專利名稱：血樣的間接熒光鑒定的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種一次性同時檢測結合生物粒子的一種或多種活性偶對中任一方成份的存在或空缺的、并且在需要的時候檢測它們在全血、血漿式血清樣品中的量值的方法和裝置。
對血樣中抗體或抗原的存在或缺少進行分析被用于診斷一些疾病，諸如，HIV(人免疫缺陷病毒)感染、肝炎、Lyme病、包括TORCH(即弓形體病(Toxoplasmosis)、風疹(Rubella)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus)、皰疹(Herpes)的縮寫)檢查在內的產前檢查，及其它感染性疾病的檢查。目前，這類血清診斷常通過標準的間接熒光免疫鑒定來完成。在標準間接熒光免疫鑒定中，抗原作為要檢測的抗體的偶對一方首先被固定于固體支持介質中，例如玻璃載片、紙膜等，隨后將病人血清樣品與被固定的抗原接觸下共同培養一段時間，這段時間足以使配對的抗體，如果存在的話，變得與被固定的抗原相結合。然后沖洗支持表面以除去所有未被結合的抗體。將包含一種已標記的人體免疫(抗體)球蛋白抗體的試劑送入與固體支持面相接觸，并進行一段時間的培養;這段時間是足以引起已標記材料與可能已與固定抗原相組合的病人之抗體的任何痕跡相鍵合。再將剩余試劑沖洗掉，對固體支持面進行檢驗，確定是否有任何標志物存在。對這種制備的樣品的檢驗可以用目測地進行、也可以利用分光光度測定或者X線測量法進行。顯然，以上方法需要多個標本操作步驟，包括沖洗、分析技術，所以是相當費時費力。前述過程每次試驗只能檢查出一種特定抗原的抗體存在與否，若無進一步試驗，不能把IgG和IgM區分開來，也不能同時檢查出多抗原或抗體。
于1991年10月4日提交的共同待審美國專利申請第07/770，875提出了一種進行不同紅血球進行計數的方法和裝置，通過使具有不同帶比重的微珠粒依比重形成密度分布帶，下文將其稱為密度標志物(density-markers)。本發明涉及一種用于快速簡捷地檢測在全血、血清或血漿樣品中，結合生物粒子的一種或多種活性偶對的各方成份是否存在的方法和裝置。這類可檢測的偶對的例子如促甲狀腺激素/抗促甲狀腺激素(TSH/AntiTSH)復合物、T4/抗T4復合物、風疹抗體/抗風疹抗體、HIV抗體/HIV抗原;在此，TSH、T4、風疹抗體和HIV抗體都是目標分析物。本方法只不過需要在一離心管內將試管中的含有幾種試劑的血樣進行離心，并觀察離心步驟的結果而實現的，檢測可以在不將血樣暴露給醫生或技師的情況下進行。
在使包含全血樣的試管內被離心之后，紅細胞將在試管底部形成連續的密度梯度層，而最稠的紅細胞落在紅細胞的最底層。當血樣在含有以上提到的包含不同比重珠粒或不同比重脂質體群的試管中被離心時，珠粒或脂質體將在紅細胞疊層中形成分離的清晰可見的標志物環。離心管中還可以包含一個圓柱形塑料嵌入芯，它可以被固定于試管底部，或者可以在試管中自由活動。如果是自由活動的，它的比重將可以使其沉入離心后血樣中的紅細胞層。嵌入芯限制了紅細胞在試管內可以占居的空間，因此增加了在離心后紅細胞層中形成的標志物環之間的距離，并將珠粒或脂質體排至試管周壁，在此可以觀察和容易地檢測到這些標志物環，而它們的信號不會被紅細胞所淹沒。
在本發明方法的進行中，珠粒或脂質體將會與一個抗原或抗體相配對，或與另外一種生物活性物質相配對，這種生物活性物質的補體或結合各方(它們可被指定為“目標分析物”)可能存在于病人血液之中。生物活性互補偶對的例子包括酶及其酶作用物、核甙酸及其互補核甘甙酸、自然出現的蛋白結合物，如甲狀結合球蛋白(TGB)和甲狀腺素、“內在內子”和維他命B12、以及一些將選擇性地與RNA-DNA雜種相配對的特異性抗體，如Stollar和Rashtchian在他們發表于1987年161.387-394的分析生物化學雜志上的《基因探針鑒定的免疫化學入門》(Immunochemical Approaches to Gene Probe Assays)文章中所描述的。
