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專利名稱：用于基于酶電化學(xué)的傳感器的水可混溶性導(dǎo)電油墨的制作方法
交叉引用本申請要求享有于2005年4月12日提交的U.S.臨時申請No.60/671,026、標(biāo)題為“用于基于酶電化學(xué)的傳感器的水可混溶性導(dǎo)電油墨”的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
1.技術(shù)領(lǐng)域本申請總體上涉及傳感器，并且尤其是基于酶電化學(xué)的傳感器。
2.現(xiàn)有技術(shù)的描述近年來，利用采用酶試劑如包含氧化還原介體(例如二茂鐵)和氧化還原酶(例如葡糖氧化酶)的酶試劑，與電極一起用于測定液體樣品中的分析物的基于酶電化學(xué)的傳感器已經(jīng)引起了高度的興趣。所述基于酶電化學(xué)的傳感器被認(rèn)為特別適用于連續(xù)或半連續(xù)的監(jiān)測流體樣品(例如，血液或間質(zhì)性流體樣品)中的分析物(例如，葡萄糖)。例如，基于酶電化學(xué)的葡萄糖傳感器，采用了氧化還原介體、氧化還原酶和工作電極，可以使用相對低的電勢(例如，小于0.4V vs SCE)來測定(即測量)葡萄糖的濃度，從而限制了工作電極上的任何干擾響應(yīng)。對于基于酶電化學(xué)的傳感器的進(jìn)一步描述，例如參見U.S.專利Nos.5,089,112和6,284,478，每一個由此都全部作為參考并入本文。
附圖簡述通過參照以下的詳細(xì)說明及附圖，將獲得對本發(fā)明特征和優(yōu)點(diǎn)的更好理解，其給出了利用本發(fā)明原理的示例性實(shí)施方案，其中

圖1描述了一種可用在根據(jù)本發(fā)明一個例舉性實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨的粘合劑中的共聚物；圖2描述了可用在根據(jù)本發(fā)明另一例舉性實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨的粘合劑中的另一種共聚物；圖3描述了又一個可用在根據(jù)本發(fā)明另一個例舉性實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨的粘合劑中的另一種共聚物；圖4描述了一種用于制備可用在根據(jù)本發(fā)明另一個例舉性實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨的粘合劑中的共聚物的反應(yīng)流程；圖5A為一個簡化的頂視圖，描述了根據(jù)本發(fā)明一個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的傳感器的一部分；圖5B描述了圖5A基于酶電化學(xué)的傳感器沿線5B-5B的一簡化橫截面圖，的；圖5C描述了圖5A基于酶電化學(xué)的傳感器沿線5C-5C的一簡化橫截面圖，；圖5D描述了圖5A基于酶電化學(xué)的傳感器沿線5D-5D的一簡化橫截面圖；圖6為用于制造一部分根據(jù)本發(fā)明一個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的傳感器的工藝流程圖；圖7描述了一個用于合成高分子量的丙烯酰胺和乙烯基二茂鐵的氧化還原共聚物的簡化的反應(yīng)流程，其可用在根據(jù)本發(fā)明一個例舉性實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨的粘合劑中；圖8A的曲線描述了根據(jù)本發(fā)明的一個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的葡萄糖傳感器的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)，以連續(xù)流動方式獲得；圖8B的曲線描述了用于根據(jù)本發(fā)明的一個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的葡萄糖傳感器的電流隨時間的穩(wěn)定性；圖9的曲線描述了根據(jù)本發(fā)明的一個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的傳感器的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)，采用微流控檢測系統(tǒng)而獲得；圖10的曲線描述了根據(jù)本發(fā)明的一個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的傳感器對各個葡萄糖濃度的瞬時響應(yīng)；圖11的曲線描述了根據(jù)本發(fā)明的一個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的傳感器對各個葡萄糖濃度的總瞬時響應(yīng)；圖12是用于根據(jù)本發(fā)明的一個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的傳感器的校準(zhǔn)曲線；圖13的曲線描述了根據(jù)本發(fā)明的一個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的傳感器的響應(yīng)穩(wěn)定性；以及圖14為用于根據(jù)本發(fā)明的一個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的葡萄糖傳感器的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)的曲線描述。
