国产自产21区,亚洲97,免费毛片网,国产啪视频,青青青国产在线观看,国产毛片一区二区三区精品

專利名稱：構建肝癌蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法及其血清檢測應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及惡性腫瘤檢測領域，為一種新的非侵入性的檢測方法，利用人血清在體外對肝癌進行早期發(fā)現(xiàn)，早期檢測，其敏感性和特異性均達到90％以上。
背景技術：
原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全球每年約發(fā)生26萬例，其中42％在中國。根據(jù)衛(wèi)生部的統(tǒng)計資料，近20年來我國每年約有11萬人死于該病，在部分城市中占惡性腫瘤死亡率的第二位，部分農(nóng)村居第一位。由于肝癌起病多隱匿早期癥狀不明顯，一旦出現(xiàn)臨床癥狀多已屬中晚期常因此而錯失治療良機。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是提高肝癌治療效果及長期生存率的有效措施。
早期診斷是在疾病的早期確定其性質(zhì)、部位的過程。但肝癌早期常常沒有明確的癥狀，病人亦不主動就診，直至癥狀出現(xiàn)時常常已非早期。在原發(fā)性肝癌的各種治療方法中，手術切除的療效已得到公認。小肝癌切除后5年生存率可達50～60％；大肝癌也達到30％。然而，有80％左右的患者在發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于晚期，從而喪失了手術機會。因此，確定高危人群、尋找靈敏的篩查方法是早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療從而改善肝癌病人預后的關鍵。
原發(fā)性肝癌患者絕大部分伴有肝硬化，而乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染，食物中含有黃曲霉素，長期嗜酒等目前已被公認是肝癌發(fā)生的最危險因素。我國對3631例肝癌患者統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，其中有乙型肝炎病史5年以上占87.9％，合并肝硬化者占85.5％，HBsAg陽性者占74.8％，因此在我國，HBsAg陽性者或有慢性肝炎病史者是發(fā)生肝癌的主要高危人群。應用靈敏度高，特異度好，經(jīng)濟簡便的方法篩選高危人群是提高肝癌患者預后的最佳方式。
甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)是一種肝癌相關抗原，它的出現(xiàn)帶動了肝癌診斷和治療水平的改善，其臨床價值已得到肯定。但是近年來由于存在以下原因，使得AFP診斷肝癌的價值似乎較以往有所下降1)近年來二級預防工作取得了可喜成果，越來越多的早期肝癌不斷地被發(fā)現(xiàn)，而有大量研究表明PHC患者血清AFP含量一般與腫瘤大小呈正相關[5，6]。所以這些早期肝癌常常因為腫瘤體積小而血清AFP含量不高或增高不明顯，造成臨床上AFP陰性肝癌病例所占的比重較前增加；2)AFP產(chǎn)量與肝癌細胞分化程度有關。高分化級癌細胞形態(tài)和功能與正常肝細胞相近，所以不合成或少合成AFP；低分化級的肝癌細胞由于喪失了合成AFP能力，所以血清AFP常呈陰性，只有中度分化級的肝癌細胞在形態(tài)和功能上近似胚肝細胞，因而合成AFP較多[7]。這可能是臨床上仍有部分中晚期肝癌患者血清AFP呈陰性的原因；3)隨著檢測方法靈敏度提高，在部分慢性肝炎和肝硬化等疾病患者血清中也可以檢測出一定含量的AFP。盡管在肝炎、肝硬化病例中，AFP達到肝癌診斷標準(＞400μg/L)的不多，有報道僅約3％，但AFP升高(20μg/L)的則可高達30％，使AFP在肝癌與良性肝占位鑒別診斷的價值下降。前兩者主要影響AFP診斷肝癌的敏感性，即假陰性增加；而后者則主要影響其特異性，即假陽性增加。由于AFP存在上述缺點，使得其在肝癌的血清學診斷價值受到了一定的限制。顯然，尋找出比AFP更敏感，更特異的肝癌特異性指標成為目前迫在眉睫的問題。
