胰臟檢查方法及胰臟檢查試劑盒的制作方法
【專利摘要】雖然是簡單的設備和步驟但以高靈敏度檢查胰疾病。提供通過免疫色譜法來測定從被檢體采集的胰液和／或包含胰液的體液中包含的S100P的濃度的胰臟檢查方法。此外，提供具備保持抗S100P抗體的免疫色譜裝置和收納抑制胰液中包含的蛋白水解酶的活性的蛋白水解酶抑制劑的采集容器的胰臟檢查試劑盒。
【專利說明】胰臟檢查方法及胰臟檢查試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及胰臟檢查方法及胰臟檢查試劑盒。
【背景技術】
[0002]以往，胰管內乳頭狀粘液性腫瘤(IPMN)作為胰癌的早期發現的線索受到注目。胰癌、IPMN的診斷通過內窺鏡檢查或活檢進行。但是，難以從內窺鏡圖像發現早期的胰癌、IPMN，在活檢中從胰臟采集組織的操作其本身是困難的。因此，通過這些方法得不到充分的檢查精度。
[0003]另一方面，已知在胰癌、IPMN中，屬于SlOO蛋白質家族之一的S100P以高的比例過量地表達(例如，參照非專利文獻1、2。)。
[0004]現有技術文獻
[0005]非專利文獻
[0006]非專利文獻1:Kenoki Ohuchida、另 9 名、“S100P Is an Early DevelopmentalMarker of Pancreatic Carcinogenesis，，、Clinical Cancer Research、2006 年 9 月 15 日、第 12 卷、第 18 號、pp.5411-5416
[0007]非專利文獻2:Mads Gronborg、另 8 名、“Comprehensive Proteomic Analysis ofHuman Pancreatic Juice，，、Journal of Proteome Research、2004 年 9 月 17 日、第 3 卷、第 5 號、pp.1042-1055
【發明內容】
[0008]發明要解決的問題
[0009]非專利文獻I中，從胰臟的組織或胰液中包含的胰細胞中提取RNA，由S100P基因的mRNA表達水平測定S100P的表達量。通過該方法能夠以高精度檢測胰癌及IPMN。然而，需要繁雜的多階段的工序，檢查中需要高額的費用和長的時間。非專利文獻2中，將胰液通過TOF - MS (飛行時間型質譜)進行解析來測定S100P的表達量，需要比較大規模的設備。即，能夠通過這些方法實施檢查的設施有限，此外，存在不適合通常的臨床檢查的不良情況。
[0010]本發明是鑒于上述的情況而進行的，目的在于提供雖然是簡單的設備和步驟但能夠以高靈敏度檢查胰疾病的胰臟檢查方法及胰臟檢查試劑盒。
[0011]用于解決問題的方案
[0012]為了達成上述目的，本發明提供以下的方案。
[0013]本發明的第I方式是一種胰臟檢查方法，其通過免疫色譜法測定從被檢體采集的胰液和/或包含胰液的體液中包含的S100P的濃度。
[0014]根據本發明的第I方式，從被檢體內采集的胰液和/或包含胰液的體液中包含的S100P的濃度由于在存在包括胰臟腫瘤、IPMN、慢性胰腺炎的胰疾病的情況下以高的概率上升，所以能夠由測定的S100P的濃度的值以高靈敏度檢查胰疾病的有無。這種情況下，在SlOOP的濃度的測定中，通過使用操作簡便且不需要特殊設備的免疫色譜法，雖然是簡單的設備和步驟但能夠以高靈敏度檢查胰疾病。
