豬李氏桿菌、豬壞死桿菌及豬土拉桿菌三聯檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種豬三種細菌病的檢測器具，特別是涉及一種豬的李氏桿菌病、壞死桿菌病、土拉桿菌病快速診斷試紙條，試紙條含支撐層、反應試劑載體吸附層，支撐層為不吸水薄片條，反應試劑載體吸附層粘貼于支撐層上，從樣品測試端依次為纖維層，上述三種細菌病抗原金標單抗或多抗纖維層，纖維素膜層，手柄端為吸水材料層；分別用上述三種細菌病抗原配對單抗或多抗或單抗溶液在纖維層上噴檢測印跡“｜｜｜”、“///”、或“＼＼＼”，分別用羊（兔）抗小鼠或豬IgG的多抗或用SPA溶液在纖維素膜層上噴對照印跡“｜”、“/”或“＼”。該試紙條特異、敏感、直觀、準確、簡便、快速，能在畜禽飼養、肉類加工和檢疫等相關部門推廣應用。
【專利說明】豬李氏桿菌、豬壞死桿菌及豬土拉桿菌三聯檢測試紙條
[0001]一、【技術領域】
本發明是一種涉及豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病檢測試劑顯示器具，特別是涉及一種可同時檢測豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病的三聯檢測試紙條。
[0002]二、技術背景
李氏桿菌病是由李氏桿菌弓I起的畜、禽、鼠及人共患的傳染病。病原菌對環境條件的抵抗力很強，但常見消毒劑都能很快將其殺死。本病多發于哺乳仔豬及斷奶不久的保育豬，通常呈散發，發病率低，病死率高為其特點。本病具有廣泛的易感動物群體，因此，傳染源也較多，其中帶菌的鼠類在疾病傳播中常起重要作用。癥狀可分為敗血型、腦膜腦炎型，但常見的是二者混合型。多數病豬興奮不安，運動失調，肌肉震顫、無目的地運動。有的病豬頭頸后仰，四肢張開呈觀星姿勢。有的后肢麻痹，拖地不能站立。有的陣發性痙攣，側臥、四肢亂劃，呈游泳狀。病初體溫升高41?42°C，食欲減少。糞干尿少，后期降致常溫或常溫以下。剖檢:有神經癥狀病豬，腦及腦膜充血、水腫，腦脊髓液增加，稍混濁，內含較多細胞。腦干變軟有小膿灶。組織學檢查，見嚴重的單核細胞浸潤現象。敗血癥嚴重病豬，肺充血、水腫，氣管、支氣管常有泡沫樣液體。肝有灰白色小壞死灶，心肌柔軟，內外膜有出血點，腸系膜淋巴結腫大。
[0003]豬壞死桿菌病是由壞死桿菌引起豬的一種慢性傳染病。本病的主要傳染源是病畜，禽類和哺乳動物都可感染，感染途徑是損傷的皮膚和粘膜。在多雨、潮濕、擁擠和衛生條件低劣的情況下容易發生。潛伏期為廣3天，長的可達2周，主要發生于仔豬和架子豬，一般呈散發性或地方性流行，豬以壞死性皮炎多見，主要表現在頸部、胸側、臀部皮下脂肪較多的皮膚間或在耳根和四肢下部的皮膚發生小而突起的丘疹。上面覆蓋有容易剝離的痂皮，痂皮下組織迅速壞死潰爛，皮下形成很大的囊狀潰爛區，流出大量的灰黃色液體，并有特殊臭味。隨后皮膚發生潰爛，嚴重者病變深入肌層，甚至穿透腹壁，形成瘺管。其次是壞死性口炎，常見于仔豬，表現在唇、齒齦及顎部粘膜發生潰瘍，上面覆蓋壞死組織。壞死性腸炎，病豬常與仔豬副傷寒并發。表現大腸、小腸粘膜壞死，形成白色假膜，假膜下為不規則的潰瘍，導致病豬生前有嚴重腹瀉，迅速消瘦等全身癥狀。此外有的還表現壞死性鼻炎，常繼發于萎縮性鼻炎，主要見于仔豬和幼豬。
[0004]土拉桿菌病是土拉費朗西斯菌引起的一種人獸共患急性傳染病。豬感染土拉桿菌病的主要特征是患豬體溫升高、淋巴結腫大、支氣管肺炎,發病率和病死率均不高。土拉費朗西斯菌為革蘭氏陰性多形態的細菌。為專性需氧菌，在普同培養基上不生長，在含有血液的培養基上生長良好，最適溫度為37°C。在幼齡培養物中呈球狀，在老嶺培養物中呈小桿狀。無鞭毛，不能運動，不產生芽胞，革蘭氏染色陰性，美藍染色呈兩極濃染。本菌的抵抗力較強，在尸體中可存活90多天，但60°C經5?20分即可殺死，3%來蘇兒、3%石炭酸以及其他常用消毒藥均能很快將其殺死。野兔和野生嚙齒動物是本菌的自然儲存宿主，也是該病的主要傳染源，它們經蜱、蚊等寄生蟲通過吸血將病菌傳播給家畜和人,此外病菌污染的飼料和飲水亦可經消化道傳染動物。各種家畜均能發病，其中綿羊尤其是羔羊發病較為嚴重，而豬以仔豬較為多見，成年豬多呈隱性感染。春末夏初是本病的高發季節，因為其時野生嚙齒動物及其體外寄生蟲繁殖最盛。本病的潛伏期一般為廣3天。仔豬出現癥狀的較為多見。患豬精神沉郁，食欲減退，體溫升高至41°C以上，全身衰弱，呼吸困難，呈腹式呼吸，有時咳嗽。病程一般疒10天，多數能耐過，死亡的較少。剖檢可見頜下、腮腺淋巴結及其他體表淋巴結腫大、化膿，支氣管肺炎，胸膜炎，肝臟實質變性。目前對上述疾病的診斷方法主要有以下幾種。