20多年來肝癌其他標志物的研究曾十分活躍，都希望能找到一個可靠的標志物彌補AFP的不足。文獻報道較多的有γ2谷胺酰轉肽酶同工酶II(GGT II)，異常凝血酶原(DCP)，α2L2巖藻糖苷酶，α12抗胰蛋白酶及5′2核苷酸磷酸二酯酶同工酶V等?？上н@些標志物大多特異性不高。目前除GGT II、DCP等尚有應用外，其余已少問津。20世紀80年代發(fā)現(xiàn)AFP糖鏈結構在肝癌與肝炎中有所不同，可藉植物凝集素親和電泳法加以區(qū)別，使用較多的如小扁豆凝集素(LCA)親和電泳法，即AFP異質(zhì)體的檢測，若LCA結合型AFP＞25％，則可提示為肝癌產(chǎn)生的AFP，對肝癌與肝炎的鑒別診斷有一定的作用。惟此法檢測僅適用于AFP濃度較高的患者。AFP單克隆抗體的檢測雖可用于AFP低濃度患者，但方法較為復雜而未能廣泛應用。
人類基因組學和蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，為腫瘤診斷提供了新的思路和手段。蛋白質(zhì)組學是現(xiàn)代科技前沿，通過對蛋白質(zhì)動態(tài)的分析可以探察出疾病早期最微小的指標和征兆。而實現(xiàn)這種診斷，首先要找出各種疾病的特殊標志分子，其次需要有適合于臨床診斷的儀器設備。
目前對蛋白質(zhì)組學的研究仍采用傳統(tǒng)技術，例如雙向電泳、質(zhì)譜。雙向電泳是一種癌癥早期鑒別腫瘤標記物的新方法。雙向凝膠電脈雖然仍是目前可以分辨最多蛋白質(zhì)種類的技術，并在技術上已有了很大的改進，使其重復性和靈敏度大大提高，但這種方法不適于大規(guī)模的普查或臨床檢驗，因為它是一種費時、費力，而且在實驗室很難標準化的方法，無法將其做大量樣品的常規(guī)分析。質(zhì)譜在蛋白質(zhì)分析方面雖然具有高分辨率和高靈敏度的優(yōu)點，但它需要在檢測之前對樣品進行必要的純化，因而無法實現(xiàn)高通量的蛋白質(zhì)分析。
美國Ciphergen公司研發(fā)的基質(zhì)輔助激光解析離子化系統(tǒng)(SELDI)集分離純化和質(zhì)譜檢測于一身，這種技術是利用經(jīng)過特殊處理的固相支持物或芯片的基質(zhì)表面，根據(jù)蛋白質(zhì)物理、化學性質(zhì)的不同，選擇性地從待測生物樣品中捕獲配體，將其結合在芯片的固相基質(zhì)表面上，經(jīng)原位清洗和濃縮后，結合TOF-MS技術，對結合的多肽或蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析的原理是利用激光脈沖輻射使芯池中的分析物解吸形成荷電離子，根據(jù)不同質(zhì)荷比這些離子在儀器中飛行的時間長短不一，由此繪制出一繞質(zhì)譜圖來。該圖經(jīng)計算機軟件外理還可形成模擬譜圖，宇數(shù)據(jù)庫中的譜圖進行對照，我們還能夠最終發(fā)現(xiàn)和捕獲新的疾病異性相關蛋白及其特征。整個測定過程一般可以在幾分鐘內(nèi)就全部完成，十分迅速，同時不會破壞所測定的蛋白質(zhì)。該技術除具有質(zhì)譜在分辨率和靈敏度方面的特別優(yōu)勢外，它還可以直接檢測相對原始的生物樣品，并可同時進行多樣品、多蛋白的檢測。其最新型號的儀器已經(jīng)實現(xiàn)了檢測的自動化，每天可以進行近千次的標本檢測，從而提供了適合于臨床檢驗的蛋白質(zhì)組研究工具。
SELDI進行蛋白質(zhì)測定所使用的是一種新的蛋白質(zhì)芯片技術，實際上是蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜技術聯(lián)用的蛋白質(zhì)譜分析平臺，其核心是一系列稱為Protein chip的蛋白質(zhì)芯片。蛋白質(zhì)芯片是以色譜原理設計的蛋白芯片，該芯片由金屬鋁制成，其長度為8厘米，寬度為1厘米，上面刻有8個直徑2毫米的芯片點，其上覆蓋有不同性質(zhì)的介質(zhì)。根據(jù)芯片表面介質(zhì)的不同化學成分，可將其分為化學表面芯片和生物表面芯片。其中化學表面芯片又可分為疏水、親水、陽離子、陰離子和金屬離子螯合芯片五種，用于檢測未知蛋白，并獲取蛋白質(zhì)表達圖譜；生物表面分為抗體-抗原、受體-配體和DNA-蛋白質(zhì)芯片等種類，可顯示與之相結合的抗原或配體的不同分子量亞型。蛋白質(zhì)芯片相當于在質(zhì)譜分析前增加了一步色譜分離。在檢測過程中使用不同類型的芯片對同一樣品進行檢測可以獲得完全不同的結果，原因相當于采用了不同的分離方法處理樣品。