[0015]在上述第I方式中，上述胰液也可以是從胰管內采集的胰液。
[0016]通過這樣操作，通過使用純度高的胰液，能夠更準確地測定在被檢體內表達的S100P的濃度。
[0017]在上述第I方式中，上述包含胰液的體液也可以是從十二指腸內采集的體液，該體液也可以是十二指腸液。
[0018]在十二指腸內，能夠在與膽汁或十二指腸的分泌液混合的狀態下以十二指腸液形式采集胰液。通過這樣操作，能夠降低采集胰液時的對被檢體的侵襲。
[0019]在上述第I方式中，上述胰液和/或包含胰液的體液也可以是在不進行胰液分泌促進劑的使用等積極的排出刺激的情況下、生理性分泌的胰液和/或包含該胰液的體液。
[0020]通過這樣操作，能夠減輕伴隨檢查而產生的對被檢體的負擔。
[0021]在上述第I方式中，上述胰液和/或包含胰液的體液也可以是通過胰液分泌促進劑的投與而分泌的胰液和/或包含該胰液的體液。
[0022]通過這樣操作，能夠將充分量的胰液和/或包含胰液的體液用于檢查。
[0023]在上述第I方式中，也可以使用采集到采集容器中的上述胰液和/或包含胰液的體液，所述采集容器收納有抑制上述胰液中包含的蛋白水解酶(蛋白酶)的活性的蛋白酶抑制劑。
[0024]通過這樣操作，能夠防止在采集及檢查的過程中S100P被胰液中包含的蛋白水解酶分解，提高檢查精度。
[0025]本發明的第2方式是一種胰臟檢查試劑盒，其具備保持2種抗S100P抗體的免疫色譜裝置，所述2種抗S100P抗體為通過標記物質標記被檢物質的第I抗體、及吸附與該第I抗體形成復合物的所述被檢物質的第2抗體，所述2種抗S100P抗體識別S100P的彼此不同的表位。
[0026]在上述第2方式中，也可以進一步具備收納有抑制胰液中包含的蛋白酶的活性的蛋白酶抑制劑的采集容器。
[0027]發明的效果
[0028]根據本發明，發揮雖然是簡單的設備和步驟但能夠以高靈敏度檢查胰疾病的效果O
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1是本發明的一實施方式所述的胰臟檢查試劑盒所具備的采集容器的整體構成圖。
[0030]圖2A是表示本發明的一實施方式所述的胰臟檢查試劑盒所具備的免疫色譜裝置的內部構成的圖。
[0031]圖2B是表示圖2A的免疫色譜裝置的外觀的圖。
[0032]圖3是對圖1的采集容器的使用方法進行說明的圖。
[0033]圖4是表示圖1的采集容器的變形例的圖。
[0034]圖5是表示圖1的采集容器的又一個變形例的圖。[0035]圖6是表示在實施例1中測定胰液、十二指腸液中的S100P濃度的結果的圖表。
[0036]圖7是表示在實施例1中測定純胰液中的S100P濃度的結果的圖表。
[0037]圖8是表示在實施例3中對5種胰疾病測定胰液、十二指腸液中的S100P濃度的結果的圖表。
【具體實施方式】
[0038]以下，對本發明的一實施方式所述的胰臟檢查試劑盒及使用該胰臟檢查試劑盒的胰臟檢查方法參照圖1至圖5進行說明。
[0039]本實施方式所述的胰臟檢查試劑盒具備如圖1所示那樣在注射器的外筒2內收納蛋白酶抑制劑A而成的采集容器1、和如圖2A及圖2B所示那樣保持抗S100P抗體的免疫色譜裝置20。
[0040]采集容器I的注射器具備外筒2、劃分該外筒2的內部空間且在外筒2內能夠滑動地設置的墊圈3和推拉該墊圈3的柱塞4。蛋白酶抑制劑A配置在通過墊圈3劃分為抽吸口 2a側的空間內。抽吸口 2a通過帽蓋5等被密封。
