專利名稱：對乙酰氨基酚、雷尼替丁、士的寧和地那銨的人t2r受體和鑒定人苦味調節劑的相關測定方法
技術領域：
本發明涉及對活化許多以前報導的涉及苦味感覺的T2R家族中的 人G-蛋白偶聯受體(GPCR)的闡明。具體地，本發明涉及如下發現 hT2R8、hT2R54和hT2R75對苦味配體雷尼替丁作出特異性反應；hT2R54 對可在某些使用者中引起苦味余味的非類固醇抗炎藥對乙酰氨基酚作 出特異性反應；hT2R8、 hT2R10、 hT2R13、 hT2R54、 hT2R61和hT2R75 對苦味配體苯甲酸地那銨作出特異性反應；和hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hT2R54和hT2R75對苦味毒素士的寧作出特異性反應。
基于這些發現，這些人味覺感受器、其片段或變體或嵌合體，包 括直向同源物、剪接變體、單核苷酸多態性(SNPS)及其遺傳工程突變 體可用于測定法，優選基于高流通量細胞.的測定法，這些測定法用于 鑒定調節(優選阻斷)士的寧、對乙酰氨基酚、雷尼替丁和地那銨以及 結構相關化合物和活化這些感受器的其它化合物的苦味的化合物。使 用這些測定方法鑒定的化合物可以用作食品、飲料或藥物產品的添加 劑以便改善其味道。相關領域的描述
人可以識別的基本味道之一是苦味。到目前為止，對苦味的生理
學了解得非常不夠。目前的研究已經開始闡明味覺生物學(Lindemann， Nature (2001))。目前認為許多苦味化合物通過與細胞表面受體發生 相互作用產生苦味。這些受體屬于與胞內G蛋白發生相互作用的七個 跨膜區受體的家族。
在本發明之前約5年，在人或嚙齒動物中鑒定了新的GPCR家族， 稱作T2R(Adler等，Cell 100 (6): 693-702 (2000); Chandrashekar 等，Cell 100 (6): 703-711 (2000); Matsunami H， Montmayeur J P， Buck L B. Nature 404 (6778): 601-4 (2000))。在發現T2R基因家 族后不久產生了大量證據提示T2R包含一類至少在嚙齒動物和人體內 表達的味覺感受器，它們介導對苦味化合物的反應。例如，發現T2R 基因在舌和腭上皮細胞的味覺感受器細胞亞類中特異性表達。其次， 發現人T2R之一 (hT2Rl)的基因位于與對苦味化合物6-正-丙基-2-石克 尿嘧啶在人體內的敏感性相關的染色體座位上(Adler等，(同上) (2000))。第三，發現小鼠T2R之一(mT2R5)位于與苦味化合物環己酰 亞胺在小鼠中的敏感性相關的染色體座位上。另外在報導發現了 T2R 基因家族及其在苦味轉導中的預期作用后不久證實，小鼠T2R，特別 是mT2R5可以活化味轉導素，即在味細胞中特異性表達并且與苦味刺 激轉導相關的G蛋白(Wong等，Nature 381:796-800 (1996))。 raT2R5
等，(同上)(2000)。因此，提出了 mT2R家族介導小鼠中的苦味反應， 而hT2R家族介導人中的苦味反應。在這一相同的Chandrasekhar參考 文獻中，證實了一種人T2R，即hT2R4由地那銨特異性活化 (Chandrashekar等，(同上)2000)。然而，本研究中使用的有效地那 銨濃度(1.5 raM)非常高，即高于報導的地那銨對人的苦味閾值10. sup. 5-倍(Saroli， Naturwissenschaf ten 71: 428—429 (1984))。因 此，Chandrashekhar沒有令人信服地使特異性苦味配體與任何hT2R 相對應。
15還預先假定了每個hT2R都能夠結合多種苦味配體。這一假定基于 以下事實hT2R家族僅由約40種不同基因組成，而人可以識別數以 百計的為苦味的不同化合物。已經預先報導了 hT2R的序列并且披露在 公開的PCT申請中，即Zuker等的申請(W0 01/18050 A2， (2001))和 Adler等的申請(WO 01/77676 Al (2001))，將這兩個申請完整地引入 本文作為參考。這一由Senomyx (該申請的受讓人)提交的Adler的 PCT申請披露了該申請涉及的hT2R基因序列和相應的多肽以及其它 hT2R基因和多肽。這一 Adler的PCT申請正確鑒定了這些不同的hT2R 序列編碼苦味味覺感受器并且列舉了活化作為這些hT2R基因的推定 耙標的人的苦味的典型苦味配體。然而，這一在先的Senomyx申請不 包含在這里使用特異性苦味配體和特異性人苦味味覺感受器的實驗例 中舉例說明的功能性測定方法，它們確定了 hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hT2R13、 hT2R54、 hT2R61和hT2R75的特定苦味配體結合特異性。
最初，研究T2R功能的困難之一在于這些受體不易于在培養的哺 乳動物細胞系中表達。為了改善T2R表達，使來自充分表達的GPCR 的N-末端序列，即視紫質與T2R序列連接(Chandrashekar等，(同上) 2000)。該N-末端標記因可利用的抗體還易于監測蛋白質表達。盡管 視紫質標記的摻入改善了某些T2R在哺乳動物細胞系中的表達，但就 功能性研究而言，它們中的許多仍然無法得到足夠充分的表達。在不 同的方法中，mT2R5在昆蟲Sf9細胞中得到成功表達并且用于使用生 化GTPyS結合測定法的功能性研究(Chandrashekar等，(同上) 2000)。
在申請人的在先專利申請US順序號10/191, 058中，申請人在哺 乳動物細胞(HEK-293細胞系)中表達了特異性hT2R并且進行了基于細 胞的測定，這些測定鑒定了特異性活化三種不同的人T2R，即hT2R4、 hT2R44和hT2R61的苦味配體；將該專利申請引入本文作為參考。
然而，雖然已經報導并且了解到人T2R的成員調節人的苦味，但 是對鑒定活化其它人T2R受體的特異性配體仍然存在需求。對于不同 的人T2R的結合特性的更深入的了解非常有益，因為這將更有利于其在選擇具有所需味道調節特性的化合物中的應用，所述的味道調節特 性即阻斷或抑制供人食用的食品、飲料或藥物中特異性苦味化合物的 味道。
發明概述
為此，本發明涉及如下發現T2R家族中的幾種味覺感受器，特 別是hT2R8、 hT2R54和hT2R75由苦味化合物雷尼替丁特異性活化； hT2R54由已知在某些使用者中引起苦味余味的止痛化合物對乙酰氨 基酚特異性活化；hT2R8、 hT2R10、 hT2R13、 hT2R54、 hT2R61和hT2R75 由眾所周知的苦味配體苯甲酸地那銨特異性活化和hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hT2R54和hT2R75由苦味毒素士的寧特異性活化。
