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從中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫中篩選sars冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的新方法

時間:2023-11-04    作者: 管理員

專利名稱:從中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫中篩選sars冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的新方法
技術領域
本發(fā)明涉及藥物的篩選方法,更具體而言,涉及以SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體結構為基礎,從中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫中篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑的新方法及基于此方法發(fā)現(xiàn)的SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制劑。
背景技術
SARS(Severe Acute Respiratory Sydrome)為引起嚴重急性呼吸道綜合癥(非典型性肺炎)的簡稱,其病原體為冠狀病毒屬的一種病毒(Peiris J.et al.Lancet,2003,3611319-1325)。冠狀病毒是正鏈RNA病毒。冠狀病毒屬隸屬于冠狀病毒科。在目前已知的正鏈RNA病毒中,它們的基因組是最大的(Siddell,S.G.等人Coronaviruses,toroviruses,and arteriviruses.in Topley & Wilson′s Microbiology andMicrobia Infections,10th edition,Vol.Virology(eds.Mahy,B.W.J.& ter Meulen,V.)823-856(Hodder Arnold,London,2005)。這個屬含有約26個種;按照它們的自然宿主、基因序列以及血清型關系,這個屬又可以被分為三個組群(group)其中第一組群有TGEV,Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus(豬傳染性胃腸炎病毒)等;第二組群有SARS冠狀病毒等;第三組群有AIBV,Avian InfectiousBronchitis Virus(禽傳染性支氣管炎病毒)等(Spaan,W.J.M.and Cavanagh,D.Coronaviridae.in Virus taxonomy,VIIIth Report of the ICTV.945-62(Elsevier-Academic Press.,London,2004)。
SARS冠狀病毒2/3到3/4的基因組編碼了兩個復制酶多蛋白(replicasepolyproteins)pp1a和pp1ab(Ziebuhr,Snijder et al.2000;Thiel,Herold et al.2001;Anand,Yang et al.2005;Ziebuhr 2005),它們只有在病毒編碼的蛋白酶切割成獨立亞基之后才能使病毒完成正常轉錄、復制功能(Ziebuhr,Snijder et al.2000;Anand,Yang et al.2005;Bartlam,Yang et al.2005)。SARS冠狀病毒主要蛋白酶(mainprotease,簡稱主蛋白酶)在這個過程中起主要作用。如果能夠抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶的水解作用,那么將會有效地抵御SARS冠狀病毒對人體的侵染。因此,SARS冠狀病毒的主蛋白酶是抗SARS藥物篩選的一個主要靶標。
天然產(chǎn)物又稱次級代謝產(chǎn)物(Secondary Metabolites),具有結構的多樣性和生物活性的多樣性。天然產(chǎn)物及其衍生物在以往的疾病治療中發(fā)揮了無可限量的作用,也是當今藥物研發(fā)過程中最具潛力的資源之一(Newman DJ,GraggGM,Snader KM.Nat Prod Rep,2000,17(3)215-234;Lee K-H.J NatProd.2004,67(2)273-283)?,F(xiàn)在對中藥等傳統(tǒng)藥物、海洋生物以及微生物代謝過程中的天然產(chǎn)物研究方興未艾,每年都會有大量結構新穎的化合物被發(fā)現(xiàn)提供出來,這些新穎化合物是合成方法所無法實現(xiàn)的藥物和藥物先導化合物的重要源泉,在新藥和先導化合物的發(fā)現(xiàn)中起著重要作用。對于天然產(chǎn)物尤其是來源于中藥等的天然產(chǎn)物的研究是很有必要的,因為中藥在我國已有數(shù)千年應用的歷史,是一個偉大的藥物小分子化合物的寶庫,因此從中藥等天然產(chǎn)物中進行重要病毒或重要疾病相關靶蛋白抑制劑的篩選是很有必要的。
陳曙霞的CN1600308A(2005.03.30)中公開了從眾多的中藥中篩選出唯一一味低毒有效成分——槐果堿單體(sophocarpine,簡稱SC),其用于抗SARS病毒是有效果。但是其實質上并不是對中藥整體的篩選,而是根據(jù)基于SARS病毒與柯薩奇B病毒存在的共同點,而槐果堿單體對于柯薩奇B病毒有治療效果而推導得出的,其中并沒有闡述該單體的作用機理。
徐筱杰等的CN1602853A(2005.04.06)中公開了一種抑制SARS冠狀病毒感染的中藥有效成分及其生物活性測定方法,具體涉及從植物五倍子中分離出的抑制SARS冠狀病毒侵染宿主細胞的有效成分,該成分針對的是冠狀病毒的關鍵結構域S2蛋白。黃建平的CN1803168A(2006.07.19)公開了一種治療嚴重急性呼吸綜合征(SARS)的中藥,該中藥來源于臨床治療ARDS有效驗方,依據(jù)上述SARS病因病機及治則加減組方,由大青葉(干品)15-30g,生桅子5-15g,金銀花15-30g,炒僵蠶10-15g,玄參10-15g,牡丹皮10-15g,紫丹參15-30g,西洋參5-10g,生甘草15-30g,桑白皮10-30g,葶藶子15-30g,漢防己5-10g,生大黃5-10g(后下)共十三味中藥材組成,具有清熱平喘,解毒化濁,涼血消斑,活血化瘀,利水祛濕,瀉肺通腑,益氣養(yǎng)陰之功效,主要用于SARS喘憋期治療,入湯劑口服,一日兩劑,一次煎取藥液600毫升,每隔1-2小時喝一次。該文獻中并沒有對各種中藥的作用機理做出任何闡述。