每個密度標志物群，其中可能僅有一種將與一個偶對粒子相結合，它對一種目標分析物是特效的，這種分析物可能在血樣或其它生物樣品中存在。將該樣品加入試管，以便使密度標志物/偶對粒子群或多群與樣品混合，足以引起任何存在于樣品中的目標分析物與在密度標志物上他們的補體配偶相配對。
當利用本發明的方法產生了結合偶對時，在配對步驟完成之后，一種被標記或標鑒的“抗-抗原-抗體復合物”抗體(AAAC抗體)對所有在密度標志物上的偶對有特效(這種AAAC抗體可以在樣品加入之前就已在試管之中)。這種AAAC抗體可以是干的，覆蓋于試管內壁，或者，例如可以以液體形式存在于真空管之中，如在1992年2月11日授予RobertA.Levine和StephenC.Wardlaw的美國專利No.5，086，784中所描述的。
這種類型的一些抗體已由美元加州SanJose的貝克頓.迪金森公司的免疫血細胞計數系統部(theImmunocytometrySystemDivisionofBectonDickinsinandCompany，ofSanJose，California)生產。不同于對所有抗原/抗體復合物偶對有特效，這種已標簽AAAC抗體可以僅對免疫球蛋白亞群(IgG和IgM抗原-抗體復合物)有特效。同樣，如果待分析物是RNA或DNA，那么試管中應含有一種特效于或將結合于RNA-DNA對的已標記抗體，如Stollar和Rashtchian所描述的那樣。
標志物可以是脂質體包圍的染色劑或熒光染色劑，或者可以是放射性能量輻射源。標志物必須是可檢測到的并且最好是可以計量的。該已標記抗體與所有具有形成于其上的偶對的密度標志物相結合。樣品被離心處理，按密度地將密度標志物在試管內分離成間隔的部分帶或環。然后檢查管內不同的密度標志物帶，以確定哪些帶(如果有的話)具有可檢測的標記量值，并且，如果適當的話，測量標記的量值。而最常用的標記應首推熒光分子，如FITC。
如果需要，不同的密度珠粒可以有不同的固有顏色，這樣，每條(如果有一種以上的帶的話)不同顏色的帶將代表不同的目標分析物。如果采用不同顏色的密度標志物，試管中標記帶的顏色將表明哪一些結合的分析物是在樣品中;如果置于試管中的密度標志物的帶中沒有展示出與其有關的任何標記，則說明樣品中沒有那些分析物。如果沒有采用著色的密度標志物，那么標記帶在管內的位置將表明哪些分析物是在樣品之中而哪些不在。當然，這一信息就可以進行對血樣提供者健康情況的診斷。
本發明的目的是提供一種改進的用于對生物樣品進行分析的技術，以便確定其中某些目標分析物存在與否。
本發明進一步的目的是提供一種改進的描述特性的技術，其中分析結果可以在透明樣品試管中依密度地進行。
本發明進一步的目的是提供一種改進的描述特性的技術，其中分析是利用與抗體和/或抗原相配對的比重不同的珠粒進行的，以便可以在一個試管內一次地進行多項鑒定。
本發明另一個目的是提供一種描述特性的技術，其中分析是通過在樣品中形成顯著的抗體/抗原配對帶而進行的。
本發明其它目的和優點將在以下并于發明的較佳實施例的詳細闡述中配合相應附圖得到更充分顯示。在圖中
圖1是用以實現本發明的過程的離心管的側視圖;
圖2是其中含有被離心的全血樣本的試管，其中紅細胞層被放大以特別地顯示本發明的特點。
圖3是實現本發明中所采用的離心管的第二實施例的軸向剖視圖。
現在參見圖1和圖2。在圖1中有一個試管2，它可以是一個玻璃毛細管或其它透明管，它可以含有一根塑料制成的浮漂或嵌入芯4，后者的比重使其在其中裝有血樣的試管2被離心之后穿過紅細胞落入試管2的底部6。比重不同的抗體和/或抗原配對的塑性珠粒親和群可以被置于試管2內的塊5中。一個塑料蓋10封閉試管2的底部6。每一珠粒群的比重將大于最輕的紅細胞(即最原始的網織紅細胞)的比重。