[0041]蛋白酶抑制劑A使用在以水作為主成分的胰液和/或包含胰液的體液中容易溶解的水溶性的物質。作為蛋白酶抑制劑A，適宜使用例如作為磺酰基系化合物的苯基甲基磺酰氟(PMSF)、脒苯基甲磺酰氟(APMSF)、4 一 (2 一氨乙基)一苯磺酰氟(AEBSF)、作為甲苯磺酸基系化合物的I 一氯一 3 —甲苯橫酸基氨一 7 —氨基一 2 —庚酮鹽酸鹽(TLCK一 HCL)、或作為肽系的抑制劑的抑肽酶、亮肽素等。這些蛋白酶抑制劑A主要是不可逆地抑制絲氨酸蛋白酶的物質，強力地抑制胰液中較多地包含的蛋白酶即淀粉酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶
坐寸ο
[0042]蛋白酶抑制劑A可以是僅I種收納在外筒2內，也可以是2種以上收納在外筒2內。此外，蛋白酶抑制劑A也可以與抑制脂肪酶等其它消化酶的活性的抑制劑一起被收納。
[0043]蛋白酶抑制劑A是經冷凍干燥的粉體。由此，蛋白酶抑制劑A更容易溶解到胰液和/或包含胰液的體液中。
[0044]通過采集容器I采集的被檢液的采集量根據采集容器I的內容量、或根據檢查所需的被檢液的量預先設定為規定量。收納在外筒2內的蛋白酶抑制劑A的重量按照溶解到應當采集的規定量的被檢液中時蛋白酶抑制劑A的濃度達到所期望的數值的方式來決定。
[0045]免疫色譜裝置20如圖2A所示的那樣具備展開被檢液的載體21、分別配置在載體21的兩端的樣品墊22及吸收墊23。
[0046]載體21只要是能夠展開被檢液的物質即可，適宜使用例如硝基纖維素制的膜濾器等。載體21上設置有保持有第I抗體的帶狀的標記區域21a、在從該標記區域21a空出間隔的位置固相化有第2抗體的帶狀的吸附區域21b。第I抗體及第2抗體是識別S100P的彼此不同的表位的抗S100P抗體。
[0047]第I抗體通過呈現規定顏色的物質、例如金膠體或鉬膠體等金屬膠體、或由彩色的聚苯乙烯膠乳等合成膠乳或天然橡膠膠乳等構成的膠乳膠體(標記物質)被標記。
[0048]標記第I抗體的標記物質也可以是酶或放射性物質等。
[0049]樣品墊22由吸水性優異的材料、例如由多孔質聚乙烯或多孔質聚丙烯等多孔質合成樹脂形成的片材或薄膜、或濾紙、棉布等纖維素制的紙、織布或無紡布等構成。[0050]吸收墊23由能夠迅速地吸收并保持液體的材質、例如棉布、濾紙、由聚乙烯或聚丙烯等形成的多孔質塑料無紡布等構成。
[0051]這些載體21、樣品墊22及吸收墊23如圖2B所示的那樣，通過塑料制的盒子24進行包裝。盒子24中，滴加窗24a在與樣品墊22對應的位置開口，觀察窗24b在與吸附區域21b對應的位置開口。
[0052]使用這樣構成的免疫色譜裝置20時，操作者從滴加窗24a向樣品墊22上滴加被檢液。所滴加的被檢液通過從樣品墊22向著吸收墊23在載體21上移動而展開。在展開的途中，被檢液中包含的S100P在標記區域21a中與第I抗體結合而形成復合物。之后，該復合物在吸附區域21b中通過與第2抗體結合而吸附到吸附區域21b上。然后，通過復合物在吸附區域21b中集聚，從而吸附區域21b呈現出規定的顏色。因此，操作者能夠由觀察窗24b內是否出現規定顏色的條帶、或條帶的顏色的濃淡來測定S100P的有無或濃度。
[0053]接著，對使用了這樣構成的胰臟檢查試劑盒的胰臟檢查方法進行說明。
