相直接生物素-親和素 EIA(Cheung 等，Virology 176:546-552(1990))；以及直接標記 RIA(Moldenhauer 等，Scand. J. Immunol. 32 77-82(1990))。通常，這樣的分析涉及使用與載有未標記供試免疫球蛋白或標記參比免疫 球蛋白的任一種的固體表面或細胞結合的純化抗原。通過測定在供試免疫球蛋白存在下與 固體表面或細胞結合的標記量，測量競爭性抑制。供試免疫球蛋白通常過量存在。通過競 爭分析鑒別的抗體(競爭性抗體)包括與參比抗體結合的表位相同的抗體，以及與充分接 近參比抗體結合的表位以產生位阻的鄰近表位結合的抗體。通常，競爭性抗體過量存在時， 其將抑制至少50%或75%的參比抗體與共同抗原的特異性結合。術語“癥狀”或“臨床癥狀”是指患者感知的疾病的主觀依據，如步態改變。“體征”是指由醫師觀察的疾病的客觀依據。“包含”一種或多種所述要素的組合物或方法可以包括其它未具體講述的要素。發明詳述I.總述本發明提供了實現預防和治療腦淀粉樣血管病(CAA)的方法，CAA是以存在Αβ肽 血管沉積物為特征的疾病。這些血管沉積物與阿爾茨海默氏癥的標志性實質沉積物不同。 大多數阿爾茨海默氏癥患者都患者至少輕度的CAA。然而，CAA也可以獨立于阿爾茨海默氏 癥的癥狀和/或特征性病理而發生。CAA還伴有阿爾茨海默氏癥通常不伴有的癥狀，如中 風。本發明提供了實現預防或治療CAA的方法，不管其是單獨發生還是并發阿爾茨海默氏 癥。在并發阿爾茨海默氏癥和CAA的患者中，本方法可以同時治療這兩種疾病。在未患任 一種疾病的患者中，本方法可以實現這兩種疾病的預防。在患有CAA而無阿爾茨海默氏癥 的患者中，本方法可以治療CAA，并實現阿爾茨海默氏癥的預防。本方法包括主動或被動免 疫治療。在被動免疫治療中，施用與Αβ的1-10位殘基內的表位結合的抗體。在主動免疫 治療中，施用藥劑，諸如可以誘導這樣的抗體的Αβ片段。盡管了解機制對于本發明的實施 并不是必需的，但認為，所述抗體與Αβ血管沉積物結合，從而促進了沉積物的清除。II.藥劑本方法使用的藥劑或者是針對A β的N末端的抗體(被動給藥)，或者在向患者給 藥后能誘導這樣的抗體。這樣的藥劑先前在有關阿爾茨海默氏癥的免疫治療的科學和專利 文獻中已有描述(見WO 98/25386和WO 00/72880)。Α.主動免疫治療A β，也稱 β 淀粉樣肽或 Α4 肽(見 US 4，666，829 ；Glenner 和 Wong，Biochem. Biophys. Res. Commun. 120，1131 (1984))，是39-43個氨基酸的肽，是阿爾茨海默氏癥的特 征性斑塊的主要成分。Aβ由被稱作β和Y分泌酶的這兩種酶加工較大的蛋白APP而產 生(見Hardy，TINS 20,154(1997))。與阿爾茨海默氏癥相關的APP中已知突變發生在緊 鄰β或Y分泌酶的位點處，或在A β內。例如，717位與γ分泌酶將APP裂解加工成A β 的位點貼近，670/671位緊鄰β分泌酶的裂解位點。人們認為，突變通過與形成Αβ的裂解 反應相互作用、從而增加所產生的42/43氨基酸形式的Αβ的量來導致AD。Αβ具有可以固定和活化經典和替代的補體級聯的獨特性質。尤其是，其與Clq結 合，最后與C3bi結合。這種締合促進了與巨噬細胞的結合，導致B細胞的活化。此外，C3bi 分解，然后與B細胞上的CR2以T細胞依賴性方式結合，導致這些細胞的活化呈10，000倍 增加。該機制致使Αβ產生超過其它抗原的免疫應答。主動給藥的優選藥劑是始于A β的1位殘基和止于5-10位殘基間之一的片段。 這樣的片段在與適宜的載體連接時，能誘導與A β的N末端特異性結合的抗體。這樣的片 段缺少天然存在的、與完整Αβ的臨床試驗中的不利副作用相關的自身T細胞表位。優選 的免疫原性片段包括A β 1-5，1-6和1-7，1-10，3-7,1-3,以及1-4。A β 1-5的名稱，舉例而 言，，表示片段包括Αβ的1-5位殘基并缺乏Αβ的其它殘基。A β衍生的可擴散配體(ADDLs)、ADDL代用品、ADDL結合分子也可以用于主動免疫 治療。參見，例如，WO 2004/031400，其出于所有目的以全文引為參考。任選，Αβ的片段與載體結合，以幫助誘導針對該片段的抗體。誘導免疫應答的一些藥劑含有用于誘導對淀粉樣蛋白的免疫應答的適當表位，但太小，不具有免疫原性。在此 情況下，可以將肽免疫原與適宜的載體分子連接，形成幫助引發免疫應答的結合物。適宜的 載體包括血清白蛋白，匙孔血藍蛋白，免疫球蛋白分子，甲狀腺球蛋白，卵清蛋白，破傷風 類毒素，或來自其它病原菌如白喉(例如，CRM 197)、大腸桿菌(E.coli)、霍亂或幽門螺旋 桿菌(H. pylori)的類毒素，或減毒的毒素衍生物。T細胞表位也是適宜的載體分子。一些結 合物可以通過將本發明的藥劑與免疫刺激聚合物分子(例如，三棕櫚酰-S-甘油酰半胱氨 酸(Pam3Cys)、甘露聚糖(甘露糖聚合物)、或葡聚糖(β 1 — 2聚合物))、細胞因子(例如， IL-1, IL-I α 和 β 肽，IL-2, y -INF, IL-10，GM-CSF)和化學因子(例如，MIPl α 和 β，及 RANTES)連接來形成。還可以如0' Mahony, WO 97/17613和WO 97/17614中所述，將免疫 原性劑與增強跨組織轉運的肽相連。免疫原可以與有或沒有間隔氨基酸(例如，gly-gly) 的載體連接。一些結合物可以通過將本發明的藥劑與至少一個T細胞表位連接來形成。一些T 細胞表位是非種系選擇性的(promiscuous)，而其它T細胞表位則是通用的(universal)。 非種系選擇性T細胞表位能夠在顯示各種HLA類型的多種多樣對象中，增強誘導T細胞免 疫。與非種系選擇性T細胞表位相反，通用T細胞表位能夠在大百分比、例如至少75%的、 顯示由不同HLA-DR等位基因編碼的各種HLA分子的對象中，增強誘導T細胞免疫。天然存在的T細胞表位有許多，如，破傷風類毒素(例如，P2和P30表位)，乙型 肝炎表面抗原，百日咳類毒素，麻疹病毒F蛋白，沙眼衣原體(Chlamydia trachomitis) 主要外膜蛋白，白喉類毒素，惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)環子孢子蛋白T， 惡性瘧原蟲CS抗原，曼森血吸蟲(Schistosoma mansoni)磷酸丙糖異構酶，大腸埃希 桿菌(Escherichia coli)TraT和流感病毒血凝素(HA)。本發明的免疫原性肽還可以 與 Sinigaglia F.等，Nature, 336 :778_780 (1988) ；Chicz R. M.等，J. Exp. Med.，178 27-47(1993) ；Hammer J.等，cell 74:197-203(1993) ；Falk K.等，Immunogenetics, 39 230-242(1994) ；WO 98/23635 ；和 Southwood S.等 J. Immunology，160 :3363_3373 (1998) 中描述的T細胞表位結合，上述每一篇都出于所有目的引入本文作為參考。其它例子包 括流感血凝素HA3Q7_319瘧疾CS :T3 表位 EKKIAKMEKASSVFNV乙肝表面抗原HbsAg19_28FFLLTRILTI熱休克蛋白65 :hsp65153_171DQSIGDLIAEAMDKVGNEG卡介苗QVHFQPLPPAWKL破傷風類毒素TT83Q_844QnKANSKFIGITEL破傷風類毒素TT947_967FNNFTVSFWLRVPKVSASHLEHIV gpl20 Tl :KQIINMWQEVGKAMYA結合物的一些例子包括AN90549 (MAP4 構型的 A β 1-7-破傷風類毒素 830-844)DAEFRHD DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELΑΝ90550 (ΜΑΡ4 構型的 A β 1-7-破傷風類毒素 947-967)DAEFRHD DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE優選為環己基丙氨酸
0088
0089
0090
an90542 (線性構型的a β 1-7-破傷風類毒素830-844+947-967)
DAEFRHD daefrhd-qyikanskfigitelfnnftvsfwlrvpkvsashle
padre肽(全部為線性構型)，其中x優選為環己基丙氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸，最
0091
0092
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0095
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0100 0101 0102
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0109
0110 0111 0112
αν90562(padre-a β 1-7) AKXVAAffTLAAA-DAEFRHD DAEFRHD an90543(3padre-aβ 1-7)
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD AKXVAAffTLKAAA 融合蛋白的其它例子(αβ的免疫原性表位用粗體標出)包括 AKXVAAffTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD DAEFRHD DAEFRHD-AKXVAAffTLKAAA DAEFRHD DAEFRHD-1SQAVHAAHAEINEAGR
frhdsgy frhdsgy-isqavhaahaeineagr efrhdsg efrhdsg-isqavhaahaeineagr
pkyvkqntlklat- DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD DAEFRHD daefrhd-pkyvkqntlklat-daefrhd DAEFRHD DAEFRHD-DAEFRHD-DA EFRHD -PKYVKQNTLKLAT daefrhd-daefrhddaefrhd-daefrhd-pkyvkqntlklat daefrhd-pkyvkqntlklat-ekkiakmekassvfnv-qyikanskfigitei fnnftvsfwlrvpkvsashle- daefrhd
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-
qyikanskfigitelnnftvsfwlrvpkvsashle
daefrhd daefrhd-qyikanskfigitelcfnnftvsfwlrvpkvsashle daefrhd daefrhd-qyikanskfigitelcfnnftvsfwlrvpkvsashle-daefrhd 二支鏈化樹脂上的 DAEFRHD -QYIKANSKFIGITEL
DAEFRHD
Lys-CJIy-Cys
DAEFRHDaβ的片段，如αβ 1-6，與載體如病毒樣顆粒(vlps)和vlps的亞基結合，以幫助 誘導針對該片段的抗體。參見，例如，wo 2004/016282和us 20040141984，其各自出于所有 目的以全文引入作為參考。b.被動免疫治療被動免疫治療使用Αβ N末端的特異性抗體來完成。“N末端表位”是位于Αβ肽 的n末端內或包括a β肽的n末端的表位或抗原決定簇。例示性n末端表位包括在a β 的 1-10 或 1-12 位氨基酸內的殘基，優選 a β 的 1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、2-6、2-7、3-6 或 3-7 位殘基。其它例示性n末端表位始于aβ的1-3位殘基，止于αβ的7-11位殘基。其它例
16示性N末端表位包括A β的2-4、2-5、2-6、2-7或2-8位殘基，A β的3-5、3_6、3-7、3_8或 3-9位殘基，或A β的4-7、4-8、4-9或4-10位殘基。當某抗體被稱為與特定殘基如Αβ 3-7內的表位結合時，這意味著該抗體與含有 特定殘基(本例子中即，Αβ 3-7)的多肽特異性結合。這樣的抗體不一定與Aβ 3-7內的每 一個殘基都接觸。Αβ3-7內的每一個單個氨基酸取代或缺失也不一定顯著影響結合親和 力。在各種實施方案中，Αβ抗體是末端特異性的。本文所用術語“末端特異性”是指抗體 與A β肽的N末端或C末端殘基特異性結合，但當相同的殘基存在于包含該殘基的更長的 Αβ種類中或在APP中時，該抗體卻不識別這些殘基。優選的抗體具有人IgGl同種型。被動免疫治療的優選抗Αβ抗體包括人源化的抗Αβ抗體，例如，人源化3D6抗 體，人源化12Β4抗體，或人源化12Α 11抗體。用于被動免疫治療的抗體可以通過許多種技術提供，包括US20040038304、US 20070020685、US 20060257396、US 20060160184、US 20060134098、US 20050255552、US 20050008625,US 20040132066,US 20040038317,US 20030198971 和 US 20030157579 中所 述技術，其全部以所有目的其全文引入作為參考。抗體i.免疫球蛋白的一般特性已知基礎抗體結構單元包括亞基的四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組 成，每對具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條“重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端 部分包括約100至110個或更多氨基酸的可變區，主要負責抗原識別。每條鏈的羧基末端 部分定義為恒定區，主要負責效應子功能。輕鏈分類為κ或λ。重鏈分類為Y、μ、α、δ或ε，并分別將抗體的同種型定 義為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在輕鏈和重鏈內，可變區與恒定區通過大約12個或更多 氨基酸的“J”區接合，重鏈還包括大約10個以上氨基酸的“D”區。(參見，Fundamental Immunology, Ch. 7 (《基礎免疫學》第七章，W. Paul 編著，Raven Press, N. Y.，第二版，1989)， 其以所有目的全文引入本文作為參考)。各輕/重鏈對的可變區形成抗體結合位點。因此，完整抗體具有兩個結合位點。 除在雙功能或雙特異性抗體中外，這兩個結合位點是相同的。鏈都表現出相同的一般結 構由三個高變區、也稱互補決定區或CDRs接合的相對保守的框架區(FR)。各對的兩條 鏈的CDRs通過框架區對齊，從而能夠與特異性表位的結合。從N末端到C末端，輕鏈和重 鏈都包括FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4結構域。每個結構域的氨基酸的分配與 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫學重要的蛋白的序列) (National Institutesof Health, Bethesda, MD, 1987 禾口 1991) ；Chothia 禾口 Lesk, J. Mol. Biol. 196 :901-917 (1987)；或 Chothia 等，Nature 342:878-883(1989)的定義一致。ii.非人抗體的產生非人單克隆抗體的產生，例如鼠、豚鼠、豬、靈長類動物、兔或大鼠，可以通過例如 用Αβ免疫動物來完成。也可以使用包含Αβ的較長的肽或者Αβ或Αβ抗體的抗特應性 抗體的免疫原性片段。見Harlow和Lane，Antibody, A Laboratory Manual (抗體，實驗室 手冊)(CSHP NY，1988)(出于所有目的引入作為參考)。這樣的免疫原可以從天然源、通過 肽合成或重組表達獲得。任選，免疫原可以如下文所述與載體蛋白融合或以其它方式復合