本發(fā)明示例性實(shí)施方案的詳細(xì)描述用于根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的傳感器的水可混溶性導(dǎo)電油墨包括導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑。此外，所述導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑被制成水可混溶性的基于水的分散體系，其中，粘合劑在干燥時變?yōu)樵诓僮魃喜蝗苡谒摹Ｔ谶@點(diǎn)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到分散體系實(shí)質(zhì)上為一種混合物，其包括分散在一種不同物質(zhì)的連續(xù)相(例如，連續(xù)的粘合劑相)中的分散的顆粒物質(zhì)(例如，導(dǎo)電物質(zhì)的顆粒)。下面將描述用于根據(jù)本發(fā)明多個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的傳感器的水可混溶性導(dǎo)電油墨的特性、優(yōu)點(diǎn)和其它例舉的細(xì)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨能夠最緊密地接近并正好置在酶、介體和導(dǎo)電物質(zhì)之間，從而便于其間的快速電子交換(即電子轉(zhuǎn)移)。所述的快速電子交換可以導(dǎo)致有利的增加電流收集效率。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨可以很容易地用在常規(guī)的基于酶電化學(xué)的傳感器制造技術(shù)中，例如絲網(wǎng)印刷技術(shù)。此外，水可混溶性導(dǎo)電油墨的實(shí)施方案適用于在干燥時被固定到基于酶電化學(xué)的傳感器的襯底上作為導(dǎo)電層，因而可防止在使用基于酶電化學(xué)的傳感器期間介體和/或酶從導(dǎo)電層流失。而且，與常規(guī)的分離電極相比，該導(dǎo)電層的導(dǎo)電物質(zhì)可具有更大的介體可及的表面積。
由于本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨被制成水基分散體系，它們很容易與典型的酶和介體兼容。此外，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨具有的優(yōu)點(diǎn)在于其水可混溶的本質(zhì)，它能夠使得在酶和介體的比例方面有很寬的配制區(qū)，酶和介體可以在其中結(jié)合成一種均勻的分散體系。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨可以很容易地制造，并且可以很容易地施加到基于酶電化學(xué)的傳感器的襯底上。因此，水可混溶性導(dǎo)電油墨可有利地適用于快速且成本高效的制造基于酶電化學(xué)的傳感器。而且，由于根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨將酶、介體和導(dǎo)電物質(zhì)結(jié)合為單一的組合物，可以有利地降低處理步驟的數(shù)量以及制造基于酶電化學(xué)的傳感器所需的昂貴造價。
應(yīng)當(dāng)注意，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨為這樣的導(dǎo)電油墨，其可以均勻地溶解和/或另外分散在水或其它水溶液中，盡管水可混溶性導(dǎo)電油墨也可以包含不引起相分離的有機(jī)溶劑(例如，水溶性有機(jī)溶劑)。
下面將詳細(xì)地描述適合的導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑，以及適于將導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑制成根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨的技術(shù)。
導(dǎo)電物質(zhì)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何合適的導(dǎo)電物質(zhì)(由于上下文可以保證，也稱作顏料或碳墨)可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案中。例如，導(dǎo)電物質(zhì)可以為細(xì)碎的導(dǎo)電顆粒物質(zhì)，如碳黑材料、石墨材料、鉑顆粒材料、鍍鉑碳材料、金顆粒材料、鉑/鈀合金顆粒材料、鈀顆粒材料、釕顆粒材料或鈰顆粒材料。這些細(xì)碎的導(dǎo)電顆粒材料的尺寸可以例如小于100微米，并且更優(yōu)選處于1nm-20微米的范圍內(nèi)。此外，尺寸范圍可以具有雙峰式分布。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨被用于制造基于酶電化學(xué)的傳感器的導(dǎo)電層時，水可混溶性導(dǎo)電油墨的導(dǎo)電物質(zhì)可以起電極的作用，并且與水可混溶性導(dǎo)電油墨的介體交換電子。在這點(diǎn)上，一旦獲知本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到由根據(jù)本發(fā)明的水可混溶性導(dǎo)電油墨形成的導(dǎo)電層含有存在于水可混溶性導(dǎo)電油墨中的導(dǎo)電物質(zhì)、酶和介體，被用于形成導(dǎo)電層。由于導(dǎo)電物質(zhì)和介體(以及酶和粘合劑)可以被制成均勻的分散體系，與在獨(dú)立的導(dǎo)電物質(zhì)層(如常規(guī)的電極)和含有介體的獨(dú)立層之間的電子交換相比，獲得的導(dǎo)電層對于導(dǎo)電物質(zhì)和介體之間的電子交換具有增強(qiáng)的穩(wěn)定性。
