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專利名稱：編碼前神經肽y原突變體,一種信號肽的突變體,的dna分子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一段編碼人前神經肽Y原(preproNPY)突變體的DNA序列、其突變信號肽或與前神經肽Y原的任何其它裂解產物相連的信號肽、以及在生物樣品中檢測上述DNA序列或肽的方法。另外，本發明也涉及用于診斷患者血清膽固醇或LDL膽固醇升高的體質的方法，以及對已診斷出具有血清膽固醇或LDL膽固醇升高體質的患者進行治療的方法。攜帶突變序列或正常序列的轉基因動物也包含在本發明的范圍內。
背景技術：
本文中所采用的用于闡明本發明背景的出版物和其它材料，特別是提供了與實踐相關的額外細節的案例，均作為參照結合于本文中。
神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)是一種含36個氨基酸的肽類激素，在中樞及外周神經系統中均大量表達。NPY在下丘腦調節的進食和能量消耗過程中起著重要作用。對試驗動物中樞施用NPY會顯著刺激進食，慢性灌輸可導致發展肥胖、高胰島素血癥以及胰島素抗性。關于NPY在人體肥胖或新陳代謝疾病中所起的作用則相對知之甚少。
神經肽Y(NPY)是一個肽家族的成員之一，它是一種神經遞質，在中樞及外周神經系統中均大量表達1，2。NPY涉及好幾種調節功能，包括進食3，4，5、焦慮6，7、腦下垂體激素釋放8，9，10、生熱11和胰島素釋放12。
在動物體內，NPY在下丘腦調節的能量平衡過程中起重要作用。中樞施用NPY后明顯刺激進食13。它也可以通過降低褐色脂肪組織的產熱來降低能量消耗，通過提高白色脂肪組織中脂蛋白脂肪酶的活性來幫助能量儲存14。慢性腦室內灌輸NPY會導致肥胖及胰島素抗性的發展13。禁食顯著增強了腦下垂體NPY的活性(重新喂食則使其活性降低)，而腦下垂體NPY神經則受外周激素(如胰島素和leptin*)的反饋調節14，15，16。因此，在肥胖fa/fa Zucker大鼠中，前NPY原mRNA和NPY在腦下垂體中的表達水平升高，該大鼠的leptin信號傳導減弱，原因是其leptin基因上有一個突變位點。對于人類，患厭食癥的患者腦脊髓液中NPY的濃度升高19，這與假定的NPY補償性激活機理是一致的。重要的是，厭食癥患者也表現出膽固醇水平的升高20，21。然而，文獻中卻沒有將NPY基因或上述的NPY與膽固醇代謝或血清膽固醇水平聯系起來的報道。
發明概述根據本發明的第一方面，本發明涉及一段含有編碼前神經肽Y原(prepro-neuropeptide Y，preproNPY)的核苷酸序列的DNA序列，其中上述前NPY原的信號肽部分中第7位上的亮氨酸被脯氨酸取代。
根據本發明的第二方面，本發明涉及一種對患者進行篩選以確定該患者是否攜帶突變的NPY基因的方法，包括以下步驟準備待篩選的患者的一份生物樣品；和提供一項檢測以確定生物樣品中ⅰ)正常的NPY基因或ⅱ)突變的NPY基因的存在。
根據本發明的第三方面，本發明涉及一種第7位上的亮氨酸被脯氨酸取代的信號肽，以及與前NPY原的任何其它裂解產物相連的上述信號肽。
根據本發明的第四方面，本發明涉及一種抗體，該抗體具有結合上述信號肽及與前NPY原的任何其它裂解產物相連的上述信號肽的能力，以及對生物樣品中的上述肽進行確定的免疫測定方法。
根據本發明的第五方面，本發明涉及一種診斷患者血清膽固醇或LDL膽固醇水平升高體質的方法，該方法包括確定該患者在人前NPY原的信號肽部分是否存在多態性，該多態性包括在上述前NPY原的信號肽部分中第7位上的亮氨酸被脯氨酸取代，該多肽性表現出具有血清膽固醇或LDL膽固醇水平升高體質。
根據本發明的第六方面，本發明涉及一種對被診斷具有血清膽固醇或LDL膽固醇升高體質的患者進行治療，以防止上述患者中血清膽固醇或LDL膽固醇水平升高的方法，包括給該患者施用有效劑量的一種能夠抵消突變的NPY基因的影響的藥劑。
根據本發明的第七方面，本發明涉及一種對被診斷具有血清膽固醇或LDL膽固醇升高體質的患者進行治療以防止上述患者中血清膽固醇或LDL膽固醇水平升高的方法，包括對該人進行特定的基因治療以修復其突變的NPY基因。
根據本發明的又一方面，本發明涉及一種轉基因動物，該動物攜帶有一段含有編碼前NPY原的核苷酸序列的DNA序列，其中上述前NPY原的信號肽部分中的第7位上的亮氨酸ⅰ)被脯氨酸取代，或ⅱ)沒有變化。