使用基于細胞的測定方法獲得了這些發現，所述的測定方法使用 表達特定T2R的細胞在有和沒有特異性苦味配體存在下測定了 T2R的 活性。特別是，如下文更詳細描述的，在其表面上表達以上鑒定的特 異性T2R并且表達嵌合G蛋白的HEK細胞系用于檢測胞內鈣濃度改變 的基于細胞的測定法，并且發現以上鑒定的特異性T2R由特異性苦味 化合物(雷尼替丁、苯曱酸地那銨、士的寧和對乙酰氨基酚)特異性活 化，而其它hT2R在相似條件下未被活化。
因此，本發明包括這些人味覺感受器在測定方法，優選高流通量 測定法中鑒定阻斷雷尼替丁、苯甲酸地那銨、士的寧和對乙酰氨基酚 以及相關和其它苦味化合物活化這些受體的化合物的應用。
本發明還包括這樣的方法，這些方法包括證實這些化合物阻斷品 嘗試驗中的苦味。此外，本發明包括所鑒定的化合物在食品、飲料和 藥物中抑制苦味，例如與藥物產品中對乙酰氨基酚相關的苦味的應用。
發明目的
本發明的一個目的在于鑒定調節，優選阻斷hT2R8、 hT2R54或 hT2R75或其片段、變體、直向同源物或嵌合體活化的化合物，所述的 hT2R8、 hT2R54或hT2R75或其片段、變體、直向同源物或嵌合體由雷尼替丁或結構上與雷尼替丁相關的活化這些受體中的至少一種的化合 物活化。
本發明的另一個目的在于鑒定調節，優選阻斷hT2R54或其片段、 變體、直向同源物或嵌合體活化的化合物，所述的hT2R54或其片段、 變體、直向同源物或嵌合體由對乙酰氨基酚或結構上與之相關的活化 hT2R54的化合物活化。
本發明的另一個目的在于鑒定調節，優選阻斷hT2R8、 hT2R10、 hT2R13、 hT2R54、 hT2R61或hT2R75活化的化合物，所述的hT2R8、 hT2R10、 hT2R13、 hT2R54、 hT2R61或hT2R75由地那銨或結構上與之 相關的特異性活化這些受體中的至少一種的化合物活化。
本發明的另一個具體目的在于鑒定調節，優選阻斷hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hT2R54或hT2R75活化的化合物，所述的hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hT2R54或hT2R75由士的寧或結構上與之相關的特異性活化 所述受體中的至少一種的化合物活化。
本發明的另一個具體目的在于在鑒定調節,優選阻斷雷尼替丁或 結構相關化合物活化所述受體中的至少一種的化合物的測定方法中使 用包含或(穩定或瞬時)表達hT2R8、hT2R54或hT2R75或其片段、變體、 直向同源物、突變體或嵌合體的細胞或細胞膜。
本發明的另一個具體目的在于在鑒定調節，優選阻斷對乙酰氨基 酚或結構相關化合物活化所述受體的化合物的測定方法中使用包含或 (穩定或瞬時)表達hT2R54或其片段、變體、直向同源物、突變體或嵌 合體的細力包或細力包膜。
本發明的另一個具體目的在于在鑒定調節，優選阻斷地那銨或結 構相關化合物活化所述受體的化合物的測定方法中使用包含或(瞬時 或穩定)表達hT2R8、 hT2R10、 hT2R13、 hT2R54、 hT2R61或hT2R75或 其片段、變體、直向同源物、突變體或嵌合體的細胞或細胞膜。
本發明的另一個目的在于在鑒定調節，優選阻斷士的寧或結構相 關化合物活化所述受體中的至少一種的化合物的測定方法中使用包含 或(瞬時或穩定)表達hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hT2R54或hT2R75或
18其片段、變體、直向同源物、突變體或嵌合體的細胞或細胞膜。
本發明的一個更具體的目的在于在基于細胞的測定方法中使用細
胞，優選哺乳動物、兩棲動物或昆蟲細胞，例如表達與其偶聯的G蛋 白，例如G^、 Gal6、味轉導素或其嵌合體的HEK293T細胞，所述的基
對乙酰氨基酚、地那銨或士的寧活化上述人味覺感受器之一的化合物。 本發明的另一個目的在于證實所鑒定的化合物調節，優選阻斷苦
味，例如因雷尼替丁、對乙酰氨基酚、地那銨或士的寧在品嘗試驗，
優選在人的品嘗試驗中引起的苦味。
本發明的另 一個目的在于使用在本文所述的測定方法中鑒定的化
合物作為調節，優選阻斷由特異性活化這些味覺感受器的化合物誘導
的苦p木的組合物中的添加劑。本發明的優選目的在于使用抑制hT2R54
的化合物來阻斷包含對乙酰氨基酚的藥物組合物，特別是兒科用藥的苦味。
附圖詳細描述
附
圖1包含表示hT2R8、hT2R54和hT2R75對10pM的雷尼替丁作 出反應，但對相同濃度下的蔗糖不作出反應的釣成像實驗結果。 附圖2表示hT2R8和hT2R54對雷尼替丁的劑量反應。 附圖3包含表示hT2R54對10 uM的對乙酰氨基酚作出特異性反 應，但對相同濃度下的DPBS或水楊苷不作出反應的鈣成像實驗結果。 附圖4表示hT2R54對對乙酰氨基酚和地那銨的劑量反應。 附圖5包含表示hT2R10、hT2R8、hT2R61、hT2R54、hT2R75和hT2R13 對苯甲酸地那銨作出特異性反應的4丐成像實驗結果。 附圖6表示hT2R8對地那銨的劑量反應。
附圖7包含揭示出hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hT2R54和hT2R75對 士的寧作出特異性反應的鈣成像實驗結果。
發明詳述1在具體描述本發明之前，提供下列定義。
術語"T2R"家族包括如下特征的多態變體、等位基因、突變體和同 源物(1)與下文披露的T2R具有約30-40%的氨基酸序列同一性，更 具體的是約40， 50， 60， 70， 75， 80， 85, 90, 95, 96， 97， 98或 99%的氨基酸序列同一性，并且在Zuker (同上)(2001)和Adler (同 上)(2001)申請(引入本文作為參考)中在約25個氨基酸，最佳50-100 個氨基酸的窗內；(2)特異性結合針對包含選自下文披露的T2R序列 及其保守性修飾的變體的氨基酸序列的免疫原產生的抗體；(3)在嚴 格雜交條件下與選自下文披露的T2R DNA序列及其保守性修飾的變體 的序列特異性雜交(具有至少約100，任選地至少約500-1000個核苷 酸的大小)；(4)包含至少約40%與選自下文披露的T2R氨基酸序列的 氨基酸序列相同的序列；或(5)由在嚴格雜交條件下與所述T2R序列 特異性雜交的引物擴增。