一旦獲知本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇導(dǎo)電顆粒、粘合劑、介體、酶和任選水可混溶性的有機(jī)共溶劑的組合來產(chǎn)生均勻的分散體系，并且在干燥時產(chǎn)生均勻的導(dǎo)電層(例如，具有基本上均勻分布的酶、介體和導(dǎo)電物質(zhì)的導(dǎo)電層)。在這樣做時，可采用用于評估分散體系和導(dǎo)電層均勻性的常規(guī)和公知的實(shí)驗技術(shù)(如可視和掃描電子顯微鏡(SEM)檢測和機(jī)械性能表征)。
在水可混溶性導(dǎo)電油墨中采用的導(dǎo)電物質(zhì)(以及粘合劑)的電性能以及導(dǎo)電物質(zhì)的比例可以被預(yù)先確定，從而使得通過干燥水可混溶性導(dǎo)電油墨而形成的導(dǎo)電層具有小于大約10kΩ的導(dǎo)電率。在這點(diǎn)上，形成導(dǎo)電率小于約1kΩ的導(dǎo)電層可以是特別有利的。
酶本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何合適的酶可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案中。例如，所述酶可以是選擇性地識別流體樣品(如血液樣品)中的待測(即檢測或測定)分析物(如葡萄糖)的酶。如基于酶電化學(xué)的傳感器領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的，所述酶參與作為通過基于酶電化學(xué)的傳感器而電化學(xué)測定分析物的基礎(chǔ)的電化學(xué)反應(yīng)。例如，所述酶利用介體可以將電子往返于電極(或其它的導(dǎo)電物質(zhì))，從而使能夠在電極上測量與分析物濃度成正比的電流。
例如，所述酶可以是氧化還原酶，如葡萄糖氧化酶。在這種情況下，采用含有葡萄糖氧化酶的水可混溶性導(dǎo)電油墨的基于酶電化學(xué)的傳感器可以被用于測定流體樣品(例如，全血液樣品)中的葡萄糖。葡糖氧化酶的例子包括但不局限于葡糖氧化酶和吡咯并喹啉醌(PQQ)葡萄糖脫氫酶。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨的制劑使該水可混溶性導(dǎo)電油墨的酶能夠可操作性地固定在基于酶電化學(xué)的傳感器的襯底上。可操作性的固定是指當(dāng)固定到襯底上時，酶能夠與分析物發(fā)生反應(yīng)并通過介體將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電物質(zhì)上。
介體本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何合適的介體可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案中。介體基本上為一個化學(xué)實(shí)體，其能夠可操作性地與水可混溶性導(dǎo)電油墨的導(dǎo)電物質(zhì)和酶交換電子。
例如，所述介體可以是鐵氰化物或二茂鐵。此外，所述介體可以為聚合物介體，如在共同待審的U.S.專利申請No.10/957,441、申請No.10/931,724和申請No.10/900,511中的描述并涉及的作為氧化還原聚合物的那些。所述聚合物介體可以為水溶性并具有高分子量，如乙烯二茂鐵和丙烯酰胺的共聚物。
具有有限水溶性適當(dāng)介體例如二茂鐵或四硫富瓦烯/四氰基醌二甲烷(TTF/TCNQ)可以通過在配制前將介體分散或溶解到水可混溶的共溶劑如甲基卡必醇或二醇醚中而被制備用于根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨。所述水可混溶的共溶劑使介體能夠有效地與水可混溶性導(dǎo)電油墨的導(dǎo)電物質(zhì)、酶和粘合劑一起分散，盡管介體在無共溶劑存在時水溶性有限。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨制劑使介體能夠可操作性地固定到基于酶電化學(xué)的傳感器的襯底上。可操作性的固定是指當(dāng)介體固定到襯底上時能夠與酶發(fā)生反應(yīng)并將電子轉(zhuǎn)移到導(dǎo)電物質(zhì)上。
粘合劑本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何適當(dāng)?shù)恼澈蟿?由于上下文可以證明，也稱作樹脂或樹脂聚合物)可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案中。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨的粘合劑發(fā)揮作用以便可操作性地將水可混溶性導(dǎo)電油墨的導(dǎo)電物質(zhì)、介體和酶固定到基于酶電化學(xué)的傳感器的襯底上。
例如，所述粘合劑可以包括樹脂聚合物和反離子，其中，該反離子通過為樹脂聚合物的酸性或堿性基團(tuán)的脫質(zhì)子化或質(zhì)子化而使樹脂聚合物可溶解于水。所述反離子可以為揮發(fā)性的，使得當(dāng)水可混溶性導(dǎo)電油墨被干燥時，反離子基本上蒸發(fā)，并且獲得的粘合劑(即干燥的樹脂聚合物)變成可操作性地不溶于水的。例如，所述樹脂聚合物可以具有從羧酸物質(zhì)衍生的酸性基團(tuán)，并且揮發(fā)性反離子可以從揮發(fā)性胺如氨、N`N`-二甲基乙醇胺或揮發(fā)性的有機(jī)胺衍生而來。當(dāng)揮發(fā)性的反離子從水可混溶性導(dǎo)電油墨中蒸發(fā)時，樹脂聚合物可以以這樣一種方式變成離子交聯(lián)到基于酶電化學(xué)的傳感器的襯底上，該方式使得水可混溶性導(dǎo)電油墨的酶、導(dǎo)電物質(zhì)和介體基本上被固定。對于帶有負(fù)電荷酸性基團(tuán)的樹脂聚合物，帶負(fù)電荷的酸性基團(tuán)可以與樹脂聚合物本身的帶正電荷的物質(zhì)或者導(dǎo)電物質(zhì)、酶和介體中的任何一種離子鍵合。
供選地，例如，聚合物樹脂的酸性或堿性基團(tuán)可以為這樣的，使得所述酸性或堿性基團(tuán)僅僅在預(yù)定的pH范圍內(nèi)離子化，因而使得聚合物樹脂在預(yù)定的pH范圍內(nèi)為水溶性。當(dāng)干燥水可混溶性導(dǎo)電油墨時，已干燥的或正在干燥的油墨可以用超出預(yù)定pH范圍的適當(dāng)pH的溶液處理，以便使樹脂在操作上為不溶于水的。