根據本發明的又一方面，本發明涉及一種攜帶一段DNA序列的轉基因動物，該DNA序列含有編碼其它正常小鼠NPY序列的核苷酸序列，或者該序列的一部分編碼成年小鼠NPY肽，但是其中編碼小鼠信號肽的核苷酸序列被編碼人的正常或突變信號肽的信號肽序列所取代。
根據本發明的又一方面，本發明涉及一種可表達突變的人NPY基因或其部分的細胞株。
附圖簡述

圖1a用圖解說明人NPY基因、前NPY原肽和成熟的NPY肽的分子結構圖1b顯示人NPY基因的核苷酸序列。大寫字母表示外顯子序列位于小寫字母的內含子序列中。基因文庫的新添編號列于圓括號內。箭頭表示在該位置上正常基因的T被C取代以形成突變基因。外顯子2中的下劃線序列是編碼28個氨基酸的信號肽的序列(外顯子1是序列標號第1號，外顯子2是序列標號第2號，外顯子3是序列標號第3號，外顯子4是序列標號第4號)，圖1c顯示人前NPY原mRNA的核苷酸序列(序列標號第5號，蛋白質序列在序列標號第6號中列出)。箭頭表示在該位置上正常mRNA的t被c取代以形成突變的mRNA，圖2顯示在肥胖患者中a)空腹時的血清中總體膽固醇，b)LDL-膽固醇，c)HDL-膽固醇及d)VLDL-膽固醇，其中實框表示前NPY原的信號肽上Leu/Leu 7純合的患者(數量=120)，虛框表示在前NPY原的信號肽上Leu 7/Pro 7雜合或Pro 7/Pro 7純合的患者(數量=21)，以及圖3顯示在正常患者中a)空腹時的血清膽總體膽固醇，b)LDL-膽固醇，c)HDL-膽固醇及d)VLDL-膽固醇，其中實框表示前NPY原的信號肽上Leu/Leu 7純合的患者(數量=56)，虛框表示在前NPY原的信號肽上Leu 7/Pro 7雜合或Pro 7/Pro 7純合的患者(數量=8)。
發明詳述本發明是本發明者調查能量代謝和肥胖的基因背景的研究計劃中的一部分。在本說明書中我們報道的是對在NPY基因的信號肽部分上的一種相當普遍的多態現象進行鑒定。令人吃驚的是，在正常體重和肥胖的非糖尿病患者中，發現這種7位亮氨酸改變為脯氨酸的多態現象與總體膽固醇以及LDL膽固醇水平的明顯升高相關，而不與能量代謝或肥胖相關。
DNA序列、突變的信號肽、或上述的與前NPY原的其它任何裂解產物相連的肽可被用于對患者進行篩選以確定該患者是否為突變NPY基因的攜帶者。
該鑒定的執行可以通過眾所周知的方法進行DNA分析，包括直接對正常和突變的NPY基因進行DNA序列測定，采用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)進行等位基因特異性擴增，以便對正常或突變的NPY序列進行檢測；或者也可以通過各種分子生物學的方法對正常或突變的NPY基因進行間接檢測，方法包括如PCR-單鏈構象多態性(single stranded conformation polymorphism，SSCP)方法或變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)。對正常或突變的NPY基因的鑒定也可以通過采用限制性片段長度多態性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)方法來進行，該方法尤其適于大量的樣品的基因型測定。
鑒定也可以在RNA水平上進行，通過采用各種方法分析RNA在組織水平的表達。可以設計等位基因特異性探針進行雜交。雜交的進行可以如通過Northern印跡、RNA酶保護測定(RNase protectionassay)或原位雜交的方法。源于正常或突變的NPY基因的RNA的分析可以通過首先將組織RNA轉換為cDNA，然后通過等位基因特異性PCR方法擴增cDNA。
可選擇的，測定可以通過免疫測定來進行，將樣品與一種抗體接觸，該抗體可以與信號肽或與前NPY原的其它任何裂解產物相連的的上述肽相結合。
抗體可以通過對抗正常或突變的前NPY原，或者更特異地，對抗NPY正常或突變的信號肽來產生。抗體的制備可以在實驗動物體內進行以獲得多克隆抗體，或者在體外采用細胞株進行以獲得單克隆抗體。
已被診斷出具有血清膽固醇或LDL膽固醇水平升高體質的患者，其治療可以通過對其施用有效劑量的可抵消突變NPY基因影響的試劑，來阻止該患者體內血清膽固醇或LDL膽固醇水平的升高。這種治療可以通過特定基因療法以修復突變的NPY序列；或者通過施用藥物療法，其目的是調節內源性NPY的合成、釋放或代謝；或者通過調節NPY的作用在NPY靶位點以特定的方式與特定的NPY受體蛋白相互作用。目前，已經克隆并定性出五種不同的NPY受體亞型(Y1-Y5受體)，也已經合成出與這些NPY受體特異性地相互作用的藥物分子。本發明中所描述的藥物療法并不僅僅局限于這些已經被命名的NPY受體或機理，也包括其他將被發現的NPY受體或相關機理。