特別地，這些"T2IT s"包括稱作hT2R8， hT2R9， hT2R10, hTlR13, hT2R54, hT2R61和hT2R75的具有本申請中所提供的核酸序列和氨基 酸序列的味覺感受器GPCR及其如下文所述特異性結合苦味配體，即雷 尼替丁、對乙酰氨基酚、地那銨和/或士的寧的變體、等位基因、突變 體、直向同源物和嵌合體。
盡管T2R基因在蛋白質和DNA水平上均表現出顯著的序列趨異， 但是已經發現迄今為止分離的所有T2R均包含某些共有序列，特別是 與前述Adler等WO 01/77676 Al (2001)和Zuker等WO 01/18050 A2 中鑒定的T2R共有序列相同或與所述的T2R共有序列具有至少70-75% 的序列同一性的區域，將所述的兩個申請引入本文作為參考。
從拓樸學來看，某些化學感受GPCR具有"N-末端結構域"，"胞外 域"，包含七個跨膜區的"跨膜結構域"和相應的胞質和胞外環，即"胞 質區"和"C-末端區"(例如，參見Hoon等，Cell, 96:541-51 (1999); Buck & Axel, Cell, 65:175-87 (1991))。可以使用本領域^支術人員 公知的方法，諸如鑒定疏水性和親水性結構域的序列分析程序從結構 上鑒定這些區域(例如，參見Stryer， Biochemistry,(第3版，1988);
20另外，參見許多基于互聯網的序列分析程序中的任一種，諸如在
dot. imgen. bcm. tmc.edu上存在的那些程序)。這些區域可用于制備嵌 合蛋白并且可用于本發明的體外測定方法，例如配體結合測定法。
"胞外域"因此意指從細胞膜中凸出來的并且暴露于細胞的胞外表 面上的T2R多肽的結構域。這類區域可以包括暴露于細胞的胞外表面 上的"N-末端結構域"和暴露于細胞的胞外表面上的跨膜結構域的胞外 環，即跨膜區2與3,跨膜區4與5和跨膜區6與7之間的胞外環。 "N-末端結構域"從N-末端開始并且延伸至接近跨膜區起始處的區域。 這些胞外區域可用于體外配體結合測定，即有可溶性的，又有固相的。
也可用于體外配體結合測定。
包含七個跨膜"區"的"跨膜結構域"意指位于質膜內并且還可以包 括也稱作跨膜"區"的相應胞質(胞內)和胞外環的T2R多肽的結構域。 可以4吏用如Kyte & Doolittle， L Mol. Biol.， 157:105-32 (1982)) 或Stryer，文獻同上中所述的標準方法鑒定七個跨膜區及胞外和胞 質環。
"胞質域"意指面向細胞內部的T2R蛋白結構域，例如，"C-末端結 構域"和跨膜結構域的胞內環，例如跨膜區1與2,跨膜區3與4和跨 膜區5與6之間的胞內環。"C-末端結構域"意指從最后一個跨膜區的 末端延伸到蛋白質的C-末端且通常位于胞質內的區域。
術語"7-跨膜受體"意指屬于具有橫跨質膜7次的七個區域的跨膜 蛋白超家族的多肽(因此，這七個區域被稱作"跨膜"或"TM"結構域TM I -TMVII)。嗅覺和某些味覺感受器家族各自屬于該超家族。7-跨膜受 體多肽具有相似的和特有的一級、二級和三級結構，如以下詳細討論 的。
術語"配體結合區"意指來源于實質上并入跨膜結構域n-vn(TM
II - VII)的化學感受或味覺感受器的序列。該區域能夠結合配體，且
更具體地說，能夠結合誘發味覺的化合物。
術語"質膜轉運結構域"或筒稱為"轉運結構域"意指功能上與典型
21的轉運結構域(5' -MNGTEGPNFYVPFSNKTGVV; SEQ ID NO: l)等效的多 肽結構域。這些肽結構域在被摻入多肽編碼序列的氨基末端時能夠以 極大的效率"陪伴"雜合("融合")蛋白或將所述蛋白"轉運"到細胞膜 上。這種特定的"轉運結構域"最初來源于人視紫質受體多肽，即7-跨 膜受體的氨基末端。另一種轉運結構域來源于牛視紫質序列并且也可 用于促進轉運。視紫質衍生序列特別有效地將7-跨膜融合蛋白轉運到 質膜上。
"功能等效性"意指結構域在相似條件下與典型SEQ ID N0:1同樣 有效地將新近翻譯的蛋白質轉運到質膜上的能力和效率；可以如本文 所述測定(以定量的方式)和比較相對效率。可以通過常規篩選根據在 細胞(哺乳動物、非洲蟾蜍屬(Xenopus )等)中將新近合成的多肽轉運 到質膜上的效率確定屬于本發明范圍的結構域，其效率與20個氨基酸 長度的轉運結構域SEQ ID N0:1的效率相同。
在用于測試調節T2R家族成員介導的味覺轉導的化合物的測定方 法中的術語'1功能作用"包括確定間接或直接在該受體影響下的任何參 數，例如功能、物理和化學作用。它包括體外、體內和離體情況下的 配體結合、離子流的改變、膜電位、電流、轉錄、G蛋白結合、GPCR 磷酸化或脫磷酸化、信號轉導、受體-配體相互作用、第二信使濃度(例 如cAMP、 cGMP、 IP3或胞內Ca2+)，并且還包括其它生理作用，諸如神 經遞質或激素釋放的增加或減少。
所謂"確定功能作用"意指對可以增加或降低間接或直接在T2R家 族成員影響下的參數，例如功能、物理和化學作用的化合物的測定方 法。可以通過本領域技術人員公知的任何方式測定這類功能作用，例 如，光譜特征(例如熒光、吸收度、折射率)、流體動力學(例如形狀)、 色譜或溶解度特性、膜片鉗、電壓靈敏染料、全細胞電流、放射性同 位素射流、誘導型標記、卵母細胞T2R基因表達的改變；組織培養細 胞T2R表達；T2R基因的轉錄活化；配體結合測定；電壓、膜電位和 電導率改變；離子流測定；胞內第二信使，諸如cAMP、 cGMP和肌醇三 磷酸(IP3)的改變；胞內鈣水平的改變；神經遞質釋放等。T2R蛋白受體的"抑制劑"、"活化劑"和調節劑"可以互換使用，是 指使用體外和體內味覺轉導測定法鑒定的抑制、活化或調節分子，例 如配體、激動劑、拮抗劑及其同系物和模擬物。抑制劑為例如結合， 部分或完全阻斷刺激、降低、預防、延緩活化、滅活、脫敏或減量調 節味覺轉導的化合物，例如拮抗劑。活化劑為例如結合、刺激、增力口、 開啟、觸發、促進、增強活化、致敏或增量調節味覺轉導的化合物， 例如激動劑。調節劑包括例如改變受體與如下成分相互作用的化合物 結合活化劑或抑制劑的胞外蛋白(例如ebnerin和疏水性載體家族中 的其它成員)；G蛋白；激酶(例如視紫質激酶及受體失活和脫敏中所 涉及的P腎上腺素能受體激酶的同系物)；和也使受體失活和脫敏的抑 制蛋白。調節劑包括T2R家族成員的基因修飾形式，例如具有改變的 活性，以及天然存在的和合成的配體、拮抗劑、激動劑、小化學分子 等。