粘合劑的作用可以通過共溶效應(yīng)的作用而被增強(qiáng)，借此，在水可混溶性導(dǎo)電油墨中存在水可混溶的有機(jī)共溶劑改善了粘合劑的水溶性。當(dāng)水可混溶性導(dǎo)電油墨被干燥時，所述有機(jī)共溶劑可以例如通過蒸發(fā)而去除。特別是，在使用基于酶電化學(xué)的傳感器期間，當(dāng)與流體樣品接觸時，有機(jī)溶劑不存在，并且樹脂聚合物在操作上為不溶于水的。例如，適當(dāng)?shù)乃苫烊艿挠袡C(jī)共溶劑包括醇類、二醇醚類、甲基卡必醇、丁基卡必醇、乙二醇、乙二醇二乙酸酯、雙丙酮醇和磷酸三乙酯。
一旦獲知本發(fā)明的公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到根據(jù)本發(fā)明的水可混溶性導(dǎo)電油墨的各組分可以從市場上購買。例如，適用于根據(jù)本發(fā)明多種實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨的導(dǎo)電石墨材料和粘合劑的水可混溶組合物可作為目錄號為66756的導(dǎo)電石墨糊購自Coates Electrographics，其為Sun Chemical Screen，Norton Hill，Midsomer Norton，Bath UK的一個分公司。另外的導(dǎo)電物質(zhì)和粘合劑的水可混溶組合物可作為水溶性導(dǎo)電物質(zhì)LFW201-H從市場上購自Precisia，Ann Arbor，Michigan，U.S.A。
通過干燥根據(jù)本發(fā)明各實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨而形成的導(dǎo)電層的干燥粘合劑可以作為透析膜，同時介體、酶和導(dǎo)電物質(zhì)被限制在干燥的并且在操作上為不溶于水的粘合劑中，從而固定到基于酶電化學(xué)的傳感器的襯底上。所述透析膜可允許相對較小的分子如葡萄糖穿過其中并與限制于其中的酶發(fā)生反應(yīng)。
參照圖1、2、3和4，適用于根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨的粘合劑可以包括帶有羧基官能團(tuán)、酸酐官能團(tuán)和/或磷酸基團(tuán)的聚合物。例如，所述粘合劑可以為圖1描述的聚苯乙烯共馬來酐的共聚物10、圖2描述的聚苯乙烯共馬來酐的水解共聚物20、聚苯乙烯共馬來酐的部分水解共聚物、圖3描述的聚苯乙烯共馬來酐的部分酯化共聚物30或通過磷酸42與環(huán)氧樹脂44反應(yīng)而獲得的磷酸官能團(tuán)的聚合物40，如圖4所示。
而且，粘合劑也可以被制成含有通過將適當(dāng)?shù)乃嵝怨倌軋F(tuán)乙烯基單體與其它單體混合而制得的共聚物或三元共聚物，所述酸性官能團(tuán)乙烯基單體是例如丙烯酸單體和/或甲基丙烯酸單體和/或衣康酸單體和/或馬來酸單體，所述其它單體是例如其它乙烯基單體，如甲基丙烯酸甲酯單體和/或苯乙烯單體和/或丙烯酸乙酯單體和/或丙烯酸異丙酯單體和/或丙烯酸丁酯單體和/或丙烯腈單體和/或甲基苯乙烯單體和/或苯甲酸乙烯酯單體和/或丙烯酰胺單體和/或甲基丙烯酸羥基甲酯單體。所述聚合物粘合劑將水溶性與良好的導(dǎo)電物質(zhì)分散性能結(jié)合起來。
參照圖5A、5B、5C和5D，根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的傳感器100包括襯底102、具有電極表面106a的參比電極104a，具有電極表面106b的工作電極104b，以及設(shè)置在電極表面106b上的導(dǎo)電層108。導(dǎo)電層108通過干燥根據(jù)本文描述的本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨而形成。因此，導(dǎo)電層108包括干燥的粘合劑(其在操作上為不溶于水的)、介體、酶和導(dǎo)電物質(zhì)。盡管導(dǎo)電層108被描述為設(shè)置在工作電極104b上，由根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨形成的導(dǎo)電層本身可以作為基于酶電化學(xué)的傳感器的工作電極或其它適當(dāng)?shù)膶?dǎo)電元件。
基于酶電化學(xué)的傳感器100也包括參比油墨層114以及任選的絕緣層112。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到圖5A-5D僅描述了一個完整的基于酶電化學(xué)的傳感器的一部分，并且該基于酶電化學(xué)的傳感器的其它組件(例如，腔體、分析/微處理器模塊和電子通訊電路)未被顯示，以避免使圖5A-5D過度復(fù)雜。
本領(lǐng)域技術(shù)人員也將意識到參比油墨層114，其組成了與參比電極104a成一體的電化學(xué)活性層，設(shè)定了“零電勢”，與其相對，將測量電勢施加到工作電極104b上。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將意識到盡管圖5A-5D描述了具有兩電極模式的基于酶電化學(xué)的傳感器，本領(lǐng)域公知的其它基于酶電化學(xué)的傳感器模式可以用于本發(fā)明的實(shí)施方案中。
襯底102可以例如由聚對苯二甲酸乙二醇酯板、聚對苯二甲酸丁二醇酯板形成(例如，可從市場上購自GE Plastic，美國)，或由定向的聚苯乙烯膜形成(例如，可從市場上購自NSW GmBH，德國)。
參比油墨層114可以例如由Ag/AgCl糊(可從市場上購自Gwent ElectronicMaterials，Pontypool Wales，UK)或任何適當(dāng)?shù)碾娀瘜W(xué)參比材料形成，包括但不局限于包含形成部分溶解鹽的金屬(例如，銀、銅、鈦和鋰)的材料。