突變的NPY序列對NPY基因功能的影響可以在轉基因動物中進行研究。轉基因動物的制備可以通過定向同源重組的方法。人正常及突變的NPY信號肽序列(或者是任意含有編碼前神經肽Y(preproNPY)原的核苷酸序列的DNA序列，或者是其部分編碼成年小鼠或人成熟NPY肽氨基酸序列，其中要么ⅰ)上述前NPY原的信號肽部分的第7位上的亮氨酸已被脯氨酸取代，或者ⅱ)上述前NPY原的信號肽部分的第7位上的亮氨酸保持不變)將被導入NPY基因序列以取代內源性的信號肽序列。在這些條件下，內源性NPY基因仍然正常發揮功能，但是前NPY原的合成受正常或突變的人NPY信號肽序列調控。這種轉基因模型可被用于以一種十分特殊的方式來研究突變的NPY基因在生理學上的重要性。它也提供了一種用于研究和篩選新的藥物分子的理想的臨床前模型，上述藥物分子是被設計用于改變突變NPY基因的影響。
在以下試驗中將更詳細地描述本發明。
試驗方法采用單鏈構象多態性(SSCP)分析的方法對芬蘭90名肥胖患者中NPY基因的編碼區進行篩選以確定可能存在的序列變體。通過限制型片段長度多態性(RFLP)的方法對141名肥胖、非糖尿病主體(研究Ⅰ)和64名正常體重的主體(研究Ⅱ)進行基因型的確定，之后分析這兩個獨立的研究人群中確定的亮氨酸7至脯氨酸的多態性和與肥胖相關的代謝參數之間的等位關聯。
用SSCP方法篩選NPY基因的研究主體在研究Ⅰ的人群中90名隨機選取的芬蘭肥胖者中取得的DNA樣品被用來進行NPY基因的篩選以得到外顯子序列的變體。
關聯和基因型頻率分析的研究主體研究Ⅰ在一項減肥研究(Uusitupa等，1996)中把具有正常的肝、腎和甲狀腺功能的141名肥胖個體(29名男性和112名女性)包括在NPY序列變體和顯型參數的關聯研究中。所有個體均沒有糖尿病、過度酗酒或吸煙(已知可影響基礎代謝率(basal metabolic rate，BMR)、膽固醇(除了一名個體在使用β阻斷劑*)或葡萄糖的代謝)的歷史。他們的平均±標準差(SD)年齡為43±8歲，平均身體質量指數(body mass index，BMI)為34.7，范圍28-43 kg/m2。所有顯型測量均在12小時空腹之后的早晨采用常規的方法進行。測量包括體重、身體質量指數、肥胖百分率*(percental fat)、呼吸商(respiratory quotient，RQ)、基礎代謝率、腰臀比(waist-to-hip ratio，WHR)以及空腹血清中的leptin*、葡萄糖、胰島素、膽固醇和三羧酸甘油酯的水平。研究Ⅰ個體的主要特性列于表1。分析方法在別處已有詳細描述22，23。在飲食日記中記錄每天對幾種營養物質(包括碳水化合物、蛋白質、脂肪和膽固醇)攝取量的詳細數據，這對所有肥胖個體都是有用的。
研究Ⅱ開始，隨機對照人群樣本(年齡45-64歲)的選取是在1979-1981年芬蘭Kuopio*地區的人口登記冊中通過使用隨機編碼表格*選取的，同時考慮了居住在農村和城市的人群分布。在開始聯系的183名個體中，最后招收了144名。對照個體中正常體重(BMI＜27kg/m2)的個體被選為加入本調查(研究Ⅱ)并被跟蹤調查了10年。總共檢查了64名(26名男性和38名女性)正常肝抗胰島素*(normoglycemic)、非糖尿病的健康芬蘭人。對照個體分別在1985-1986和1991-1992年的首次檢查之后的5年和10年再次接受檢查。研究Ⅱ人群在這些各自的時間點上的特性列于表2。原始記錄被Kuopio和Helsinki大學道德規范委員會(the Ethics Committees ofthe University of Kuopio and Helsinki)認可。研究Ⅱ人群以前已有詳細描述24。
PCR-SSCP分析人NPY基因分為四個外顯子，第一個含有不翻譯區，第二個外顯子編碼信號肽(氨基酸序列殘基1-28)以及成熟的NPY氨基酸殘基29-63，第三個外顯子編碼殘基64-90，第四個外顯子含有proNPY羧基端的七肽以及不翻譯的3’-區(圖1a)25。用于擴增NPY基因的四個外顯子區的PCR引物對以及相應的PCR退火溫度(Ta)如下第一對5’TTGGGGTGTGGGTGGCTC(序列編號第7號)以及5’CCTAGACAGACGGGTCGTAGCA(序列編號第8號)，Ta=65℃，第二對5’CCCGTCCGTTGAGCC TTCTG(序列編號第9號)以及5’CGGTCCCGCGGTCCC(序列編號第10號)，Ta=67℃，第三對5’AAAGACTTTTTTT TTTCCAG(序列編號第11號)，以及5’AATGTCCCCATCACAAG(序列編號第12號)，Ta=51℃，以及第四對5’CCTTACAT GCTTTGCTTCTTA(序列編號第13號)，以及5’GATTTTTCATTGAGGAGGAT(序列編號第14號)，Ta=51℃。