[0054]本實施方式所述的胰臟檢查方法如下進行:從被檢體的十二指腸內將包含胰液的十二指腸液采集到采集容器內，使用免疫色譜裝置20測定所采集的包含胰液的十二指腸液中的S100P的濃度。十二指腸液的采集方法及采集容器并不限定于例示的導管及注射器，只要能夠采集胰液和/或包含胰液的體液即可。
[0055]具體而言，首先，介由插入十二指腸內的內窺鏡的管道將導管配置在十二指腸內的乳頭部附近，如圖3所示的那樣，將導管6的基端連接到外筒2的抽吸口 2a上，拉緊柱塞
4。由此，能夠將由乳頭部分泌到十二指腸內的胰液與膽汁、十二指腸分泌液一起以十二指腸液形式抽吸并采集到外筒2內。
[0056]在抽吸十二指腸液前，也可以進行促進胰臟中的胰液的分泌及胰液由乳頭部向十二指腸內的排出的處理、例如分泌素等胰液分泌促進劑的向被檢體內的投與。此外，也可以不進行這樣的處理而采集 在生理性條件下排出到十二指腸內的胰液和/或包含該胰液的十二指腸液。
[0057]在外筒2內采集胰液與膽汁、十二指腸分泌液的混合液(以下，稱為胰液.十二指腸液。)至規定量后，從抽吸口 2a卸下導管6，將外筒內2的胰液.十二指腸液由抽吸口 2a滴加到免疫色譜裝置20的滴加窗24a中。之后，例如等待5分鐘到15分鐘，直到胰液?十二指腸液充分地在載體21上展開。通過以上的步驟，能夠以觀察窗24b內有無條帶出現的形式檢查胰液.十二指腸液中的S100P的有無、即胰癌或IPMN等胰疾病的有無。另外，也可以在胰臟檢查試劑盒中附帶包含緩沖液等的稀釋液，通過該稀釋液將胰液.十二指腸液稀釋后滴加到滴加窗24a中。
[0058]在觀察窗24b內觀察到條帶時，通過以目視或免疫色譜用的讀取器測定條帶的呈色的濃淡來測定S100P的濃度。也可以通過以由健康的人的胰液?十二指腸液預先得到的條帶的呈色的濃淡作為基準值，并將該基準值與測定的條帶的呈色的濃淡進行比較來判定被檢體的胰疾病的有無。此時，基準值的設定根據使用從胰管內采集的純胰液和胰液?十二指腸液中的哪個而不同，此外，也根據采集量或采集所需的時間、是否使用胰液分泌促進劑而不同。因此，需要在各種條件下采集作為被檢液的胰液和/或包含胰液的體液時的基準值。
[0059]這種情況下，根據本實施方式，在胰液和/或包含胰液的體液中包含的S100P的濃度與胰疾病的有無之間存在高的相關性，在存在胰疾病的情況下，胰液和/或包含胰液的體液中的SlOOP的濃度以高的比例上升。因此，能夠以高的靈敏度檢查胰疾病的有無。
[0060]進而，胰液.十二指腸液從導管6流入外筒2內后在外筒2內迅速地與蛋白酶抑制劑A混合。由此，由于胰液?十二指腸液中包含的S100P的分解迅速地被抑制，所以能夠測定準確的S100P的濃度，能夠進一步提高檢查靈敏度。特別是由于胰液與其它的消化液相比蛋白酶的活性高，所以通過按照采集到外筒2內的胰液.十二指腸液中的蛋白酶抑制劑A的濃度充分地變高的方式設定蛋白酶抑制劑A的收納量，能夠有效地提高檢查精度。
[0061]此外，通過以十二指腸液的形式采集排出到十二指腸中的胰液并用于檢查，與在胰管內插入導管6來采集胰管內的純胰液的情況相比能夠降低侵襲同時簡便地采集胰液。此外，由于免疫色譜裝置20的操作不需要特殊的設備、長的時間，所以即使是例如規模比較小的經常就診的醫院等也能夠廉價地且以短時間實施高靈敏度的檢查。