任選的絕緣層112可以例如由介電絲網(wǎng)可印刷的油墨糊(例如，可從市場上購自Sericol Inks Ltd.)形成。參比電極104a和工作電極104b可以由本領(lǐng)域公知的任何適當(dāng)?shù)牟牧闲纬伞?br> 參比電極104a、工作電極104b、絕緣層112可以具有適當(dāng)?shù)暮穸取Ｈ欢瑢τ谶@些層中的每一個厚度，一般處于1-100微米的范圍內(nèi)。
圖6為用于制造根據(jù)本發(fā)明一個例舉性實(shí)施方案的基于酶電化學(xué)的傳感器的方法600的流程圖。制造的部分可以為任何導(dǎo)電層，例如圖5A-5D中描述的電極、導(dǎo)電圖形或?qū)щ妼印Ｈ欢绢I(lǐng)域技術(shù)人員將意識到盡管圖5A-5D顯示了可以利用根據(jù)本發(fā)明的方法所制造的基于酶電化學(xué)的傳感器，所述方法不局限于圖5A-5D描述的基于酶電化學(xué)的傳感器。
方法600包括將水可混溶性導(dǎo)電油墨施加到基于酶電化學(xué)的傳感器的襯底上，如步驟610中所示。水可混溶性導(dǎo)電油墨包括導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑，該導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑被制成水可混溶的水基分散體系，并且其中粘合劑在干燥時變?yōu)樵诓僮餍陨喜蝗苡谒摹?br> 襯底可以為任何適當(dāng)?shù)囊r底，例如包括基于酶電化學(xué)的傳感器的電絕緣襯底和/或基于酶電化學(xué)的傳感器的導(dǎo)電襯底。
步驟610的施加可以例如通過任何適當(dāng)?shù)氖┘蛹夹g(shù)包括絲網(wǎng)印刷技術(shù)、浸涂技術(shù)、噴涂技術(shù)和噴墨涂敷技術(shù)而完成。本文相對于根據(jù)本發(fā)明的水可混溶性導(dǎo)電油墨和基于酶電化學(xué)的傳感器進(jìn)一步描述了步驟610中施加的水可混溶性導(dǎo)電油墨。
如圖6的步驟620中所示，方法600還包括干燥水可混溶性導(dǎo)電油墨以在襯底上形成一個導(dǎo)電層，該層包含在操作上不溶于水的粘合劑。
干燥可以在足以將已干燥的水可混溶性導(dǎo)電油墨固定到襯底上并形成導(dǎo)電層但不足以明顯降低酶活性的溫度下進(jìn)行一段時間。例如，水可混溶性導(dǎo)電油墨可以在約75℃下干燥約20分鐘。
實(shí)施例1制備根據(jù)本發(fā)明的一個例舉性實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其包括酶葡糖氧化酶、介體二茂鐵和可從市場上購買的導(dǎo)電物質(zhì)和粘合劑的組合物(可購自Coates的水溶性的石墨糊66756)。水可混溶性導(dǎo)電油墨按如下過程制備將50mg葡糖氧化酶溶解在0.7ml的高純水中。將獲得的溶液加入到5g水可混溶的石墨糊66756中，接著混入25mg已溶于1ml甲基卡必醇共溶劑中的二茂鐵。
將上述水可混溶性導(dǎo)電油墨的一部分涂敷到玻碳電極上，并在烘箱中于75℃干燥20分鐘以產(chǎn)生其上帶有導(dǎo)電層的玻碳電極。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到其上帶有導(dǎo)電層的該電極代表基于酶電化學(xué)的傳感器的一部分。
在含有攪拌緩沖葡萄糖溶液的燒杯中，在300mV的恒電勢下測試其上帶有導(dǎo)電層的電極。該測試采用了銀/氯化銀參比電極和鉑絲對電極。在燒杯中增加葡萄糖的濃度而觀察到電流響應(yīng)。電流測試進(jìn)行了超過12小時的一段時間，通過連續(xù)改變緩沖液和葡萄糖添加物。在延長的測試中，電流響應(yīng)降低。假設(shè)該降低是從導(dǎo)電層損失介體的結(jié)果。
實(shí)施例2通過圖7描述的自由基共聚反應(yīng)合成適用于根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨的親水性的高分子量氧化還原聚合物(即圖7的氧化還原聚合物700)，利用了在40ml二氧雜環(huán)己烷和乙醇的混合物(體積比為1∶1)中含有1.8g 97％丙烯酰胺(AAM)、0.3g 97％乙烯基二茂鐵(VFc)和0.03g 2.2`-偶氮二異丁腈(AIBN)的反應(yīng)溶液。反應(yīng)在圓底燒瓶中進(jìn)行。采用5摩爾百分比的乙烯基二茂鐵和95摩爾百分比的丙烯酰胺進(jìn)行反應(yīng)。
在開始反應(yīng)前，通過鼓氮?dú)馀?小時而將上述反應(yīng)溶液脫氧。隨后在油浴中將反應(yīng)液加熱到70℃，持續(xù)24小時，在氮?dú)夥罩羞B續(xù)進(jìn)行磁力攪拌。將獲得的聚合物沉淀濾出，并反復(fù)用丙酮清洗以提供純的聚合物沉淀物樣品。隨后將純化的樣品在烘箱中于50℃干燥。
隨后，通過相對于去離子水透析而將分子量相對較低的部分從干燥的純樣品中除去，利用了分子量截止為13Kg/mol的纖維素膜管。獲得的組合物為親水性的高分子量氧化還原聚合物(即圖7的氧化還原聚合物700)。
實(shí)施例3采用實(shí)施例2描述的氧化還原聚合物700制備根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨。制備過程包括將30mg葡糖氧化酶(得自AspergillusNiger)、160mg 5％的氧化還原聚合物700的水溶液、1ml高純水、3g水溶性的石墨糊(可從市場上購自Coates Screen，Sun Chemical的一個分公司，目錄號為66756))混合起來以形成均勻的水基分散體系。
將上述剛描述的水可混溶性導(dǎo)電油墨涂敷到基于酶電化學(xué)的傳感器的襯底上(即3.75毫米2的傳感器布線圖，帶有導(dǎo)電軌道和參比電極(絲網(wǎng)印刷的Ag/AgCl))。將涂敷的襯底于75℃下干燥20分鐘。接著將干燥的涂敷襯底放入流通池中，并連接到恒電位器。將300mV的電勢施加到工作電極上(由以上剛描述的水可混溶性導(dǎo)電油墨形成)，Pt絲插入池中以充當(dāng)對電極。