[0005](I)染色鏡檢:李氏桿菌病可采取肝、脾、脊髓液及腦橋等病料，涂片，革蘭氏染色鏡檢，如發現紫色兩端鈍圓的細長小桿菌即可確診。如不能排除豬丹毒時，可將病料作細菌分離培養。壞死桿菌病在病健組織交界處取材，涂片、染色，鏡檢可見到革蘭氏陰性多形桿菌，呈串珠狀長絲或細長菌體。土拉桿菌病病料染色鏡檢，可見革蘭氏陰性多形態的細菌。
[0006](2)細菌分離培養:李氏桿菌病病料接種于兔血瓊脂平板、0.05%亞碲酸鹽胰蛋白胨瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和1%葡萄糖血清肉湯進行分離培養，在血平板上菌落周圍呈b溶血，亞碲酸鹽平板上長成圓形、隆起、濕潤、黑色的菌落，麥康凱上不生長，肉湯培養呈均勻渾濁，形成顆粒狀沉淀。本菌發酵葡萄糖、水楊苷和蕈糖，產酸，接觸酶陽性，不產生硫化氫和靛基質，不液化明膠，不還原硝酸鹽，M.R試驗和V.P.試驗陽性。壞死桿菌病取肝、肺、皮膚潰瘍灶膿汁接種于0.02%結晶紫或0.01 %孔雀綠卵黃培養基，經48~72小時后，本菌長出一種帶藍色的菌落，中央不透明，邊緣一圈亮帶。土拉桿菌病取感染豬的淋巴結，接種于含有先鋒霉素(每毫升40單位)、抗敵素(每毫升100單位)的半胱氨酸葡萄糖、血液瓊脂平板上，37°C培養24小時，挑取可疑菌落染色鏡檢。同時挑取可疑菌落，分別接種于卵黃培養基、費朗西斯培養基和普通培養基上，在前兩種培養基中生長，后一種培養基上不生長時判為陽性。
[0007](3)動物實驗:李氏桿菌病可點眼接種家兔、小鼠、幼鴿或幼豚鼠，一天后發生結膜炎，不久發生敗血癥死亡 。壞死桿菌病將病料用生理鹽水制成懸液，分別給家兔、小鼠皮下注射。家兔耳外側皮下注射0.5^1毫升，小鼠尾根注射0.2^0.4毫升，被接種動物逐日消瘦，接種局部壞死。家兔注射后2~3天，接種部位形成壞死區，耳下垂，經8~10天死亡。小鼠注射后3天在注射部位發生膿腫，5飛天發生壞死，8~12天死亡。剖檢內臟有轉移性壞死灶。肝臟涂片鏡檢或分離培養發現本菌即可確診。
[0008]土拉桿菌病將感染豬的淋巴結制備成懸液，取豚鼠皮下注射0.5毫升，1~10天死亡后，剖檢可見肝、脾有多發性壞死灶。用土拉費朗西斯菌素注射病豬尾根皮內0.2毫升，注射后24小時、48小時觀察結果。局部發紅、腫脹、疼痛者判為陽性。僅有不明顯的水腫判為可疑。無任何變化的判為陰性。
[0009]
(4)聚合酶鏈式反應(PCR)技術:PCR技術具有高靈敏度、高特異性等優點，已被廣泛運用于許多疾病的病原體鑒定和流行病學調查。上述疾病的病原體檢測均可使用PCR技術進行檢測。
[0010]上述檢測方法需要專業人員在實驗室操作，操作繁瑣，檢測費時費力；而且需要昂貴的儀器設備，如PCR儀、酶標儀和CO2培養箱等，對非專業人員而言，上述檢測方法很難完成。雖然上述方法特異敏感，但每次只能檢測一種豬病，且無法實現現場快速檢測或診斷。本發明，研究一種簡便快速、實時在線，同時檢測三種豬病的三聯檢測試紙，對控制和消滅此類疾病意義重大。
[0011]三、
【發明內容】
本發明的目的是為了克服現有技術中檢測豬病病原存在的缺點，提供一種特異、敏感、簡便快速的呼吸道疾病檢測方法，研制出一次可同時檢測三種豬細菌性呼吸道疾病的三聯檢測試紙。
[0012]本發明的技術方案是:提供一種豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病三聯檢測試紙條，該試紙條含有支撐層和吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設有檢測印跡和對照印跡；金標抗體纖維層吸附有納米級金顆粒標記的抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體特異抗原的三種單克隆抗體，檢測印跡用抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體特異抗原的配對單抗印制，對照印跡用羊抗或兔抗小鼠IgG的多克隆抗體；或金標抗體纖維層吸附有納米級金顆粒標記的抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體的多克隆抗體，檢測印跡分別用抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體特異抗原的單抗制備，對照印跡用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)或抗豬IgG多抗制備。