17后給藥。任選，免疫原可以與佐劑一起給藥。可以如下文所述使用數種類型的佐劑。實驗 動物免疫優選弗氏完全佐劑然后用不完全佐劑。兔或豚鼠通常用于制備多克隆抗體。小鼠 通常用于制備單克隆抗體。篩選與A β特異性結合的抗體。任選，進一步篩選與A β的特 定區結合的抗體。后種篩選可以通過測定抗體與Αβ肽的缺失突變體集合的結合、并確定 哪種缺失突變體與該抗體結合來完成。結合可以通過例如Western印跡或ELISA來評價。 顯示與抗體特異性結合的最小片段定義該抗體的表位。或者，可以通過供試抗體與參比抗 體競爭與A β結合的競爭分析，測定表位特異性。如果供試抗體與參比抗體競爭，則它們與 相同表位或足夠接近、以致一種抗體的結合干擾另一種抗體結合的表位結合。這樣的抗體 的優選同種型為小鼠同種型IgG2a或其它物種的等同同種型。小鼠同種型IgG2a是人同種 型IgGl的等同體。iii.嵌合和人源化抗體嵌合和人源化抗體具有與提供構建嵌合或人源化抗體的起始材料的小鼠或其它 非人抗體相同或相似的結合特異性和親和力。嵌合抗體是通常用屬于不同物種的免疫球蛋 白基因區段通過基因工程構建其輕鏈和重鏈基因的抗體。例如，來自小鼠單克隆抗體的基 因的可變(V)區段可以與人恒定(C)區段如IgGl和IgG4結合。人同種型IgGl是優選的。 在一些方法中，抗體的同種型是人IgG。一些方法中也可以使用IgM抗體。因此，典型的嵌 合抗體是由小鼠抗體的V或抗原結合域和人抗體的C或效應域組成的雜交蛋白。人源化抗體具有基本上來自人抗體(稱為受體抗體)的可變區框架殘基和基本 上來自小鼠抗體(稱為供體免疫球蛋白)的互補決定區。參見，Queen等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 10029-10033(1989), W090/07861, US 5，693，762，US 5，693，761，US 5, 585,089, US 5，530，101和Winter，US 5，225，539 (出于所有目的，其各自以全文引入作 為參考)。恒定區如存在，也基本上或完全來自人免疫球蛋白。人可變域通常選自其框架序 列表現出與衍生CDRs的鼠可變區結構域的高度序列同一性的人抗體。重鏈和輕鏈可變區 框架殘基可以衍生自相同或不同的人抗體序列。人抗體序列可以是天然存在的人抗體的序 列，或者可以是數種人抗體的共有序列。見Carter等，WO 92/22653。根據對⑶R構象和/ 或與抗原結合的可能影響，選擇人可變區框架殘基的某些氨基酸進行取代。對這些可能影 響的研究通過模擬、考察特定位置上的氨基酸的特性、或根據經驗觀察特定氨基酸的取代 或誘變效應來進行。例如，當鼠可變區框架殘基和所選的人可變區框架殘基之間氨基酸不同時，應通 常用來自小鼠抗體的等同框架氨基酸取代人框架氨基酸，在此情況下合理地預期該氨基 酸(1)直接與抗原非共價結合，(2)鄰近 CDR 區，(3)以其它方式與⑶R區相互作用(例如，在⑶R區的約6A內)，或(4)參與 VL-VH 界面。其它取代候選是人免疫球蛋白在此位置上罕見的受體人框架氨基酸。這些氨基酸 可以用來自小鼠供體抗體的等同位置或來自更典型的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸 取代。其它取代候選是人免疫球蛋白在此位置上罕見的受體人框架氨基酸。人源化免疫球 蛋白的可變區框架通常顯示與人可變區框架序列或這些序列的共有序列有至少85%的序
18列同一性。iv.人抗體抗Αβ的人抗體通過下述多種技術提供。一些人抗體通過競爭性結合實驗或以其 它方式進行選擇，以具有與特定小鼠抗體相同的表位特異性，如實施例XI所述小鼠單克隆 抗體之一。人抗體也可以通過僅用Αβ的片段作為免疫原，和/或通過篩選Aβ的缺失突 變體集合的抗體，來篩選特定的表位特異性。人抗體優選具有人IgGl同種型特異性。(1)三源雜交瘤法Oestberg 等，Hybridoma 2 :361_367 (1983) ；Oestberg，美國專利 4, 634, 664 ；和 Engleman等，美國專利4，634，666 (出于所有目的，其各自以全文引入作為參考)描述了基 本方法和用于本方法的例示性細胞融合伴侶SPAZ-4。通過本方法獲得的產抗體細胞系被稱 為三源雜交瘤，因為其傳自三種細胞——兩種人類的和一種小鼠的。首先，將小鼠骨髓瘤細 胞系與人B淋巴細胞融合，得到不產抗體的異種雜交細胞，如同上Oestberg描述的SPAZ-4 細胞系。然后異種細胞與免疫的人B淋巴細胞融合，得到產抗體三源雜交瘤細胞系。已發 現三源雜交瘤比制備自人細胞的普通雜交瘤更穩定地產生抗體。免疫的B淋巴細胞獲自人供體的血液、脾、淋巴結或骨髓。如果需要抗特異性抗原 或表位的抗體，優選使用其抗原或表位進行免疫。免疫可以是體內或體外的。對于體內免 疫，通常從用A β、其片段、含有A β或片段的更大多肽、或A β抗體的抗特應性抗體免疫的 人中分離B細胞。在一些方法中，B細胞分離自最終被施用抗體治療的同一患者。對于體外 免疫，B淋巴細胞通常在補充10%人血漿的培養基如RPMI-1640(見Engleman，同上)中， 暴露于抗原7-14天的時間。免疫的B淋巴細胞通過公知方法與異種雜交細胞如SPAZ-4融合。例如，細胞用 40-50%的分子量為1000-4000的聚乙二醇在約37°C處理約5_10min。從融合混合物中分 離出細胞，在對想要的雜交體(例如，HAT或AH)具有選擇性的培養基中繁殖。分泌具有所 需結合特異性的抗體的克隆通過分析三源雜交瘤培養基結合Aβ或其片段的能力來鑒定。 產生具有預期特異性的人抗體的三源雜交瘤通過有限稀釋技術進行亞克隆，然后在培養基 中進行體外培養。然后測試所得三源雜交瘤細胞系結合Aβ或其片段的能力。盡管三源雜交瘤在遺傳上穩定，但其產生抗體的水平并不非常高。表達水平可以 通過將三源雜交瘤的抗體基因克隆入一個或多個表達載體、并將該載體轉化到標準的哺 乳動物、細菌或酵母細胞系中來增加。(2)轉基因非人哺乳動物抗Αβ的人抗體也可以由具有至少編碼人免疫球蛋白基因座的區段的轉基因的 非人轉基因哺乳動物產生。通常，這樣的轉基因哺乳動物的內源性免疫球蛋白基因座在功 能上是滅活的。優選該人免疫球蛋白基因座的區段包括重鏈和輕鏈組分的未重排序列。內 源性免疫球蛋白基因的滅活和外源性免疫球蛋白基因的引入，都可以通過定向同源重組或 引入YAC染色體來實現。由該過程產生的轉基因哺乳動物能在功能上重排免疫球蛋白組 分序列，并表達人免疫球蛋白基因編碼的各種同種型抗體的所有組成成分，而不表達內源 性免疫球蛋白基因。具有這些特性的哺乳動物的產生和特性在例如下列中有詳細描述 Lonberg 等，W093/1222, US 5,877,397，US 5,874,299，US 5,814,318，US 5,789,650，US 5，770，429，US 5，661，016，US 5，633，425，US 5，625，126，US 5，569，825，US 5，545，806，Nature 148,1547-1553(1994), NatureBiotechnology 14,826(1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (出于所有目的，其各自以全文引入作為參考)。轉基因小鼠尤其適宜。抗Αβ抗體 通過用A β或其片段使轉基因非人哺乳動物免疫而獲得，如同上Lonberg或Kucherlapati 所述。單克隆抗體通過例如，用常規Kohler-Milstein技術將來自這些哺乳動物的B細胞 與適宜的骨髓瘤細胞系融合來制備。人多克隆抗體還可以提供成用免疫原性劑免疫的人的 血清形式。任選，這樣的多克隆抗體可以用Αβ或其它淀粉樣肽作為親和試劑，通過親和純 化來濃縮。(3)噬菌體展示法另一獲得人抗A β抗體的方法是按照Huse等，Science246 1275-1281 (1989)所 述通用方案，從人B細胞中篩選DNA文庫。如三源雜交瘤法中所述，這樣的B細胞可以獲 自經Αβ片段、含有Αβ或片段的更長多肽、或抗特應性抗體免疫的人。任選，這樣的B細 胞獲自最終接受抗體治療的患者。選擇與Αβ或其片段結合的抗體。然后克隆編碼這些 抗體(或結合片段)的序列并擴增。Huse描述的方案與噬菌體展示技術相組合，會更有 效。參見，例如，Dower 等，WO 91/17271 和 McCafferty 等，WO 92/01047，US 5，877，218，US 5，871，907，US5, 858，657，US 5，837，242，US 5，733，743 以及 US 5，565，332 (出于所有目 的，其各自以全文引入作為參考)。在這些方法中，產生了其中成員在其外表面展示不同抗 體的噬菌體文庫。抗體通常展示為Fv或Fab片段。通過對A β肽或其片段的親和富集，選 擇展示具有所需特異性的抗體的噬菌體。在噬菌體展示法的變體中，可以產生具有所選鼠抗體的結合特異性的人抗體。見 Winter, WO 92/20791。在此方法中，所選鼠抗體的重鏈或輕鏈可變區被用作起始材料。如 果選擇例如輕鏈可變區作為起始材料，則構建的噬菌體庫中，其成員展示出相同的輕鏈可 變區(即，鼠起始材料)和不同的重鏈可變區。重鏈可變區獲自重排人重鏈可變區文庫。選 擇對A β顯示強特異性結合(例如，至少108，優選至少IO9M-1)的噬菌體。該噬菌體的人重 鏈可變區然后起到構建另一噬菌體文庫的起始材料的作用。在該文庫中，各噬菌體展示相 同的重鏈可變區(即，從第一展示文庫中鑒別的區)和不同的輕鏈可變區。輕鏈可變區獲 自重排的人輕鏈可變區文庫。再次，選擇對Αβ顯示出強特異性結合的噬菌體。這些噬菌 體展示完全的人抗Αβ抗體的可變區。這些抗體通常具有與鼠起始材料相同或相似的表位 特異性。(4)納米抗體(NAN0B0DY)法抗Αβ抗體還可以通過Nanobody 法(Ablynx N. V.)產生。納米抗體是由抗體衍 生的、具有天然存在的重鏈抗體特性的治療性蛋白。納米抗體可以起到單一的、相對小的功 能性抗原結合結構單元、結構域或蛋白的作用。Nanobody 技術的最初開發是在發現駱駝 科動物(駱駝和美洲駝)具有缺失輕鏈的全功能抗體之后。這些重鏈抗體含有單個可變域 (VHH)和兩個恒定域(CH2和CH3)。VHH用來將它們與存在于常規的4鏈抗體中的重鏈可 變域(稱作“VH域”)相區別。克隆并分離的VHH域是包含原來的重鏈抗體的全部抗原結 合能力的穩定多肽。VHH域和納米抗體也可以工程化為多價體和多特異性形式。具有與天 然存在的VHH域的氨基酸序列相應的氨基酸序列的納米抗體可以人源化，S卩，通過將天然 存在的VHH序列的氨基酸序列(和尤其是框架序列)中的一個或多個氨基酸殘基用存在于 常規人4鏈抗體的VH域的相應位置上的一個或多個氨基酸殘基替代。詳細情況見，例如，
20US20050130266, US 20040253638，W0/2006/040153, US 20050214857，W0/2006/079372，或 W0/2006/122825,出于所有目的，其各自引入本文作為參考。v.恒定區的選擇嵌合、人源化、或人抗體的重鏈和輕鏈可變區可以與人恒定區的至少一部分連接。 恒定區的選擇部分取決于想要的是否抗體依賴性補體和/或細胞介導毒性。例如，同種型 IgGl和IgG3具有補體活性，而同種型IgG2和IgG4則沒有。同種型的選擇還可以影響抗體 進入腦部。人同種型IgGl是優選的。輕鏈恒定區可以是λ或κ。抗體可以表達為含有兩 條輕鏈和兩條重鏈的四聚體，表達為分開的重鏈、輕鏈，表達為Fab、Fab' F(ab' )2和Fv， 或者表達為其中重鏈和輕鏈可變域通過間隔區連接的單鏈抗體。vi.重組抗體的表達嵌合、人源化和人抗體通常通過重組表達產生。重組多核苷酸構建體通常包括與 抗體鏈的編碼序列可操作地連接的表達控制序列，其包括天然相關或異源的啟動子區。優 選，表達控制序列是能轉化或轉染真核宿主細胞的載體中的真核啟動子系統。一旦該載體 進入適宜宿主，宿主便保持在適于高水平表達核苷酸序列以及收集和純化叉反應抗體的狀 態下。這些表達載體通常可在宿主有機體中作為附加體或宿主染色體DNA的整合部分 進行復制。通常，表達載體含有選擇標記，例如，氨芐西林抗性或潮霉素抗性，以便檢測這 些被想要的DNA序列轉化的細胞。大腸桿菌是一種尤其適用于克隆本發明的DNA序列的原核宿主。微生物，如酵母， 也可用于表達。酵母菌屬(Saccharomyces)是優選的酵母宿主，其具有含有所需的表達控 制序列、復制起點、終止序列等的適宜載體。典型的啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶和其它 糖酵解酶。誘導型酵母啟動子特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素(isocytochromeK和負 責麥芽糖及半乳糖利用的酶的啟動子。哺乳動物細胞是表達免疫球蛋白或其片段的編碼核苷酸區段的優選宿主。見 ffinnacker, From Genes to Clones (從基因到克隆)，(VCHPublishers，NY，1987)。本領域 已經開發出許多能分泌完整異源蛋白的適宜宿主細胞系，包括CHO細胞系、各種COS細胞 系、HeLa細胞、L細胞、人胚腎細胞和骨髓瘤細胞系。優選，細胞是非人的。這些細胞的表 達載體可以包括表達控制序列，如復制起點、啟動子、增強子(Queen等，Immunol. Rev. 89 49 (1986))，和必要的加工信息位點，如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多腺苷酸化位點，以 及轉錄終止序列。優選的表達控制序列是衍生自內源性基因、巨細胞病毒、SV40、腺病毒、牛 乳頭瘤病毒等的啟動子。見Co等，J. Immunol. 148 =1149(1992) 或者，可以將編碼序列的抗體整合到轉基因中，以將其引入轉基因動物的基因 組，隨后在該轉基因動物的乳汁中表達(參見，例如，US 5，741,957，US 5，304，489，US 5，849，992)。適宜的轉基因包括與來自乳腺特異基因如酪蛋白或β-乳球蛋白的啟動子和 增強子可操作地連接的輕鏈和/或重鏈的編碼序列。含有目的DNA區段的載體可以根據細胞宿主的類型通過公知方法轉入宿主細 胞中。例如，氯化鈣轉染常用于原核細胞，而磷酸鈣處理、電穿孔、脂質轉染、基因槍 (biolistics)或基于病毒的轉染可以用于其它細胞宿主。其它用來轉化哺乳動物細胞的方 法包括運用polybrene、原生質融合、脂質體、電穿孔和顯微注射(一般見，Sambrook等，同
21上)。為產生轉基因動物，可以將轉基因顯微注射入受精的卵母細胞，或者可以將其整合到 胚胎干細胞的基因組中，并將這些細胞的細胞核轉入去核卵母細胞中。抗體一旦表達，便可以按照本領域的標準程序進行純化，包括HPLC純化、柱層析、 凝膠電泳等(一般見，Scopes，Protein Purification(蛋白純化)(Springer-Verlag, NY, 1982))。3D6或其嵌合或人源化形式是優選的抗體(見美國專利公布No. 20030165496A1, 美國專利公布No. 20040087777A1,國際專利公布No. WO 02/46237A3和國際專利公布No. WO 04/080419A2)。3D6的描述還可見于，例如，國際專利公布No. WO 02/088306A2和國際專利 公布No.W002/088307A2。其它3D6抗體在美國專利申請No. 11/303，478和國際專利申請 No. PCT/US05/45614中描述。3D6是與位于人β淀粉樣肽中N末端表位、具體為1_5位殘 基特異性結合的單克隆抗體(HiAb)。根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)的條款，產生 3D6單克隆抗體的細胞系(RB963D6. 32. 2. 4)于2003年4月8日保藏在美國典型培養物保 藏中心(American Type Culture Collection, ATCC), Manassas, VA 20108，USA,保藏號為 PTA-5130。巴比紐珠單抗(bapineuzumab)是指一種人源化3D6抗體，其包含的輕鏈具有氨基 酸序列被指定為SEQ ID NO :1的成熟可變區和重鏈具有氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 2 的成熟可變區，顯示如下。人源化3D6輕鏈可變區Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser LeuVal Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser CysLeu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu AsnPro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu lie Tyr LeuSer Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser GlyThr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu AspCys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Arg Thr PheVal Glu lie Lys(SEQ ID NO 1)人源化3D6重鏈可變區Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly LeuPro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala AlaSer Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln AlaGlu Trp Val Ala Ser lie Arg Ser Gly Gly GlyAsp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser ArgThr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg AlaTyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser GlyGly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEQ巴比紐珠單抗(bapineuzumab)被稱為 AAB-001。第二種版本的的人源化3D6抗體，其包含的輕鏈具有氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 3的成熟可變區和重鏈具有氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 4的成熟可變區，顯示如 下。