磷酸緩沖鹽水(PBS)，含有處于0-20mmol/L范圍的生理相關(guān)濃度的葡萄糖，以0.7ml/分鐘的速度流經(jīng)基于酶電化學(xué)的傳感器。產(chǎn)生的電流響應(yīng)正比于恰好在特定點(diǎn)流動的分析物中葡萄糖的濃度，如圖8A的數(shù)據(jù)所例示，并在超過20小時的期間內(nèi)保持穩(wěn)定。穩(wěn)定性進(jìn)一步由圖8B的數(shù)據(jù)例示，其描述了11小時的數(shù)據(jù)。
基于圖8A和8B的數(shù)據(jù)，該實(shí)施例的基于酶電化學(xué)的傳感器突出地適用于以連續(xù)操作的方式檢測葡萄糖的生理相關(guān)濃度。假定基于酶電化學(xué)的傳感器采用的水可混溶性導(dǎo)電油墨組合了固定的高分子量介體和固定酶的優(yōu)點(diǎn)，在酶、介體和導(dǎo)電物質(zhì)之間具有改進(jìn)的電化學(xué)聯(lián)系。
實(shí)施例4制備了與實(shí)施例3類似的水可混溶性導(dǎo)電油墨，但加入了流變學(xué)改性劑(即Cabosil LM 150親水性的熱解法二氧化硅)。加入流變學(xué)改性劑(即Cabosil LM150親水性的熱解法二氧化硅或Cabosil TS 610疏水性的熱解法二氧化硅)可以改善水可混溶性導(dǎo)電油墨對絲網(wǎng)印刷的適用性。
通過混合540mg來自Aspergillus Niger的葡糖氧化酶、8.14g 5％氧化還原聚合物700的水溶液、60g Coates 66756水可混溶的石墨糊和1.6g Cabosil LM150親水性的熱解法二氧化硅而制備水可混溶性導(dǎo)電油墨。將混合物在高剪切速率下(即2000rpm)混合5分鐘直到為均勻的高粘性糊。接著利用DEK248的絲網(wǎng)印刷機(jī)將高粘性糊通過篩網(wǎng)印刷到基于酶電化學(xué)的傳感器的襯底上并干燥以形成導(dǎo)電層。獲得的酶電化學(xué)傳感器基本上如圖5D所描述的。
隨后，結(jié)合微流控檢測系統(tǒng)檢測這樣形成的基于酶電化學(xué)的結(jié)構(gòu)。當(dāng)采用數(shù)個葡萄糖濃度檢測時，基于酶電化學(xué)的傳感器的響應(yīng)在超過10小時的期間內(nèi)是非常穩(wěn)定的，并且在300mV下線性達(dá)20mmol的葡萄糖濃度。
在進(jìn)一步的測試中，在磷酸鹽緩沖液中，多種濃度的葡萄糖以200nL/分鐘的速度流經(jīng)微流控檢測系統(tǒng)。電流響應(yīng)(如圖9的數(shù)據(jù)所示)正比于采用的葡萄糖濃度。圖9的數(shù)據(jù)表明可以在超過10小時的時間段內(nèi)進(jìn)行連續(xù)的穩(wěn)定測量，不需要重新校正或基線校正。
實(shí)施例5制備了實(shí)施例4描述的另一基于酶電化學(xué)的傳感器結(jié)構(gòu)和微流控檢測系統(tǒng)，并采用通過將新提取的人血漿和磷酸緩沖液以1∶2的比例混合而產(chǎn)生的分析物進(jìn)行測試，從而，獲得的流體在生理上與人的間質(zhì)性流體匹配。將葡萄糖添加物加入到該流體中以產(chǎn)生代表糖尿病患者中常見的生理葡萄糖范圍的一定范圍的樣品。
將獲得的樣品流體以300nL/分鐘的速度在5分鐘內(nèi)導(dǎo)入微流控檢測系統(tǒng)，期間，在基于酶電化學(xué)法傳感器結(jié)構(gòu)的工作電極和對電極之間施加0V的電勢。接下來是分析物停滯的10分鐘間隔。在分析物停滯不動的該10分鐘間隔內(nèi)，將300mV的電勢施加到工作電極上，并測定瞬時的電流響應(yīng)。該過程重復(fù)多次，每次用含有不同葡萄糖濃度的樣品液體。在每次測量周期內(nèi)產(chǎn)生的電流響應(yīng)描述在圖10中。
圖10的數(shù)據(jù)代表在超過20小時的時間段內(nèi)以10-15分鐘的間隔進(jìn)行的測量。圖10的數(shù)據(jù)表明可以通過在選定的時間進(jìn)行的電流測定或者通過在特定的測量時間對電流響應(yīng)積分或部分積分進(jìn)行的庫侖定量而從電流響應(yīng)中測定葡萄糖的濃度。例如，圖11的曲線代表對圖10所示的每個瞬時電流的庫侖積分，表明所加入的分析物的葡萄糖水平和進(jìn)行測量時的時間。圖12描述了一個從圖11的數(shù)據(jù)得出的校正曲線。圖13的數(shù)據(jù)表明當(dāng)以上述方式測試時，基于酶電化學(xué)的傳感器顯示出在超過20小時的期間內(nèi)具有穩(wěn)定性。
實(shí)施例6如實(shí)施例4所描述的水可混溶性導(dǎo)電油墨在測試前于5℃保持冷藏21天。當(dāng)進(jìn)行如實(shí)施例4所述的檢測時，與連續(xù)幾天進(jìn)行制造、印刷并檢測的水可混溶性導(dǎo)電油墨相比，采用已經(jīng)于5℃儲存21天的水可混溶性導(dǎo)電油墨在電流響應(yīng)上無顯著差別。
實(shí)施例7通過將83g Precisia LFW201-H水溶性導(dǎo)電物質(zhì)和粘合劑、8.7g 5％的氧化還原聚合物700(如上所述)的溶液和0.5g來自Aspergillus Niger的葡糖氧化酶混合而制備根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨。混合后，將獲得的水可混溶性導(dǎo)電油墨涂敷在(即施加到)印刷的碳電極上，如實(shí)施例4所述。當(dāng)暴露于10mM葡萄糖時，獲得的基于酶電化學(xué)的產(chǎn)生一個約10nA的信號。該信號保持1小時的測試持續(xù)時間，因而表明可操作性地固定水可混溶性導(dǎo)電油墨的各種組分。