SELDI可以克服二維凝膠電泳存在的內(nèi)在問題，包括疏水性問題、強酸性、強堿性的蛋白質(zhì)的分離、膜蛋白的分離問題、低分子量檢測的靈敏性、低豐度蛋白質(zhì)的靈敏性問題。蛋白質(zhì)只要與SELDI蛋白質(zhì)芯片陣列結合，就可通過電離——解吸飛行時間——質(zhì)譜儀檢測，并根據(jù)蛋白質(zhì)的質(zhì)量和電荷比(m/z)每一個蛋白質(zhì)的峰值明顯地分離并形成一個蛋白質(zhì)(保留在芯片上的蛋白質(zhì))的圖譜。
蛋白芯片在癌癥相關蛋白的研究領域內(nèi)進展最快，國外學者將前列腺癌、卵巢癌患者與非癌對照者的血清或排泄物的樣本通過蛋白芯片儀進行了研究，Petricoin III EF等用C16疏水性蛋白芯片分析了66例健康婦女、50例卵巢癌患者，圖譜采用534、989、2 111、2 251、2 465質(zhì)荷比(M/Z)蛋白峰綜合分析，靈敏度100％、特異性95％、預測準確率94％，同樣的標本用CA125陰性預測值只有35％，且主要反映在年輕人組中，而CA125在良性盆腔疾病中的假陽性率亦很高。Bao-Ling Adam應用SELDI蛋白芯片系統(tǒng)在金屬表面芯片上確定了4.475kD，5.074kD，5.382kD，7.024kD，7.82kD，8.141kD，9.149kD，9.507kD，9.656kD等九個蛋白質(zhì)用于檢測前列腺癌，其靈敏度為83％，特異性為97％；而用PSA的靈敏度高于90％，但其特異性僅僅為25％。
目前，在非侵入性肝癌的診斷中常有以下幾種方法1.血清學檢測甲胎蛋白(AFP)由Bergstrand于1956年在人胎兒血清中首次發(fā)現(xiàn)，于1964年在肝細胞癌病人血清中首次測得，現(xiàn)已成為臨床診斷肝癌方面最常用的腫瘤標記物。其通常使用的截斷值為20ng/ml，其敏感性為65％，特異性為89％。AFP在臨床上應用時間較長，檢驗方法成熟，在高危人群篩查方面有一定的優(yōu)勢，但同時它也存在著一些不足，其一是敏感性較低(70％左右)，容易造成漏診。其二在一些良性肝病(病毒性肝炎，肝硬化等)、生殖性畸胎瘤、肝母細胞癌、胰腺癌、肺癌、腎癌、白血病患者中也可有升高，而我國病毒性肝炎、肝硬化患者較多，容易造成誤診。其余腫瘤標志物如a-L-巖藻糖苷酶(AFU)、鐵蛋白(Ferritin)、CA19-9等的檢測結果未得到公認。
2.B超檢測肝癌早期肝癌的聲像圖有如下幾個方面的特點(1)比較孤立的單個或兩個低回聲結節(jié)，結節(jié)反射明顯弱于周圍肝組織，形成一個類圓形低回聲團，邊界清晰，但邊緣不規(guī)則，內(nèi)部回聲不均勻[2]。(2)結節(jié)周圍常有(62.5％)圓環(huán)狀低回聲暈。(3)肝臟的其它聲像圖表現(xiàn)常無明顯異常。但其對2厘米以下小肝癌無法檢測。并且檢測結果必須得到AFP檢測驗證。
由于肝癌癌從細胞發(fā)生癌變到形成臨床病灶需較長時間，如果能夠在人體甚至細胞未出現(xiàn)任何病變前診斷出肝癌前兆，將大大提高肝癌患者的生存期。由于血清具有取材方便，無創(chuàng)傷性，并可連續(xù)檢測的優(yōu)點，因此從血清中發(fā)現(xiàn)并檢測肝癌早期生物標志物將把肝癌的早期診斷提高到一個新的水平，從而最終降低肝癌的發(fā)病率和死亡率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型，該模型為早期診斷肝癌提供了新的途徑和方法，并為進一步發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標記物提供了基礎。該模型能夠在人體甚至細胞未出現(xiàn)任何病變前診斷出肝癌前兆，大大提高肝癌患者的生存期；由于血清具有取材方便，無創(chuàng)傷性，并可連續(xù)檢測的優(yōu)點，因此從血清中發(fā)現(xiàn)并檢測肝癌早期生物標志物將把肝癌的早期診斷提高到一個新的水平，從而最終降低肝癌的發(fā)病率和死亡率。
本發(fā)明提供的血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型由人血清蛋白質(zhì)組質(zhì)譜圖譜及生物信息學-人工神經(jīng)網(wǎng)絡分析方法組成。