[0013]檢測印跡用抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體特異抗原的配對單抗制備即用上述三種病原體特異抗原的配對單抗溶液分別制備；檢測印跡用抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體的多克隆抗體制備即為用上述三種病原體的多克隆抗體分別制備。
[0014]支撐層用不吸水的硬質塑膠片條或硬紙條制成；測試端樣品吸附纖維層用玻璃棉制成；金標抗體纖維層用玻璃棉和金標抗體制成，金標抗體可以是單抗或多克隆抗體。
[0015]纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜、或羧化纖維素膜、或聚偏二氟乙烯PVDF纖維素膜制成。
[0016]吸水材料層用吸水紙制成。
[0017]檢測印跡和對照印跡為直線式、或斜線式，纖維素膜層上含有三條檢測印跡和一條對照印跡，檢測印跡和對照印跡的排列形式為“ I I I I ”、“////”、“\\ \\”中的任一種。
[0018]試紙條吸附層上面含有一層保護層，保護層附著在吸附層上，在測試端樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在測試端樣品吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線偏向測試端樣品吸附纖維層一側處約0.5cm處。
[0019]根據需要，選擇上述金標抗體纖維層、檢測印跡和對照印跡排列形式中一種形式。
[0020]本發明的積極有益效果:
1.檢測特異性強、敏感性高:本發明檢測試紙條以納米級金顆粒標記高親和力特異性單克隆抗體或特異性多克隆抗體為基礎而制成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，金顆粒不影響單克隆抗體或多克隆抗體的特異性和結合力，并且具有較高的標記率。本發明檢測試紙條具有較高的特異性和敏感性，可檢測到納克級病原體蛋白。
[0021]2.操作簡便、快速:使用本發明試紙條檢測時無需附加任何其它儀器和試劑，只需將其測試端插入待檢的樣品液中30秒左右，然后在1-5分鐘內即可判定檢測結果。
[0022]3.檢測結果直觀、準確:本發明試紙條以是否顯示棕紅色的檢測線和對照線作為判定陽性和陰性結果的依據，即只在纖維素膜的對照線印記處顯示一條棕紅色對照線C，而在檢測線印記處無棕紅色條帶顯示，表示被檢測的3種豬病均為陰性結果；在纖維素膜的對照線印記處顯示一條棕紅色對照線C，在檢測印跡處出現三條棕紅色條帶Tl、T2、T3 (Tl為豬李氏桿菌病，Τ2為豬壞死桿菌病，Τ3為豬土拉桿菌病)，則表示被檢測的3種豬病均為陽性結果；在纖維素膜上顯示一條棕紅色對照線和三條棕紅色檢測線中的任一條或任兩條，則表示在被檢測3種豬病中的任一種或兩種為陽性結果。無論陽性結果或陰性結果對照線C均應顯示，當對照線C不顯示時，說明試紙條失效。
[0023]4.檢測費用降低:使用本發明檢測試紙條，不需其它儀器及試劑，節省了儀器、設備和附加試劑費用；一條試紙一次可以檢測3種豬病，非專業人員也可隨時實時在線檢測，無需支付專家診斷檢查費及其相關費用，可極大的降低檢測成本的投入，降低檢測費用。
[0024]5.使用范圍廣:本發明檢測試紙條操作簡單，即“傻瓜式”操作，而且攜帶方便、易保存，可滿足不同單位和不同層次人員的需要，包括專業化驗、海關檢疫、衛生防疫、質量監測、畜產品加工、集約化養殖到個體養殖等，具有廣闊的市場前景和社會效益。
[0025]四、【專利附圖】
【附圖說明】:
圖1 一種豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病三聯檢測試紙條的側視結構示意圖
圖2 —種豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病三聯檢測試紙條的俯視結構示意圖
五、【具體實施方式】:
以下實施例僅為了進一步說明本發明，并不限制本發明的內容。豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病三聯檢測試紙條的制備，需要制備抗三種病原體特異抗原的單克隆抗體和多克隆抗體，用于制備檢測印跡和金標抗體纖維層；同時需要制備羊或兔抗鼠IgG抗體，或羊或兔抗豬IgG抗體，用于制備對照印跡。
[0026]1.羊(兔)抗鼠或豬IgG抗體的制備:
以飽和硫酸銨法提取小鼠或豬血清中的IgG，取I份血清加2份PBS液(pH 7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨液混勻，置4°C冰箱內2h，在4°C、10000r/min離心15min，棄上清液；以適量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨液至其最終濃度為33%，置4°C冰箱內2h，在4°C、10000r/min條件下離心15min，棄上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱內用PBS液(pH7.2)過夜透析，換液2?3次，在4°C、10000r/min條件下離心15min，收集上清液，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度。以50 μ g?100 μ g (IgG) /kg體重經皮下或肌肉注射抗體陰性健康羊或家兔3?4次，末次免疫20天后，靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1:2000以上，心臟采血或頸動脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨法提取羊(兔)抗小鼠或豬的IgG (其提取方法與上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于制備本發明試紙條的對照印跡。
[0027]2.豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體特異抗原單克隆抗體(Mi)的制備:每只用50 μ g~100 μ g病原體特異抗原免疫Balb/c系小鼠三次，每次間隔15~30d ；第三次加強免疫后3~4d，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，用75%酒精浸泡5~lOmin，無菌取其脾臟，剪碎并經100目尼龍網過濾，1000r/min離心10min，收集脾細胞；將I X IO8個脾細胞與2~5 X IO7個NSO骨髓瘤細胞混合，1000r/min離心10min棄上清，將含有沉淀細胞的離心管置于37°C的水中，并緩緩加入0.7~Iml 40%~50% PEG4000 (pH 8.5~9.0)作用lmin，然后緩慢加入無血清1640培養基15ml，以終止PEG的作用，37°C水浴5~lOmin，1000r/min離心10min棄上清，將細胞沉淀重懸于HAT選擇培養基中，并加入
96孔培養板(100μΙ~200μ1/孔)，置于37°C 5% CO2培養箱中培養。培養7~IOd后，以548~1(^ g/ml的純化的病原體特異抗原包被96孔酶標板，以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測雜交瘤的培養上清，挑取強陽性細胞克隆(OD45tl ^ 0.5)，進行連續三次的有限稀釋法克隆化，獲得陽性雜交瘤細胞株，其染色體數為92~98，其分泌的單克隆抗體(M1，M2或M3)，能夠特異識別三種不同的病原體，而不與其它豬的病原體發生交叉反應，親和力常數達109~1(1，輕鏈亞型為K或λ，重鏈亞型為IgG1' IgG2a, IgG2b, IgG3 ;獲得的配對單克隆抗體，用于制金標單抗體玻璃棉或檢測印跡。
[0028]3.金標單抗玻璃棉的制備:
利用檸檬酸鈉還原法制備納米級金顆粒:即在50~100mL沸騰的0.01~0.05%氯金酸水溶液中加入2~4ml的0.5~2%檸檬酸三鈉溶液，獲得直徑15nm左右的納米級金顆粒。以0.lmol/L的K2CO3調 金顆粒溶液的pH至8.5~9.5，以1:1000~1300的標記比將待標記的單克隆抗體(Ml，M2或M3)加入pH8.5~9.5的金溶膠中，標記IOmin后，加20%PEG10000至最終濃度為0.05%, 4°C、1500~3000r/min離心20min，除去未結合的金顆粒顆粒,4°C、15000r/min離心Ih,棄上清,獲金標抗體混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析,分離純化金標抗體，分別獲得Ml、M2、M3的金標抗體。將1:100~500稀釋的三種金標抗體，吸附于精制玻璃棉中，4°C低溫真空干燥，制備金標單克隆抗體玻璃棉。
[0029]4.病原體特異抗原多克隆抗體(Ci)的制備:
病原體特異抗原多克隆抗體(Ci)的制備。分別采用國家批準的上述三種豬病的滅活疫苗、弱毒疫苗或標準抗原，多次免疫接種抗體陰性健康豬。末次免疫20天后靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1:2000以上，心臟采血或頸動脈放血，收集其高免血清，以飽和硫酸銨法提取血清中IgG抗體(方法與小鼠血清IgG的提取相同，不再重述)。