這類抑制劑和活化劑的測定方法包括例如表達細胞或細胞膜中 的T2R家族成員，在有或沒有調節例如苦味化合物的化合物存在下施 用推定的調節劑化合物，且然后如上所述測定對味覺轉導的功能作用。 將包含用潛在的活化劑、抑制劑或調節劑處理的T2R家族成員的樣品 或測定方法與不使用抑制劑、活化劑或調節劑處理的對照樣品進行比 較，以便檢驗調節程度。將對照樣品(未用調節劑處理)指定為具有 100%的相對T2R活性值。在T2R活性值相對于對照而言約為80%,任 選地為50%或25-0%時實現對T2R的抑制。在T2R活性值相對于對照而 言為110%，任選地為150%，任選地為200-500%或1000-3000%以上時 實現對T2R的活化。
本文所用的"純化的"、"基本上純化的"和"分離的"意指不 含本發明的化合物一般以其天然狀態與之結合的其它不同的化合物。 優選，"純化的"、"基本上純化的"和"分離的"意指其組成構成 指定樣品質量(按重量計)的至少0. 5%， 1%， 5%， 10°/。或20%且最優選 至少50%或75%。在一個優選的實施方案中，這些術語是指占指定樣品 的質量(以重量計)至少95%的本發明的化合物。本文所用的術語"純化的"、"基本上純化的"和"分離的"在指一種核酸或蛋白質，或 多種核酸或蛋白質時，也指不同于天然存在于哺乳動物，尤其是人體 內的狀態的純化或濃縮的狀態。大于天然存在于哺乳動物，尤其是人
體內的程度的純化或濃縮的任何程度屬于"分離的"含義，所述程度包
括(1)從其它相關結構或化合物中純化或(2)與在哺乳動物，尤其 是人體中一般不與之結合的結構或化合物結合。可以按照本領域技術
人員公知的各種方法和過程分離本文所述的核酸或蛋白質或核酸或蛋
白質類，或相反使之與它們本質上一般不結合的結構或化合物結合。
本文所用的術語"分離的"在指核酸或多肽時意指不同于天然存在 于哺乳動物，尤其是人體內的狀態的純化或濃縮狀態。大于天然存在 于體內的程度的純化或濃縮的任何程度屬于本文所用的"分離的"含 義，所述程度包括(1)從其它天然存在的相關結構或化合物中純化； 或(2)與一般在體內不與結合的結構或化合物結合。可以按照本領域 技術人員公知的各種方法和過程分離本文所述的核酸或多肽，或相反 使之與它們本質上一般不結合的結構或化合物結合。
本文所用的術語"擴增"意指如以下詳細描述的使用任何合適的擴 增技術產生或檢測重組或天然表達的核酸。例如，本發明提供了用于 在體內或體外擴增(例如通過聚合酶鏈反應PCR)本發明的天然表達的 (例如基因組或mRM)或重組的(例如cDNA)核酸(例如本發明的結合誘 發味覺的化合物的序列)的方法和試劑(例如特異性寡核苷酸引物對)。
術語"表達栽體"意指目的在于在任何細胞中以組成型或誘導型方 式體外或體內表達本發明的核酸序列的任何重組表達系統，所述的細 胞包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞。該術語包括 線性或環狀表達系統。該術語包括仍然為附加型或整合入宿主細胞基 因組的表達系統。這些表達系統可以具有或不具有自我復制的能力， 即在細胞內僅驅動瞬時表達。該術語包括僅包含轉錄重組核酸所需的 最少元件的重組表達"盒"。
術語"文庫"意指為不同核酸或多肽分子的混合物的制品，諸如重 組產生的感受器，特別是通過使用簡并引物對擴增核酸產生的味覺感受器配體結合區的文庫，或并入擴增的配體結合區的栽體的分離收集 物，或各自被編碼味覺感受器的至少 一種載體隨機轉染的細胞混合物。
術語"核酸"或"核酸序列"意指單鏈或雙鏈形式的脫氧核苷酸或核 苷酸寡核苷酸。該術語包括包含已知天然核苷酸類似物的核酸，即寡 核苷酸。該術語還包括具有合成主鏈的核酸樣結構。
除非另外指明，否則特定的核酸序列還隱含地包括其保守性修飾 的變體(例如簡并密碼子置換)和互補序列以及明確指出的序列。具體 地，可以通過產生例如一個或多個選擇的密碼子中的第三位被混合堿
基和/或脫氧肌苷殘基置換的序列實現簡并密碼子置換(Batzer等， Nucleic Acid Res. ， 19:5081 (1991); 0htsuka等，J. Biol. Chem.， 260:2605-08 (1985); Rossolini等，MoL Cell. Probes, 8:91-98 (1994))。術語核酸可以與基因、cDNA、 mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互 換使用。
術語"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文中可以互換使用，是指氨基 酸殘基的聚合物。該術語適用于氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基 酸殘基為相應天然存在的氨基酸的人工化學模擬物，以及適用于天然 存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
本文所述的"轉運結構域"、"配體結合區"和嵌合受體組合物還包 括具有基本上相當于典型序列的結構和活性的"類似物"或"保守性變 體"和"模擬物"("肽模擬物")。因此，術語"保守性變體"或"類似物" 或"模擬物"意指具有修飾的氨基酸序列的多肽，使得其中的改變基本 上不會改變如本文所定義的多肽(保守性變體)的結構和/或活性。這些 術語包括氨基酸序列的保守性修飾變化，即，那些對蛋白質活性而言 并不關鍵的殘基的氨基酸置換、添加或缺失或用具有相似特性的殘基 (例如酸性、堿性、帶正電荷或帶負電荷、極性或非極性等)置換氨基 酸，使得甚至關鍵的氨基酸置換也基本上不會改變結構和/或活性。
更具體地說，"保守性修飾的變體"適用于氨基酸和核酸序列。就 特定的核酸序列而言，保守性修飾的變體意指那些編碼相同或基本上 相同的氨基酸序列的核酸，或在該核酸不編碼氨基酸序列的情況下，
25意指基本上相同的序列。因為遺傳密碼子的簡并性，所以大量功能相同的核酸編碼任何指定的蛋白質。
例如，密碼子GCA、 GCC、 GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每一由密碼子限定丙氨酸的位置上，該密碼子可以被改變成任何所述的相應密碼子，但不會改變編碼的多肽。
這類核酸變化為"沉默變化"，其為保守性修飾變化的一個種類。編碼多肽的本文的每個核酸序列還描述了核酸的每種可能的沉默變化。本領域技術人員公認可以修飾核酸中的每一密碼子(除一般為曱硫氨酸的唯一密碼子的AUG和一般為色氨酸的唯一密碼子TGG外)以便產生功能相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每種沉默變化均暗示了每個所述的序列。