本發(fā)明提供的肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型，其特征是該蛋白質(zhì)組指紋圖譜由5個質(zhì)荷比(M/Z)位于4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的蛋白質(zhì)(包括磷酸化，甲基化，乙酰基化修飾前或修飾后)所組成。
本發(fā)明的第二個目的是提供肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型構建方法，包括①血清準備；②血清標本的質(zhì)譜檢測和數(shù)據(jù)的收集；③質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學-人工神經(jīng)網(wǎng)絡分析。
本發(fā)明提供的構建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，血清準備包括取一定量臨床病理確診的肝癌患者及正常對照人員外周血，室溫15℃～25℃析出血清后，離心吸取血清，分裝，-80℃冷凍備用；或直接進行檢測處理；檢測時按一定濃度稀釋。
本發(fā)明提供的構建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，血清標本的質(zhì)譜檢測和數(shù)據(jù)的收集包括用美國賽弗吉公司的弱陽離子蛋白質(zhì)芯片WCX2；置入美國賽弗吉公司飛行質(zhì)譜儀，分析樣品血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜；利用表面增強激光解吸/離子化-飛行時間質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)收集，激光強度為185，檢測敏感性為8。
本發(fā)明提供的構建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學-人工神經(jīng)網(wǎng)絡分析包括采用反向傳播(BP)人工神經(jīng)網(wǎng)絡的方法進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析。對比分析肝癌患者及健康人員血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜，獲得肝癌患者血清中特異的蛋白質(zhì)波峰；將發(fā)現(xiàn)的血清中特異的蛋白質(zhì)波峰進行組合后形成肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型，采用反向傳播(BP)人工神經(jīng)網(wǎng)絡的方法進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析。采用肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型雙盲法進行臨床篩選實驗，確定該圖譜的靈敏度、特異度。
本發(fā)明與其他非侵入性肝癌的診斷方法比較，具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明提供的質(zhì)譜模型，為早期診斷肝癌提供了新的途徑和方法，并為進一步發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標記物提供了基礎。(2)與以往的傳統(tǒng)的非侵入性方法比較具有較高的特異性與敏感性，其敏感性和特異性均達到90％以上，是一種在蛋白質(zhì)組學水平上的診斷，對肝癌的早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷提供了新的方法和標準。(3)本發(fā)明模型的構建方法設計合理，可行，是為降低我國肝癌的病死率、提高肝癌的治愈率、進一步篩查肝癌提供了一種新的方法。(4)操作簡便，成本低，可重復性好，患者痛苦小，可大幅度提高早期肝癌患者的檢出率，使肝癌患者的生存期進一步延長，甚至治愈。便于對高危人群進行大規(guī)模的檢測。


圖1是利用血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型測定的病人與正常人在質(zhì)荷比為8815±20處的蛋白質(zhì)含量的差別示意圖。圖中字母C代表肝癌患者血清，N代表正常人血清。經(jīng)方差分析，肝癌組和正常人組蛋白質(zhì)含量差異有顯著性(P≤0.01)。