目前還沒有以SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體結構為基礎,從中藥等天然藥物系統(tǒng)(如中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫)中來篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的技術。本發(fā)明提供了一種從來源于中藥等天然產(chǎn)物混合物備選樣品中篩選靶向與SARS冠狀病毒主蛋白酶結合,且結合能力最好的小分子抑制劑的方法,并從原子水平闡釋了其對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制機理。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種從天然產(chǎn)物混合物備選庫中篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的方法,此方法包括步驟A測定天然產(chǎn)物混合物備選庫中的備選樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性,獲得對SARS冠狀病毒主蛋白酶有抑制活性的樣品,這些樣品稱為“有抑制活性的樣品”,將SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體與“有抑制活性的樣品”接觸,得到SARS冠狀病毒主蛋白酶與小分子抑制劑復合體的晶體。SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體與“有抑制活性的樣品”接觸時,根據(jù)需要,可分別與單一的“有抑制活性的樣品”接觸,也可與混合的“有抑制活性的樣品”接觸。
在得到SARS冠狀病毒主蛋白酶與小分子抑制劑復合體的晶體后,再進行步驟B收集并分析步驟A中得到的復合體的晶體的X射線衍射數(shù)據(jù),獲得與SARS冠狀病毒主蛋白酶結合的小分子抑制劑的電子密度。
獲得與SARS冠狀病毒主蛋白酶結合的小分子抑制劑的電子密度后,再進行步驟C以步驟B中獲得的與SARS冠狀病毒的主蛋白酶結合的小分子抑制劑的電子密度為基礎,鑒定與SARS冠狀病毒主蛋白酶結合的小分子抑制劑,獲得小分子抑制劑與SARS冠狀病毒主蛋白酶復合體的精細三維結構。
在步驟C之后,再進行步驟D測定小分子抑制劑對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性。
本發(fā)明中用來篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的天然產(chǎn)物混合物備選庫,可以是以任何天然產(chǎn)物為原料,以任何方法制備得到的備選樣品。
本發(fā)明優(yōu)選用如下初級原料制備用于篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的天然產(chǎn)物混合物備選庫包括傳統(tǒng)藥材、按中藥處方規(guī)定的藥材種類和用量組成的混合藥材等中藥,還未進行藥用開發(fā)的動植物品種、海洋生物、微生物等等。
由于中藥等天然產(chǎn)物粗提物所含的成分是相當復雜的,因此必須對天然產(chǎn)物的粗提物進行優(yōu)化,目的是去除對SARS冠狀病毒主蛋白酶體外活性測定和晶體浸泡實驗中的干擾因素如蛋白、多糖等,保留成藥性較好的小分子并使之盡量集中,提高相對濃度,以制備適用于以SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體結構為基礎進行抑制劑篩選的備選庫。本發(fā)明提供了可以實現(xiàn)這一目的制備備選庫的技術方案,其基本原理為對初級原料提取后,提取物先使用不同極性的溶劑如乙酸乙酯進行萃取、萃取后的水相再用大孔樹脂分離的方法進行處理,這樣既能保證去除蛋白、多糖等干擾因素,又能利用兩種不同分離機制的差別,使小分子集中到極性不同的段位,由此得到含有適中分子量的并能夠用于以SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體結構為基礎進行抑制劑篩選的天然產(chǎn)物混合物備選庫。
本發(fā)明提供的制備用于篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑天然產(chǎn)物混合物備選庫的方法,具體包括下述步驟(a)、取一定量的初級原料,用乙醇溶液回流提取,合并提取液,濃縮得浸膏;(b)、稱取一定量步驟(a)中所得的浸膏,用雙蒸水懸浮,用有機溶劑萃取,分離有機溶劑相和水相;合并水相,備用;合并每次有機溶劑萃取物,蒸除其中的有機溶劑,得到干膏狀有機溶劑相樣品,備用;(c)、蒸除步驟(b)中萃取后的水相部分的水中溶解的少量有機溶劑,用大孔樹脂柱層析分離,依次用水和乙醇溶液為流動相洗脫;棄去水洗部分,蒸除乙醇溶液洗脫部分的溶劑,得干膏狀樣品備用;
(d)、上述步驟(b)中制得的干膏狀有機溶劑相樣品和步驟(c)中制得的干膏狀樣品即為源自一種初級原料的2個備選樣品。
本發(fā)明提供的制備天然產(chǎn)物混合物備選庫的優(yōu)選方法為步驟(a)中乙醇溶液與初級原料的用量質量比為6∶1-12∶1;所用乙醇溶液濃度為70%-95%;步驟(b)中浸膏與懸浮用雙蒸水的質量比為1∶5-1∶15,萃取用有機溶劑為乙酸乙酯或氯仿,其體積與懸浮用雙蒸水的體積比為6∶1-10∶1;步驟(c)中所用乙醇溶液濃度為50%。
上述制備方法中,優(yōu)選的初級原料為中藥,更優(yōu)選的初級原料為魚腥草,野菊花,大青葉,蘆根,金銀花,連翹,黃芩,知母,四季青,穿心蓮,鴨跖草,梔子,射干,山豆根,馬勃,玄參,地骨皮、川藏香茶菜、鄂西香茶菜。
此外,本發(fā)明提供的從天然產(chǎn)物混合物備選庫中篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的方法,更優(yōu)選在步驟A中SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體與“有抑制活性的樣品”接觸時,使用的方法為晶體浸泡或共結晶的晶體浸泡方法。
在一個實施方案中,本發(fā)明獲得了SARS冠狀病毒主蛋白酶-川藏香茶菜丙素復合體的晶體。
在另一個實施方案中,本發(fā)明篩選得到了SARS冠狀病毒主蛋白酶的小分子抑制劑川藏香茶菜丙素。
在另一個實施方案,本發(fā)明提供了川藏香茶菜可以用于治療或預防SARS冠狀病毒、傳染性胃腸炎病毒或者禽傳染性支氣管炎病毒等冠狀病毒感染。
在另一個實施方案中,本發(fā)明提供的川藏香茶菜丙素能夠有效抑制冠狀病毒主蛋白酶活性,可以用于治療或者預防SARS冠狀病毒、傳染性胃腸炎病毒或者禽傳染性支氣管炎病毒等冠狀病毒感染。
在另一個實施方案中,本發(fā)明提供了能夠有效抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶活性的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品、鄂西香茶菜乙酸乙酯萃取樣品、黃芩乙酸乙酯萃取樣品、魚腥草乙酸乙酯萃取樣品、山豆根乙酸乙酯萃取樣品、梔子乙酸乙酯萃取樣品、知母乙酸乙酯萃取樣品7種中藥樣品及其制備方法。
本發(fā)明選取SARS冠狀病毒中晶體結構已知的主蛋白酶,對我國傳統(tǒng)中藥等天然產(chǎn)物混合物樣品進行活性成分篩選,是從一種新的角度去研究中藥學、天然產(chǎn)物學和生物學。其實質內容可包括兩方面第一,靶蛋白的表達、純化及結晶,這屬于生物大分子的研究范疇;第二,使中藥等天然產(chǎn)物混合物樣品中非孤立存在的天然產(chǎn)物小分子自由地與靶蛋白——SARS冠狀病毒主蛋白酶進行競爭性的結合,這屬于化學特別是天然產(chǎn)物化學研究的范疇。