提供功能類似氨基酸的保守置換表為本領域眾所周知的。例如，一種選擇保守置換的典型指導原則包括(原始殘基后面跟隨典型置換):ala/gly或ser;arg/lys;asn/gln或his;asp/glu;cys/ser;gln/asn;gly/asp; gly/ala或pro; his/asn或gln; ile/leu或val; leu/ile或val; lys/arg或gln或glu; met/leu或tyr或ile; phe/met或leu或tyr'， ser/thr; thr/ser; trp/tyr; tyr/trp或phe; val/ile或leu。可選擇的典型指導原則使用如下的6種基團，它們各自包含彼此為保守置換的氨基酸1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E); 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q); 4)精氨酸(R)、賴氨酸(I); 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、曱硫氨酸(M)、纈氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(另外參見例如Creighton， Proteins, W. H. Freeman和Company (1984);Schultz 和Schimer，Principlesof Protein Structure,Springer-Verlag (1979))。本領域技術人員會意識到上述置換并非唯一可能的保守置換。例如，為了某些目的，可以將所有帶電荷的氨基酸視為彼此保守置換，無論它們是帶正電荷還是負電荷。此外，還可以將在編碼的序列中改變、添加或缺失單一氨基酸或較小百分比的氨基酸的各置換、缺失或添加視為"保守性修飾變化"。術語"模擬物"和"肽模擬物"意指具有基本上相同的多肽類結構和/或功能特征，例如本發明的轉運結構域、配體結合區或嵌合受體的合成化合物。模擬物可以完全由合成的非天然氨基酸類似物組成，或可
物還;以摻:任何i:的天;氨基酸;守i換，只要這類置換也基本上不會改變該模擬物的結構和/或活性。
就為保守性變體的本發明的多肽而言，常規實驗可以確定模擬物是否在本發明范圍內，即其結構和/或功能基本上未改變。多肽模擬物組合物可以包含非天然結構成分的任意組合，這些非天然結構成分一般來自三種結構基團a)非天然酰胺鍵("肽鍵")連接的殘基連接基團；b)代替天然存在的氨基酸殘基的非天然殘基；或c)誘導二級結構擬態，即誘導或穩定二級結構的殘基，例如P轉角、Y轉角、P片層、a螺旋構象等。多肽可以在其所有或某些殘基通過化學方式而非天然肽鍵連接時被表征為模擬物。各肽模擬物殘基可以通過肽鍵、其它化學鍵或偶聯方式連接，諸如，例如戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯類、雙官能馬來酰亞胺類、N，N'-二環己基碳二亞胺(DCC)或N，N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)。可以作為傳統的酰胺鍵("肽鍵")連接的備選的連接基包括例如南五味子酮(例如，對于一C (. =0) —NH--)的--C(. =. 0)—CH2、氨基亞甲基(CH2冊)、亞乙基、烯烴(CH. dbd. CH)、醚(CH20)、石充醚(CH廣S)、四唑(CN4)、瘞唑、retroamide、石克代酰胺或酉旨(倉寸^口,參見Spatola， Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins, Vol. 7， 267-357， Marcel 1 Dekker， PeptideBackbone Modifications, NY (1983))。多肽還可以通過包含所有或某些非天然殘基代替天然存在的氨基酸殘基被表征為模擬物；非天然殘基在科學和專利文獻中進行了充分的描述。
"標記"或"可檢測部分"為通過分光光度、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段可檢測的組合物。例如，有用的標記包括"P、熒光染料、電子密試劑、酶(例如，如ELISA中通常使用的)、生物素、地高辛配基或可以例如通過將放射性標記摻入肽而成為可檢測的或用于
27檢測與肽特異性反應的抗體的半抗原和蛋白質。
"標記的核酸探針或寡核苷酸"是通過接頭或化學鍵以共價形式或通過離子鍵、范德瓦爾斯鍵、靜電或氫鍵以非共價形式與標記結合，使得可以通過檢測與探針結合的標記的存在檢測探針的存在的標記的核酸探針或寡核苷酸。
將本文所用的"核酸探針或寡核苷酸"定義為能夠通過一種或多種類型的化學鍵，通常通過互補堿基對，通常通過氫鍵形成結合互補序
列的靶核酸的核酸。本文所用的探針可以包括天然(即A、 G、 C或T)或修飾的堿基(7-脫氮鳥苷、肌苷等)。此外，探針中的堿基可以通過非磷酸二酯鍵的鍵合而連接，只要它不會干擾雜交。因此，例如，探針可以為肽核酸，其中成分堿基通過非磷酸二酯鍵的肽鍵連接。本領域技術人員可以理解，根據雜交條件嚴格性的不同，探針可以使缺乏完整互補性的靶序列與該探針序列結合。任選地如用同位素、發色團、發光團、色原直接標記探針或如用隨后鏈霉抗生物素復合物可以與其結合的生物素間接標記探針。通過測定存在或不存在探針，可以檢測存在或不存在選擇的序列或亞序列。
術語"異源"在用于指核酸的部分時表示該核酸包含兩種或多種實際上發現彼此并非具有相同的親緣關系的亞序列。例如， 一般可以通過重組方式生產核酸，它們具有兩種或多種來自排列形成新的功能核酸的無關基因的序列，例如來自一種來源的啟動子和來自另一種來源的編碼區。類似地，異源蛋白表示該蛋白質包含兩種或多種實際上發現彼此并非具有相同的親緣關系的亞序列(例如融合蛋白)。
將"啟動子"定義為指導核酸轉錄的一系列核酸序列。本文所用的啟動子包括接近轉錄起始位點的必需核酸序列，諸如就聚合酶11型啟動子而言，為TATA元件。啟動子還任選地包括遠側增強子或阻抑元件，它們可以位于距轉錄起始位點多達數千個堿基對處。"組成型"啟動子為在大多數環境和發育條件下具有活性的啟動子。"誘導型"啟動子為在環境或發育調節下具有活性的啟動子。術語"可操作地連接"意指核酸表達控制序列(諸如啟動子或轉錄因子結合位點陣列)與第二種核酸序列之間的功能連接，其中表達控制序列指導相當于第二種序列的核酸的轉錄。