圖2是利用血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型測定的病人與正常人在質(zhì)荷比為4064±20處的蛋白質(zhì)含量的差別示意圖。圖中字母B代表肝癌患者血清，A代表正常人血清。經(jīng)方差分析，肝癌組和正常人組蛋白質(zhì)含量差異有顯著性(P≤0.01)。
圖3是為人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型構建圖。
具體實施例方式本發(fā)明將結合具體實施例作進一步說明，這些實例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
實施例1 本發(fā)明的一種檢測肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型及構建方法1.血清的預處理血清標本在冰浴中解凍后3000r/min離心5min，取6μl血清加入18μl尿素，充分混勻后冰浴30m，以WCX2結合緩沖液稀釋成120μl。
2.WCX-2蛋白芯片的預處理用5μl 10mmol/L HCI預處理WCX-2蛋白芯片點10min，用M-Q水洗芯片3次，將芯片安裝于Bioprocessor上，芯片每點加150uL結合緩沖液(50mmol/L乙酸鈉，pH4.0)，振蕩室溫下孵育5min，棄掉液體，重復1次。
3.芯片與樣品的結合加100μl稀釋好的樣品于芯片上，振蕩孵育。加入結合緩沖液進行洗脫連續(xù)兩次，每次5min。卸去Bioprocessor，芯片用M-Q水洗滌2次，待芯片表面自然晾干后，各點加兩次0.5μl基質(zhì)，芯片表面干后，用蛋白質(zhì)芯片閱讀機(PBS II型)進行蛋白質(zhì)譜分析。
4.數(shù)據(jù)采集和結果分析蛋白質(zhì)芯片采用蛋白質(zhì)芯片閱讀機PBSII型讀取數(shù)據(jù)。儀器每天用All-in-one蛋白質(zhì)芯片進行分子量校正，系統(tǒng)的質(zhì)量偏差為0.1％。檢測芯片時蛋白質(zhì)芯片閱讀機設置如下激光強度180，檢測敏感度8，優(yōu)化分子質(zhì)量范圍3~10kD，最高分子量20kD，每個樣品收集30個點，采用Ciphergen proteinchip 3.0版本的分析軟件自動采集數(shù)據(jù)，結果采用Biomarker Wizard分析肝癌和正常人血清的蛋白質(zhì)組指紋圖譜差異。
5.統(tǒng)計學分析與正常人血清相比，對肝癌病人不表達或低表達的標志蛋白分子，其敏感性定義為無或低表達標志分子的病人數(shù)與全部肝癌病人數(shù)之百分比，特異性定義為有高表達標志分子的正常人數(shù)與全部正常人數(shù)之百分比。采用Ciphergen proteinchip 3.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，不同組之間蛋白峰比較采用r檢驗，確定兩組之間p值小于0.001時具有統(tǒng)計學意義。
6.網(wǎng)絡參數(shù)的優(yōu)化對訓練集用這多個變量建立一個神經(jīng)網(wǎng)絡。神經(jīng)網(wǎng)絡采用反向傳播算法(用共軛梯度學習函數(shù)改進Trainscg)。具體設置為共有4層，輸入輸出層，和兩個隱含層，每個隱含層有20個神經(jīng)元。每一層都采用正切S形傳遞函數(shù)(Tansig)。隨機初始化。輸出神經(jīng)元為1個，對應健康人和肝癌患者的期望輸出值，分別設為-1和1。首先對訓練標本進行人工神經(jīng)網(wǎng)絡訓練，得出一個模型，對模型進行檢驗，并利用此模型對未知血清進行盲法分析。
實施例2 部分實例
1.試劑及芯片乙腈，三氟乙酸，尿素，蛋白酶抑制劑，Hepes，Tris-HCl，CHAPS和OGP均購自Sigma公司。WCX2蛋白質(zhì)芯片購于美國Ciphergen公司。蛋白標準品Aβ-(1-42)購自Sigma公司。