本發(fā)明的抑制劑篩選的方法以SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體結構為基礎,從中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫中進行篩選,能夠快速、準確的尋找對SARS冠狀病毒主蛋白酶的特異性的抑制劑,提高了篩選的準確性。本發(fā)明的方法相對簡單、成本較低,但篩選效率高、快捷、準確,并可以從混合物樣品中,得到結合能力最好的抑制劑小分子。
具體而言,與現(xiàn)有方法相比,本發(fā)明的抑制劑的篩選方法的優(yōu)點如下(1)首先,該方法省去了繁瑣的天然產(chǎn)物分離純化步驟,大大減少工作量,而且本方法的中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫的中的樣品適宜于進行SARS冠狀病毒主蛋白酶的體外活性測定和X射線晶體學測試,極大地提高了篩選效率和命中率。
(2)使用SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體作為誘餌,浸泡有活性的天然產(chǎn)物混合物樣品,可以把對SARS冠狀病毒主蛋白酶有抑制作用的小分子抑制劑從混合物樣品中分離出來,獲得SARS冠狀病毒主蛋白酶與小分子抑制劑結合的復合體的精細三維結構,并從原子水平上闡釋該小分子抑制劑對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制機理。。
(3)使用本發(fā)明方法,通過使用SARS冠狀病毒主蛋白酶浸泡天然產(chǎn)物混合物樣品,可以從天然產(chǎn)物混合物樣品中找到與SARS冠狀病毒主蛋白酶結合能力最好的小分子(競爭結合的原理),優(yōu)化選擇了小分子抑制劑。


圖1本發(fā)明的野菊花,蘆根,金銀花,連翹,四季青,鴨跖草,梔子,射干,馬勃,玄參,地骨皮的水相50%乙醇洗脫樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度100μg/mL圖2本發(fā)明的魚腥草,大青葉,黃芩,知母,穿心蓮,山豆根的水相50%乙醇洗脫樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度100μg/mL圖3本發(fā)明的金銀花,黃芩,穿心蓮,四季青,鴨跖草,馬勃,玄參,蘆根,大青葉,地骨皮的乙酸乙酯萃取樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度100μg/mL圖4本發(fā)明的魚腥草,野菊花,連翹,知母,梔子,射干,山豆根的乙酸乙酯萃取樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度100μg/mL圖5本發(fā)明的魚腥草、山豆根、梔子、知母、黃芩的乙酸乙酯萃取樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度10μg/mL圖6本發(fā)明的鄂西香茶菜乙酸乙酯萃取樣品、水相50%乙醇洗脫樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度100μg/mL圖7本發(fā)明的鄂西香茶菜乙酸乙酯萃取樣品、水相50%乙醇洗脫樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度10μg/mL圖8本發(fā)明的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品、水相50%乙醇洗脫樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度100μg/mL圖9本發(fā)明的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品、水相50%乙醇洗脫樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性曲線圖。樣品濃度10μg/mL圖10本發(fā)明的SARS冠狀病毒主蛋白酶活性位點附近電子密度對比圖。a為SARS冠狀病毒主蛋白酶母體晶體活性位點的電子密度顯示;b為SARS冠狀病毒主蛋白酶與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品浸泡后的晶體活性位點的電子密度顯示;c為SARS冠狀病毒主蛋白酶與川藏香茶菜丙素浸泡后的晶體活性位點的電子密度顯示。圖中所示的電子密度,藍色為2fofc電子密度,為1.0sigma;青色和綠色為1fofc差值電子密度,為2.5sigma圖11本發(fā)明的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品中的存在的小分子的電子密度與SARS冠狀病毒主蛋白酶活性位點Cys145殘基電子密度形成共價鍵的顯示圖。蛋白質分子用白色飄帶圖表示,活性位點的Cys145殘基用球棍模型表示;藍色電子密度表示Cys145的電子密度,紅色電子密度表示未知小分子的電子密度。
圖12本發(fā)明的SARS冠狀病毒主蛋白酶與川藏香茶菜提取物乙酸乙酯萃取樣品作用前后的質譜圖。藍色表示SARS冠狀病毒主蛋白酶本身的質譜峰;紅色表示SARS冠狀病毒與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品作用后的質譜峰。
圖13 20μM的川藏香茶菜丙素對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性曲線14 2μM的川藏香茶菜丙素對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性曲線15 20μM的川藏香茶菜丙素對TGEV主蛋白酶的抑制活性曲線16 2μM的川藏香茶菜丙素對TGEV主蛋白酶的抑制活性曲線17 100μM的川藏香茶菜丙素對AIBV主蛋白酶的抑制活性曲線18 10μM的川藏香茶菜丙素對AIBV主蛋白酶的抑制活性曲線圖為了更加詳細地解釋本發(fā)明,下面將結合附圖給出本發(fā)明的具體實施例。
具體實施例方式
實施例11.SARS冠狀病毒主蛋白酶的表達、純化和晶體生長根據(jù)文獻(Yang H etal.Proc Natl Acad Sci.2003 Nov;100(23)13190-5)進行SARS冠狀病毒主蛋白酶(氨基酸序列見序列表部分)的表達、純化和晶體生長,得到衍射分辨率較高(高于2.6)的SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體。具體地a.SARS冠狀病毒主蛋白酶的表達載體構建具體步驟包括(1.1)利用北京華大基因中心提供的編號為BJ01的SARS病毒毒株的cDNA文庫,用PCR技術進行體外擴增。
正向引物5′-CGGGATCCAGTGGTTTTAGGAAAATG-3′反向引物5′-CCGCTCGAGTCATTGGAAGGTAACACCAGA-3′(1.2)經(jīng)PCR擴增的基因片段經(jīng)BamHI和XhoI雙酶酶切后,用瓊脂糖凝膠電泳回收大小為1kb左右的片段。
