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專(zhuān)利名稱(chēng)：肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)及肌酐濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定肌酐濃度的方
法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
測(cè)定肌酐主要有化學(xué)測(cè)定法(Jaffe法)、酶法、高效液相層析法和毛細(xì)管電泳法 等。 化學(xué)測(cè)定法成本低廉，操作簡(jiǎn)便，是目前國(guó)內(nèi)測(cè)定肌酐最常用的方法之一。標(biāo)本中 的肌酐與苦味酸鹽作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物。此法的缺點(diǎn)是特異性不高，維生 素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高濃度葡萄糖、蛋白質(zhì)和一些抗生素如青霉素G、頭孢 西丁、頭孢唑啉等也能與堿性苦味酸反應(yīng)生成紅色。 高效液相層析法(HPLC)，肌酐在弱酸性環(huán)境中帶正電荷，通過(guò)陽(yáng)離子交換層析柱 可與其他成分很好分離，在234nm測(cè)定其光吸收。此法分析的精密度高、特異性好，但本法 不適于大批量臨床標(biāo)本分析，通常作為肌酐測(cè)定的參考方法，用于評(píng)價(jià)市售肌酐測(cè)定的試 劑盒和某些科研目的。檢索發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?0106198. 0、申請(qǐng)日為1990. 12. 18的中國(guó)專(zhuān)利 申請(qǐng)公開(kāi)了用高效液相色譜直接測(cè)定人尿中假尿嘧啶核苷(簡(jiǎn)稱(chēng)假尿苷)，再通過(guò)分光光 度法同時(shí)測(cè)出肌酐，分別用假尿苷和假尿苷/肌酐作為鼻咽癌和肺癌的標(biāo)志物。(這個(gè)專(zhuān)利 和我們的無(wú)關(guān)) 毛細(xì)管電泳法，血清標(biāo)本用高速離心作預(yù)處理，尿液標(biāo)本可用低速離心，除去有形 成分，上清液用膠束動(dòng)電毛細(xì)管電泳分離后測(cè)定235nm處吸光度。本法測(cè)定線(xiàn)性范圍寬，操
作較為簡(jiǎn)便，但需用特殊設(shè)備和進(jìn)行血清標(biāo)本的預(yù)處理，臨床常規(guī)使用困難。 酶學(xué)測(cè)定法主要有肌酐脫亞胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶
(Creatininase)兩大類(lèi)。 檢索發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?2139298. 6、申請(qǐng)日為2002. 11. 15的專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了應(yīng)用 酶反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶配制的測(cè)定試劑。該發(fā)明所指的酶法測(cè)定試劑并不加入測(cè) 定反應(yīng)所需的還原型煙酰胺輔酶或其類(lèi)似物，而加入其反應(yīng)產(chǎn)物氧化型煙酰胺輔酶或其類(lèi) 似物及其相應(yīng)的生成還原型輔酶所需的酶和底物系統(tǒng)，通過(guò)在試劑內(nèi)形成酶_底物-NAD 或酶_底物-NADP等慢反應(yīng)系統(tǒng)，將這類(lèi)氧化型輔酶或其類(lèi)似物緩慢循環(huán)還原為還原型煙 酰胺輔酶或其類(lèi)似物，當(dāng)被還原的還原型煙酰胺輔酶或其類(lèi)似物達(dá)到一定的濃度時(shí)，該發(fā) 明所指的酶法試劑就可達(dá)到測(cè)定樣本中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、尿素、 氨、肌酐和二氧化碳等的目的。該發(fā)明的特點(diǎn)在于為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門(mén)冬氨酸氨 基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二氧化碳試劑等的測(cè)試提供一個(gè)內(nèi)源合成 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑、尿素養(yǎng)試劑、氨試劑、肌酐試劑和二 氧化碳試劑等反應(yīng)所需要的底物-還原型煙酰胺輔酶。其缺點(diǎn)之一為，這個(gè)系統(tǒng)在生成反 應(yīng)所需要的還原型煙酰氨輔酶的同時(shí)，也抵消了部分丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門(mén)冬氨酸氨基 轉(zhuǎn)移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成試劑測(cè)試的準(zhǔn)確性大大降低。其缺點(diǎn)之二是，該試劑在正式測(cè)試前必須事先反應(yīng)一段時(shí)間，以便能夠產(chǎn)生足夠的還原型煙酰氨輔酶， 這樣一來(lái)就造成了緩不濟(jì)急的結(jié)果，給測(cè)試帶來(lái)很大的不便。 據(jù)申請(qǐng)?zhí)枮?2139298. 6、申請(qǐng)日為2002. 11. 15的專(zhuān)利介紹，該系統(tǒng)由于不斷生成 測(cè)定所需的NADH或NADPH，從而大大提高了試劑的穩(wěn)定性，并大大降低試劑的生產(chǎn)成本。其 實(shí)在試劑中加入NADH或NADra的穩(wěn)定劑已經(jīng)不是困難或增加成本的問(wèn)題，反而比在試劑中 增加一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)要經(jīng)濟(jì)得多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定肌酐濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn) 該方法的肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全 自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行肌酐濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推 廣應(yīng)用。 本發(fā)明肌酐濃度測(cè)定方法如下 肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨 氨+2水+6高鐵細(xì)胞色素c亞硝酸還原酶/Ca21亞硝酸+ 6亞鐵細(xì)胞色素c 亞硝酸+水+輔酶硝酸還原酶硝酸+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用肌酐脫亞胺酶(creatinine deaminase ;EC 3. 5. 4. 21)酶(偶) 聯(lián)亞石肖酸還原醇(nitrite reductase ;EC 1. 7. 2. 2)、石肖酸還原醇(nitrate reductase ; ECl. 7. 1. 1 ;EC 1. 7. 1. 2 ;EC 1. 7. 99. 4)酶促反應(yīng)比色終點(diǎn)法。肌酐脫亞胺酶酶解肌酐反應(yīng) 產(chǎn)生氨，再通過(guò)(偶)聯(lián)合亞硝酸還原酶、硝酸還原酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒(méi)有 吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm 處吸光度上升的程度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的程度，可以測(cè)算肌酐的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性?xún)煞矫婢C合考慮，無(wú)論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)較為理想緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L輔酶3mmol/L肌酐脫亞胺酶10000U/L亞硝酸還原酶12000U/L硝酸還原酶12000U/L高鐵細(xì)胞色素c12mmol/L氯化鈣5mmol/L本發(fā)明的肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