[0030]金標多抗和金標多抗玻璃棉的制備，與金標單抗玻璃棉的制備方法相同，不再重述。
[0031]詳見【具體實施方式】中的內容3。
[0032]5.本發明檢測試紙條檢測原理
當本發明檢測試紙條測試端插入待檢樣品溶液后，待檢溶液通過虹吸帶動待檢病原體進入金標抗體纖維層，并與其中的金標抗體(Mi或Ci ) 一起沿硝酸纖維素膜向手柄端擴散，最終滲入手柄端吸水材料層，擴散過程中金標抗體能夠與相應的待檢病原體結合，結合的金標抗體的病原體能夠被纖維素膜上檢測印跡的配對單抗或多抗攔截，當樣品液中含有被檢病原體時，則出現I~3條棕紅色的檢測線；羊或兔抗鼠或抗豬IgG則可與相應的金標單抗或多抗結合，出現I條棕紅色對照線。當待檢樣品液中沒有上述病原體時，試紙條只顯示出一條棕紅色對照線；當纖維素膜上沒有對照線顯示時，則表明試紙條已失效。[0033]6.本發明檢測試紙條的檢測操作方法
(I)檢測樣品的處理:取病豬病變組織，1:1?5加入生理鹽水并用剪刀剪碎，浸出液為待檢樣品，病豬全血或血清加入生理鹽水1:1?5稀釋后為待檢樣品。
[0034](2)檢測操作:將本發明檢測試紙條樣品端插入待檢樣品液中，插入深度不超過標記線9，約30秒后取出試紙條，水平放置約I?5分鐘，同時觀察結果。
[0035](3)結果判定:如果在檢測試紙條纖維素膜上只顯示出一條棕紅色對照線C，表示檢測結果為陰性，說明在被檢樣品中不含上述3種病原體；如果檢測試紙條上的纖維素膜出現對照線C，檢測印跡處出現Tl或T2或T3檢測線，表示檢測結果為陽性，即在待檢樣品中含有豬李氏桿菌病病原體或豬壞死桿菌病病原體或豬土拉桿菌病病原體；如果檢測印跡處Tl或T2或T3同時出現，表示在待檢樣品中存在上述3種病原體；如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效。
[0036]實施例一:豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病三聯檢測試紙條 參見圖1和圖2，圖中I為支撐層，用硬質塑膠薄片條制成，2為測試端的樣品吸附纖維
層，用玻璃棉制成，3為金標抗體纖維層，吸附有納米級金顆粒標記的抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體的三種單克隆抗體的玻璃棉，根據上述【具體實施方式】3中所述的制備方法制備其金標單抗玻璃棉，4為纖維素膜層，采用硝酸纖維素膜制成，5為吸水材料層，用吸水紙制成，將編號2、3、4、5各層從左端測試端至右粘貼在硬質塑膠薄片條I上，彼此之間交界處互相交叉重疊。在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體的配對單抗溶液印制的檢測印跡Tl、T2、T3，7為用羊或兔抗鼠IgG溶液印制的對照印跡C，檢測印跡和對照印跡為直線式、或斜線式，兩種印跡帶排列形成的組合形式為“ I I I I”、“/ / / /”、“\ \ \ \”中的任一種。8 -1為覆蓋在測試端樣品吸附纖維層2和金標抗體纖維層3上面的白色保護膜，在2和3交界處對應保護膜8-1位置上偏向于樣品吸附纖維層2 —側0.5cm處印有標記線9，9的右端印有箭頭及max字樣，吸水材料層5 (手柄端)上覆蓋有其它顏色(如黃色)保護膜8-2。
[0037]待測樣品溶液的制備及檢測操作步驟，與【具體實施方式】6中的檢測操作方法相同，不再重述。
[0038]實施例二:豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病三聯檢測試紙條，與實施例一基本相同，不同之處在于:
金標抗體纖維層3用吸附有金顆粒標記的抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病的三種多克隆抗體的玻璃棉制成，根據上述【具體實施方式】3中所述的制備方法制備其金標多克隆抗體玻璃棉；在硝酸纖維素膜層4上，6為分別用抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體的單抗溶液印制的檢測印跡Tl、T2、T3，7為用羊或兔抗豬的IgG溶液印制對照印跡C，兩種印跡帶排列形成的組合形式為“ I I I I”、“/ / / /”、“\ \ \\”中的任一種。其它包括檢測樣品制備、操作方法和結果判定等均與【具體實施方式】6中的操作方法相同，不再重述。