ProLysSerSerGlnSerTrpLeuLeuGlnLysValSerLysLeuAspSerGlyThrAspPheValGlyValTyrTyrGlyGlnGlyThrLysValGlnSerGlyPheThrPheProGlyLysGlyLeuArgThrTyrTyrSerAspAsnSerLysAsnGluAspThrAlaValSerSerAspTyrTrpID NO 2)0181]人源化3D6輕鏈可變區0182]TyrValValMetThrGlnSerProLeuSerLeuPro0183]ValThrProGlyGluProAlaSerIle Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser0184]LeuLeuAspSerAspGlyLysThrTyrLeuAsnTrpLeuLeuGlnLys0185]ProGlyGlnSerProGlnArgLeulieTyrLeuValSerLysLeuAsp0186]SerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPhe0187]ThrLeuLyslieSerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyr0188]CysTrpGlnGlyThrHisPheProArgThrPheGlyGlnGlyThrLys0189]ValGluIleLys (SEQID NO 3)0190]人源化3D6 a鏈可變區0191]GluValGlnLeuLeuGluSerGlyGlyGlyLeuValGln0192]ProGlyGlySerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPhe0193]SerAsnTyrGlyMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeu0194]GluTrpValAlaSerlieArgSerGlyGlyGlyArgThrTyrTyrSer0195]AspAsnValLysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnAlaLysAsn0196]SerLeuTyrLeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaLeu0197]TyrTyrCysValArgTyrAspHisTyrSerGlySerSerAspTyrTrp0198]GlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer(SEQID NO 4)0199]第三種版本的的人源化3D6抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO5的
氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 6的重鏈，在2005年4月28日公布的US 2005/0090649 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化3D6輕鏈
AspValValMetThrGlnSerProLeuSerLeuProValThrLeuGly
GlnProAlaSerlieSerCysLysSerSerGlnSerLeuLeuAspSer
AspGlyLysThrTyrLeuAsnTrpLeuGlnGlnArgProGlyGlnSer
ProArgArgLeulieTyrLeuValSerLysLeuAspSerGlyValPro
AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslie
SerArgValGluAlaGluAspValGlyValTyrTyrCysTrpGlnGly
ThrHisPheProArgThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulieLys
ArgThrValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGlu
GlnLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPhe
TyrProArgGluAlaLysValGlnTrpLysValAspAsnAlaLeuGln
SerGlyAsnSerGlnGluSerValThrGluGlnAspSerLysAspSer
ThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGlu
LysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGlnGlyLeuSerSer
ProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys (SEQID NO 5)
人源化3D6 a鏈
GlnValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValGln Pro GlyGly
Ser Leu Arg LeuSerCysAlaGlySerGlyPheThrPheSerAsnTyr
GlyMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal
AlaSerlieArgSerGlyGlyGlyArgThrTyrTyrSerAspAsnVal
LysGlyArgPheThrlieSerArgGluAsnAlaLysAsnSerLeuTyr
LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys
ValArgTyrAspHisTyrSerGlySerSerAspTyrTrpGlyGlnGly
ThrLeuValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe
ProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeu
GlyCysLeuValLysAspTyrPheProGlnProValThrValSerTrp
AsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeu
GlnSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSer
SerSerLeuGlyThrGlnThrTyrlieCysAsnValAsnHisLysPro
SerAsnThrLysValAspLysLysValGluProLysSerCysAspLys
ThrHisThrCysProProCysProAlaProGlnLeuLeuGlyGlyPro
SerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlieSer
ArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAsp
ProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsn
AlaLysThrLysProArgGluGluGlnTyrAsnSerThrTyrArgVal
ValSerValLeuThrValLeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGlu
TyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGluLys
ThrlieSerLysAlaLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThr
LeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGlnValSerLeuThr
CysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGluTrpGlu
SerAsnGlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeu
AspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLys
SerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGlu
AlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys (SEQ ID NO 6)12A11或其嵌合或人源化或納米抗體形式是優選的抗體。12A11抗體或其變體 在美國專利公布No. 20050118651、美國專利公布No. 20060198851、國際專利公布No. WO 04/108895和國際專利公布No. WO 06/066089中描述，出于所有目的，其全部以全文引入作 為參考。12A11是與位于人β淀粉樣肽的N末端表位、具體為3-7位殘基特異性結合的mAb。 產生12A11單克隆抗體的細胞系于2005年12月13日保藏在ATCC (美國典型培養物保藏中 心，10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)，ATCC 登錄號為 PTA-7271。第一種版本的人源化12A11抗體，其包含氨基酸序列被指定為SEQ ID NO :7的 輕鏈和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO :8(版本1)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651A1中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGlu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn GlyAsn Thr Tyr Leu
24Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln LeuLeu lie Tyr Lys ValSer Asn
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp PheThr Leu
Lys lie Ser Arg Val Glu AlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln SerSer His Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)
人源化12A11重鏈(版本1)GlnVal GlnLeuVal GluSerGlyGlyGly Val Val Gln Pro Gly ArgSerLeuArg LeuSerCys AlaPheSer GlyPheSerLeuSer Thr Ser GlyMet Ser Val GlyTrplie ArgGlnAla ProGlyLys GlyLeuGluTrpLeuAla His lie Trp Trp Asp AspAsp
Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Thr Thr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser(SEQ ID NO 8) 第二種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕 鏈和氨基酸序列被指定為SEQ ID N0:9(版本2)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈
AspValValMetThrGlnSerPro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGluProAla SerlieSerCysArgSerSerGlnSer lie Val His Ser Asn GlyAsn ThrTyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer Pro Gln LeuLeu lie Tyr Lys ValSerAsnArg PheSerGlyValProAspArgPheSerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp PheThrLeuLys lieSerArgValGluAlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln SerSerHis
Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本2)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser(SEQ ID No 9)第三種版本的的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO :10(版本2. 1)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGlu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn GlyAsn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln LeuLeu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu AlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser Ser HisVal Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本2. 1)
GlnValGlnLeu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSerLeuArg LeuSerCysAlaPhe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser GlyMetSer ValGlyTrplie ArgGlnAlaProGly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla His lie TrpTrp AspAspAspLys TyrTyrAsnProSer Leu Lys SerArg Phe Thr lie Ser Lys AspAsn SerLysAsnThr LeuTyrLeuGlnMetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ValTyr TyrCysAla
Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser (SEQ ID NO 10)第四種版本的的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕 鏈和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 11(版本3)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGlu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn GlyAsn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu AlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser Ser His Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本3)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser (SEQ ID NO 11)第五種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO :12(版本4. 1)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出入所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈AspValValMetThrGln SerProLeuSerLeu Pro Val Thr Pro GlyGluProAla SerlieSerCysArgSerSer GlnSerlieValHis Ser Asn GlyAsn Thr TyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGly GlnSerProGlnLeuLeu lie Tyr Lys Val SerAsn