(1.3)將回收片段與T載體進行連接,然后用連接產(chǎn)物轉化大腸肝菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細胞,并涂在LB平板(含100mg/L氨芐青霉素)上,培養(yǎng)過夜。
(1.4)從平板上挑取多個單克隆,分別接種于裝有約5mL的LB的試管(該LB溶液中加入氨卞青霉素,使其終濃度為100mg/L)中,培養(yǎng)過夜。然后用質粒提取試劑盒(博大泰克公司B型質粒小量快速提取試劑盒)提取質粒,并用BamHI和XhoI酶切,然后用瓊脂糖凝膠回收大小約為1kb左右的目標基因片段。
(1.5)將目標載體pGEX-4T-1(購自Pharmacia公司)用BamHI和XhoI酶切,然后用瓊脂糖凝膠回收酶切的片段。
(1.6)將(1.4)和(1.5)獲得的片段連接(將酶切回收后的目標基因片斷和目標載體片段按照摩爾數(shù)3∶1-6∶1的比率混合,按照Takara DNA Ligation的要求在16℃反應30分鐘-18小時),轉化大腸肝菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細胞,涂在LB平板(含100mg/L氨芐青霉素)上培養(yǎng)過夜。將篩選到的陽性克隆,用于鑒定和測序。
測序結果表明,SARS冠狀病毒的主蛋白酶的編碼基因已被正確地克隆到pGEX-4T-1載體中。
b.SARS冠狀病毒主蛋白酶的表達與純化包括步驟(2.1)將上述步驟a中得到的含有編碼SARS冠狀病毒主蛋白酶基因的pGEX-4T-1載體轉化Escherichia coli BL21(DE3)的菌株,并用LB平板(含100mg/L氨芐青霉素)篩選陽性克隆。
(2.2)在(2.1)中所述的LB平板上挑取陽性克隆(在含有氨芐青霉素的LB平板上生長出來的單克隆),培養(yǎng)過夜,然后轉入1L的LB培養(yǎng)基(含100mg/L氨芐青霉素),當OD600達到0.6-0.8時,加入1mM左右的IPTG,在16℃培養(yǎng)12小時左右;(2.3)5000-8000rpm離心10-15min收集細胞,然后冰浴超聲破菌20-30分鐘;破菌液13000rpm-15000rpm離心20-40min后收集上清液。
(2.4)將上清液加入PBS預平衡的GST親和層析柱(GE公司)中,用PBS淋洗20-30個柱床體積去除雜蛋白。最后加入2ml 0.1mg/ml左右的人類鼻病毒3C蛋白酶,在4℃酶切12-20小時,之后收集SARS冠狀病毒主蛋白酶。
(2.5)將(2.4)獲得的蛋白再用Mono Q(GE公司)陰離子交換層析進行純化c.SARS冠狀病毒的主蛋白酶的晶體生長SARS冠狀病毒的主蛋白酶的晶體生長是采用懸滴氣相擴散法,在289-297K(K是溫度單位開爾文,攝氏溫度16℃~24℃)下,用組織培養(yǎng)板進行的。用Hampton Research公司的晶體生長試劑盒(Crystal Screening Kit I & II,PEG/IONKit,PEG 6000 Grid Kit和(NH4)2SO4Kit)對初始結晶條件進行篩選。在PEG6000 Grid Kit的C3(20%PEG 6000,0.1M MES(pH 6.0))條件下的液滴中有紅色球狀沉淀,并在沉淀的邊緣出現(xiàn)微晶。在此結晶條件下,我們嘗試了不同pH值的緩沖液(如pH值從5.5到6.5之間進行)、不同聚合度的PEG(如從PEG 3350到PEG 10000之間進行)、不同蛋白濃度(如從2mg/ml到30mg/ml之間進行)和各種添加劑(Hampton Research公司地添加劑試劑盒)等來優(yōu)化晶體。最后,在1.8~12%的PEG 6000,3%二甲基亞砜(DMSO),1mM DTT,100mM MES緩沖液(pH 5.0~PH6.0)以及蛋白濃度為5~12mg/ml時獲得了衍射分辨率較高(高于2.6)的晶體。
2.中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫的制備源自川藏香茶菜(I.pharicus(Prain)Murata)的天然產(chǎn)物混合物備選樣品的制備(1)制備川藏香茶菜提取物浸膏取500克干燥粉碎的川藏香茶菜藥材,用4500毫升95%乙醇回流提取,提取3次,每次2小時,合并提取液,濃縮得浸膏;(2)制得川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品稱取此浸膏10.5克,用85毫升雙蒸水懸浮,傾入1000毫升分液漏斗中,用乙酸乙酯萃取。每次萃取用乙酸乙酯850毫升,充分振搖,靜置6小時分層。共萃取6次,合并各次乙酸乙酯萃取物。萃取后得到乙酸乙酯相和水相。乙酸乙酯萃取物用EYELA N1001型旋轉蒸發(fā)儀蒸除溶劑,得干膏狀川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品,備用;(3)制得川藏香茶菜水相大孔樹脂50%乙醇洗脫樣品萃取后的水相部分用EYELA N1001型旋轉蒸發(fā)儀蒸除水中溶解的少量乙酸乙酯,用HP-20型大孔樹脂柱層析分離(大孔樹脂用170毫升,玻璃柱規(guī)格30×300mm),依次用水、50%乙醇為流動相洗脫。水洗脫8次,每次洗脫250毫升,棄去水洗部分。50%乙醇洗脫5次,每次洗脫300毫升。將50%乙醇洗脫部分使用EYELA N1001型旋轉蒸發(fā)儀蒸除溶劑,得干膏狀川藏香茶菜水相大孔樹脂50%乙醇洗脫樣品,備用;(4)獲得源自川藏香茶菜的天然產(chǎn)物混合物備選樣品上述步驟(2)制得的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品、步驟(3)制得的川藏香茶菜水相大孔樹脂50%乙醇洗脫樣品組成了源自初級原料川藏香茶菜的2個備選樣品(按照上述方法制備的每一個備選樣品都含有多種天然產(chǎn)物小分子化合物,因此稱為天然產(chǎn)物混合物備選樣品)。
源自其它初級原料的天然產(chǎn)物混合物備選樣品的制備由于中藥中的清熱藥往往有抗菌、抗病毒作用,并且非典期間國家中醫(yī)藥管理局公布的三個處方中也大多含此類藥(比如處方一藥物組成為魚腥草15克、野菊花6克、茵陳15克、佩蘭10克、草果3克。其功效清熱解毒、利濕化濁,其中魚腥草、野菊花為清熱藥;處方二藥物組成為蒲公英15克、金蓮花6克、大青葉10克、葛根10克、蘇葉6克。其功效清熱解毒、散風透邪,其中蒲公英、金蓮花、大青葉為清熱藥;處方三藥物組成為蘆根15克、金銀花10克、連翹10克、薄荷6克、生甘草5克。其功效清熱解表、疏風透邪,其中蘆根、金銀花、連翹為清熱藥)。故先從這些藥入手。查中藥學專著(黃兆勝主編,人民衛(wèi)生出版社,2002年8月第1版)常用的此類藥有44種,其中17種歸肺經(jīng),為魚腥草,野菊花,大青葉,蘆根,金銀花,連翹,黃芩,知母,四季青,穿心蓮,鴨跖草,梔子,射干,山豆根,馬勃,玄參,地骨皮(中國科學院云南昆明植物所提供),列為用于進行SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑篩選的中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫的初級原料。