血樣被抽入管2之中，在培養了一段時間之后，與嵌入芯4和珠粒5一起被離心。在培養過程中，珠粒塊5彌散在血樣中，然后在離心步驟中分成不同的帶，這些帶在紅細胞層中形成一些線，如圖2所示，同時浮漂4則穿過紅細胞R。管2中還含有一些前述的已標記AAAC抗體。
白細胞W在紅/白紅胞界面I之上的帶中分出層。密度標志物珠粒B依密度不同在紅細胞層中分層。對帶B的檢查將顯示其中帶B中哪些已被標簽，因為熒光標記物只能在被加標記的帶中被檢測到。
圖3示出可以用來實現本發明的離心管的另一種替換形式。管12有一個化合物漏斗形孔，帶有加大的開口端部分14和受限的封閉端部分16。孔的大小如此設定以便使被離心后血樣中紅細胞R落入孔的受限部分16，而白細胞和血漿則保留在孔的加大部分14中的大部分中。被標記的密度標志物帶B彌散于離心后的紅細胞層中。管12由透明玻璃或塑料材料制作。請注意圖3所示的實施例中未采用漂浮部件。
從圖2和3將可注意到密度標志物帶被分得足夠開，使每個帶可以不受任何其它帶B干擾地地進行熒光鑒定、或其它能量輻射鑒定，并且甚至能夠如以下提出的被量值化。當進行血樣鑒定時，紅細胞的自然屬性，即當以排斥血漿的方式被離心時它們相疊的事實，保證了實際上所有在管內的未結合的標記AAAC抗體將結束于血漿層中，并將不影響該過程。
下面舉例說明利用本發明對樣本中的一種目標分析物定量的一個一般例子。醫生可以從文獻中預計在已知待驗生物液體的體積樣品中找到多少一種目標分析物的分子或單位。比如假設一個遭受Lyne病感染的病人每毫升血液中最多可能含有50Lyme分析物單位(50Lymeanalyteunitspermilliterofblood)。醫生將向每毫升被測血樣中至少加入100密度標志物/抗原/抗體配對單位，也將向容器中每毫升樣品最少加入100已標記AAAC抗體單位。因為擁有與預計在樣品中找到的最大數量的分析物相比超量的結合位點和標記粒子，Lyme珠粒帶發出的標記輻射強度將與樣本中實際存在的Lyme待分析物的數量成正比。這樣，血液中Lyme待分析物的含量就可以通過測量輻射強度而得到估算。定量測定步驟的關鍵是在血樣中提供與預計能在樣品中找到的分析物單位的最大數值相比起作用的超量的結合點和標記抗體。只要存在的待分析物的量與最終結合于密度標志物-AAAC抗體偶對上的待分析物之間存在一定數學關系，即使結合的AAAC抗體單位以少于待分析物的摩爾數出現，人們也能夠求出分析物的量值。
當一個實驗室希望利用血清或血漿樣本，或者需要更有價值的密度梯度時，諸如如果需要將很多密度梯度分離開的情形時，則可以用一種穩定材料預先灌注圖3所示的試管的狹窄部分，例如灌注具有所需梯度的膠凝Ficoll。這種密度梯度材料，除了可以分離固有帶之外，還在離心過程中起到從結合層中沖走未結合的AAAC抗體的作用。
應能理解到，雖然已經結合血液診斷相關描述了本發明，但本發明還可用于診斷其它生物液中所能找到的高度特異性補體偶對的存在與缺少。與象血漿分析一樣，當鑒定一種血以外的其它生物液時，離心步驟需要在密度梯度液體中，例如，如上所述的Ficoll凝膠中進行，它將不與生物液的液相相混合，并將使密度梯度液體中的帶依密度地分離開，由于同時利用密度標志物的梯度液體沖洗，所以保證了所有未結合標記從帶中分離出來。這消除了未結合標記與標記帶計量的干擾。當檢查全血時，以及當在膠凝的Ficoll中測試一種非細胞液體時(它出現于離心步驟中)，將未結合標記從標記細胞中沖走的固有特性，消除了先有技術中所要求的分離沖洗步驟，并且防止了未結合標記影響過程的精度的問題。這種固有沖洗機制對本發明而言是一重要因素。
因為可以在不背離本發明概念的情況下，對本發明所公開的實施例進行很多變化和修改，所以除了由所附權利要求所請求的之外，并不打算對本發明作限制。
權利要求