[0062]另外，在本實施方式中，將由乳頭部排出到十二指腸內并與膽汁、十二指腸分泌液混合的胰液用于檢查，但也可以將從胰管內采集的純胰液用于檢查來代替上述方式。純胰液可以通過邊造影邊將導管從乳頭部插入胰管內進行抽吸、或將氣囊導管或軟管在胰管內留置一定時間來采集。
[0063]通過這樣操作，由于從胰管內采集的純胰液不會被十二指腸液稀釋，所以能夠測定被檢體內的更準確的S100P的濃度。
[0064]此外，在本實施方式中，作為蛋白酶抑制劑A，使用經冷凍干燥的粉體物質，但也可以使用溶解到緩沖液等中的液體物質來代替該粉體物質。通過這樣操作，即使胰液.十二指腸液的采集量為少量，也能夠使蛋白酶抑制劑A容易地均一地與胰液?十二指腸液混合。
[0065]此外，在本實施方式中，例示出使用注射器作為采集容器I的構成，但采集容器I的構成并不限定于此，只要是介由所連接的導管內能夠抽吸胰液和/或包含胰液的體液、且收納與胰液和/或包含胰液的體液接觸而抑制胰液中包含的蛋白酶的活性的蛋白酶抑制劑的構成即可。例如，作為采集容器1，可以使用如圖4所示那樣捕集器(trap)型的容器，也可以使用如圖5所示那樣內部為真空狀態的容器。
[0066]此外，采集容器只要是能夠使采集到的胰液和/或包含胰液的體液與預先收納在容器內的蛋白酶抑制劑A迅速地接觸的構成即可，也可以采用圖1、圖4及圖5中例示的采集容器I以外的采集容器。此外，也可以是通過所例示的導管以外的采集手段如抽吸、吸收、回收等采集胰液和/或包含胰液的體液的構成。采集容器的構成可以根據采集方法來選擇。
[0067]圖4所示的采集容器I具備與導管6連接的抽吸口 2a、和與連接在排氣泵等上的軟管7連接的排氣口 2b，通過從排氣口 2b進行排氣，從抽吸口 2b流入胰液?十二指腸液并貯存。
[0068]圖5所示的采集容器I利用例如由橡膠等彈性構件構成的塞8來堵塞開口，通過使與導管6連接的中空針9貫穿塞8，從而將胰液.十二指腸液抽吸到內部。
[0069]即使這樣操作，也能夠在采集后迅速地抑制胰液和/或包含胰液的體液中包含的蛋白酶的活性，提高所采集的胰液中包含的S100P的檢查精度。
[0070]這里，在以往的體液的采集容器的情況下，由于在導管的基端連接采集容器邊貯存邊抽吸胰液和/或包含胰液的體液，在抽吸結束后分注胰液和/或包含胰液的體液并添加蛋白酶抑制劑，所以在抽吸的過程中在采集容器內也發生蛋白質的分解，存在難以由所采集的胰液和/或包含胰液的體液得到準確的檢查結果的問題。
[0071]與此相對，根據本實施方式所述的采集容器I，通過迅速地抑制所采集的胰液和/或包含胰液的體液中包含的蛋白酶的活性，不僅對于S100P，對于胰液和/或包含胰液的體液中包含的其它蛋白質也能夠提高檢測精度，也能夠有效地用于以其它蛋白質作為標志物的胰臟檢查。
[0072]此外，在本實施方式中，通過免疫色譜法來測定S100P的濃度，但只要是使用固相化的抗體能夠簡便地測定的方法，也可以使用其它的測定方法。也可以使用例如小型的表面等離子共振裝置(SPR)或微流控(Micro Fluidics)等進行測定。
[0073]實施例
[0074]接著，對上述的實施方式所述的胰臟檢查方法的實施例進行說明。
[0075]〔實施例1〕
[0076]對本發明所述的胰臟檢查方法的檢查靈敏度通過以下的實驗進行評價。