另有鄂西香茶菜(中國科學院云南昆明植物所提供)是我國民間用來治療多種炎癥的有效藥物,且最近從該屬植物中分離出多種被證明具有抗病毒、抗腫瘤等生理活性的二萜類成分,故也列為用于進行SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑篩選的中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫的初級原料。
源自以上18種初級原料的36個天然產(chǎn)物混合物備選樣品按照上述源自川藏香茶菜(I.pharicus(Prain)Murata)的天然產(chǎn)物混合物備選樣品的制備方法制備。
按照上述方法制備的38個天然產(chǎn)物混合物備選樣品組成了用于進行SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑篩選的中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫。
3.天然產(chǎn)物混合物備選樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制活性測定SARS冠狀病毒主蛋白酶的活性測定是使用熒光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(純度大于95%,上海吉爾生化有限公司)來完成的。該熒光底物的氨基酸序列來源于SARS冠狀病毒主蛋白酶的N端自剪切序列。
用于熒光強度測定的儀器為Fluoraskan Ascent熒光儀(ThermoLabsystems,Helsinki,F(xiàn)inland),激發(fā)光和發(fā)射光的波長分別為320nm和405nm。
按照本發(fā)明制備的用于進行SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑篩選的中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫中的樣品稱為天然產(chǎn)物混合物備選樣品。將步驟2中制備的38個干膏狀的天然產(chǎn)物混合物備選樣品溶于二甲基亞砜(DMSO)中使其終濃度為50mg/mL,分別制得38個天然產(chǎn)物混合物備選樣品的DMSO溶解物。
在緩沖溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3),1mM EDTA(含或不含DTT))中加入SARS冠狀病毒主蛋白酶(終濃度0.5μM),加入天然產(chǎn)物混合物備選樣品的DMSO溶解物(如川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品的DMSO溶解物)使其終濃度為100μg/mL,底物濃度為20μM,298K放置10分鐘后,迅速加入熒光標記底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH2,終濃度20μM)。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為320nm和405nm,溫度保持298K,每2秒鐘記錄一次熒光讀數(shù)。
對照不加入備選樣品,其余條件相同。結果示于圖1-圖9中。
圖1-圖4以及圖6、圖8為38個天然產(chǎn)物混合物備選樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制活性的測定結果,其中每個備選樣品的濃度為100μg/mL。
由以上圖1-圖9可以看出,其中大部分備選樣品均對SARS冠狀病毒主蛋白酶有抑制活性,其中抑制活性較好的有7個,分別是黃芩、魚腥草、山豆根、梔子、知母、川藏香茶菜、鄂西香茶菜的乙酸乙酯萃取物樣品。
圖5、圖7和圖9是以上7個抑制活性較好的黃芩、魚腥草、山豆根、梔子、知母、川藏香茶菜、鄂西香茶菜的乙酸乙酯萃取樣品的濃度稀釋至10μg/mL時的對SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制活性測定結果,可以發(fā)現(xiàn),將黃芩、魚腥草、山豆根、梔子、知母、川藏香茶菜、鄂西香茶菜的乙酸乙酯萃取物濃度為10μg/mL時,對SARS冠狀病毒主蛋白酶仍有較強的抑制活性。
這就說明在這7種中藥的乙酸乙酯萃取樣品中可能含有某種成分能夠有效的抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶的活性,也說明這7種中藥有可能成為治療SARS冠狀病毒的有效藥物。為了了解它們對SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制作用的確切的分子機理,我們可以選擇這7種中藥的乙酸乙酯萃取樣品進行SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體浸泡或共結晶實驗。
4、SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體浸泡川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品由于用于SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑篩選的中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫中的每一個樣品都含有許多種天然產(chǎn)物小分子(因此稱為天然產(chǎn)物混合物備選樣品),若采用共結晶的方法,對SARS冠狀病毒主蛋白酶結晶體系的影響較大,無法獲得衍射質量好、數(shù)量充足的SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體,甚至可能無法生長晶體,因此主要采用晶體浸泡的方法來獲得SARS冠狀病毒主蛋白酶與小分子抑制劑復合體的晶體。
為了盡可能的在保證晶體質量的基礎上,提高浸泡時川藏香茶菜乙酸乙酯樣品中小分子化合物的濃度,可以采用如下兩種方法制備SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體浸泡液。
方法一、將川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品的DMSO溶解物(按照步驟3制備)10倍稀釋至SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體生長池液(1.8~12%的PEG 6000,3%二甲基亞砜(DMSO),1mM DTT,100mM MES緩沖液(pH 5.0~PH6.0))中,13000-15000rpm高速離心,之后取上清液,得浸泡液1,備用。
方法二、將干膏狀的川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品(步驟2制備)直接溶解于SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體生長池液(1.8~12%的PEG 6000,3%二甲基亞砜(DMSO),1mM DTT,100mM MES緩沖液(pH 5.0~PH6.0))中,13000-15000rpm高速離心,之后取上清液,得浸泡液2,備用。