PCR反應(共5μl)含有100ng基因組DNA(分離自全血或經過固定的淋巴母細胞系)，1.0mM dNTPs，30nM33P-dCTP，每種引物2.5mM，0.25U AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)。PCR條件的最優化可以通過使用PCR OptimizerTM(Invitrogen，San Diego，CA)。樣品的擴增通過使用基因擴增PCR系統(GeneAmp PCRsystem)9600(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)，30個循環，其中在94℃保持30秒，在最佳退火溫度保持30秒，在72℃保持30秒。接著進行延長步驟，在72℃保持7分鐘。把經過擴增的樣品與SSCP緩沖液(含95％甲酰胺，10mM NaOH，0.05％二甲苯藍以及0.05％溴酚藍，總體積25μg)相混合。上樣前，樣品在95℃變性5分鐘并冰谷5分鐘。把3μl混合物上到一MDETM凝膠(FMC，BioProducts，Rockland，MA)上。SSCP-凝膠電泳是在兩個不同的實施條件下進行的6％MDE凝膠，于+4℃；以及3％MDE凝膠，含10％甘油，于室溫。在5W衡壓下電泳20小時。干燥凝膠并通過將一Kodak BIOMAX MR底片在室溫下曝光24小時以進行放射自顯影。
序列測定把SSCP中的異常遷移條帶用Thermo Cycle SequenaseTM試劑盒(Amersham Life Science，Inc.Cleveland，OH)進行系列測定。
基因型確定用于研究Ⅰ和Ⅱ中主體的基因型確定的引物也是用于外顯子2PCR擴增的那些引物。外顯子2中T(1128)至C(1128)的替換產生一個Bsi E I(New England Biolabs，Inc.Beverly，MA)位點。
酶切通過2％瓊脂糖凝膠電泳進行分析。
空腹血清參數和人體測量血液葡萄糖的分析通過葡萄糖氧化酶的方法(GloxKabi Ab，Stockholm，瑞典)。血清胰島素的分析通過放射性免疫測定(antiserumM 8309Novo Industries，Copenhagen，丹麥)。本方法的變更系數為5.4％，靈敏度為2mU/l。確定從12小時空腹的樣本中取出的血清和脂蛋白中的脂類。脂蛋白的分離是通過超速離心在密度1.006處去掉VLDL，接著用葡聚糖硫酸鹽和氯化鎂沉淀漂浮在下部的部分26。酶法是用來確定整體血清中的膽固醇和三羧酸甘油酯、超速離心VLDL之后的上層部分以及沉淀LDL之后的上清。LDL是作為整體血清與VLDL和HDL的加和之間的區別。整體膽固醇、HDL膽固醇和三羧酸甘油酯的測定間變化分別為1.3％、0.95％和3.1％，試樣間變化分別為3.3％、1.9％和5.2％。免鞋測量站高的精確度*為0.5厘米。體重的測量是通過電子體重儀(model 707Seca.Hamburg，德國)，個體赤足、穿短褲。計算身體質量指數(BMI)(體重[千克]/身高[米2])。對于腰臀比，腰圍的測量是在腎臟水平位置、側部較低肋骨邊緣和髂骨頂部之間。臀圍的測量是在沿著*(trough*懷疑拼寫有誤*)公共骨合生的較大的轉子水平部位。靜止能量消耗的測量是通過間接的能量測定方法(Deltatrac，TM Datex，Helsinki，芬蘭)，該方法使用一種計算機跟蹤處理、用天棚遮蓋的氣體分析系統，每次測量之前用精確的氣體混合物校準該系統。該方法在以前已有詳細描述29。
統計分析對于Hardy-Weinberg平衡的基因型頻率貢獻的測定是通過X2分析。所有關于相關分析的計算均通過使用SPSS/WIN程序，版本6.0(SPSS，Chicago，IL)。兩組之間在顯型參數上的統計區別通過Student’s t*測試來評估。在研究Ⅰ中，基因型與顯型參數之間的多種比較沒有用到多樣測試的形式糾正。在研究Ⅱ中，我們有一條先驗假設，即多樣性與血清膽固醇水平相關，因此不采用其它的統計比較，只采用空腹血清中總體、LDL、HDL和VLDL膽固醇水平的比較。