本文所用的"重組"意指合成或以另外的方式在體外操作的多核普酸(例如"重組多核苷酸")，使用重組多核苷酸在細胞或其它生物系統中產生基因產物的方法，或由重組多核苷酸編碼的多肽("重組蛋白質")。"重組方式"還包括將具有各種來自不同來源的編碼區或結構域或啟動子序列連入表達盒或栽體，以便表達，例如誘導型或組成型表達包含本發明轉運結構域和使用本發明的引物擴增的核酸序列的融合蛋白。
用語"選擇性(或特異性)雜交"意指在嚴格雜交條件下分子僅與特定的核苷酸序列結合、雙鏈結合或雜交，此時該序列存在于復合混合
物(例如總細胞或文庫DNA或RNA)中。
用語"嚴格雜交條件"意指探針可與其靶亞序列( 一般在核酸的復合混合物中)雜交，但不與其它序列雜交的條件。嚴格條件為序列依賴性的并且在不同的環境中是不同的。較長的序列在較高的溫度下特異性雜交。對核酸雜交的廣泛指導原則可以在Tijssen， Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology—Hybridisation withNucleic Probe, "Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid assays" (1993)中找到。 一般而言，將嚴格條件選擇為低于特異性序列在確定的離子強度、pH下的熱解鏈點(Tm)約5-l(TC。 Tm為50%的與靶標互補的探針與平衡態的靶序列雜交時的溫度(在確定的離子強度、pH和核酸濃度下)(當耙序列在Tm下以過量存在時，50%的探針在平衡狀態下)。嚴格條件為其中在pH 7. 0-8. 3下鹽濃度低于約1.0 M鈉離子， 一般約為0.01-1.0 M鈉離子濃度(或其它鹽)且對短探針而言(例如10-50個核苷酸)溫度至少約30'C而對長探針而言(例如大于50個核苷酸)至少約6(TC的條件。還可以通過添加去穩定劑，諸如曱酰胺達到嚴格條件。為了選擇性或特異性雜交，陽性信號至少為背景的2倍，任選10倍于背景雜交。典型的嚴格雜交條件可以如下50%甲酰胺、5xSSC和l。/。SDS,在42。C下孵育；或5xSSC、 1% SDS,在65。C下孵育與在65。C下0. 2xSSC和0. 1% SDS中洗滌。例如，可以將這類雜交和洗滌步驟進行例如1， 2, 5， 10,15， 30， 60分鐘或60分鐘以上。
在嚴格條件下彼此不雜交的核酸仍然是基本上相關的，條件是它們編碼的多肽是基本上相關的。例如，這種情況在使用遺傳密碼子所允許的最大密碼子簡并性生成核酸拷貝時發生。在這類情況中，核酸一般在中等嚴格雜交條件下雜交。典型的"中等嚴格雜交條件"包括在37。C下在40°/。甲酰胺、1MNaCl、 1% SDS緩沖液中雜交和在45。C下在lxSSC中洗滌。例如，可以將這類雜交和洗滌步驟進行1， 2， 5， 10，15， 30， 60分鐘或60分鐘以上。陽性雜交至少為背景的2倍。本領域技術人員易于認識到備選的雜交和洗滌條件可以用于提供類似嚴格性的條件。
"抗體"意指包含特異性結合和識別抗原的來自免疫球蛋白基因或其片段的構架區的多肽。所識別的免疫球蛋白基因包括k、 X、 oc、 y、S、 s和p恒定區基因以及眾多免疫球蛋白可變區基因。將輕鏈分類為k或X。將重鏈分類為y、 p、 a、 S或s，依次確定了免疫球蛋白的類型，分別為IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE。
典型的免疫球蛋白(抗體)結構單元包含四聚體。每個四聚體由兩個相同的多肽鏈對組成，每對具有一條"輕"鏈(約25 kDa)和一條"重"鏈(約50-7 0 kDa)。每條鏈的N-末端確定了主要導致抗原識別的約100- 110個或110個以上氨基酸的可變區。術語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(Vh)分別意指這些輕鏈和重鏈。
"嵌合抗體"為抗體分子，其中(a)恒定區或其部分被改變，置換或交換，以便抗原結合部位(可變區)與不同或改變的類型，效應子功能和/或種類或給所述嵌合抗體賦予新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等的恒定區連接；或(b)可變區或其部分被改變，被具有不同或改變的抗原特異性的可變區置換或與之交換。
"抗-T2R"抗體為特異性結合由T2R基因、cDNA或其亞序列編碼的多肽的抗體或抗體片段。
術語"免疫測定"為使用特異性結合抗原的抗體的測定法。免疫測定的特征在于使用使用特定抗體的特異性結合特性分離，靶向和/或定量抗原。
術語"特異性(或選擇性)結合"抗體或"特異性(或選擇性)與…發生免疫反應"在指蛋白質或肽時意指確定蛋白質和其它生物學樣品的異源性群體中存在該蛋白質的結合反應。因此，在指定的免疫測定條
件下，指定抗體結合特定蛋白質至少為背景的2倍并且基本上不會大量結合樣品中存在的其它蛋白質。在這類條件下特異性結合抗體可能需要根據其對特定蛋白質的特異性選擇的抗體。
例如，可以從諸如大鼠、小鼠或人這類具體物種中選擇對T2R家族產生的多克隆抗體以便僅獲得那些與T2R多肽或其免疫原性部分發生特異性免疫反應，而不與其它蛋白質發生特異性免疫反應的多克隆抗體，除了 T2R多肽的直向同源物或多態變體和等位基因以外。可以通過扣除與來自其它物種的T2R分子或其它T2R分子交叉反應的抗體進行這種選擇。還可以選擇僅識別T2RGPCR家族成員，但不識別來自其它家族的GPCR的抗體。各種免疫測定方式可以用于選擇與特定蛋白質發生特異性免疫反應的抗體。例如，通常使用固相ELISA免疫測定選擇與蛋白質發生特異性免疫反應的抗體(例如，參見Harlow &Lane，Antibodies, A Laboratory Manual, (1988)，有關可以用于確定特異性免疫反應性的免疫測定方式和條件的描述)。 一般而言，特異性或選擇性反應至少為背景信號或噪聲的2倍，并且更典型的是高于背景的10- IOO倍。
術語"選擇性與…結合"意指如上所定義的核酸與另一種核酸"選擇性雜交"的能力或如上所定義的抗體"選擇性(或特異性)結合"蛋白質的能力。
術語"表達載體"意指目的在于在任何細胞中以組成型或誘導型方式在體外或體內表達本發明的核酸序列的任何重組表達系統，所述的細胞包括原核、酵母、真菌、植物、昆蟲或哺乳動物細胞。該術語包