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu AlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser Ser His Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本4· 1)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu
26Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp LeuAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser (SEQ ID NO 12) 第六種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO :13(版本4. 2)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈
AspValValMetThrGlnSerPro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGluProAla SerIleSerCysArgSerSerGlnSer lie Val His Ser Asn GlyAsn ThrTyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer Pro Gln LeuLeu lie Tyr Lys ValSerAsnArg PheSerGlyValProAspArgPheSerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp PheThrLeuLys IleSerArgValGluAlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln SerSerHis
Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7) 人源化12A11重鏈(版本4. 2)GlnValGlnLeu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSerLeuArg LeuSerCysAlaPhe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser GlyMetSerValGlyTrplie ArgGlnAlaProGly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla His lie TrpTrpAspAspAspLys TyrTyrAsnProSer Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Lys AspThrSerLysAsnThr ValTyrLeuGlnMetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ValTyrTyrCysAlaArg ArgThrThrThr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln GlyThrThrValThr
ValSer Ser(SEQ ID NO 13) 第七種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO :14(版本4. 3)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈
AspValValMetThrGlnSerPro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGluProAla SerlieSerCysArgSerSerGlnSer lie Val His Ser Asn GlyAsn ThrTyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer Pro Gln LeuLeu lie Tyr Lys ValSerAsnArg PheSerGlyValProAspArgPheSerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp PheThrLeuLys lieSerArgValGluAlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln SerSerHis
Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7) 人源化12A11重鏈(版本4. 3)GlnValGlnLeuValGluSer Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSerLeuArg LeuSerCysAlaPheSerGlyPhe Ser Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val GlyTrplie ArgGlnAlaProGlyLysGlyLeu Glu Trp LeuAla His lie Trp Trp Asp AspAspLys TyrTyrAsnProSerLeuLysSerArg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser LysAsn
27Thr Val Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser (SEQ ID NO 14) 第八種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID N0:15(版本4. 4)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈
AspValValMetThrGln SerPro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGluProAla SerlieSerCysArgSerSer GlnSer lie Val His Ser Asn GlyAsn ThrTyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGly GlnSer Pro Gln LeuLeu lie Tyr Lys ValSerAsnArg PheSerGlyValProAspArg PheSerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp PheThrLeuLys lieSerArgValGluAlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln SerSerHis
Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本4. 4)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp LeuAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser (SEQ ID NO 15)第九種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO :16(版本5. 1)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGlu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn GlyAsn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu AlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser Ser His Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本5· 1)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser (SEQ ID NO 16)
第十種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO :17(版本5. 2)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈
AspValValMetThrGlnSerPro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGluProAla SerIleSerCysArgSerSerGlnSer lie Val His Ser Asn GlyAsn ThrTyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer Pro Gln LeuLeu lie Tyr Lys ValSerAsnArg PheSerGlyValProAspArgPheSerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp PheThrLeuLys IleSerArgValGluAlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln SerSerHis
Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本5. 2)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp LeuAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser(SEQ ID NO 17)第十一種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 18(版本5. 3)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈AspValValMetThrGlnSerPro Leu Ser Leu Pro Val Thr Preι GlyGluProAla SerlieSerCysArgSerSerGlnSer lie Val His Ser Asn GlyAsnThrTyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer Pro Gln LeuLeu lie Tyr LysValSerAsnArg PheSerGlyValProAspArgPheSerGly Ser Gly Ser Gly Thr AspPheThrLeuLys lieSerArgValGluAlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe GlnSerSerHis
Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7) 人源化12A11重鏈(版本5. 3)GlnValGlnLeu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSerLeuArg LeuSerCysAlaPhe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser GlyMetSerValGlyTrplie ArgGlnAlaProGly Lys Gly Leu Glu Trp LeuAla His lie TrpTrpAspAspAspLys TyrTyrAsnProSer Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Lys AspThrSerLysAsnThr LeuTyrLeuGlnMetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ValTyrTyrCysAlaArg ArgThrThrThr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln GlyThrThrValThr
ValSer Ser Val(SEQ ID NO 18) 第十二種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 19(版本5. 4)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。化12A11輕鏈Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGlu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn GlyAsn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln LeuLeu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu AlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser Ser His Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本5· 4)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser Val(SEQ ID NO 19) 第十三種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 20 (版本5. 5)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈
AspValValMetThrGln SerPro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGluProAla SerlieSerCysArgSerSer GlnSer lie Val His Ser Asn GlyAsn ThrTyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGly GlnSer Pro Gln LeuLeu lie Tyr Lys ValSerAsnArg PheSerGlyValProAspArg PheSerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp PheThrLeuLys lieSerArgValGluAlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln SerSerHis
Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本5. 5)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser (SEQ ID NO 20)第十四種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 21 (版本5. 6)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651A1中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGlu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn GlyAsn Thr Tyr Leu
30Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu AlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser Ser His Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本5. 6)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp LeuAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser (SEQ ID NO 21) 第十五種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 22 (版本6. 1)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈
AspValValMetThrGlnSerPro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGluProAla SerIleSerCysArgSerSerGlnSer lie Val His Ser Asn GlyAsn ThrTyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer Pro Gln LeuLeu lie Tyr Lys ValSerAsnArg PheSerGlyValProAspArgPheSerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp PheThrLeuLys IleSerArgValGluAlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln SerSerHis
Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本6. 1)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser(SEQ ID NO 22) 第十六種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 23 (版本6. 2)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651A1中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈
AspValValMet ThrGlnSerPro Leu Ser Leu Pro ValThr Pre丨 GlyGluProAla SerlieSerCysArg SerSerGlnSer lie Val His Ser AsnGlyAsnThrTyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLys ProGlyGlnSer Pro Gln LeuLeu lieTyr LysValSerAsnArg PheSerGlyValPro AspArgPheSerGly Ser Gly Ser GlyThr AspPheThrLeuLys lieSerArgValGlu AlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr CysPhe GlnSerSerHisVal Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本6. 2)
GlnValGlnLeu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSerLeuArg LeuSerCysAlaPhe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser GlyMetSerValGlyTrplie ArgGlnAlaProGly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla His lie TrpTrpAspAspAspLys TyrTyrAsnProSer Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Lys AspThrSerLysAsnThr LeuTyrLeuGlnMetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala ValTyrTyrCysAlaArg ArgThrThrThr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln GlyThrThrValThr
ValSer Ser (SEQ ID NO 23) 第十七種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO :24(版本6. 3)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈
AspValValMetThrGln SerPro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGluProAla SerlieSerCysArgSerSer GlnSer lie Val His Ser Asn GlyAsn ThrTyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGly GlnSer Pro Gln LeuLeu lie Tyr Lys ValSerAsnArg PheSerGlyValProAspArg PheSerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp PheThrLeuLys lieSerArgValGluAlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln SerSerHis
Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本6. 3)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp LeuAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala sp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val SerSer (SEQ ID NO 24)第十八種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕鏈 和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 25 (版本6. 4)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈AspValValMetThrGln SerProLeuSerLeu Pro Val Thr Pro GlyGluProAla SerlieSerCysArgSerSer GlnSerlieValHis Ser Asn GlyAsn Thr TyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGly GlnSerProGlnLeuLeu lie Tyr Lys Val SerAsn
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu AlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser Ser His Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本6· 4)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer LeuArg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp ValAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Phe Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser (SEQ ID NO 25)第十九種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕 鏈和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 26 (版本7)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參考。人源化12A11輕鏈Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro GlyGlu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser lie Val His Ser Asn GlyAsn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu AlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser Ser His Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本7)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Thr Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp LeuAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser(SEQ ID NO 26)第二十種版本的人源化12A11抗體包含氨基酸序列被指定為SEQID NO 7的輕 鏈和氨基酸序列被指定為SEQ ID NO 27 (版本8)的重鏈，在2005年6月2日公布的US 20050118651 Al中描述，出于所有目的，該申請引入本文作為參比。人源化12A11輕鏈AspValValMetThrGlnSerPro Leu Ser Leu Pro Val Thr Preι GlyGluProAla SerlieSerCysArgSerSerGlnSer lie Val His Ser Asn GlyAsnThrTyrLeuGlu TrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer Pro Gln LeuLeu lie Tyr LysValSerAsnArg PheSerGlyValProAspArgPheSerGly Ser Gly Ser Gly Thr AspPheThrLeuLys lieSerArgValGluAlaGlu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe GlnSerSerHis
Val Pro Leu ThrPhe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys(SEQ ID NO 7)人源化12A11重鏈(版本8)Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly ArgSer Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser GlyMet Ser Val Gly Trp lie Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp LeuAla His lie Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys SerArg Leu Thr lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn
33Thr Val Tyr Leu Gln MetAsn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg ThrThr Thr Ala Asp Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr ValSer Ser (SEQ ID NO 8)上述任何抗體都可以用不同的同種型或突變體同種型產生，以控制與不同Fc受 體結合的程度。缺乏Fc區的抗體(例如，Fab片段)不能與Fc受體結合。同種型的選擇也 影響與Fc受體的結合。已經測定了各種人IgG同種型各自對三種Fc γ受體FcRI、FcRII 和 FcRIII 的親和力(見 Ravetch 和 Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9，457 (1991))。FcRI 是與 單體形式的IgG結合的高親和力受體，后兩種是僅與多聚體形式的IgG結合的低親和力受 體。一般而言，IgGl和IgG3對所有三種受體都具有顯著結合活性，而IgG4僅對FcRI，IgG2 僅對FcRII被稱為IIaLR的一種類型具有顯著結合活性(見Parren等，J. Immunol. 148， 695 (1992))。因此，當期望與Fc γ受體結合較強時，常選擇人同種型IgGl，而較弱結合常選 擇 IgG2。所有同種型的鉸鏈連接區鄰近或接近位點上的突變(例如，234、235、236和/或 237位殘基被另一殘基替代)減少了對Fc γ受體、尤其是Fc y RI受體的親和力。任選，234、 236和/或237位被丙氨酸取代，235位被谷氨酰胺取代(參見，例如，US 5，624，821)。人 IgG2同種型中236位缺失。人IgG2的234、235和237位的例示性氨基酸區段為ala ala gly, val ala ala, ala ala ala, val glu ala 禾口 ala glu ala。對于人同禾中型 IgGl,優選 的突變體組合是L234A、L235A和G237A。尤其優選的抗體是具有人同種型IgG和Fc區的 這三種突變的巴比紐珠單抗(bapineuzumab)。其它減少與Fc γ受體結合的取代有Ε233Ρ 突變(尤其在小鼠IgGl中)和D265A。恒定區的氨基酸通過與人抗體EU比對進行編號(見Cunningham等，J.Biol. Chem.，9，3161 (1970))。即，將抗體的重鏈和輕鏈與EU的重鏈和輕鏈進行比對，使氨基 酸序列同一性最大化，并將該抗體中的各個氨基酸分配與EU中的相應氨基酸相同的編 #。 EU m胃Mi胃夫 1 白勺(#1， Kabat ·， Sequences of Protein of Immunological Interest(免疫重要的蛋白序列)，NIH 公布號 91-3242，US Department of Health andHuman Services (美國健康和人類服務部)(1991))。抗體對補體成分Clq的親和力可以通過使重鏈的318、320和322位氨基酸殘基中 的至少一個突變成具有不同側鏈的殘基來改變。對于改變，例如降低或消除，與抗體的特異 性Clq結合的其它適宜改變，包括318 (Glu)、320 (Lys)和322 (Lys)位殘基中的任何一個變 成Ala。Clq結合活性可以通過將所述三個特定殘基中的任何一個用其側鏈上具有不適當 官能性的殘基替代來消除。不必只用Ala替代離子殘基來消除Clq結合。為了消除Clq結 合，用其它烷基取代的非離子殘基如Gly、Ile、LeU或Val，或芳香族非極性殘基如Phe、Tyr、 Trp和Pro，替代三個殘基中的任何一個也是可能的。此外，為消除Clq結合活性，用極性非 離子殘基如Ser、Thr、Cys和Met替代320和322位殘基，而不是318位殘基也是可能的。用 極性殘基替代318 (Glu)位殘基可以改變但卻不消除Clq結合活性。用Ala替代297 (Asn) 位殘基導致了裂解活性的去除，而對Clq的親和力僅輕微下降(約減弱三倍)。這種改變破 壞了糖基化位點和補體激活所必需的碳水化合物的存在。此位點上的任何其它取代也破壞 糖基化位點。III.適用(CAA)治療方案的患者
腦淀粉樣血管病也稱作嗜剛果紅血管病或腦血管淀粉樣變。這是一種腦部小血管 疾病，其中，血管壁的淀粉樣蛋白沉積物可以導致中風、腦出血、白質局部缺血或癡呆。淀粉 樣蛋白類似淀粉，在某些慢性疾病的病程中沉積于組織內。CAA可以侵襲45歲以上的患者，但最常見于65歲以上患者，并且隨著年齡增長而 變得更常見。男性和女性患病相等。在一些病例中，CAA是散發性的，但其也可以以常染 色體顯性遺傳病(一種遺傳形式，其中疾病的表達只需要存在該疾病的編碼基因的一個拷 貝；父母任何一方患有此病時，子女繼承該病的幾率為50% )遺傳。CAA對5-20%的腦出 血和高至30%的局限于腦的一個葉的腦葉出血負有責任。即使在世時沒有過腦出血、中風 或該疾病的其它表現，但超過三分之一的60歲以上人們在尸檢時可以發現CAA。在阿爾茨 海默氏癥中，CAA比在普通人群中更常見并可在大于80%的60以上阿爾茨海默氏癥患者中 存在。散發性CAA中腦血管淀粉樣沉積物的原因尚不明。在遺傳性CAA中，遺傳缺陷，通 常在21號染色體上，允許了淀粉樣蛋白——一種由名為β折疊片原纖維的單元構成的蛋 白——累積。原纖維有結成一團的趨勢，使得淀粉樣蛋白不能消散，并在腦血管壁中累積起 來。淀粉樣原纖維亞基蛋白的一種形式是淀粉樣β蛋白。淀粉樣沉積物可以破壞內皮細胞或平滑肌細胞，或內皮細胞和平滑肌細胞，或者 導致血管壁炎癥，并且還可以導致血管更易破裂。當帶有淀粉樣沉積物的微細血管變得越 來越重、越來越脆，并因此更有可能因小損傷或波動的血壓而發生爆裂時，還可以發生腦內 出血。當拉伸的壁變得更薄并處于較大的壓力之下時，可能形成動脈瘤或血管壁膨脹，還可 能破裂。CAA的最常見形式是與衰老有關的散發形式。這種類型的CAA通常導致可能在腦 的不同葉復發的腦葉出血。額葉(在額后)和頂葉(在額葉后)是最常受侵襲的；顳葉(接 近顳部)和枕葉(在腦后部)則較少受到侵襲；而小腦(在枕葉下)很少受侵襲。散發性 CAA中，約10-50%的出血涉及一個以上的腦葉。在CAA中，腦葉出血的癥狀根據所波及的腦葉，包括頭痛突然發作，神經癥狀如衰 弱、感覺缺失、視野改變或言語障礙；以及意識水平下降(患者難以喚醒)，惡心和嘔吐。散 發性CAA可以伴有與腦葉出血無關的癥狀。點狀出血(波及許多小血管的微小出血)可以 引起繼發于癲癇或血流量減少的復發性短暫神經癥狀，或者可以引起按獨特步驟惡化而不 是逐步惡化的迅速進展性癡呆(記憶和其它腦功能喪失)。超過40%的CAA繼發出血患者 同時患有癡呆。遺傳因素在某些類型的CAA和CAA相關疾病中起作用·荷蘭型(Dutch)遺傳性腦出血伴淀粉樣變(淀粉樣蛋白在血管中累積)常染 色體顯性，涉及淀粉樣前體蛋白的基因突變。發病于40-60歲，伴有頭痛常位于頂葉的腦出 血、中風和癡呆。一半以上的患者死于其首次出血。荷蘭型CAA患者可以發生抗凝異常或 血變稀，這導致更有可能出血。· Flemish型遺傳性腦出血伴淀粉樣變常染色體顯性，伴有涉及淀粉樣前體蛋白 的突變。癥狀包含腦出血或癡呆。·家族性阿爾茨海默氏癥常染色體顯性，占所有阿爾茨海默氏癥病例(其中神經 細胞死亡導致進行性癡呆的腦病)的5-10%。