結果SSCP篩選是基于探測胸腺嘧啶脫氧核糖(1128)是否被胞嘧啶取代以導致第7位(前NPY原信號肽部分的疏水殘基)上的亮氨酸到脯氨酸的氨基酸變化。對于正常體重和肥胖個體而言，亮氨酸7至脯氨酸多態性等位基因頻率均為0.08。與相應的具亮氨酸//亮氨酸7基因型個體的數值相比，具脯氨酸7等位基因的肥胖個體具有明顯較高的空腹血清中總體、LDL和VLDL膽固醇水平以及較低的HDL膽固醇水平。這些值分別為6.2±1.1比5.3±0.9毫摩爾/升(P=0.0001)，4.2±1.0比3.5±0.8毫摩爾/升(P=0.0003)，0.9±0.6比0.7±0.5毫摩爾/升(P=0.042)，1.1±0.3比1.2±0.3毫摩爾/升(P=0.041)。這些差別無法通過包括年齡、性別、吸煙、伴隨藥物或apoE顯型在內的混淆因素來解釋。在肥胖個體中，NPY基因中亮氨酸7至脯氨酸多態性與任何肥胖相關的參數均沒有關系，這些參數包括體重、BMI、腰臀比、脂肪質量、基礎代謝率或其它代謝參數，如空腹血漿中葡萄糖、胰島素、leptin*或三磷酸甘油酯的水平。在研究Ⅱ的正常體重個體中，確定了脯氨酸7等位基因與較高的血清總體膽固醇(P=0.035)和LDL-膽固醇(p=0.036)水平之間的顯著關聯。
NPY基因外顯子區域的SSCP篩選通過SSCP篩選包含全部NPY基因編碼區的各個外顯子的突變體。已確定的多態性有1)T(1128)至C(1128)，2)A(1258)至G(1258)，3)T(5671)至C(5671)，以及4)T(8233)至A(8233)。多態性的編號是根據Minth等，1996，其中多態性2和3已經有報道25。
基因型頻率所有等位基因頻率均處于Hardy-Weinberg平衡。已發現的T(1128)至C(1128)的多態性的基因頻率在肥胖個體(n=141)中為0.078，在正常體重對照的芬蘭人(n=64)中為0.077。這兩個人群中任何等位基因的貢獻均無區別。
相關分析研究Ⅰ脯氨酸7/脯氨酸7純合基因型僅在一例個體中發現，該個體被歸入雜合型人群中。脯氨酸7/亮氨酸7基因型個體(包括一例脯氨酸7/脯氨酸7基因型)與野生型亮氨酸7/亮氨酸7基因型個體之間的相關分析顯示出各種水平高度明顯的區別，這些區別有空腹血清中總體膽固醇6.2±1.1比5.3±0.9毫摩爾/升(P=0.0001)、LDL膽固醇4.2±1.0比3.5±0.8毫摩爾/升(P=0.0003)、和VLDL膽固醇0.9±0.6比0.7±0.5毫摩爾/升(P=0.042)以及HDL膽固醇1.1±0.3比1.2±0.3毫摩爾/升(P=0.041)(圖2)。當分別分析肥胖男性(總體膽固醇、LDL膽固醇、VLDL膽固醇和HDL膽固醇)和肥胖女性(總體膽固醇和LDL膽固醇膽固醇)時，這些區別仍然高度明顯。兩種基因型人群中，總體脂肪、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸或飲食規定的膽固醇的攝取量沒有區別。肥胖程度也不能解釋這些發現。在這兩個不同的人群中，apo脂蛋白E顯型的貢獻沒有區別(數據未顯示)。
研究Ⅱ一例個體為脯氨酸7/脯氨酸7純合型，將其并入雜合型分析。在正常體重個體中，每三次測量中均為具有脯氨酸7的個體空腹血清中總體和LDL膽固醇水平明顯高于亮氨酸7/亮氨酸7基因型的個體。空腹血清中總體膽固醇7.4±0.6比6.7±0.9毫摩爾/升(P=0.035)，LDL膽固醇5.2±0.6比4.5±0.9毫摩爾/升(P=0.036)。在VLDL膽固醇(0.8±0.5比0.7±0.4毫摩爾/升)或HDL膽固醇水平(1.3士0.4比1.5±0.3毫摩爾/升)中沒有明顯的統計差別(圖3)。
討論本研究提供了第一步證據，即在正常體重和非糖尿病肥胖個體中，NPY基因中7位亮氨酸改變為脯氨酸的多態性與臨床上不利的血清膽固醇和LDL膽固醇水平相關。這意味著NPY在調節人體膽固醇的代謝中具有以前沒有被認識到的功能，以及NPY是最強的遺傳因子之一，因而進一步被確定影響血清膽固醇的水平。
本研究主要觀察的是在芬蘭人中，NPY基因信號肽上已確定的7位亮氨酸改變為脯氨酸的多態性與血清中總體和LDL膽固醇水平的升高明顯相關。而且在肥胖人群中，也存在對于具有脯氨酸7等位基因的個體，其VLDL膽固醇明顯升高以及HDL膽固醇降低。主要的發現最初是在肥胖、非糖尿病個體中進行，接著在正常體重個體中重復。在芬蘭人群中，這種序列變體的等位基因頻率約為8％。這種觀察到的相關性無法用其它已知可影響膽固醇代謝的混淆因子來解釋，如年齡、肥胖度、性別、吸煙、藥品或apoE顯型。而且，將這種關聯歸于對于研究人群的統計錯誤也是極不可能的，因為他們均為本地的芬蘭人，具有十分相似的遺傳背景。因此，NPY基因7位亮氨酸改變為脯氨酸的多態性可以作為高血清總體膽固醇和LDL膽固醇水平的一項新的重要的遺傳標志。