【權利要求】
1.一種檢測豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病的三聯檢測試紙條，該試紙條含有支撐層和吸附層，支撐層為不吸水的薄片層，吸附層附著在支撐層上，吸附層從測試端依次為樣品纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上制備有檢測印跡和對照印跡，其特征是金標抗體纖維層吸附有納米級金顆粒標記的抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體特異抗原的三種單克隆抗體，檢測印跡用抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體特異抗原的配對單抗或多克隆抗體印制，對照印跡用羊或兔抗小鼠IgG的多克隆抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)印制。
2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是金標抗體纖維層吸附有納米級金顆粒標記的抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體特異抗原的三種單克隆抗體的混合液，檢測印跡用抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體特異抗原的配對單抗或多克隆抗體印制，對照印跡用羊或兔抗小鼠IgG的多克隆抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)印制，或金標抗體纖維層吸附有納米級金顆粒標記的抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體的多克隆抗體，檢測印跡分別用抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體特異抗原的單抗制備，對照印跡用金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)或抗豬IgG多抗制備。
3.根據權利要求1或2所述的試紙條，其特征是檢測印跡用抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體特異抗原的配對單抗制備即用上述三種病原體特異抗原的配對單抗溶液分別制備；檢測印跡用抗豬李氏桿菌病、豬壞死桿菌病及豬土拉桿菌病病原體的多克隆抗體制備即為用上述三種病原體的多克隆抗體分別制備。
4.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是支撐層用不吸水的硬質塑膠片條或硬紙條制成；測試端樣品吸附纖維層用玻璃棉制成；金標抗體纖維層用玻璃棉和金標抗體制成，金標抗體可以是單抗或多克隆抗體。
5.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜、或羧化纖維素膜、或聚偏二氟乙烯PVDF纖維素膜制成。
6.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是吸水材料層用吸水紙制成。
7.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是檢測印跡和對照印跡為直線式、或斜線式，纖維素膜層上含有三條檢測印跡和一條對照印跡，檢測印跡和對照印跡的排列形式為“III 1”、“// //”、“\ \ \ \”中的任一種。
8.根據權利要求1所述的試紙條，其特征是試紙條吸附層上面含有一層保護層，保護層附著在吸附層上，在測試端樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在測試端樣品吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線偏向測試端樣品吸附纖維層一側約0.5cm處。
【文檔編號】G01N33/577GK103941003SQ201310085542
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年3月15日 優先權日:2013年3月15日
【發明者】張改平, 李學伍, 楊繼飛, 鄧瑞廣, 趙東, 柴書軍, 王方雨, 王麗 申請人:河南省農業科學院
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