31括線性或環狀表達系統。該術語包括仍然為附加型或整合入宿主細胞基因組的表達系統。這些表達系統可以具有或不具有自我復制的能力，即在細胞內僅驅動瞬時表達。該術語包括僅包含轉錄重組核酸所需的最少元件的重組表達"盒"。
所謂"宿主細胞"意指包含表達載體并且支持該表達載體復制或表
達的細胞。宿主細胞可以為原核細胞，諸如大腸桿菌；或真核細胞，諸如酵母、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞，諸如CH0、 HeLa、 HEK-293等，例如培養的細胞、外植體和體內細胞。
基于以上描述，本發明提供了用于鑒定化合物的測定方法，所述的化合物調節，優選阻斷由苦味化合物導致的上述的人苦味味覺感受器的特異性活化，所述的苦味化合物即雷尼替丁、對乙酰氨基酚、地那銨、士的寧或結構相關化合物。特別是，本發明提供了用于鑒定化合物的基于細胞的測定方法，所述的化合物調節(例如阻斷)hT2R8、hT2R54或hT2R75對雷尼替丁或結構相關化合物的活化；hT2R54對對乙酰氨基酚或結構相關化合物的活化；hT2R8、hT2R10、hT2R13、hT2R54、hT2R61或hT2R75對苯甲酸地那銨或結構相關化合物的活化；或hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hT2R54或hT2R75對士的寧或結構相關化合物的活化。預計這些化合物可調節與這些人受試者的味覺感受器相關的苦味。這一結果可以在品嘗試驗中得以證實。
使用HEK293表達系統和其它出版物以及本受讓人提交的專利申請，例如美國順序號US10/191， 058和US09/825， 882中報導的鈣成像法確定上述味覺感受器特異性應答苦味配體，即乙酰氨基酚、苯曱酸地那銨、士的寧和雷尼替丁，將所述的兩個申請完整地引入本文作為參考。更具體地說，本發明人用特定的hT2R與嵌合G蛋白(G16 gust 44)一起轉染了 HEK293細胞，所述的嵌合G蛋白包含通過用味轉導素的那些氨基酸殘基置換羧基-44的氨基酸殘基修飾的Gal4 G蛋白序列，并
且本發明人通過鈣成像法記錄了這些細胞對特異性苦味配體的反應。如附圖1中所示，發現hT2R8、 hT2R54和hT2R75對10jjM濃度下
的雷尼替丁作出反應，但對相同濃度下的蔗糖無反應。因此，這些細胞或其它功能上表達這些受體的細胞可以用于鑒定調節雷尼替丁活化，優選阻斷這些受體的雷尼替丁活化的化合物的測定方法。
此外，如附圖2中所示，觀察到hT2R8和hT2R54以劑量依賴性方式作出特異性反應，其中味覺檢測閾值為78|aM(n=4)。
此外，如附圖3中所示，使用這些相同的鈣成像實^驗觀察到hT2R54對10juM下的對乙酰氨基酚作出特異性反應，但對相同濃度下的DPBS或水楊苷無反應。
這一結果在評價hT2R54對地那銨和對乙酰氨基酚的劑量反應的實驗中得以證實(其中人對對乙酰氨基酚的苦味閾值為1. 25 pM并且；對地那銨的EC50為0. 38 y M而對對乙酰氨基酚的EC50為L83jjM)。這些結果證實了功能上表達hT2R54的細胞可以用于鑒定調節苦味的配體的測定方法，所述的調節苦味的配體特別是調節由對乙酰氨基酚、地那銨或結構相關化合物引起的苦味的化合物。這是一個重大發現，例如倘若對乙酰氨基酚廣泛應用于藥物，包括那些用于兒童的藥物中，
口性并且增進其在口服劑型中的應用。
此外，如附圖5中所示，類似的鈣成像實驗揭示出hT2R10、hT2R8、hT2R61、 hT2R54、 hT2R75和hTlR13特異性應答苯曱酸地那銨。附圖6中包含的實驗證實了 hT2R8以劑量特異性方式對地那銨作出反應(EC50為0. 45mM且味覺檢測閾值為24mM)。
這些結果表明功能上表達hT2R8、hT2R10、hTlR13、hT2R54、hT2R61或hT2R75味覺感受器任一種的細胞可以用于鑒定調節與hT2R8、hT2R10、 hTlR13、 hT2R54、 hT2R61或hT2R75相關的苦"木，例如由地那銨或結構相關化合物引起的苦味的配體的測定方法中。
最后，使用相同的鈣成像實驗獲得的附圖7中包含的結果揭示出hT2R8、 hT2R10、 hTlR13、 hT2R54、 hT2R61和hT2R75各自特異性應答士的寧。
基于以上描述，功能上表達hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hTlR13、hT2R54、 hT2R61或hT2R75味覺感受器中至少一種的細胞可以用于鑒定調節與hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hTlR13、 hT2R54、 hT2R61和hT2R75中任一種相關的苦味，特別是由地那銨、對乙酰氨基酚、雷尼替丁、士的寧或結構相關化合物引起的苦味的化合物的測定方法中。
優選這些測定方法將使用表達編碼具有下文鑒定的氨基酸序列之一的hT2R的DNA的測試細胞。然而，預計保持這些苦味味覺感受器的功能特性，即對某些苦味化合物作出反應的這些受體多肽的片段、直向同源物、變體或嵌合體也可用于這些測定方法中。這類變體的實例包括剪接變體、單核苷酸多態性、等位基因變體和通過重組或化學手段產生或天然存在的突變。下文敘述用于本發明的測定方法和打算用于本發明以鑒定抑制這些受體活化的化合物的測定方法中的T2R的分離和表達方式。
T2R的分離和表達
可以通過充分確立的克隆操作步驟，使用基于本申請中披露的T2R核酸序列構建的探針或引物對本發明的T2R或其片段或變體進行分離和表達。還可以使用本文披露的序列和公知的基于計算機的檢索技術，例如BLAST序列檢索從人或其它物種的基因組數據庫中鑒定相關的T2R序列。在一個具體的實施方案中，本文披露的假基因可以用于筌定功能性等位基因或相關基因。
表達載體然后可以用于感染或轉染用于這些序列功能性表達的宿主細胞。在體外或體內制備和表達這些基因和載體。本領域技術人員可以認識到用于改變和控制核酸表達的所需表型可以通過調節本發明載體內基因和核酸(例如啟動子、增強子等)的表達或活性而獲得。可以使用對于增加或降低表達或活性描述的任何公知的方法。可以結合在科學和專利文獻中充分描述的本領域公知的任何方法或方案實施本發明。
另外，可以通過如在例如下列文獻中所述的眾所周知的化學合成技術在體夕卜合成這些核酸Carruthers， Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 47:411-18 (1982); Adams, Am. Chem， Soc， 105:661