為了保證晶體浸泡時,不至于使川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品中的小分子化合物濃度過高影響晶體的衍射質量,因此將浸泡液1和2分別稀釋至原液濃度的10倍,備用。
浸泡時,利用尼龍晶體環(huán)等工具,將已生長好的SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體從結晶池液中取出,分別加入浸泡液1和2中以及相應的10倍稀釋液中,浸泡2-48小時。
5.晶體衍射數(shù)據(jù)的收集和分析在步驟4的基礎之上,使用具備較好衍射能力(分辨率優(yōu)選大于2.6)的晶體,進行X射線衍射數(shù)據(jù)的收集和分析。
進行數(shù)據(jù)收集時,首先使用Hampton Research公司的尼龍晶體環(huán),從浸泡液1和浸泡液2中獲取浸泡一定時間(通常為2-48小時)的晶體;并迅速使用Rigaku公司的冷卻系統(tǒng)或Oxford Cyrosystem公司的冷卻系統(tǒng),將晶體在以上所述的兩種冷凍系統(tǒng)產(chǎn)生的低溫氮氣流中冷凍至-150℃--180℃;使X射線通過晶體,使用旋進法收集X射線衍射數(shù)據(jù)。
選擇衍射質量好的晶體(分辨率最好大于2.6)進行數(shù)據(jù)收集、處理,檢測是否有小分子的結合。數(shù)據(jù)收集的統(tǒng)計如下表1表1SARS冠狀病毒主蛋白酶母體、SARS冠狀病毒主蛋白酶與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品浸泡后的復合體數(shù)據(jù)收集統(tǒng)計

通過觀察相同角度的SARS冠狀病毒主蛋白酶母體和復合體的活性位點電子密度圖(圖10)(藍色是蛋白質本身的電子密度),可以發(fā)現(xiàn),在復合體的活性位點能夠觀察到清晰的非蛋白質本身的電子密度(青色表示),提示可能有小分子化合物結合在蛋白質分子上。圖10a中顯示的是SARS冠狀病毒主蛋白酶母體結構的活性位點附近的電子密度,圖10b為SARS冠狀病毒主蛋白酶與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品浸泡后晶體活性位點附近的電子密度。
仔細觀察該處的電子密度(如圖10所示),我們可以發(fā)現(xiàn)存在于川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品中的未知小分子的電子密度與SARS冠狀病毒主蛋白酶活性位點處Cys145的電子密度緊密結合在一起,提示我們這應該是小分子與Cys145的γ硫原子形成了共價鍵,從而抑制了SARS冠狀病毒主蛋白酶的活性(如圖11所示)。
6.結合小分子的分析與鑒定我們將SARS冠狀病毒主蛋白酶(濃度為12mg/ml的SARS冠狀病毒主蛋白酶水溶液)與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品按照質量濃度比1∶1-1∶4的比例混合,并在4℃-16℃下作用6-18小時。將作用后的樣品,13,000-15,000rpm高速離心,棄去沉淀后備用于質譜分析。質譜采用MALDI(matrix-assistedlaser-desorption ionization)譜對樣品進行分析,結果參見圖12。
從質譜的結果我們可以發(fā)現(xiàn),在加入川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品后,分子量出現(xiàn)了明顯的偏移,這主要是因為蛋白質分子與川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品中的小分子結合的原因。通過質譜結果可以計算(用較高的質譜峰值減去較低的質譜峰)發(fā)現(xiàn),結合的小分子分子量約為390Da。
通過分析已有的川藏香茶菜成分,我們發(fā)現(xiàn),在該分子量水平上,主要存在如下所示的化合物
我們可以發(fā)現(xiàn)在川藏香茶菜的主要成分中,在該分子量范圍內,主要成分以二萜類化合物為主,包括川藏香茶甲、乙、丙、丁、戊、己素(分別對應上面PseurataA、PseurataB、PseurataC、PseurataD、PseurataE、PseurataF),Isodomedin和Dihydropseurata)等。又由于結合在SARS冠狀病毒主蛋白酶活性口袋處的小分子,和Cys145的γ硫原子形成了共價鍵,推知該小分子為Michael受體類小分子,具有α,β共軛不飽和雙鍵。
基于分子量和化學環(huán)境的分析,得出結論結合的小分子為川藏香茶菜丙素或者Isodomedin。
為了進一步驗證,我們從中國科學院云南昆明植物所獲得了川藏香茶菜丙素及Isodomedin的純化合物,按照以上所述的方法制備川藏香茶菜丙素以及Isodomedin與SARS冠狀病毒主蛋白酶復合體的晶體,并進行了數(shù)據(jù)收集(數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果示于表2)。通過觀察電子密度,我們只在川藏香茶菜丙素浸泡過的SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體發(fā)現(xiàn)了相似的電子密度,如圖10.c所示。因此可以確定,從川藏香茶菜乙酸乙酯萃取樣品中發(fā)現(xiàn)的與SARS冠狀病毒主蛋白酶相結合的抑制劑小分子應為川藏香茶菜丙素。
在川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品和川藏香茶菜丙素浸泡過的SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體活性位點,未知電子密度還有所區(qū)別,主要是因為不同晶體的數(shù)據(jù)質量不同,而且在川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物樣品中川藏香茶菜丙素的相對濃度比純品肯定要低,因此可能占有率也有所下降。
因此,可以確定結合的小分子即為川藏香茶菜丙素。
表2SARS冠狀病毒主蛋白酶母體、SARS冠狀病毒主蛋白酶與川藏香茶菜丙素的復合體數(shù)據(jù)收集統(tǒng)計

由此,我們獲得了SARS冠狀病毒主蛋白酶與川藏香茶菜丙素復合體的精細三維結構。
這里,我們可以看到本發(fā)明的新方法與傳統(tǒng)的抑制劑篩選方法相比,能夠對篩選效率有極大的提高。按照我們的方法,(1)僅需要篩選一次就可以從川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物中快速發(fā)現(xiàn)能夠與SARS冠狀病毒主蛋白酶結合的小分子,(2)該小分子是川藏香茶菜乙酸乙酯萃取物中與SARS冠狀病毒主蛋白酶的結合能力最好的小分子,(3)無需在抑制劑篩選時制備眾多的純品化合物;而如果利用傳統(tǒng)方法,不僅需要在進行篩選前分離提取制備出至少8種化合物,而且需要至少進行8次的活性測定、并進行至少8次晶體浸泡實驗等,才有可能發(fā)現(xiàn)結合能力最好的小分子化合物。