7位亮氨酸改變為脯氨酸的多態性定位于前NPY原的信號肽部分。信號肽在成熟的NPY中被切去，在肽的合成及轉運至分泌囊泡的過程中，它對指導肽在內質網中的正確折疊和包裝起重要作用。通常信號肽含有一個疏水基元，前NPY原通常就是這樣。已知亮氨酸可以形成α-螺旋，然而脯氨酸常常會給主鏈中的α-螺旋部分引入斷裂或扭結。雖然我們沒有關于7位亮氨酸改變為脯氨酸的多態性是如何改變前NPY原合成的生化數據，有一點可以推測，即細胞內前NPY原的合成過程被減弱，這樣接著會引起NPY活性的改變。然而，為具體地說明這些機理需要進一步的研究。
血清中總體膽固醇和LDL膽固醇的平均水平分別為0.9和0.7毫摩爾/升，與具有亮氨酸7/亮氨酸7基因型的個體相比，具有脯氨酸7等位基因的肥胖和非肥胖芬蘭個體中含量較高。而且，在這些個體中還發現有較高的VLDL膽固醇和較低的HDL膽固醇的趨向。這種基因異常對血清膽固醇水平的影響比apoE 4等位基因的影響大，與通過對自由生活的芬蘭個體的膽固醇降低節食治療所得到的量級相等(14％)。
在這些代表著芬蘭人口8％的個體中，血清中總體膽固醇和LDL膽固醇升高的因素是什么呢？基于胃腸道大量受含NPY的神經調節的事實31，32，有一點可以推測，即NPY可能參與了飲食中膽固醇的吸收，具有脯氨酸7等位基因的個體中膽固醇吸收量可能有所加。這一點，在另一方面，可能會導致肝臟中B/E(LDL)受體活性的下調以及血清中LDL和其前體(如VLDL)的升高。由于在受影響的個體中VLDL或三羧酸甘油酯的水平沒有明顯異常，我們認為主要的缺陷不在VLDL的合成或代謝中。有趣的是，然而，中樞NPY可增加脂蛋白脂肪酶mRNA的表達以及增強利于白色脂肪的脂類儲存的酶活性。因此，不能完全排除脂蛋白脂肪酶活性的作用。然而，對于血清膽固醇水平升高最可能合理的解釋是LDL受體活性數量的降低，該受體已知可以調節血清中LDL的濃度，在較低程度上，也可調節IDL和VLDL顆粒的濃度。沒有發現象這種肥胖會改變7位亮氨酸改變為脯氨酸的多態性對血清脂類的影響，因為突變和正常個體之間脂類值的區別與肥胖和正常個體之間的區別類似。畢竟，需要注意的是，沒有試驗證據以支持以上所討論的任何機理，這些機理將這種特殊的NPY基因異常與膽固醇代謝聯系起來。
如以上所述，apoE-顯型4也已知與較高的血清中總體膽固醇和LDL膽固醇水平相關，以前這在我們的研究個體中已經有所報道22。apoE-顯型4在兩種NPY群體中平均分配，不會混淆NPY信號肽多態性與血清膽固醇水平差別之間的聯系。
在本研究這中，沒有發現已確定的NPY基因中7位亮氨酸改變為脯氨酸的多態性與任何肥胖相關的參數有聯系，例如體重、BMI、WHR、BMR或RQ。一致地，在正常體重的對照個體和肥胖、非糖尿病個體中，突變的等位基因的基因頻率相似。這項結果也與最近在法國人群中進行的研究相符，在該研究中，NPY基因的側翼標記物(flanking markers)與任何形式的肥胖均沒有聯系33。
本研究提供了第一步證據，即在非糖尿病正常體重和肥胖的個體中，NPY基因中7位亮氨酸改變為脯氨酸的多態性與臨床上不利的血清膽固醇和脂蛋白水平相關。這暗示著NPY在控制人體膽固醇代謝中可能具有以前尚未知曉的作用，而且它可能是最強的遺傳因子之一因而被確定*在遠端影響血清膽固醇的水平。此外，NPY的機理可為新藥的發展提供可能的目標。
值得推薦的是本發明中的方法可以結合在各種不同的具體實施方案形式中，在此僅公布了其中幾例。對于本領域的專家，很明顯也存在其它具體案例*與本發明的本質相符。因此，所描述的具體案例是說明性的，不能被認作具有限制性。
表1．根據NPY基因中存在或不存在亮氨酸(7)到脯氨酸(7)的突變對141名肥胖個體的人口統計和臨床特性。值為平均值(mean)±標準差(SD)。
*經調整適于非肥胖的質量和年齡。
**leptin水平從69名個體中獲得。
表2．在隨后的研究(1979-1981年之間)開始時，根據NPY基因中存在或不存在亮氨酸(7)到脯氨酸(7)的突變對64名正常體重的個體的人口統計和臨床特性。值為平均值(mean)±標準差(SD)。
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29.Karhunen L,Franssila-Kallunki A,Rissanen A,KervinenK,Kesaniemi YA,Uusitupa序列清單(1)總體信息(ⅰ)申請者Koulu,MarkkuKarvonen,MattiPesonen,UllamariUusitupa，Matti(ⅱ)發明題目編碼前神經肽Y原突變體，一種信號肽的突變體，的DNA分子及其應用(ⅲ)序列數目14(ⅳ)聯系地址(A)收件人Rothwell,Figg,Ernst & Kurz,P.C.