1.一種用檢測在一透明管內生物液樣品中可疑目標分析物的方法，所述方法包括步驟a)向樣品中加入一組密度標志物，這些密度標志物具有預定的比重，在所述組中的每種密度標志物與一種結合物質相配對，以形成對該可疑目標分析物特效的密度標志物偶對；b)向樣品中加入被標記的配對結合抗體；c)培養這種密度標志物/被標記的配對結合抗體樣品混合物；d)依密度將密度標志物聚集到管內的至少一個清晰帶中；以及e)檢測是否該帶顯示出被標記配對結合抗體的存在，進而判定出目標分析物的存在。
2.如權利要求1的方法，其中通過向樣品中增加不同組密度標志物，可以檢測在透明管中某種生物液樣品內一種或多種不同目標分析物，對于樣品內每種被懷疑的目標分析物有一組密度標志物，每組密度標志物具有不同于其它組的密度標志物的比重，并且在每組中的每一種密度標志物都與對目標分析物的一種有特效的結合物質相配對，從而每種不同密度標志物/結合物質配對組對可疑目標分析物中一種不同分析物有特效。
3.如權利要求2的方法，進一步包括在依密度進行分離的步驟期間從密度標志物中替換未結合標記配對結合抗體的步驟。
4.如權利要求3的方法，其中液樣是全血，并且其中密度標志物的比重大于最輕紅細胞的比重。
5.如權利要求4的方法，其中所述替換步驟是通過在全血樣內被離心的紅細胞所進行的。
6.用于離心地分析一種生物液樣中目標分析物的存在或缺少的裝置，所述裝置包括a)一個具有用于容納液樣的孔的透明管;b)用于在所述管孔內形成一局部縮狹的裝置;c)在所述管內大量的目標分析物特效抗體和/或抗原配對密度標志物;以及d)在所述管內形成一密度梯度層的裝置，在所述管中液樣的離心過程中，密度標志物沉入其中。
7.如權利要求6的裝置，進一步包括在所述管內的可操作量的被標記抗-抗原-抗體復合物(AAAC)抗體，所述AAAC抗體特效于在所述密度標志物上形成的任何抗體/抗原/分析物偶對，并且可操作以便可檢測地突出所述偶對。
8.如權利要求7的裝置，其中存在于管內的抗體和/或抗原配對密度標志物和被標記的AAAC抗體的數量超出了預計在液樣中可找到的目標分析物單位的數量，大到足以量化液樣中目標分析物的程度。
9.如權利要求8的裝置，其中抗體和/或抗原配對密度標志物和被標記的AAAC抗體的數量至少是所預計目標分析物量的兩倍。
10.用于離心地分析一種生物液樣中免疫球蛋白亞群存在或缺少的裝置，所述裝置包括a)一個具有用于容納液樣的孔的透明管;b)用于在所述管的孔內形成一局部縮狹的裝置;c)在所述管內的大量的免疫球蛋白特效抗體和/或抗原配對密度標志物;d)在所述管內的可操作量的被標記抗-抗原-抗體混合物(AAAC)抗體，所述AAAC抗體特效于形成于所述密度標志物上的免疫球蛋白抗體-抗原復合物，并且可操作以便可檢測地突出所述復合物;以及e)用于在所述管中形成一密度梯度層的裝置，在離心過程中，所述密度標志物將沉入其中。
全文摘要
通過對透明試管中的血樣進行離心處理來診斷病人的健康狀況。試管中含有一群或多群，諸如每群有不同密度的脂質體或塑性珠粒的粒子，密度相同的粒子攜帶有對可能存在于被測血樣內的補體抗原或抗體有特效的抗原或抗體。向血樣中加入一種對所有結合抗體/抗原偶對有特效的被標記抗體，形成標記抗體+抗原——抗體復合物(AAAC)。離心后，復合物粒子依各自的比重落至管內不同區域，各層的標記輻射程序可定性或定量地分析血樣。
文檔編號G01N33/537GK1088310SQ9311965
公開日1994年6月22日 申請日期1993年10月29日 優先權日1992年10月30日
發明者羅伯特·A·利費恩, 斯蒂芬·C·瓦爾德羅, 萊昂·W·M·M·特斯塔彭, 迪澤·J·萊克坦沃爾德, 托馬斯·J·邁爾科林諾 申請人:羅伯特·A·利費恩, 斯蒂芬·C·瓦爾德羅, 貝克頓·迪金森公司
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