7、川藏香茶菜丙素對SARS冠狀病毒的主蛋白酶抑制活性的測定我們使用純品化合物小分子(川藏香茶菜丙素),測定了其對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性。川藏香茶菜丙素對SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制活性的測定按照如下步驟進行在緩沖溶液(50mM Tris-HCl(pH 7.3),1mM EDTA(含或不含DTT))中加入SARS冠狀病毒主蛋白酶(終濃度0.5μM),川藏香茶菜丙素(終濃度為20μM),底物濃度為20μM,298K放置10分鐘后,迅速加入熒光標記底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH2,終濃度20μM)。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為320nm和405nm,溫度保持298K,每2秒鐘記錄一次熒光讀數(shù)(結果示于圖13)。然后改變川藏香茶菜丙素的濃度,在2μM測定其對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性(結果示于圖14)。對照不加入備選樣品,其余條件相同。活性測定結果見圖13-圖14。從圖13-圖14中可以發(fā)現(xiàn),20μM的川藏香茶菜丙素對SARS冠狀病毒主蛋白酶具有較強的抑制活性,當其濃度為2μM時對SARS冠狀病毒主蛋白酶仍然有抑制活性。這就說明中藥川藏香茶菜里面含有的川藏香茶菜丙素能夠有效的抑制SARS冠狀病毒主蛋白酶的活性,也說明川藏香茶菜丙素有可能成為治療SARS冠狀病毒的有效藥物。
8、川藏香茶菜丙素對豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的主蛋白酶抑制活性的測定在緩沖液(20mM Tris-HCl pH 7.0,1mM DTT)中,加入所述蛋白酶(0.5μM),川藏香茶菜丙素(20μM),298K放置10分鐘后,迅速加入熒光標記底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2,20μM)。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為320nm和405nm,溫度保持298K,每2秒鐘記錄一次熒光讀數(shù)。然后改變抑制劑濃度,在2μM下測定抑制活性。對照不加入抑制劑,其余條件相同。結果示于圖15-圖16中。TGEV的表達純化參考文獻Conservation of substratespecificities among coronavirus main proteases.J.Gen.Virol.2002;83(Pt 3)595-9。
9.川藏香茶菜丙素對禽傳染性支氣管炎病毒(AIBV)的主蛋白酶抑制活性的測定在緩沖液(20mM Tris-HCl pH 7.0,1mM DTT)中,加入所述蛋白酶(1μM),川藏香茶菜丙素(100μM),298K放置10分鐘后,迅速加入熒光標記底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2,20μM)。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為320nm和405nm,溫度保持298K,每2秒鐘記錄一次熒光讀數(shù)。然后改變抑制劑濃度,在10μM下測定抑制活性。對照不加入抑制劑,其余條件相同。結果示于圖17-圖18中。
AIBV的表達純化參考文獻Preliminary crystallographic analysis of avianinfectious bronchitis virus main protease.Acta.Cryst.F.2007;63(Pt1)24-6。
由圖13-圖18可以看出,川藏香茶菜丙素對SARS、TGEV、AIBV的主蛋白酶都有抑制活性,其中對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性最強。由于TGEV屬于冠狀病毒屬的第一組群,SARS冠狀病毒屬于冠狀病毒屬的第二組群,AIBV屬于冠狀病毒屬的第三組群。因此,可以推斷川藏香茶菜丙素對整個冠狀病毒家族的主蛋白酶都有抑制活性。
本文中所涉及的各種實驗用品(包括但不限于化學試劑、生物制品、細胞、生物體、儀器等)之中,對于那些特殊的或不易獲得的,文中均已注明了制造商、參考文獻或詳細的制備方法;未經(jīng)特別說明的,均為常規(guī)實驗用品,在本申請申請日之前,可以通過各種方式(例如購買、自行制備等)很方便地獲得。
應當理解,在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下,本領域的普通技術人員可以在形式和細節(jié)上對其做出各種改變和改進,而這些均被認為落入本發(fā)明的保護范圍中。
序列表<110>南開大學、清華大學、中國科學院生物物理研究所<120>從中藥等天然產(chǎn)物混合物備選庫中篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的新方法<160>2<210>1<211>306<212>prt<213>SARS冠狀病毒(SARS Coronavirus)<400>1Ser Gly Phe Arg Lys Met Ala Phe Pro Ser Gly Lys Val Glu Gly Cys1 5 10 15Met Val Gln Val Thr Cys Gly Thr Thr Thr Leu Asn Gly Leu Trp Leu20 25 30Asp Asp Thr Val Tyr Cys Pro Arg His Val Ile Cys Thr Ala Glu Asp35 40 45Met Leu Asn Pro Asn Tyr Glu Asp Leu Leu Ile Arg Lys Ser Asn His50 55 60Ser Phe Leu Val Gln Ala Gly Asn Val Gln Leu Arg Val Ile Gly His65 70 75 80Ser Met Gln Asn Cys Leu Leu Arg Leu Lys Val Asp Thr Ser Asn Pro85 90 95Lys Thr Pro Lys Tyr Lys Phe Val Arg Ile Gln Pro Gly Gln Thr Phe100 105 110Ser Val Leu Ala Cys Tyr Asn Gly Ser Pro Ser Gly Val Tyr Gln Cys