2.標本來源160例血清標本中，60例肝細胞癌患者的血清標本來自2002年8月～2003年8月廣州市各大醫(yī)院外科系統(tǒng)收治的初治患者；100例健康人的血清標本取自經(jīng)體檢的志愿健康人群，觀察半年未見腫瘤發(fā)生。60例肝癌經(jīng)術后病理確診為肝細胞癌。肝細胞癌中男性85例，女性15例，年齡32～75歲，平均59.6歲。根據(jù)中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標準》，Ia16例，Ib22例，Iia36例，Iib16例，IIIa10例。所有患者均于入院后第二天留取標本，全部血清標本均在清晨空腹治療前抽取，室溫放置2小時，3000r/min離心10min，吸取血清，按每管100μl分裝，血清儲存于-80℃低溫冰箱中。所有腫瘤患者在留取標本前未接受過放化療。
3.蛋白質(zhì)芯片閱讀機蛋白質(zhì)芯片閱讀機(美國Ciphergen公司生產(chǎn))實際上是一臺激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜。它可以檢測IkD小分子物質(zhì)以及多肽，也可檢測500kD以下的大分子。它與蛋白質(zhì)芯片結合在一起構成了蛋白質(zhì)芯片檢測系統(tǒng)。人工神經(jīng)網(wǎng)絡軟件采用Matlab的NNTools，預先將數(shù)據(jù)進行矩陣轉換后輸入NNTools。
4.蛋白質(zhì)芯片采用化學修飾的蛋白質(zhì)芯片WCX2(弱陽離子交換芯片)芯片，其表面結合有弱型陰離子羧基，可以和被分析物表面的正電荷基團相互作用(如賴氨酸、精氛酸和組氛酸)而捕獲蛋白，可用于檢測高等電點的蛋白質(zhì)和生物標記分子。
實驗方法1.血清的預處理血清標本在冰浴中解凍后3000r/min離心5min，取6μl血清加入18μl尿素，充分混勻后冰浴30m，以WCX2結合緩沖液稀釋成120μl。
2.WCX-2蛋白芯片的預處理用5μl 10mmol/L HCI預處理WCX-2蛋白芯片點10min，用M-Q水洗芯片3次，將芯片安裝于Bioprocessor上，芯片每點加150uL結合緩沖液(50mmol/L乙酸鈉，pH4.0)，振蕩室溫下孵育5min，棄掉液體，重復1次。
3.芯片與樣品的結合加100μl稀釋好的樣品于芯片上，振蕩孵育。加入結合緩沖液進行洗脫連續(xù)兩次，每次5min。卸去Bioprocessor，芯片用M-Q水洗滌2次，待芯片表面自然晾干后，各點加兩次0.5μl基質(zhì)，芯片表面干后，用蛋白質(zhì)芯片閱讀機(PBS II型)進行蛋白質(zhì)譜分析。
4.數(shù)據(jù)采集和結果分析蛋白質(zhì)芯片采用蛋白質(zhì)芯片閱讀機PBSII型讀取數(shù)據(jù)。儀器每天用All-in-one蛋白質(zhì)芯片進行分子量校正，系統(tǒng)的質(zhì)量偏差為0.1％。檢測芯片時蛋白質(zhì)芯片閱讀機設置如下激光強度185，檢測敏感度8，優(yōu)化分子質(zhì)量范圍3~10kD，最高分子量20kD，每個樣品收集30個點，采用Ciphergen proteinchip 3.0版本的分析軟件自動采集數(shù)據(jù)，結果采用Biomarker Wizard分析肝癌和正常人血清的蛋白質(zhì)組指紋圖譜差異。
5.統(tǒng)計學分析與正常人血清相比，對肝癌病人不表達或低表達的標志蛋白分子，其敏感性定義為無或低表達標志分子的病人數(shù)與全部肝癌病人數(shù)之百分比，特異性定義為有高表達標志分子的正常人數(shù)與全部正常人數(shù)之百分比。采用Ciphergen proteinchip 3.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，不同組之間蛋白峰比較采用r檢驗，確定兩組之間p值小于0.001時具有統(tǒng)計學意義。取4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的蛋白質(zhì)作為鑒別肝癌與健康人血清蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組指紋圖譜。
6、網(wǎng)絡參數(shù)的優(yōu)化對訓練集用這5個變量建立一個神經(jīng)網(wǎng)絡，參見圖3。神經(jīng)網(wǎng)絡采用反向傳播算法(用共軛梯度學習函數(shù)改進Trainscg)。具體設置為共有4層，輸入層2、輸出層3，和兩個隱含層3-2、3-2，每個隱含層有20個神經(jīng)元，有3個連接權重值5、6、7，每一層都采用正切S形傳遞函數(shù)(Tansig)。隨機初始化。輸出神經(jīng)元為1個，對應健康人和肝癌患者的期望輸出值，分別設為健康人-1和肝癌1。首先對100例標本進行人工神經(jīng)網(wǎng)絡訓練，得出一個模型，對模型進行檢驗，并利用此模型對60例未知血清進行盲法分析。