實(shí)施例8將5g微粉末的Mw2300的具有異丙基苯封端的聚苯乙烯共馬來酸酐部分異辛基酯(得自Aldrich)溶解在20g 2-丁氧基乙醇中以形成聚合物樹脂糊而制備根據(jù)本發(fā)明的水可混溶性導(dǎo)電油墨。接著，將12g石墨粉(粒度為2微米，得自Aldrich)和2g碳黑(黑珍珠3700等級，得自Cabot Chemical company)與聚合物樹脂糊在三輥式研磨機(jī)上混合10分鐘。之后將10g獲得的混合物進(jìn)一步與0.5g N`N`二甲基乙醇胺(一種揮發(fā)性反離子，得自Aldrich)混合。接下來，加入3ml水以形成中間混合物。用no3 K-bar涂敷于聚酯襯底上的該中間混合物的一部分的電阻約為300歐姆/每平方。
將1.3g該中間混合物與0.56g 5％的氧化還原聚合物700的水溶液和30mg得自Aspergillus Niger的葡糖氧化酶混合以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨。
將水可混溶性導(dǎo)電油墨涂敷在碳電極上(如圖5A-5D所述)并在流動體系中以0.7ml/分鐘的速度進(jìn)行測試，含有葡萄糖的溶液以0.7ml/分鐘的速度進(jìn)行約5小時的一段時間。在測試期間，響應(yīng)于10mmol的葡萄糖溶液，獲得了80nA的電流。
實(shí)施例9通過將120mg葡萄糖脫氫酶-PQQ加合物(可從市場上購自Toyobo，高于500IU/mg)與6.1g 3.5％的氧化還原聚合物700的水溶液混合而制備根據(jù)本發(fā)明一個實(shí)施方案的水可混溶性導(dǎo)電油墨。將獲得的混合物加入到65g Coates66756水可混溶的石墨糊中。接著加入930mg Cabosil LM 150二氧化硅，并且將獲得的組合物用攪拌器在2000rpm下混合10分鐘。
將水可混溶性導(dǎo)電油墨印刷到3.75mm2帶有銀/氯化銀參比電極的電極布線圖上，并于75℃下干燥20分鐘以形成基于酶電化學(xué)的傳感器。將基于酶電化學(xué)的傳感器在流通池中于施加300mV的電勢下進(jìn)行測試，如實(shí)施例4所述，并利用了磷酸緩沖鹽水溶液中的葡萄糖，以0.7ml/分鐘的速度流動。獲得的電流響應(yīng)由圖14的數(shù)據(jù)來描述。在圖14描述的連續(xù)傳感器操作和測試中，電流響應(yīng)穩(wěn)定超過2.5小時。
應(yīng)當(dāng)理解，對本文描述的本發(fā)明實(shí)施例的各種替換可以用在本發(fā)明的實(shí)施中。意欲通過以下的權(quán)利要求書限定了本發(fā)明的范圍，并因此也涵蓋了這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等同物。
權(quán)利要求
1.一種用于基于酶電化學(xué)的傳感器的水可混溶性導(dǎo)電油墨，該水可混溶性導(dǎo)電油墨包括導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑，其中，所述導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑被配制成水可混溶性的水基分散體系，并且其中，所述粘合劑在干燥時變?yōu)樵诓僮魃喜蝗苡谒摹?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述導(dǎo)電物質(zhì)為細(xì)碎的導(dǎo)電顆粒材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述細(xì)碎的導(dǎo)電顆粒材料為碳黑材料、石墨材料、鉑顆粒材料、鍍鉑碳材料、金顆粒材料、鉑/鈀合金顆粒材料、鈀顆粒材料、釕顆粒材料或鈰顆粒材料中的至少之一。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述酶為葡萄糖氧化酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述葡萄糖氧化酶為葡糖氧化酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述葡萄糖氧化酶為吡咯并喹啉醌(PQQ)葡萄糖脫氫酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述介體為二茂鐵。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述介體為鐵氰化物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述介體為聚合物介體。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述粘合劑包括樹脂聚合物和反離子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述反離子為揮發(fā)性反離子。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述粘合劑包括樹脂聚合物和水可混溶性的有機(jī)共溶劑，當(dāng)干燥該水可混溶性導(dǎo)電油墨時，所述共溶劑從水可混溶性導(dǎo)電油墨中除去。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述水可混溶性的有機(jī)共溶劑為醇類、二醇醚類、甲基卡必醇、丁基卡必醇、乙二醇、乙二醇二乙酸酯、雙丙酮醇和磷酸三乙酯中的至少之一。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其還包括一種水可混溶性共溶劑。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述介體為四硫富瓦烯/四氰基醌二甲烷。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述粘合劑包括聚苯乙烯共馬來酐的共聚物、聚苯乙烯共馬來酐的水解共聚物、聚苯乙烯共馬來酐的部分水解共聚物、聚苯乙烯共馬來酐的部分酯化共聚物和通過磷酸與環(huán)氧樹脂反應(yīng)而獲得的磷酸官能團(tuán)的聚合物中的至少之一。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述粘合劑包括丙烯酸單體、甲基丙烯酸單體、衣康酸單體、馬來酸單體中的至少一種和甲基丙烯酸甲酯單體、苯乙烯單體、丙烯酸乙酯單體、丙烯酸異丙酯單體、丙烯酸丁酯單體、丙烯腈單體、甲基苯乙烯單體、苯甲酸乙烯酯單體、丙烯酰胺單體和甲基丙烯酸羥基甲酯單體中的至少一種的共聚物。