115 120 125Ala Met Arg Pro Asn His Thr Ile Lys Gly Ser Phe Leu Asn Gly Ser130 135 140Cys Gly Ser Val Gly Phe Asn Ile Asp Tyr Asp Cys Val Ser Phe Cys145 150 155 160Tyr Met His His Met Glu Leu Pro Thr Gly Val His Ala Gly Thr Asp165 170 175Leu Glu Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Phe Val Asp Arg Gln Thr Ala Gln180 185 190Ala Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ile Thr Leu Asn Val Leu Ala Trp Leu195 200 205Tyr Ala Ala Val Ile Asn Gly Asp Arg Trp Phe Leu Asn Arg Phe Thr210 215 220Thr Thr Leu Asn Asp Phe Asn Leu Val Ala Met Lys Tyr Asn Tyr Glu225 230 235240Pro Leu Thr Gln Asp His Val Asp Ile Leu Gly Pro Leu Ser Ala Gln245250255Thr Gly Ile Ala Val Leu Asp Met Cys Ala Ala Leu Lys Glu Leu Leu260 265270Gln Asn Gly Met Asn Gly Arg Thr Ile Leu Gly Ser Thr Ile Leu Glu275 280 285Asp Glu Phe Thr Pro Phe Asp Val Val Arg Gln Cys Ser Gly Val Thr290 295300Phe Gln30權利要求
1.從天然產(chǎn)物混合物備選庫中篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的方法,其特征在于包括步驟A測定天然產(chǎn)物混合物備選庫中的備選樣品對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性,獲得對SARS冠狀病毒主蛋白酶有抑制活性的“有抑制活性的樣品”;將SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體與“有抑制活性的樣品”接觸,得到SARS冠狀病毒主蛋白酶與小分子抑制劑復合體的晶體。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法,其特征在于步驟A之后還包括步驟B收集并分析步驟A中得到的復合體的晶體的X射線衍射數(shù)據(jù),獲得與SARS冠狀病毒主蛋白酶結合的小分子抑制劑的電子密度。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法,其特征在于步驟B之后還包括步驟C以步驟B中獲得的與SARS冠狀病毒的主蛋白酶結合的小分子抑制劑的電子密度為基礎,鑒定與SARS冠狀病毒主蛋白酶結合的小分子抑制劑,獲得小分子抑制劑與SARS冠狀病毒主蛋白酶復合體的精細三維結構。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法,其特征在于在步驟C之后還包括步驟D測定小分子抑制劑對SARS冠狀病毒主蛋白酶的抑制活性。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法,其特征在于其中所述的天然產(chǎn)物混合物備選庫中的備選樣品,是用如下方法制備(a)、取一定量的初級原料,用乙醇溶液回流提取,合并提取液,濃縮得浸膏;(b)、稱取一定量步驟(a)中所得的浸膏,用雙蒸水懸浮,用有機溶劑萃取,分離有機溶劑相和水相;合并水相,備用;合并每次有機溶劑萃取物,蒸除其中的有機溶劑,得到干膏狀有機溶劑相樣品,備用;(c)、蒸除步驟(b)中萃取后的水相部分的水中溶解的少量有機溶劑,用大孔樹脂柱層析分離,依次用水和乙醇溶液為流動相洗脫;棄去水洗部分,蒸除乙醇溶液洗脫部分的溶劑,得干膏狀樣品備用;(d)、上述步驟(b)中制得的干膏狀有機溶劑相樣品和步驟(c)中制得的干膏狀樣品即為源自一種初級原料的2個備選樣品。
6.根據(jù)權利要求5所述的方法,其特征在于步驟(a)中乙醇溶液與初級原料的用量質量比為6∶1-12∶1;所用乙醇溶液濃度為70%-95%;步驟(b)中浸膏與懸浮用雙蒸水的質量比為1∶5-1∶15,萃取用有機溶劑為乙酸乙酯或氯仿,其體積與懸浮用雙蒸水的體積比為6∶1-10∶1;步驟(c)中所用乙醇溶液濃度為50%。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一項權利要求所述的方法,其特征在于在步驟A中SARS冠狀病毒主蛋白酶晶體與“有抑制活性的樣品”接觸時,使用的方法為晶體浸泡或共結晶的晶體浸泡方法。
8.根據(jù)權利要求7中所述的方法,其特征在于在步驟A中SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體與“有抑制活性的樣品”接觸時,可分別與單一的“有抑制活性的樣品”接觸,也可與混合的“有抑制活性的樣品”的接觸。
9.根據(jù)權利要求8中任一項所述的方法,其中所述天然產(chǎn)物混合物備選庫中的備選樣品源自中藥。
10.根據(jù)權利要求9中任一項所述的方法,其中所述天然產(chǎn)物混合物備選庫中的備選樣品源自下述初級原料魚腥草,野菊花,大青葉,蘆根,金銀花,連翹,黃芩,知母,四季青,穿心蓮,鴨跖草,梔子,射干,山豆根,馬勃,玄參,地骨皮、川藏香茶菜、鄂西香茶菜。
11.根據(jù)權利要求1-10中任一項的方法獲得的復合體的晶體,其是SARS冠狀病毒主蛋白酶-川藏香茶菜丙素復合體的晶體。
12.根據(jù)權利要求1-10中任一項所述的方法,其中所述篩選出的小分子抑制劑是川藏香茶菜丙素。
13.川藏香茶菜在制備治療冠狀病毒感染的藥物中的用途。
14.川藏香茶菜丙素在制備治療或者預防冠狀病毒感染的藥物中的用途。
15.根據(jù)權利要求13或14所述的用途,其中所述的冠狀病毒為SARS冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒或者禽傳染性支氣管炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明提供了從天然產(chǎn)物混合物備選庫中篩選SARS冠狀病毒主蛋白酶抑制劑的方法將SARS冠狀病毒主蛋白酶的晶體與“有抑制活性的樣品”接觸,獲得與SARS冠狀病毒主蛋白酶結合的小分子抑制劑的電子密度;以與SARS冠狀病毒主蛋白酶結合的小分子抑制劑的電子密度為基礎,鑒定小分子抑制劑,從而得到SARS冠狀病毒主蛋白酶與小分子抑制劑復合體的精細三維結構。本發(fā)明據(jù)此方法篩選得到了SARS冠狀病毒主蛋白酶的小分子抑制劑川藏香茶菜丙素。川藏香茶菜丙素能夠有效抑制冠狀病毒主蛋白酶活性,可以治療或者預防SARS冠狀病毒、傳染性胃腸炎病毒或者禽傳染性支氣管炎病毒等冠狀病毒感染。
文檔編號G01N33/573GK101063234SQ200710065119
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月4日 優(yōu)先權日2007年4月4日
發(fā)明者饒子和, 孫玉娜, 婁智勇, 向科輝 申請人:南開大學, 清華大學, 中國科學院生物物理研究所

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