5、盲法分析方法對60例血清標本(包括肝癌患者與健康人)進行盲法預測，應用相同的技術路線與收集數(shù)據(jù)的方法，用已確定的聚類模型對60例血清的蛋白質(zhì)的質(zhì)譜進行聚類，同樣得到5個分子量的峰值，將數(shù)據(jù)導出后，進行矩陣轉換，再導入已建立的人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型，輸出預測值。
一結果1.血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜所有芯片在PBS-II SELDI質(zhì)譜儀(Ciphergen)進行數(shù)據(jù)的讀取，每個標本均收集30次，共檢測到160個不同質(zhì)荷比(M/Z)的峰值，所有數(shù)據(jù)均保存在同一個文件中，部分圖譜參見圖1，在圖1中共有24例樣本，N代表的12例為健康人的血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖，C代表的12例為肝癌患者的。原始數(shù)據(jù)先用Proteinchip Software 3.0(Ciphergen)做校正(總離子強度及分子量的均一化)。對2k-20k的峰值，用Proteinchip Software 3.0的biomark wizard過濾噪音，設置初始的噪音過濾值為5，第二次的噪音過濾值為2，以10％為最小閾值。聚類共產(chǎn)生54個分子量的峰值圖譜。
2.人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型對100例訓練組的血清標本的蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)經(jīng)矩陣轉換后，輸入MATLAB的NNTools中，進行訓練，經(jīng)過254次后模型達到我們設定的值，檢驗模型的誤差低于1×10-8。將100例血清標本的蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)用此模型進行檢驗，輸出值為-1和1，-1為健康人，1為肝癌患者，結果所有肝癌患者和健康人都被準確地分類。(見表1)表1 100例血清標本應用人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型的輸出值

3.盲法分析結果60例未知的血清標本應用已確定的方法進行血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜的測定，對每例血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)導入已建立的人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型中，進行預測，30例肝癌病人中28例，30例健康人中有29例被準確地預測，結果見表2表2 60例未知的血清標本應用人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型輸出值

計算該方法的敏感性為93％(28/30)，特異性為97％(29/30)。
權利要求
1.一種構建肝癌蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法及其在肝癌患者血清檢測中的應用，其特征是該血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型由人血清蛋白質(zhì)組質(zhì)譜圖譜及生物信息學-人工神經(jīng)網(wǎng)絡分析方法組成，可以應用于肝癌患者的血清學早期檢測和篩查。
2.如權利要求1所述的構建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型，其特征是該蛋白質(zhì)組指紋圖譜由4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的5個質(zhì)荷比峰的蛋白質(zhì)所組成。