18.一種基于酶電化學(xué)的傳感器，包括襯底；以及由干燥的水可混溶性導(dǎo)電油墨形成的導(dǎo)電層，該水可混溶性導(dǎo)電油墨包括導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑，其中，所述水可混溶性導(dǎo)電油墨是水可混溶性的水基分散體系，并且所述粘合劑在干燥時變?yōu)樵诓僮魃喜蝗苡谒摹?br> 19.根據(jù)權(quán)利要求18的基于酶電化學(xué)的傳感器，其中，所述導(dǎo)電層具有的電導(dǎo)率小于約10kΩ。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的基于酶電化學(xué)的傳感器，其中，所述導(dǎo)電層具有的電導(dǎo)率小于約1kΩ。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的基于酶電化學(xué)的傳感器，其中，所述導(dǎo)電層的干燥粘合劑起透析膜的作用。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的基于酶電化學(xué)的傳感器，其中，所述襯底為工作電極。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的基于酶電化學(xué)的傳感器，其中，所述介體為聚合物介體。
24.根據(jù)權(quán)利要求18的基于酶電化學(xué)的傳感器，其中，所述導(dǎo)電層起基于酶電化學(xué)的傳感器的電極的作用。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的基于酶電化學(xué)的傳感器，其中，所述所述導(dǎo)電層起基于酶電化學(xué)的傳感器的工作電極的作用。
26.根據(jù)權(quán)利要求18的基于酶電化學(xué)的傳感器，其中，所述酶、介體和粘合劑基本上均勻地遍布整個導(dǎo)電層。
27.一種用于制造一部分基于酶電化學(xué)的傳感器的方法，該方法包括將水可混溶性導(dǎo)電油墨施加到基于酶電化學(xué)的傳感器的襯底上，其中，所述水可混溶性導(dǎo)電油墨包括導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑，其中，所述導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑被配制成水可混溶性的水基分散體系，并且所述粘合劑在干燥時變?yōu)樵诓僮魃喜蝗苡谒模灰约案稍锼龅乃苫烊苄詫?dǎo)電油墨以便在襯底上形成導(dǎo)電層，所述導(dǎo)電層含有在操作上不溶于水的粘合劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中，所述施加步驟是利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)而實(shí)現(xiàn)的。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中，所述干燥步驟是在約75℃的溫度下進(jìn)行約20分鐘而實(shí)現(xiàn)的。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中，所述干燥步驟將該水可混溶性導(dǎo)電油墨固定到襯底上，因而形成導(dǎo)電層。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中，所述施加步驟施加含有聚合物介體的水可混溶性導(dǎo)電油墨。
32.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中，所述干燥步驟形成導(dǎo)電層，其起所述基于酶電化學(xué)的傳感器的電極的作用。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中，所述干燥步驟形成導(dǎo)電層，其起所述酶電化學(xué)傳感器的工作電極的作用。
34.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中，所述施加步驟施加水可混溶性導(dǎo)電油墨，其中，所述酶為葡萄糖氧化酶。
35.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中，所述施加步驟施加一種制備成均勻分散體系的水可混溶性導(dǎo)電油墨。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中，所述干燥步驟形成導(dǎo)電層，其含有均勻分布的酶、介體和導(dǎo)電物質(zhì)。
37.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中，所述施加步驟施加含有導(dǎo)電物質(zhì)的水可混溶性導(dǎo)電油墨，該導(dǎo)電物質(zhì)包括細(xì)碎的導(dǎo)電顆粒，具有小于100微米的尺寸。
全文摘要
一種用于基于酶電化學(xué)的傳感器的水可混溶性導(dǎo)電油墨包括導(dǎo)電物質(zhì)、一種酶、介體和粘合劑。所述導(dǎo)電物質(zhì)、酶、介體和粘合劑被配制成一種水可混溶性的水基分散體系，并且所述粘合劑在干燥時變?yōu)樵诓僮魃喜蝗苡谒摹?br> 文檔編號G01N27/327GK1927958SQ20061015343
公開日2007年3月14日 申請日期2006年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月12日
發(fā)明者J·I·羅杰斯, 劉最芳, A·W·麥奈拉格, M·麥倫南, J·莫法特, G·利利, M·麥唐納 申請人:生命掃描蘇格蘭有限公司