唐氏綜合征由21三體(3條而不是2條21號染色體拷貝)引起，導致淀粉樣 前體蛋白基因過量。唐氏綜合征患兒有智力殘疾，并且可能有心臟問題。·冰島型遺傳性腦出血伴淀粉樣變常染色體顯性，伴有半胱氨酸蛋白酶抑制劑C 的編碼基因突變。癥狀常始于30-40歲，伴有多發性腦出血、癡呆、麻痹(衰弱)和10-20 年內死亡。一半以上的患者發生頭痛，四分之一出現癲癇發作。與大部分其它形式的CAA 不同，大多數出血波及腦內深處的基底神經節。(基底神經節是腦的小腦部分的組織島)。·家族性眼-柔腦膜淀粉樣變常染色體顯性，基因缺陷未知，見于日本、意大利和 北美家族。癥狀可以包括癡呆，共濟失調(協調障礙)，痙攣(四肢僵硬)，中風，癲癇發作， 外周神經病(影響支配四肢的神經的疾病)，偏頭痛，脊髓問題，失明和耳聾。罕見腦出血， 因為淀粉樣蛋白沉積在眼和腦脊膜(腦的被膜)的血管中，而不是腦自身內。在意大利患 病家族中，患者可以早在20-30歲時便受到該疾病的侵襲。 英國型家族性淀粉樣變常染色體顯性，基因缺陷未知，伴有進行性癡呆、痙攣和 共濟失調。腦干、脊髓和小腦都顯示有淀粉樣沉積物，但通常不發生出血。在一些方法中，患有CAA、并且無阿爾茨海默氏癥或其它疾病癥狀的患者適于用 Αβ抗體或能誘導Αβ抗體的藥劑進行治療。在其它方法中，并發CAA和阿爾茨海默氏癥或 其它疾病的患者適于用Αβ抗體或能誘導Αβ抗體的藥劑進行治療。在其它方法中，未患 CAA和阿爾茨海默氏癥及其它任何疾病的患者適于用Aβ抗體或能誘導Αβ抗體的藥劑進 行治療。在無癥狀患者中，治療可以始于任何年齡(例如，10，20或30歲)。然而，通常沒有 必要在患者達到40、50、60或70歲之前開始治療。治療通常必須是一段時間內多次給藥。 治療可以通過隨時間分析抗體或活化的T細胞或B細胞對治療藥劑(Αβ的抗體或其片段) 的應答來進行監測。如果應答減弱，表明應加大劑量。任選，在開始治療之前確定疾病的癥狀、體征或風險因子的存在與否。IV. CAA患者的診斷和監測同大多數神經疾病一樣，常常從患者的病史與仔細詢問家族史和患者的發病情況 及癥狀的模式、以及神經學檢查而得出診斷。腦部計算機斷層掃描(CT)或核磁共振成像 (MRI)可以鑒定腦葉出血、中風或點狀出血，在排除動靜脈畸形、腦腫瘤或其它出血原因中 很重要。血管造影術(血管和心臟內部的X線檢查)對CAA的診斷沒有幫助，但可能是排 除動脈瘤所需要的。腦活檢(手術切除小塊腦組織)可以顯示特征性淀粉樣沉積物。當診 斷不確定時，可能需要活檢來排除潛在要治療的病癥。檢查腦脊液蛋白的腰椎穿刺可以顯 示特征性的異常。伴有出血CAA必須與其它類型的腦出血區分開來。在CAA中，出血通常發生在葉 區，常破裂進入腦及其被膜間的蛛網膜下腔中，并在夜晚發生。在高血壓相關的出血中，出 血通常發生在腦內更深處，破裂進入腦內深處的室或腔中，并在日間活動時發生。腦出血的 其它原因有動靜脈畸形，創傷，動脈瘤，腦腫瘤中出血，血管炎(血管的炎癥)或出血性病 癥。患者可以通過MRI監測腦微出血和/或通過正電子發射斷層(PET)掃描監測血管淀粉 樣蛋白的去除。適于治療的患者包括處于CAA風險但未表現出癥狀的個體，以及目前正表現出癥 狀的患者。
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V.治療方案在預防性應用中，向易患CAA或處于CAA風險中的患者施用藥物組合物或藥劑，方 案包括所述組合物或藥劑的給藥量和頻率足以消除或降低風險、減輕嚴重度或延遲疾病發 作，包括疾病的生理學、生物化學、組織學和/或行為癥狀，疾病發展過程中呈現出的并發 癥和中間病理表型。在治療性應用中，向懷疑患有或已患有這樣的疾病的患者施用組合物 或藥劑，方案包括所述組合物的給藥量和頻率足以治愈或至少部分遏制疾病的癥狀(生 理學，生物化學，組織學和/或行為的)，包括疾病發展中呈現出的并發癥和中間病理表型。 完成治療性或預防性治療的適當量被定義為有效的治療或預防劑量。完成治療性或預防性 治療的適當的量和給藥頻率的組合被定義為有效治療或預防方案。在預防和治療方案中， 藥劑通常給藥數次劑量，直至獲得充分的免疫應答。通常，監測免疫應答，并在免疫應答開 始減弱時重復給藥。本發明的組合物治療上述病癥的有效劑量根據許多不同的因素而變化，包括給 藥方式、靶位點、患者的生理狀態、患者是人還是動物、施用的其它藥物以及治療是預防性 還是治療性的。通常，患者是人，但也可以治療非人哺乳動物，包括轉基因哺乳動物。治療 劑量需要逐漸增加，使安全性和有效性最佳。免疫原的量取決于是否還施用佐劑，無佐劑 時需要更高劑量。向人給藥時，免疫原的給藥量有時在1-500 μ g/患者間變化，更通常在 5-500 μ g/注射間變動。通常，每人注射使用約10、20、50或lOOyg。免疫原的質量還依 賴于免疫原內的免疫原性表位與免疫原總體質量的質量比。通常，對于微克級的免疫原使 用10-3-10_5μπιΟ1的免疫原性表位。注射時間的選擇可以從每天一次到每年一次到每十年 一次而顯著不同。在給予免疫原劑量的任何給定日，如果還施用佐劑，則劑量大于1 μ g/患 者，且通常大于10 μ g/患者，無佐劑時，大于10 μ g/患者，且通常大于100 μ g/患者。典型 的方案由先免疫、然后按時間間隔如6周的間隔加強注射而組成。另一方案由先免疫、然后 在1、2和12個月后加強注射組成。另一方案需要終生每2個月注射一次。或者，加強注射 可以根據免疫應答的監測所示，無規律地進行。對于用抗體進行被動免疫，劑量方案通常為0. 01_5mg/kg宿主體重。尤其是，劑量 范圍為約0. 5至小于5mg/kg，更通常為0. 5-3mg/kg宿主體重。例如，劑量可以小于5mg/kg 體重或1. 5mg/kg體重，或者在0. 5-1. 5mg/kg的范圍內，優選為至少1. 5mg/kg。對象可以每 天、隔天、每周一次或根據任何其它通過經驗分析確定的時間表來施用這些劑量。例示性 治療需要在較長時間，例如至少6個月內，多劑量給藥。其它例示性治療方案需要每2周一 次或每月一次或每3-6個月一次給藥。例示性被動給藥時間表包括每13周1. 5-3mg/kg或1. 5mg/kg。本發明的藥劑通常 多次給藥。單次劑量間的間隔可以是每周、每月、每13周或每年。時間間隔還可以根據患 者血液中的Αβ抗體水平的測量所示，是無規律的。在一些方法中，調整劑量以達到1-1000μ g/ml的血漿抗體濃度，在一些方法中達 到25-300 μ g/ml。或者，抗體可以作為緩釋制劑給藥，在這種情況下，需要的給藥頻率較低。 劑量和頻率根據抗體在患者中的半衰期而變化。一般而言，人抗體顯示出最長的半衰期，其 后是人源化抗體、嵌合抗體和非人抗體。施用Αβ N末端的特異性抗體的優選方案在患者中達到所施用抗體的平均血 清濃度l-15yg/ml。血清濃度可以通過實際測量確定，或者從標準藥代動力學(例如，
37WinNonline4. 0. 1 版(Pharsight Corporation，Cary，USA))根據抗體的給藥量、給藥頻率、 給藥途徑和抗體半衰期進行預測。血清中的平均抗體濃度優選在1-10、1-5或2-4μ g/ml 的范圍內。對于靜脈內給藥，每月一次至每季一次(優選每13周一次)施用劑量為0. l-5mg/ kg的抗體。對于每季一次給藥，劑量優選在0. 5-3,0. 5-2或0. 5-1. 5mg/kg的范圍內。每月 靜脈內給藥一次的抗體的優選劑量在0. 1-1. Omg/kg的抗體，或優選0. 5-1. Omg/kg的抗體 范圍內。對于更頻繁的給藥，例如，每周一次至每月一次給藥，皮下給藥是優選的。用于皮 下給藥的劑量通常在0. 1-0. 6mg/kg或0. 01-0. 35mg/kg、優選0. 05-0. 25mg/kg的范圍內。 對于每周一次或每兩周一次給藥，劑量優選在0. 015-0. 2mg/kg或0. 05-0. 15mg/kg的范圍 內。對于每周一次給藥，劑量優選為0. 05-0. 07mg/kg，例如，0. 06mg/kg。對于每兩周一次給 藥，劑量優選為0. 1-0. 15mg/kg。對于每月一次給藥，劑量優選為0. 1-0. 3mg/kg或2mg/kg。 每月一次給藥包括按照歷月或太陰月(即，每四周一次)給藥。治療方案通常連續，以使上述抗體的平均血清濃度維持至少6個月或一年，有時 一生。血清濃度可以在治療過程中的任何時間測量，如果平均濃度落入目標范圍以下，則增 加給藥劑量和/或頻率，或者如果平均濃度落入目標范圍以上，則降低劑量和/或頻率。盡管測定抗體的最佳血漿濃度對于確定個體患者的劑量方案或優化劑量有用，但 實際上，一旦根據給藥的mg/kg或mg和頻率確定了有效劑量方案，許多其它患者就可以使 用相同的劑量方案，而無需詳細計算或測量患者滴度。因此，不管是否測量或預測具體患者 的滴度，上述任何劑量和治療方案都可以使用。例如，一個適宜的方案是，以每月為間隔靜 脈內給藥，劑量范圍為0. 1-1. Omg/kg的抗體或優選0. 5-1. Omg/kg的抗體。對于皮下給藥， 所用劑量通常在0. 01-0. 6mg/kg或0. 01-0. 35mg/kg的范圍內，優選0. 05-0. 25mg/kg。對 于每周一次或每兩周一次給藥，劑量優選在0. 015-0. 2mg/kg或0. 05-0. 15mg/kg的范圍內。 對于每周一次給藥，劑量優選為0. 05-0. 07mg/kg，例如，0. 06mg/kg。對于每兩周一次給藥， 劑量優選為0. 1-0. 15mg/kg。對于每月一次給藥，劑量優選為0. 1-0. 3mg/kg或2mg/kg。這里以及本申請的別處，以mg/kg表示的劑量可以通過乘以典型患者的質量(例 如，70或75kg)轉換成以絕對質量劑量，通常四舍五入成整數。根據絕對質量表示，抗體通 常按l-40mg的劑量，以每周一次至每月一次的頻率給藥。優選范圍為5-25mg或2. 5_15mg， 頻率為每周一次至每月一次。對于每周一次至每兩周一次給藥，劑量常常為l_12mg或 2. 5-10mg。對于每周一次給藥，劑量常常為2. 5-5mg或4-5 mg。對于每兩周一次給藥，劑量 可以為7-10mg。以單位劑量包裝給藥的抗體質量通常四舍五入成整數，如1、5、10、20、30、 40、50、75 或 IOOmg0給藥的劑量和頻率可以根據治療是預防性的還是治療性的而變化。在預防性應用 中，向還未處于疾病狀態中的患者施用含有本抗體或用其混合物的組合物，以增強患者的 抵抗力。這樣的量被定義為“有效預防劑量”。在這種應用中，精確的量還是依賴于患者的 健康和全身免疫狀況，但通常在每劑0. l_25mg，特別是每劑0. 5-2. 5mg的范圍內。相對低的 劑量以相對不頻繁的間隔長時間給藥。一些患者在其余生中持續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對短的間隔的相對高劑量(例如，每劑約 10-250mg抗體，更常用5-25mg的劑量)，直至減輕或終止疾病的進展，優選直至患者表現出疾病癥狀的部分或完全改善。之后，可以向患者施用預防性方案。本發明的藥劑可以任選與其它在致淀粉樣變疾病的治療中至少部分有效的藥劑組合給藥。在淀粉樣沉積物出現在腦血管系統中的CAA情況下，本發明的藥劑還可以與增 加本發明的藥劑通過血腦屏障的其它藥劑聯合給藥。編碼免疫原的核酸的劑量范圍為約IOng至lg，IOOng-IOOmg, 1 μ g-10mg或 30-300 μ g DNA/患者。感染性病毒載體的劑量從每劑10-100個或更多的病毒體而異。誘導免疫應答的藥劑可以通過胃腸外、局部、靜脈內、口服、皮下、動脈內、顱內、鞘 內、腹膜內、鼻內或肌內方式給藥，用于預防性和/或治療性治療。盡管其它途徑同樣有效， 但免疫原性劑最典型的給藥途徑是皮下。其次最常見的途徑是肌內注射。這種類型的注射 最通常在臂或腿部肌肉中實行。在一些方法中，藥劑直接注射到沉積物累積的特定組織 中，例如，顱內注射。肌內注射或靜脈輸注是抗體給藥所優選的。在一些方法中，特定的治 療性抗體直接注射到顱內。在一些方法中，抗體作為緩釋組合物或裝置、如Medipad 裝置 施用。如上文所述，誘導對A β的免疫原性應答的藥劑各自可以組合給藥。藥劑可以 組合成單一制劑或藥劑盒，以同時、相繼或分開使用。藥劑可以在制劑或試藥劑盒中占 用單獨的小瓶，或者可以合并成單一小瓶。本發明的這些藥劑可以任選與其它在CAA的 治療中至少部分有效的藥劑組合給藥。葡胺聚糖模擬品(glycosaminoglycan-mimetic) CEREBRILL (Neurochem)目前處于治療CAA的臨床試驗中。應建議大多數CAA患者避開“使血 液稀薄”或干擾凝血的藥劑。影響凝血最強的藥物(因此對CAA患者最危險)是華法林(也 稱其商品名“Coumadin”)。其它對血液影響較弱的藥物有阿司匹林，噻氯匹定(“Ticlid”)， 氯吡格雷(“Plavix”)，和大多數抗炎藥物如布洛芬。并且，患者在出血性中風恢復后通常 謹慎監測血壓，使其保持在正常范圍內。癲癇發作或考慮為癲癇發作的復發性神經癥狀應 用抗癲癇藥處理，盡管D印akote (丙戊酸鈉)由于其抗血小板作用而應該避免。有時向大 量腦葉出血的患者給予抗癲癇藥以試圖防止癲癇發作，盡管這樣做的益處仍不清楚。消除 腦出血可能需要手術。CAA罕見伴有腦血管炎或血管壁炎癥。在這些情況下，用類固醇或免 疫系統抑制劑可能有幫助。本發明的免疫原性劑，如肽，有時與佐劑組合給藥。許多種佐劑都可以用于與肽組 合，以引發免疫應答。優選佐劑增強對免疫原的固有應答，而不引起影響應答的性質形式的 免疫原構象變化。優選的佐劑包括氫氧化鋁和磷酸鋁，3 De-O-酰化單磷酰脂質A(MPLtm) (見 GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc.，Hamilton，Montana，現為 Corixa 的 一部分)。StimuIon QS-21是分離自南美發現的皂皮樹(Quillaja Saponaria Molina tree)樹皮的三萜試或皂苷(見 Kensil 等，Vaccine Design :The Subunit and Adjuvant Approach (疫苗設計亞基和佐劑途徑)(Powell 和 Newman 編著，Plenum Press,NY, 1995)； 美國專利 No. 5，057, 540，Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, ΜΑ。其它佐劑有水包 油乳劑(如角鯊烯或花生油)，其任選與免疫刺激劑組合，如單磷酰脂質A (見Stoute等， N.Engl. J.Med. 336，86-91 (1997))、普流尼克(pluronic)聚合物和已殺死的分枝桿菌。另 一佐劑是CpG(W098/40100)。或者，Αβ可以與佐劑偶聯。然而，就影響對免疫原的免疫應 答性質而言，這樣的偶聯應基本不改變免疫原的構象。佐劑可以作為與活性劑的治療組合 物的成分給藥，或者可以在治療劑給藥之前、同時和之后單獨給藥。
優選的佐劑種類是鋁鹽(礬)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁。這樣的佐劑可以與 或不與其它特定的免疫刺激劑如MPL或3-DMP、QS-21，氨基酸聚合物或單體如聚谷氨酸或 聚賴氨酸一起使用。另一類佐劑是水包油乳劑制劑。這樣的佐劑可以與或不與其它特異免 疫刺激劑如胞壁酰肽(例如，N-乙酰胞壁酰基-L-蘇氨酰基-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)， N-乙酰基-降胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺(nor-MDP)，N-乙酰胞壁酰基-L-丙 氨酰基-D-異谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1'，2' -二棕櫚酰基-sn-甘油-3-羥基磷 酰氧基)-乙胺(MTP-PE)，N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰胞壁酰基-L-Al-D-異谷氨酸-L-丙 氨酸-二棕櫚氧基丙酰胺(DTP-DPP) theramide )或其它細菌細胞壁成分一起使用。水包 油乳劑包括(a)MF59(W0 90/14837)，含有5%角鯊烯、0. 5%吐溫80和0. 5% Span 85 (任 選含有不同量的MTP-PE)，用微流化器如IlOY型微流化器(Microfluidics，Newton ΜΑ)制 成亞微米粒子，(b)SAF，含有10%角鯊烯、0.4%吐溫80、5%普流尼克嵌段聚合物L121和 thr-MDP，均微流化成亞微米乳劑或渦旋至產生粒度較大的乳劑，以及(c)Ribi 佐劑系統 (RAS), (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT)含有2%角鯊烯、0. 2%吐溫80和來自單磷酰月旨 質A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細胞壁骨架(CWS)的一種或多種細菌細胞壁成分，優 選 MPL+CWS(Detox )。