3.如權利要求1和2所述的構建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，其特征是①血清準備；②血清標本的質(zhì)譜檢測和數(shù)據(jù)的收集；③質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學-人工神經(jīng)網(wǎng)絡分析。
4.如權利要求3所述的構建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，其特征是取一定量臨床病理確診的肝癌患者及正常對照人員外周血，室溫15℃～25℃析出血清后，離心吸取血清，分裝，-80℃冷凍備用；或直接進行檢測處理；檢測時按一定濃度稀釋。
5.如權利要求3構建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，其特征是用美國賽弗吉公司的弱陽離子蛋白質(zhì)芯片WCX2；置入美國賽弗吉公司飛行質(zhì)譜儀，分析樣品血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜；利用表面增強激光解吸/離子化-飛行時間質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)收集，激光強度為185，檢測敏感性為8。
6.如權利要求3所述的構建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，其特征是采用反向傳播(BP)人工神經(jīng)網(wǎng)絡的方法進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析。對比分析肝癌患者及健康人員血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜，獲得肝癌患者血清中特異的蛋白質(zhì)波峰；將發(fā)現(xiàn)的血清中特異的蛋白質(zhì)波峰進行組合后形成肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型，采用反向傳播(BP)人工神經(jīng)網(wǎng)絡的方法進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析。采用肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型雙盲法進行臨床篩選實驗，確定該圖譜的靈敏度、特異度。
7.如權利要求1和2所述的構建肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型的方法，其特征是該模型可用于肝癌患者的血清學檢測和篩查。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對肝癌進行檢測的非侵入性新方法構建肝癌蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型及并應用于肝癌患者的血清檢測。該血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型由人血清蛋白質(zhì)組質(zhì)譜圖譜及生物信息學—人工神經(jīng)網(wǎng)絡分析方法組成，可以應用于肝癌患者的血清學早期檢測和篩查。該蛋白質(zhì)組指紋圖譜由五個質(zhì)荷比(M/Z)4064±20、5182±20、8815±20、8942±20和14046±20的蛋白質(zhì)所組成。肝癌血清蛋白質(zhì)組指紋圖譜模型構建方法包括①血清準備；②血清標本的質(zhì)譜檢測和數(shù)據(jù)的收集；③質(zhì)譜數(shù)據(jù)的生物信息學—人工神經(jīng)網(wǎng)絡分析。該模型能夠在人體甚至細胞未出現(xiàn)任何病變前診斷出肝癌前兆，大大提高肝癌患者的生存期；由于血清具有取材方便，無創(chuàng)傷性，并可連續(xù)檢測的優(yōu)點，因此從血清中發(fā)現(xiàn)并檢測肝癌早期生物標志物將把肝癌的早期診斷提高到一個新的水平，其對肝癌檢測的敏感性和特異度均達到90％以上，從而為最終降低肝癌的發(fā)病率和死亡率提供了新的方法與標準。
文檔編號G01N30/88GK1654953SQ20051003325
公開日2005年8月17日 申請日期2005年2月24日 優(yōu)先權日2005年2月24日
發(fā)明者郭愛林 申請人:郭愛林