(B)街道555 13th Street NW,Suite 701-E(C)城市Washington(D)州D.C.(E)國家USA(F)郵編20304(ⅴ)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統PC-DOS／MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Version#1.30(ⅵ)本次申請數據(A)申請號US 08/994,946(B)歸檔日期19-DEC-1997(C)分類(ⅷ)代理商/代理人信息(A)名稱Ihnen，Jeffrey L.(B)注冊號28，957(C)參考/登記號碼2328-110(ⅸ)通訊信息(A)電話202-783-6040(B)電傳202-783-6031(2)序列標號1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度325堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型雙鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述序列標號1CCGCTTCTTC AGGCAGTGCC TGGGGCGGGA GGGTTGGGGT GTGGGTGGCT CCCTAAGTCG 60ACACTCGTGC GGCTGCGGTT CCAGCCCCCT CCCCCCGCCA CTCAGGGGCG GGAAGTGGCG 120GGTGGGAGTC ACCCAAGCGT GACTGCCCGA GGCCCCTCCT GCCGCGGCGA GGAAGCTCCA 180TAAAAGCCCT GTCGCGACCC GCTCTCTGCA CCCCATCCGC TGGCTCTCAC CCCTCGGAGA 240CGCTCGCCCG ACAGCATAGT ACTTGCCGCC CAGCCACGCC CGCGCGCCAG CCACCGTGAG 300TGCTACGACC CGTCTGTCTA GGGGT 325(2)序列標號2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度247堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型雙鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述序列標號2CCCGTCCGTT GAGCCTTCTG TGCCTGCAGA TGCTAGGTAA CAAGCGACTG GGGCTGTCCG 60GACTGACCCT CGCCCTGTCC CTGCTCGTGT GCCTGGGTGC GCTGGCCGAG GCGTACCCCT120CCAAGCCGGA CAACCCGGGC GAGGACGCAC CAGCGGAGGA CATGGCCAGA TACTACTCAG180CGCTGGGACA CTACATCAAC CTCATCACCA GGCAGAGGTG GGTGGGACCG CGGGACCGAT240TCCGGGA 247(2)序列標號3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度142堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型雙鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述序列標號3ACTTGCTTTA AAAGACTTTT TTTTTTCCAG ATATGGAAAA CGATCTAGCC CAGAGACACT 60GATTTCAGAC CTCTTGATGA GAGAAAGCAC AGAAAATGTT CCCAGAACTC GGTATGACAA 120GGCTTGTGAT GGGGACATTG TT 142(2)序列標號4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度300堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型雙鏈(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅹⅰ)序列描述序列標號4CCTTACATGC TTTGCTTCTT ATGTTTTACA GGCTTGAAGA CCCTGCAATG TGGTGATGGG60AAATGAGACT TGCTCTCTGG CCTTTTCCTA TTTTCAGCCC ATATTTCATC GTGTAAAACG 120AGAATCCACC CATCCTACCA ATGCATGCAG CCACTGTGCT GAATTCTGCA ATGTTTTCCT 180TTGTCATCAT TGTATATATG TGTGTTTAAA TAAAGTATCA TGCATTCAAA AGTGTATCCT 240CCTCAATGAA AAATCTATTA CAATAGTGAG GATTATTTTC GTTAAACTTA TTATTAACAA 300(2)序列標號5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度551堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型mRNA(ⅸ)特征(A)名稱/檢索表*sig_peptide(B)定位87..170(ⅸ)特征(A)名稱/檢索表*CDS(B)定位87..377(ⅸ)序列描述序列標號5ACCCCATCCG CTGGCTCTCA CCCCTCGGAG ACGCTCGCCC GACAGCATAG TACTTGCCGC 60CCAGCCACGC CCGCGCGCCA GCCACC ATG CTA GGT AAC AAG CGA CTG GGG CTG 113Met Leu Gly Asn Lys Arg Leu Gly Leu1 5TCC GGA CTG ACC CTC GCC CTG TCC CTG CTC GTG TGC CTG GGT GCG CTG 161Ser Gly Leu Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Cys Leu Gly Ala Leu10 15 20 25GCC GAG GCG TAC CCC TCC AAG CCG GAC AAC CCG GGC GAG GAC GCA CCA 209Ala Glu Ala Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro30 35 40GCG GAG GAC ATG GCC AGA TAC TAC TCG GCG CTG CGA CAC TAC ATC AAC 257Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn45 50 55CTC ATC ACC AGG CAG AGA TAT GGA AAA CGA TCC AGC CCA GAG ACA CTG 305Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr Gly Lys Arg Ser Ser Pro Glu Thr Leu60 65 70ATT TCA GAC CTC TTG ATG AGA GAA AGC ACA GAA AAT GTT CCC AGA ACT 353Ile Ser Asp Leu Leu Met Arg Glu Ser Thr Glu Asn Val Pro Arg Thr75 80 85CGG CTT GAA GAC CCT GCA ATG TGG TGATGGGAAA TGAGACTTGC TCTCTGGCCT 407Arg