另一類優選的佐劑是皂苷類佐劑，如Stimulon (QS-21，Aquila，Framingham, ΜΑ) 或由其產生的顆粒，如ISCOMs (免疫刺激復合物)和ISC0MATRIX。其它佐劑包括RC-529， GM-CSF，和藥學上可接受級的不完全弗氏佐劑(IFA)(以商品名Montanide銷售)。其它佐 劑包括細胞因子，如白細胞介素(例如，IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-12，IL-13和IL-15)、 巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子 (TNF)。另一類佐劑是糖脂類似物，包括N-糖基酰胺、N-糖基脲和N-糖基氨基甲酸酯，其 各自在糖殘基上被氨基酸取代，作為免疫調節劑或佐劑(見美國專利No. 4，855，283)。熱休 克蛋白，例如HSP70和HSP90，也可以用作佐劑。佐劑可以與免疫原一起作為單一組合物給藥，或者可以在免疫原給藥之前、同時 或之后給藥。免疫原和佐劑可以包裝和供應于同一小瓶中，或者可以包裝在分開的小瓶中， 于臨用前混合。免疫原和佐劑通常包裝有說明預定治療應用的標簽。如果免疫原和佐劑 分別包裝，包裝通常包括臨用前混合的說明書。佐劑和/或載體的選擇依賴于含有佐劑的 免疫原性制劑的穩定性、給藥途徑、給藥時間表、佐劑對被接種物種的有效性，并且，對人而 言，可藥用的佐劑是已被相關管理部門批準或可批準用于向人給藥的佐劑。例如，完全弗 氏佐劑不適用于向人給藥。礬、MPL和QS-21是優選的。任選，可以同時使用兩種或兩種以 上的不同佐劑。優選的組合物包括礬和MPL，礬和QS-21，MPL和QS-21，MPL或RC-529和 GM-CSF，以及礬、QS-21和MPL—起。也可以使用不完全弗氏佐劑(Chang等，Advanced Drug DeliveryReviews 32 (先進的藥物投送綜述 32)，173-186 (1998))，任選與礬、QS-21 和 MPL 中的任何一個及其所有組合物相組合。本發明的藥劑常常作為藥物組合物給藥，S卩，包含活性治療藥劑和多種其它藥學 上可接受的成分。見Remington' s PharmaceuticalScience (雷氏藥物科學)(第15版， Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1980)。優選的形式取決于給藥和治療 應用的預定模式。根據所需的制劑，組合物還可以包括藥學上可接受的無毒載體或稀釋劑， 其定義為常用來配制向動物或人給藥的藥物組合物的介質。選擇稀釋劑以不影響組合物的生物活性。這樣的稀釋劑的例子有蒸餾水、生理磷酸鹽緩沖鹽水、林格(Ringer's)溶液、右 旋糖溶液和Hank溶液。此外，藥物組合物或制劑還可以包括其它載體、佐劑或無毒、無治療 性、無免疫原性的穩定劑等。藥物組合物還可以包括大的代謝緩慢的大分子，如蛋白質，多糖如殼聚糖，聚乳 酸，聚乙醇酸和共聚物(如膠乳官能化的瓊脂糖(TM)，瓊脂糖，纖維素等)，聚合的氨基酸， 氨基酸共聚物，以及脂質集合體(如油滴或脂質體)。另外，這些載體可以起到免疫刺激劑 (艮P，佐劑)的作用。對于腸胃外給藥 ，本發明的藥劑可以以物質在生理學上可接受的稀釋劑和藥用載 體中的溶液或混懸液的可注射劑量給藥，所述藥用載體可以是無菌液體，如水、油、鹽水、甘 油或乙醇。此外，輔助性物質，如潤濕劑或乳化劑、表面活性劑、PH緩沖物質等，可以存在于 組合物中。藥物組合物的其它成分是石油、動物、植物或合成來源的那些，例如花生油、大豆 油和礦物油。一般而言，二醇如丙二醇或聚乙二醇是優選液體載體，尤其是對注射液而言。 抗體可以以按照允許活性成分持續釋放的方式配制的貯存注射劑(depot injection)或植 入制劑的形式給藥。例示性組合物包括5mg/mL單克隆抗體，在由50mM L-組氨酸和150mM NaCl組成、用HCl調節至pH 6. 0的含水緩沖液中配制。用于腸胃外給藥的組合物通常基本 上無菌，基本上等張，并依照FDA或類似部門的GMP條件生產。例如，含有生物劑的組合物 通常以過濾滅菌法滅菌。組合物可以配制成用于單劑量給藥。通常，將組合物制備成液體溶液或混懸液的可注射劑；也可以制備成適于注射前 在液體介質中制成溶液或混懸液的固體形式。如上文所討論，為增強佐劑效應，還可以將 制劑乳化或包囊在脂質體或微粒如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物中(見Langer，Science 249，1527(1990)和 Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28 (先進的藥物投送綜述 28) ,97-119(1997))。本發明的藥劑可以以貯存注射劑或植入制劑的形式給藥，它們可以按 允許活性成分持續或脈沖式釋放的方式配制。適于其它給藥方式的其它制劑包括口服、鼻內和肺制劑，栓劑，以及透皮應用。對于栓劑而言，粘合劑和載體包括，例如，聚亞烷基二醇或甘油三酯；這樣的栓 劑可以用含有0. 5% -10%、優選-2%范圍的活性成分的混合物制成。口服制劑包括 賦形劑，如藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素和碳酸鎂。這些組合物采 取溶液劑、混懸液、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋制劑或散劑的形式，并含有10% -95%、優選 25% -70%的活性成分。局部應用可以導致透皮或皮內遞送。藥劑與霍亂毒素或其去毒衍生物或亞基或者 其它類似的細菌毒素共同給藥，可以促進局部給藥(見Glerm等，Nature 391,851(1998))。 共同給藥可以通過用所述成分作為混合物或作為經化學交聯得到的連接分子或作為表達 為融合蛋白來完成。或者，透皮遞送可以用皮膚貼藥劑或用輸送體(transferosomes)來完成 (Paul φ, Eur. J. Immunol. 25, 3521-24 (1995) ；Cevc φ, Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15(1998))。VI.藥劑盒本發明進一步提供了治療產品。產品包括小玻璃瓶和說明書。小玻璃瓶含有制劑， 該制劑包括約IOmg至約250mg人源化抗A β抗體、約4%甘露醇或約150mM NaCl、約5mM至約IOmM組氨酸、和約IOmM蛋氨酸。說明書包括通過MRI監測患者的腦微出血，或者通過 PET掃描監測患者的血管淀粉樣蛋白的去除。
實施例實施例1
材料和方法研究設計。在兩項研究中考察慢性被動免疫對PDAPP小鼠中已形成的VA β的影 響。將A研究設計成比較N末端抗體(306，識別六0 1-5)和中間區抗體(266，識別A β 16-23) 的單劑有效性。B研究是3D6的劑量效應研究。在兩項研究中，將12月齡的雌性雜合PDAPP 小鼠分成40只一組；各組在年齡和轉基因親本上盡可能匹配相近。在分開評估中，在、時 處死一組40只動物，以測定12月齡時的血管淀粉樣蛋白水平。如表1所概括，處理組小鼠 被腹膜內注射鼠單克隆抗體3D6 γ 2a (以3種劑量水平)、266 γ 1或ΤΥ11-15 (作為陰性對 照)。所有被處理的動物均接受為計劃每周劑量的250%的初始負荷劑量。每只動物的劑 量根據該年齡段PDAPP小鼠的歷史平均體重50g計算。動物每周處理一次，共約6個月(26 周)。存活期(in-life phase)終止后，評價VAi3和微出血的存在及程度。所有工作都按 照Elan IA⑶C指導原則進行。抗體的制備。抗體3D6 (識別A β 1-5)、266 (識別A β 16-23)和12Α11 (識別 A β 3-7)的制備方法先前已有描述(見 K. Johnson-Wood 等，Proc Natl Acad Sci USA 94， 1550-5 (1997)，P. Seubert 等，Nature 359，325-7 (1992)，F. Bard 等，Proc Natl Acad Sci USA 100,2023-8(2003))。TY11/15 (IgG2a同種型)起無關對照抗體的作用。其識別未知的 人淋巴細胞抗原，但不識別小鼠淋巴細胞。抗體3D6和12A11如先前所述用NHS-生物素標 記(見 P. Seubert 等，Nature 359, 325-7 (1992))。制備腦組織用于組織化學。動物用異氟烷深度麻醉，心室內灌注鹽水。將各腦的 一個半球在4%多聚甲醛中于4°C浸沒固定48小時，在振動切片機上以40 μ m冠狀面切 片。免疫染色前，將切片儲存在_20°C的防凍液(30%甘油/30%乙二醇在pH 7.4的40福 Na2HPO4*)中。各腦選擇4-6個切片，以240μπι的間隔跨越吻側海馬水平，進行分析。從 頭骨中取出時額皮質受損的腦和切片不予分析。最終編號顯示在結果中。切片由不清楚處 理情況的研究者進行染色和分析。VA β和微出血共標記的組織化學程序將Αβ沉積物用生物素化抗體 3D6 (3. 0 μ g/ml)或12A11 (3· 0 μ g/ml)在1 %馬血清的PBS溶液中于4°C標記過夜。漂浮的 切片然后與親和素-生物素化辣根過氧化物酶復合物反應，用3，3-二氨基聯苯胺顯影。接 著將切片固定在載玻片上，用改良的Perls鐵反應共染色(co-stained)(見Μ. M. Racke等， 同上)，改良是在37°C孵育，以強化血鐵黃素反應產物。血鐵黃素的存在表明過去有微出血 事件。VA β分析通過將動物分類成反映VA β量的2類之一“無至少許VA β ”(任何 單個切片中(3根淀粉樣蛋白陽性血管/動物)或“中度VA β ”(任何單個切片中> 3根 淀粉樣蛋白陽性血管/動物)，對各個動物中的3D6免疫反應血管進行評價。這種分類方 法通過對A和B研究的組織中所有含淀粉樣蛋白的血管進行計數，并用ROC曲線鑒別出平 衡靈敏度和特異性的最佳截止值來建立。血管如果含有任何量的淀粉樣蛋白，便對其計數，這樣，被部分清除的血管和未被清除的血管便都計數。采用Fisher確切檢驗(FET)進行配對比較，以鑒定νΑβ的顯著差異。各研究中，用Hochberg法(見Y. Hochberg，Biometrika 75,800-802(1988))調整多重配對比較。微出血分析對各個動物在整個切片中血鐵黃素染色的存在、量、位置和強度進行 0-3級評分。“O”分表示染色非常少或無染色，“1”表示每個動物在少數切片中有小量斑點 或弱染色，“2”是指多個切片中有染色強度較高的連續聚積物，“3”反映在大多數切片中觀 察到了最深染色，通常包括大多數的周邊受襲血管。這些等級的設計限于反映本臨床前動 物研究的血鐵黃素陽性染色的范圍，因此不能代表或轉換成臨床出血性病癥的等級。采用 Fisher確切檢驗進行配對比較，以檢驗處理組間的差異。也對免疫標記的淀粉樣蛋白的形 態學外觀及其與血鐵黃素的空間關系進行觀察。各研究中，用Hochberg法(見Y. Hochberg, 同上)調整多重配對比較。結果血管A β。致密淀粉樣蛋白的硫磺素S染色(圖la)和識別PDAPP小鼠和人AD (圖 Ic)中的致密和彌漫性淀粉樣蛋白的抗體3D6 (圖lb)揭示，未處理的18月齡PDAPP小鼠的 柔腦膜和淺表實質中VA β顯著。VA β主要局限于腦脊膜，并緊靠在腦淺表層下面(圖Id)。 在皮質中、尤其是在矢狀竇的中線血管中特別顯著，硫磺素S(圖1)和抗體3D6(圖lb)顯 示，在小鼠和人組織(圖Ic)中有類似的VAi3分布。在N末端和中間區抗體的單劑量比較研究(Α研究)中，與266或ΤΥ11-15比較， 3mg/kg的3D6完全清除或阻止了 νΑβ (圖2a_e)；這些差異在統計學上具有顯著性(兩項 比較，P值都< 0. 0001)。3D6處理還降低了 98%的實質淀粉樣斑塊負荷量(ρ < 0. 0001)， 而266未產生作用。在開始處理之前，VAi3以中等水平存在于23%的12月齡小鼠中。采 用多重比較的Hochberg法，FET ρ值< 0. 025在統計學上具有顯著性。在3D6的劑量效應研究(B研究，圖3a_d)中，與TY11-15對照處理相比，3D6處理 再次在3. Omg/kg的3D6劑量水平上顯著清除或阻止了 νΑβ (ρ < 0. 001)。與對照相比，中 間劑量水平(0. 3mg/kg)也清除或阻止了 νΑβ (ρ = 0. 016)。0. lmg/kg劑量組與TY11-15 對照組間無差異((P = O. 8037)。采用多重比較的Hochberg法，FET ρ值< 0. 025在統計 學上具有顯著性。盡管血管數無顯著性差異，但該組在顯微鏡水平上觀察到了血管的淀粉 樣蛋白的部分清除(圖4a，b)。雖然如圖4a所示，完整Αβ形成包圍未受襲柔腦膜血管的 塊和帶，而在部分清除時，VAi3具有小塊的被腐蝕外觀(圖4b)。這種形態未見于未處理小 鼠。血鐵黃素評定。為辨別處理組間的細微差異，制定了血鐵黃素評定量表，反映本研 究內發現的染色密度的范圍。指示微出血的血鐵黃素染色限于血管系統的結構邊界而不擴 展至周圍的實質。局部血鐵黃素沉積物見于皮質柔腦膜(圖5a_f)和海馬-丘腦界面的血 管、內側皮質的矢狀竇血管、與柔腦膜血管成直角并連接的少數實質血管。血鐵黃素通常集 中在這些區域的巨噬細胞樣細胞中。血鐵黃素灶常與VAi3的形態改變相伴與VAi3沉積 的特征性獨特帶和小片(scales)(例如，圖4a)不同，淀粉樣蛋白具有不常見的斑塊狀被剝 蝕樣外觀(例如，圖4b)或者完全不存在。這些特征在柔腦膜(圖5)和矢狀竇的血管中尤 其顯著，其在TY11-15對照組和未處理小鼠(圖2和3)中常顯示出已發展的VAi3形態。在所有處理組中，血鐵黃素染色普遍缺乏或輕度，組間的大多數動物評分為0或1 (圖6)。兩項研究的3D63mg/kg處理組的評分明顯較高，表明這些比對照更有可能具有 大于0的血鐵黃素評分。在A研究中，TY11-15組與266組的血鐵黃素評分的分布相似， 表明266抗體處理不能提高血鐵黃素評分。B研究顯示，微出血的發生率通過給藥降低了。 TY11-15對照組與0. lmg/kg 3D6組及0. 3mg/kg 3D6組之間未發現顯著差異，表明低劑量和 中間劑量不可能使血鐵黃素評定增加至基線水平之上。3. Omg/kg組與這些組不同，其還與 對照有顯著差異。與A研究相比，3. Omg/kg組的較高血鐵黃素評分可能歸因于抗體暴露水 平隨時間的差異，以及群組的基線水平因對照組的評分稍微提高而有輕微增加。VA β清除與微出血的關系。兩項研究均在0. 3mg/kg和3. Omg/kg組中觀察到了對 血管淀粉樣蛋白的顯著清除或阻止。這些組中的大多數動物的血鐵黃素評分為0或1，表明 VAβ減少的大多數腦都有很少或無微出血跡象。在所有處理組中發現了帶有非常零星的 VA β和被腐蝕樣外觀的血鐵黃素陰性血管的數個例子(例如，圖4b)；這些可能是淀粉樣蛋 白在沒有微出血下被清除的血管。在0. lmg/kg 3D6處理的動物(圖5d)中觀察到血鐵黃 素染色時，其通常伴隨著斑塊狀淀粉樣蛋白在血管周圍的分布，可能表明清除正在進行中。 這些血管周圍的淀粉樣蛋白斑塊出現在皮質腦脊膜、實質和矢狀竇血管內的血管相關血鐵 黃素標記的位置處。0. 3mg/kg 3D6處理動物的血鐵黃素染色也伴隨著斑塊狀淀粉樣蛋白在 血管周圍的分布(圖5e)。淀粉樣蛋白的形態與0. lmg/kg 3D6處理動物的相似，但淀粉樣 蛋白較不豐富，并且一些血鐵黃素陽性血管被清除了淀粉樣蛋白。在包括皮質腦脊膜和實 質的血管相關血鐵黃素染色的位置上觀察到了淀粉樣蛋白的完全和部分清除。相反，3mg/ kg 3D6處理動物的血鐵黃素陽性血管常常完全沒有淀粉樣蛋白(圖5f)。這種特征在未處 理小鼠中從沒有觀察到，可能說明了出現在VAi3被完全去除的亞組血管中存在的殘留血 鐵黃素“足跡”。這些區域的另一特征是存在胞噬血鐵黃素的細胞(圖5f)。這些巨噬細胞 樣細胞對Αβ沒有免疫反應，因此似乎是有別于去除斑塊相關淀粉樣蛋白的小膠質細胞和 巨噬細胞的群體。討論CAA已被鑒定為認知受損的獨立風險因子，其與重要的病理如出血和局部缺血性 損傷有關(見S. Μ. Greenberg等，Stroke 35，2616-9 (2004))。在典型病例中，進展性CAA導 致了腦脊膜和實質血管系統中的平滑肌細胞的破壞，推測導致了灌注和血管周圍清除系統 的病損(tonal impairment)和損害(見R. Christie等，Am J Pathol 158，1065-71 (2001)， S.D.Preston 等，Neuropathol Appl Neurobiol 29，106-17 (2003))。在這里，我們第一次展示了用抗體外周給藥的長期免疫治療范例中，VAi3被N末 端特異性Αβ抗體(3D6)幾乎完全清除或阻止的證據。盡管了解機制并不是實施本發明所 必需的，但該作用可能依賴于牢固地結合沉積的淀粉樣蛋白的能力，因為在體內結合沉積 的Αβ的能力弱得多的中間區Αβ抗體(266)未顯示出清除或阻止νΑβ的證據。雖然有 越來越多的證據表明，血管淀粉樣蛋白的形成和組成可能與實質斑塊不同(見M.C，HerZig 等，Nat Neurosci 7，954-60 (2004))，但抗體3D6有能力清除這兩種形式，因此具有廣譜的 減少淀粉樣蛋白的活性。早先在APP轉基因小鼠中考察Αβ免疫治療的作用和腦微血管系統的研究報道了 微出血的發生率增加。然而，對于VAi3和微出血之間的明確因果關系還未有描述。在本報 告中，我們顯示，大部分沉積的血管淀粉樣蛋白被清除，而沒有誘導微出血，并通過證明微出血的發生率與VA β的去除相關，提高了早期觀察。