[0077]作為被檢體，從31人的胰癌患者組及7人的IPMN患者組通過導管抽吸采集作為被檢液的膜液及包含膜液的體液。將從患者米集的被檢液在米集后迅速地冷凍保存后，使用CycLex C0.，Ltd.制的ELISA試劑盒測定各被檢液中包含的S100P的濃度。作為對照組，對6人的良性的胰腺囊腫患者(MCN、SCN)也通過同樣的方法進行被檢液的采集及測定。各患者的疾病已通過病理診斷進行診斷。
[0078]作為被檢液，使用從胰管內采集的純胰液及胰液.十二指腸液。對于胰液.十二指腸液，使用包含生理性分泌及排出的胰液(以下，稱為胰液.十二指腸液(一)。)的十二指腸液及利用投與分泌素促進胰液分泌后采集的十二指腸液(以下，稱為胰液.十二指腸液(+)。)。進而，對于胰液?十二指腸液(一)、(+)，測定使用收納有蛋白酶抑制劑的采集容器(抑制劑(十))及空的采集容器(抑制劑(一))采集的被檢液。將其測定結果示于圖6及圖7中。
[0079]在圖6及圖7中，橫軸表示患者的癥例，縱軸表示純胰液中或十二指腸液中的S100P的濃度。各點表示在上述條件下從各患者采集的胰液或十二指腸液中的S100P的濃度。
[0080]接著，以由對照組得到的S100P的濃度的最高值作為截止值，在由胰癌患者及IPMN患者得到的S100P的濃度超過截止值的情況下，判定該患者在胰癌或IPMN的檢查中為陽性。然后，在各檢查條件下，相對于31人的胰癌患者組及7人的IPMN患者組中正常地完成檢查的患者的合計，算出判定為陽性的患者的比例作為陽性率。將其結果示于表I中。在上述的條件下無法正常地采集被檢液的數據從表1、圖6及圖7所示的統計中除外。
[0081][表 I]
【權利要求】
1.一種胰臟檢查方法，其通過免疫色譜法測定從被檢體采集的胰液和/或包含胰液的體液中包含的SlOOP的濃度。
2.根據權利要求1所述的胰臟檢查方法，其中，所述胰液為從胰管內采集的胰液。
3.根據權利要求1所述的胰臟檢查方法，其中，所述包含胰液的體液為從十二指腸內采集的體液。
4.根據權利要求3所述的胰臟檢查方法，其中，所述包含胰液的體液為十二指腸液。
5.根據權利要求1到權利要求4中任一項所述的胰臟檢查方法，其中，所述胰液和/或包含胰液的體液為生理性分泌的胰液和/或包含該胰液的體液。
6.根據權利要求1到權利要求4中任一項所述的胰臟檢查方法，其中，所述胰液和/或包含胰液的體液為通過胰液分泌促進劑的投與而分泌的胰液和/或包含該胰液的體液。
7.根據權利要求1到權利要求6中任一項所述的胰臟檢查方法，其中，使用采集到采集容器中的所述胰液和/或包含胰液的體液，所述采集容器收納有抑制所述胰液中包含的蛋白水解酶的活性的蛋白水解酶抑制劑。
8.—種胰臟檢查試劑盒，其具備保持2種抗S100P抗體的免疫色譜裝置，所述2種抗S100P抗體為通過標記物質標記被檢物質的第I抗體、及吸附與該第I抗體形成復合物的所述被檢物質的第2抗體，所述2種抗S100P抗體識別S100P的彼此不同的表位。
9.根據權利要求8所述的胰臟檢查試劑盒，其進一步具備收納有抑制胰液中包含的蛋白水解酶的活性的蛋白水解酶抑制劑的采集容器。
【文檔編號】G01N33/53GK103460045SQ201280015866
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年4月4日 優先權日:2011年4月5日
【發明者】佐貫博美, 片岡理惠, 守屋奈緒 申請人:奧林巴斯株式會社
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