Leu Glu Asp Pro Ala Met Trp90 95TTTCCTATTT TCAGCCCATA TTTCATCGTG TAAAACGAGA ATCCACCCAT CCTACCAATG 467CATGCAGCCA CTGTGCTGAA TTCTGCAATG TTTTCCTTTG TCATCATTGT ATATATGTGT 527GTTTAAATAA AGTATCATGC ATTC551(2)序列標號6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度98氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述序列標號6Met Leu Gly Asn Lys Arg Leu Gly Leu Ser Gly Leu Thr Leu Ala Leu1 5 10 15Ser Leu Leu Val Cys Leu Gly Ala Leu Ala Glu Ala Tyr Pro Ser Lys20 25 30Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr35 40 45Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr50 55 60Gly Lys Arg Ser Ser Pro Glu Thr Leu Ile Ser Asp Leu Leu Met Arg65 70 75 80Glu Ser Thr Glu Asn Val Pro Arg Thr Arg Leu Glu Asp Pro Ala Met85 90 95Trp(2)序列標號7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度18堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=″引物″(ⅹⅰ)序列描述序列標號7TTGGGGTGTG GGTGGCTC(2)序列標號8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=″引物″(ⅹⅰ)序列描述序列標號8CCTAGACAGA CGGGTCGTAG CA(2)序列標號9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=″引物″(ⅹⅰ)序列描述序列標號9CCCGTCCGTT GAGCCTTCTG(2)序列標號10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度15堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=″引物″(ⅹⅰ)序列描述序列標號10CGGTCCCGCG GTCCC(2)序列標號11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=″引物″(ⅹⅰ)序列描述序列標號11AAAAGACTTT TTTTTTTCCA G(2)序列標號12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅰ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=″引物″(ⅹⅰ)序列描述序列標號12AATGTCCCCA TCACAAG(2)序列標號13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=″引物″(ⅹⅰ)序列描述序列標號13CCTTACATGC TTTGCTTCTT A(2)序列標號14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈的類型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/desc=″引物″(ⅹⅰ)序列描述序列標號14GATTTTTCAT TGAGGAGGAT
權利要求
1．DNA序列，包含編碼前神經肽Y原(preproNPY)的核苷酸序列，其中上述的前神經肽Y原中信號肽部分上的第7位的亮氨酸被脯氨酸所取代。
2．如權利要求1中所述的DNA序列，其中所包含的基因組核苷酸序列如圖1b所示。
3．如權利要求1中所述的DNA序列，其中上述DNA序列為cDNA。
4．含有與權利要求1中所述的DNA序列相應的RNA序列的一段RNA序列。
5．一種篩選某一個體以確定該個體是否為突變的NPY基因攜帶者的方法，包括的步驟為-準備待篩選的個體的一份生物樣品；和提供一項檢測以確定該生物樣品中ⅰ)正常NPY基因或ⅱ)突變NPY基因的存在。
6．如權利要求5中所述的方法，其中的檢測是任何一種利用如權利要求1中所述的DNA序列信息的檢測。
7．第7位上的亮氨酸被脯氨酸取代的信號肽。
8．含有與前NPY原的任何其它裂解產物相連的如權利要求7中所述的信號肽的肽。
9．具有結合如權利要求7中所述的信號肽能力的抗體。
10．具有結合如權利要求8中所述的肽能力的抗體。
11．確定如權利要求7或8中所定義的肽的免疫測定方法，其中生物樣品暴露于具有結合上述肽能力的抗體。
12．診斷一患者血清膽固醇或LDL膽固醇水平升高體質的方法，上述方法包括確定該患者在人前NPY原基因的信號肽部分是否具有多態性，上述多態性包括在上述前NPY原的信號肽部分中第7位上的亮氨酸被脯氨酸取代，上述多態性意味著具有血清膽固醇或LDL膽固醇水平升高的體質。
13．治療一患者的方法，診斷如權利要求12中所述的血清膽固醇或LDL膽固醇水平升高的體質，阻止該患者血清膽固醇或LDL膽固醇水平的升高包括對該患者施用有效劑量的可以抵消突變的NPY基因影響的藥劑。
14．如權利要求13中所述的方法，其中上述藥劑是一種目的為調節內源性NPY的合成、釋放或代謝的藥物，它或者通過調節NPY的作用在NPY靶位點以特定的方式與特定的NPY受體蛋白相互作用。
15．如權利要求13中所述的方法，其中上述試劑是一種目的為調節正常或突變的NPY基因的表達的藥物。
16．治療一患者的方法，診斷如權利要求12中所述的具有血清膽固醇或LDL膽固醇水平升高的體質，阻止該患者血清膽固醇或LDL膽固醇水平的升高包括對該患者進行特殊的基因治療，目的是修復突變的NPY序列。
17．攜帶有一段人DNA序列的轉基因動物，該序列包含編碼一種前神經肽Y原(preproNPY)或其部分的編碼成熟人NPY肽的核苷酸序列，其中上述前NPY原的信號肽部分中第7位上的亮氨酸被脯氨酸取代。
18．攜帶有一段人DNA序列的轉基因動物，該序列包含編碼一種前神經肽Y原(preproNPY)或其部分的編碼成熟人NPY肽的核苷酸序列，其中上述前NPY原的信號肽部分中第7位上的亮氨酸沒有變化。
19．攜帶有一段人DNA序列的轉基因動物，該序列包含編碼其它正常小鼠NPY序列或其部分的編碼成熟小鼠NPY肽的核苷酸序列，但其中編碼小鼠信號肽序列的核苷酸序列被人的編碼正常或突變的人信號肽的信號肽序列所取代。
20．表達突變的人NPY基因或其部分的一種細胞株。
全文摘要
本發明涉及一段DNA序列,該序列包含編碼前神經肽Y原(preproNPY)的核苷酸序列,其中上述的前神經肽Y原中信號肽部分上的第7位的亮氨酸被脯氨酸所取代。本發明進一步涉及到該種或與前神經肽Y原的任何其它裂解產物相連的信號肽突變體,以及在生物樣品中檢測上述DNA序列或肽的方法。另外,本發明還涉及對具血清膽固醇或LDL膽固醇水平升高體質的患者進行診斷以及對已被診斷為具體內血清膽固醇或LDL膽固醇升高體質的患者進行治療的方法。攜帶突變序列或正常序列的轉基因動物也包含在本發明的范圍內。
文檔編號G01N33/50GK1282338SQ98812379
公開日2001年1月31日 申請日期1998年12月16日 優先權日1997年12月19日
發明者M·庫魯, M·卡沃寧, U·佩索寧, M·烏斯圖帕 申請人:霍莫斯醫療有限公司