此外，微出血的有限區域集中局限于 不血管系統涉及實質的結構邊界。這與VAi3的部分或完全去除有關。重要的是，可以通過 將抗體劑量調整至在仍有效清除實質淀粉樣斑塊的范圍內，來顯著減輕微出血。Racke和同事(見Μ. M. Racke等，同上)報道，PDAPP小鼠用明顯更大劑量的3D6 處理6周后，不常發生微出血。值得注意的是，報道的微出血的程度也大于當前研究中觀察 到的任何事件，這與我們關于抗體劑量與微出血評分之間正相關的發現一致。我們的觀察 結果與他們關于266不能結合沉積的淀粉樣蛋白或誘導微出血的發現一致，這些發現的延 伸顯示了 266也不能清除VA β。在VAi3病理非常嚴重的APP轉基因小鼠(ΑΡΡ23小鼠)中，腦出血自發發生，并 且，與人類患者相似，這可能是平滑肌細胞紊亂和丟失、以及A β相關毒性的其它破壞性后 果的結果(見R. Christie等，同上)。APP23小鼠用N末端區A β抗體被動免疫，最初加劇 了基線出血的發生和程度(見Μ. Pfeifer等，Science 298,1379(2002))。然而，隨后的超 微結構研究未在被處理和未免疫的對照的血管系統中發現結構差異(見G. J. Burbach等， 同上)。結論是，不管基線VA β病理的嚴重度，免疫治療沒有導致或加重對血管壁的明顯損 害。本研究與先前報道的不同在于考察的是很少自發微出血的模型，并且其中Αβ和血鐵 黃素被共標記。我們記錄了 Αβ去除和微出血的共定位，并發現局部微出血僅發生在被清 除淀粉樣蛋白的亞組血管中。由于我們的定量方法不能區別部分清除的VAβ和完整νΑβ， 因此絕對清除度可能被低估。實質淀粉樣蛋白和血管淀粉樣蛋白的清除之間的關系還未完全了解。然而，近 來的報道顯示，兩種病理之前可能存在共調節關系，這可以在去除斑塊的內容中進一步闡 明(見 D. Μ. Wilcock 等，同上；Μ. C. Herzig 等，同上；J. A. Nicoll 等，J Neuropathol Exp Neurol 65，1040-8 (2006))。例如，將嚴重VA β的突變APP小鼠飼養成嚴重實質斑塊負荷 量的小鼠實際上減少了 VAi3，提示斑塊可以為Αβ提供模板，否則其就會沉積于血管系統 上(見Μ. C. Herzig等，同上)。反過來，Wilcock和同事(見D. Μ. Wilcock等，同上)顯示， 在被動免疫范例中，VAβ在實質斑塊的去除過程中增加，提示在免疫治療過程中可能發生 Aβ從實質移位至血管腔。在本研究中，我們證明了 VAβ可以在被動免疫后被幾乎完全清除或阻止，所伴隨 的微出血發生率增加可以通過抗體給藥來減少。AD患者和AD的APP轉基因小鼠模型都顯 示，微出血發生率的增加與VAi3的進展有關。本文所述微出血可能可以由Wilcock所述的 VA β在清除實質斑塊的過程中增加(見D. MWilcock等，同上)進行解釋，其在本模型中 預期是暫時的，因為到本研究結束時，Μβ被最終清除。或者，在Wilcock的研究中，使用 了不同小鼠模型和抗體，因此Μβ的變化可以反映出關于不同抗體表位和動物模型的基 本機制差異。無論如何，假設去除已存在的VAi3和預防進一步沉積將對與進展性VAβ相 關的進一步微出血具有預防作用，則3D6的處理后事實上降低微出血的最終累積發生似乎 是可能的。換言之，處理相關的νΑβ和νΑβ附隨的(VAβ-contingent)微出血可能是暫 時現象，這種現象在VAi3被最終去除后將不再持續。總而言之，由臨床前模型獲得的發現 表明，與νΑβ的形成和清除相關的機制還需要進一步研究。重要的是，近來的研究已經顯 示，用全長Αβ肽免疫TG 2576小鼠實際上改善了血腦屏障的完整性(即，降低了伊文思 藍的滲透性)，提示這些多重因素事實上可能對血管系統具有積極影響(見D. L. Dickstein等，同上)。應該注意的是，完整A β肽的免疫產生了主要針對與3D6的表位相似的N末端 的抗體。約80%的AD患者受到至少輕度CAA的侵襲，臨床有害后果有出血、白質變性、局部 缺血和炎癥(見S. MGreenberg等，同上)。我們的研究發現提供了 Αβ免疫治療可以有潛 力逆轉或阻止目前還沒有治療方法的重要血管病理進展的證據，并進一步擴展了抗Αβ免 疫治療的潛在治療利益。實施例2材料和方法考察了淀粉樣蛋白誘導的結構變化對PDAPP小鼠血管的平滑肌細胞(SMC)和細胞 外基質(ECM)的影響，以及被動免疫對PDAPP小鼠血管的SMC和ECM的影響。每周一次用1或3mg/Kg的3D6抗體對小鼠進行免疫，為期3或9個月。對VA β 沉積物顯著(約70%的血管受襲)的矢狀竇的腦脊膜血管進行血管成分(對SMC為α肌 動蛋白，對ECM為膠原-IV)的高分辨率定量免疫組織化學(IHC)分析。通過血鐵黃素檢測 或鐵蛋白免疫組織化學監測微出血事件。結果在本研究中，我們證明了血管壁的變化總是與VA β相關，其包括SMC和ECM的變 性(厚度減少)及增生/肥大(厚度增加)。這兩種對立的結果常見于同一血管，但不存在 于野生型動物或沒有淀粉樣蛋白的PDAPP血管中。未處理PDAPP小鼠中，SM的極度增厚和 變薄導致大幅可變的血管表型。被動免疫治療以劑量和時間依賴性的方式恢復了血管SMC和ECM的厚度模式，并 降低了表型的可變性，高劑量的3D6在9個月時達到了對照水平(野生型)(ρ > 0. 05)。 雖然微出血的發生率在3個月組中增加，但其在9個月的處理后降低到了對照水平(ρ > 0. 05)。我們的結果提示，被動免疫治療可以使腦脊膜血管從淀粉樣蛋白誘導的結構變化中 恢復過來。此外，處理相關的微出血的增加似乎是暫態事件，其在VA β清除的過程中消退。 修復的機制可能由VAβ的去除觸發，最終導致血管功能障礙的恢復。盡管已經出于清楚理解的目的對上述發明進行了詳細描述，但顯而易見的是，可 以在所附權利要求的范圍內實施某些修改。本文所引用的所有出版物和專利文獻、以及出 現在附圖中的文本都出于所有目的以相同的程度全文引入本文作為參考，就像各自被個別 指出的一樣。
權利要求
治療CAA的方法，包括向患有或懷疑患有CAA的患者施用有效方案的藥劑，其中所述藥劑是對Aβ的N末端具有特異性的抗體或者在向患者給藥后誘導這樣的抗體，并從而治療患者。
2.權利要求1的方法，其中藥劑是抗體。
3.權利要求2的方法，其中藥劑是結合在Aβ的1-5位殘基內的抗體。
4.權利要求2的方法，其中抗體是人源化抗體、人抗體或嵌合抗體。
5.權利要求4的方法，其中抗體是人源化3D6或人源化12Α11。
6.權利要求5的方法，其中3D6人源化抗體是巴比紐珠單抗(bapineuzumab)。
7.權利要求1的方法，其中藥劑是Αβ的片段。
8.權利要求7的方法，其中片段始于Aβ的1位殘基，并止于A β的5-10位殘基之一。
9.權利要求7的方法，其中片段是Aβ 1-7。
10.權利要求7的方法，其中Αβ的片段與可藥用的佐劑一起給藥。
11.權利要求7的方法，其中Αβ的片段與幫助該片段誘導針對該片段的抗體的載體連接。
12.權利要求11的方法，其中載體與片段的C末端連接。
13.權利要求1的方法，還包括確定患者患有CAA，其中確定步驟發生在給藥步驟之前。
14.權利要求13的方法，其中確定步驟確定患者罹患CAA的臨床癥狀。
15.權利要求1的方法，其中患者腦中沒有阿爾茨海默氏癥的特征性斑塊。
16.權利要求14的方法，其中患者沒有阿爾茨海默氏癥的癥狀。
17.權利要求1的方法，其中患者有過心臟病發作或中風。
18.權利要求1的方法，其中抗體的劑量在約0.01至約5mg/kg之間。
19.權利要求1的方法，其中抗體的劑量在約0.1至約5mg/kg之間。
20.權利要求18的方法，其中劑量為約0.5mg/kg。
21.權利要求18的方法，其中劑量為約1.5mg/kg。
22.權利要求18的方法，其中劑量在約0.5至約3mg/kg之間。
23.權利要求18的方法，其中劑量在約0.5至約1. 5mg/kg之間。
24.權利要求18的方法，其中多次施用所述劑量。
25.權利要求18的方法，其中每周一次至每季一次施用所述劑量。
26.權利要求18的方法，其中每13周一次施用所述劑量。
27.權利要求1的方法，其中抗體經靜脈內或皮下給藥。
28.權利要求1的方法，還包括監測針對給藥步驟的CAA響應的體征或癥狀的變化。
29.權利要求1的方法，還包括施用有效治療CAA的第二藥劑。
30.實現預防CAA的方法，包括向易患CAA的患者施用有效方案的藥劑，其中所述藥劑是對Αβ的N末端具有特異性 的抗體或者在向患者給藥后誘導這樣的抗體，并從而實現患者的預防。
31.藥劑在治療或預防阿爾茨海默氏癥中的應用，其中所述藥劑是對Αβ的N末端具有 特異性的抗體或者在向患者給藥后誘導這樣的抗體。
32.減少患者血管淀粉樣蛋白的方法，包括按照與有效去除血管淀粉樣蛋白相關的和減少腦微出血發生率的治療方案施用對Αβ的N末端具有特異性的抗體。
33.權利要求32的方法，還包括 通過MRI監測患者的腦微出血。
34.權利要求32的方法，還包括通過PET掃描監測患者的血管淀粉樣蛋白的去除。
35.權利要求32的方法，其中治療方案是長期治療方案。
36.權利要求32的方法，其中治療方案包括每周一次至每季一次施用在0.01至5mg/ kg患者體重之間的抗體劑量。
37.權利要求36的方法，其中抗體的劑量為0.l-5mg/kg。
38.權利要求36的方法，其中劑量為約0.5mg/kg。
39.權利要求36的方法，其中劑量為約1.5mg/kg。
40.權利要求36的方法，其中劑量在約0.5至約3mg/kg之間。
41.權利要求36的方法，其中劑量在約0.5至約1. 5mg/kg之間。
42.權利要求36的方法，其中每13周一次施用所述劑量。
43.權利要求32的方法，其中抗體經靜脈內或皮下給藥。
44.權利要求32的方法，其中抗體結合在Aβ的1-5位殘基內。
45.權利要求32的方法，其中抗體是人源化抗體、人抗體或嵌合抗體。
46.權利要求45的方法，其中抗體是人源化3D6或人源化12Α11。
47.權利要求46的方法，其中人源化抗體是巴比紐珠單抗(bapineuzumab)。
48.治療阿爾茨海默氏癥的方法，包括以減少或抑制血管致淀粉樣變病理發展、使微出血最少化、和/或減少或抑制Αβ斑塊 發展的劑量施用對Aβ的N末端具有特異性的抗體。
49.權利要求48的方法，其中抗體結合在Aβ的1-5位殘基內。
50.權利要求48的方法，其中抗體是人源化抗體、人抗體或嵌合抗體。
51.權利要求50的方法，其中抗體是人源化3D6或人源化12Α11。
52.權利要求51的方法，其中人源化抗體是巴比紐珠單抗(bapineuzumab)。
53.治療阿爾茨海默氏癥的方法，包括以減少或抑制血管致淀粉樣變病理發展、使微出血最少化、和/或減少或抑制神經炎 病理發展的劑量施用對Aβ的N末端具有特異性的抗體。
54.權利要求53的方法，其中抗體結合在Aβ的1-5位殘基內。
55.權利要求53的方法，其中抗體是人源化抗體、人抗體或嵌合抗體。
56.權利要求55的方法，其中抗體是人源化3D6或人源化12Α11。
57.權利要求56的方法，其中人源化抗體是巴比紐珠單抗(bapineuzumab)。
58.治療阿爾茨海默氏癥的方法，包括以減少或抑制血管致淀粉樣變病理、使微出血最少化、和/或改善患者認知功能的劑 量施用對Aβ的N末端具有特異性的抗體。
59.權利要求58的方法，其中抗體結合在Aβ的1-5位殘基內。
60.權利要求58的方法，其中抗體是人源化抗體、人抗體或嵌合抗體。
61.權利要求60的方法，其中抗體是人源化3D6或人源化12Α11。
62.權利要求61的方法，其中人源化抗體是巴比紐珠單抗(bapineuzumab)。
63.權利要求48-62任一項的方法，其中減少或抑制血管致淀粉樣變病理是阻止血管 Aβ累積或清除血管Aβ。
64.用于治療CAA的藥劑盒，包括a.含有制劑的小玻璃瓶；和b.監測施用所述制劑的患者的CAA的說明書。
65.用于治療CAA的藥劑盒，包括a.含有制劑的玻璃小瓶，所述制劑包含約0.5至3mg/kg的人源化抗Aβ抗體；和b.監測施用所述制劑的患者的CAA的說明書，包括 i.通過MRI監測患者的腦微出血，或 .通過PET掃描監測患者的血管淀粉樣蛋白的去除。
66.用于治療CAA的藥劑盒，包括a.含有制劑的小玻璃瓶，所述制劑包括i.約IOmg至約250mg的人源化抗Aβ抗體，ii.約4%甘露醇或約150mMNaCl，iii.約5mM至約IOmM組氨酸，和iv.約IOmM蛋氨酸；以及b.監測施用所述制劑的患者的CAA的說明書，包括 i.通過MRI監測患者的腦微出血，或 .通過PET掃描監測患者的血管淀粉樣蛋白的去除。
67.用于治療阿爾茨海默氏癥的藥劑盒，包括a.含有制劑的小玻璃瓶，所述制劑包括i.約IOmg至約250mg的人源化抗Aβ抗體，ii.約4%甘露醇或約150mMNaCl,iii.約5mM至約IOmM組氨酸，和iv.約IOmM蛋氨酸；以及b.監測施用所述制劑的患者的阿爾茨海默氏癥的說明書，包括 i.通過MRI監測患者的腦微出血，或 .通過PET掃描監測患者的血管淀粉樣蛋白的去除。
68.用于治療CAA和阿爾茨海默氏癥的藥劑盒，包括a.含有制劑的小玻璃瓶，所述制劑包括i.約IOmg至約250mg的人源化抗Aβ抗體，ii.約4%甘露醇或約150mMNaCl,iii.約5mM至約IOmM組氨酸，和iv.約IOmM蛋氨酸；以及b.監測施用所述制劑的患者的CAA和阿爾茨海默氏癥的說明書，包括 i.通過MRI監測患者的腦微出血，或 .通過PET掃描監測患者的血管淀粉樣蛋白的去除。
69.權利要求2的方法，其中抗體按照足以使患者抗體的平均血清濃度維持在1-15μ g抗體/ml血清并從而治療患者的方案給藥。
70.權利要求69的方法，其中平均血清濃度在1-10μ g抗體/ml血清的范圍內。
71.權利要求70的方法，其中平均血清濃度在1-5μ g抗體/ml血清的范圍內。
72.權利要求71的方法，其中平均血清濃度在2-4μ g抗體/ml血清的范圍內。
73.權利要求69的方法，其中抗體經靜脈內給藥。
74.權利要求73的方法，其中每月一次施用0.5-1. Omg/kg的劑量。
75.權利要求74的方法，其中每月一次施用0.1-1. Omg/kg的劑量。
76.權利要求2的方法，其中抗體經皮下給藥。
77.權利要求76的方法，其中抗體以每周一次至每月一次的頻率給藥。
78.權利要求76的方法，其中抗體每周一次或每兩周一次給藥。
79.權利要求76的方法，其中抗體以約0.01至約0. 35mg/kg的劑量給藥。
80.權利要求76的方法，其中抗體以約0.05至約0. 25mg/kg的劑量給藥。
81.權利要求76的方法，其中抗體以約0.015至約0. 2mg/kg的劑量每周一次至每兩周 一次給藥。
82.權利要求76的方法，其中抗體以約0.05至約0.15mg/kg的劑量每周一次至每兩周一次給藥。
83.權利要求76的方法，其中抗體以約0.05至約0. 07mg/kg的劑量每周一次給藥。
84.權利要求76的方法，其中抗體以0.06mg/kg的劑量每周一次給藥。
85.權利要求76的方法，其中抗體以約0.1至約0. 15mg/kg的劑量每兩周一次給藥。
86.權利要求2的方法，其中抗體的平均血清濃度保持至少6個月。
87.權利要求2的方法，其中抗體的平均血清濃度保持至少一年。
88.權利要求2的方法，還包括測量血清中的抗體濃度，并且如果測得的濃度處于范圍 之外，則調整方案。
89.權利要求2的方法，其中抗體以約0.01至約0. 6mg/kg的劑量和每周一次至每月一 次的頻率經皮下給藥。
90.權利要求2的方法，其中抗體以約0.05至約0. 5mg/kg的劑量給藥。
91.權利要求89的方法，其中抗體以約0.05至約0. 25mg/kg的劑量給藥。
92.權利要求89的方法，其中抗體以約0.015至約0. 2mg/kg的劑量每周一次至每兩周 一次給藥。
93.權利要求89的方法，其中抗體以約0.05至約0.15mg/kg的劑量每周一次至每兩周一次給藥。
94.權利要求89的方法，其中抗體以約0.05至約0. 07mg/kg的劑量每周一次給藥。
95.權利要求89的方法，其中抗體以0.06mg/kg的劑量每周一次給藥。
96.權利要求89的方法，其中抗體以約0.1至約0. 15mg/kg的劑量每兩周一次給藥。
97.權利要求89的方法，其中抗體以約0.1至約0. 3mg/kg的劑量每月一次給藥。
98.權利要求89的方法，其中抗體以0.2mg/kg的劑量每月一次給藥。
99.權利要求2的方法，其中抗體以約1至約40mg的劑量和每周一次至每月一次的頻 率給藥。
100.權利要求99的方法，其中抗體以約5至約25mg的劑量給藥。
101.權利要求99的方法，其中抗體以約2.5至約15mg的劑量給藥。
102.權利要求99的方法，其中抗體以約1至約12mg的劑量每周一次至每兩周一次給藥。
103.權利要求99的方法，其中抗體以約2.5至約IOmg的劑量每周一次至每兩周一次給藥。
104.權利要求99的方法，其中抗體以約2.5至約5mg的劑量每周一次給藥。
105.權利要求99的方法，其中抗體以約4至約5mg的劑量每周一次給藥。
106.權利要求98的方法，其中抗體以約7至約IOmg的劑量每兩周一次給藥。
全文摘要
本發明提供了用于治療腦淀粉樣血管病(CAA)的改進的藥劑和方法，以及實現CAA預防的方法。本方法可以治療CAA并發阿爾茨海默氏癥，或者分別治療。本方法可以實現CAA并發阿爾茨海默氏癥的預防，或分別預防。本方法包括施用對Aβ的N端具有特異性的抗體，或可以誘導這種抗體的藥劑。
文檔編號G01N33/53GK101970000SQ200880018810
公開日2011年2月9日 申請日期2008年4月18日 優先權日2007年4月18日
發明者卡特·多拉·蓋姆斯, 薩利·施勒特爾 申請人:楊森阿爾茨海默氏癥免疫治療公司;惠氏有限責任公司
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