4直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶。 輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣在試劑l或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶。 輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定肌酐濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的肌酐診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3mmol/L
肌酐脫亞胺酶 10000U/L
亞硝酸還原酶 12000U/L
硝酸還原酶 12000U/L
高鐵細(xì)胞色素c 12mmol/L
氯化f丐 5mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)肌酐樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。
實(shí)施例二 本實(shí)施例的肌酐診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3,1/L
高鐵細(xì)胞色素c 12,1/L
氯化牽丐 5,1/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 肌酐脫亞胺酶 10000U/L 亞硝酸還原酶 12000U/L 硝酸還原酶 12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度《0. l，測(cè)
試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)肌酐樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，
反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的肌酐診斷/領(lǐng)lJ定試劑為三試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1,穩(wěn)定劑50mmol/L輔酶3mmol/L高鐵細(xì)胞色素c12mmol/L氯化鈣5mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1,穩(wěn)定劑500,1/L亞硝酸還原酶12000U/L硝酸還原酶12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100,1,穩(wěn)定劑500,1/L肌酐脫亞胺酶10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定肌酐濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度《0. 1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)肌酐樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類(lèi)同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0008 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線(xiàn)應(yīng)呈上升曲線(xiàn)直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線(xiàn)形范圍可達(dá)1. 5mmol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±4% ;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑的靈敏度可達(dá)O. 2±0. 1 AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線(xiàn)形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶比色法及酶聯(lián)法的肌酐的濃度測(cè)定方法，其方法如下肌酐+水肌酐脫亞胺酶N-甲基海因+氨氨+2水+6高鐵細(xì)胞色素c亞硝酸還原酶/Ca2+亞硝酸+6亞鐵細(xì)胞色素c亞硝酸+水+輔酶硝酸還原酶硝酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的程度，測(cè)算出肌酐的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種肌酐診斷 緩沖液 穩(wěn)定劑 輔酶肌酐脫亞胺酶 亞硝酸還原酶 硝酸還原酶 高鐵細(xì)胞色素c 氯化f丐 1-50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì) 反應(yīng)作用。鈣離子是亞硝酸還原酶的激活劑，因此氯化鈣可用其它鈣鹽取代。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣組成；試劑 2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶組成。輔酶、肌酐脫亞胺酶、 亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣組成；試劑 2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、肌酐脫亞 胺酶組成。輔酶、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣在試劑 1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的肌酐診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定肌酐濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、高鐵細(xì)胞色素c、氯化鈣、肌酐脫亞胺酶、亞硝酸還原酶、硝酸還原酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度，從而測(cè)算出肌酐的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101762499SQ200810235698
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司