34(1983); Belousov， Nucleic Acids Res. 25:3440-3444 (1997);Frenkel， Free Radio. Biol. Med. 19:373-380 (1995); Blo隱rs，Biochemistry 33: 7886-7896 (1994); Na訓g， Meth. Enzymol. 68:90(1979); Brown， Meth. Enzymol. 68:109 (1979); Beaucage， Tetra.Lett. 22:1859 (1981);美國專利US4， 458， 066。然后可以通過合成互補鏈并且使這些鏈在適當條件下一起退火或通過使用帶有合適的引物序列的DNA聚合酶增加互補鏈獲得雙鏈DNA片段。
用于操縱核酸，諸如，例如在序列中產生突變，亞克隆，標記探針，測序，雜交等的技術充分描述在科學和專利文獻中。例如，參見Sambrook, ed. ， Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.)Vols, l-3， Cold Spring Harbor Laboratory (1989); Ausubel， ed.，Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons, Inc.,New York (1997) ; Tijssen， ed. ， Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology: Hybridization With NucleicAcid Probe, Part I， Theory and Nucleic Acid Preparation,Elsevier, N. Y. (1993)。
可以通過本領域技術人員眾所周知的大量一般方式中的任一種分析核酸、載體、殼體、多肽等并且對其定量。這些方式包括例如分析生物化學方法，諸如NMR、分光光度法、放射照相術、電泳、毛細管電泳、高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)和超擴散色譜法、各種免疫學方法，例如流體或凝膠沉淀素反應、免疫擴散、免疫電泳、放射性免疫測定(RIA)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、免疫熒光測定、DNA印跡分析、RNA印跡分析、斑點印跡分析、凝膠電泳(例如SDS-PAGE) 、 RT-PCR、定量PCR、其它核酸或靶或信號擴增方法、放射性標記、閃爍計數和親和色i瞽法。
寡核苷酸引物可以用于擴增編碼T2R配體結合區的核酸。還可以使用擴增技術克隆或定量測定本文所述的核酸。擴增方法也為本領域眾所周知的并且包括例如聚合酶鏈反應(PCR) (Innis ed. ， PCRProtocols, a Guide to Methods and Appl icat ions， Academic Press,N.Y. (1990); Innis ed.， PCR Strategies, Academic Press, Inc.,N. Y. (1995));連接酶鏈反應(LCR) (Wu， Genomics, 4:560 (1989);Landegren， Science, 241:1077 (1988); Barringer, Gene， 89:117(1990));轉錄擴增(Kwoh， PNAS， 86:1173 (1989));自動維持序列擴增(Guatelli， PNAS， 87:1874 (1990)); Q P復制酶擴增(Smi th， J.Clin. Microbiol, 35:1477-91 (1997));自動化Q-P復制酶擴增測定(Burg， MoL Cell. Probe, 10:257-71 (1996));和其它RNA聚合酶介導的技術(例如NASBA， Cangene， Mississauga， Ontario)。 例如，參見Berger， Methods EnzymoL， 152:307-16 (1987); Sambrook;Ausubel; 美國專利US4, 683，195和US4， 683， 202 ; Sooknanan，Biotechnology, 13:563-64 (1995)。
一旦擴增，那么如果需要，就可以使用常規的分子生物學方法，按照本領域公知的方法將單個或作為文庫的核酸克隆入多種載體的任.一種中；例如，用于克隆體外擴增的核酸的方法描述在美國專利US5， 426， 039中。為了有利于克隆擴增的序列，可以將限制酶位點"構建入"PCR引物對。例如，將Pst I和Bsp El位點^沒計成本發明的典型引物對的組成部分。這些特定的限制位點具有在連接時就它們所剪接入的7-膜受體"供體"編碼序列而言為"框內"的序列(連接結合區編碼序列為7-膜多肽固有的，因此，如果需要在限制酶剪接位點的下游翻譯該構建體，那么應避免異讀框結果；如果插入的配體結合區包含基本上大部分的跨膜VII區，那么這種情況可能不是必需的)。可以將引物設計成保留"供體"7-膜受體的原始序列。另外，引物可以編碼為保守置換(例如對疏水性殘基而言為疏水性的，參見上文的討論)或功能良性置換(例如不會阻止質膜插入，導致通過肽酶的切割，導致受體的異常折疊等)的氨基酸殘基。
可以將引物對設計成選擇性擴增T2R蛋白的配體結合區。這些結合區可以因不同的配體而不同；因此，可以為一種配體的最小結合區的可能對于第二種潛在的配體卻過于有限。因此，可以擴增包含不同結構域結構的不同大小的結合區；例如，7-跨膜T2R的跨膜(TM)結構域II - VII， III -VII， III -VI或II -VI或其變化形式(例如，只有
特定結構域的亞序列，使該結構域的順序混合等)。
因為許多7-膜T2R蛋白的結構域結構和序列為已知的，所以本領域技術人員易于選擇結構域側翼序列和內在結構域序列作為設計筒并擴增引物對的模型序列。例如，可以通過使用引物對的PCR擴增生成編碼結構域II -VII區的核酸序列。為了擴增包含跨膜結構域I(TM I)序列的核酸，可以由編碼上述T2R家族共有序列l的氨基酸序列的核酸設計簡并引物。這類簡并引物可以用于產生并入TM I-TM III、 TMI一TM IV、 TM I-TM V、 TM I - TM VI或TM I - TM VII的結合區)。可以基于本文提供的其它T2R家族共有序列設計其它簡并引物。這種簡并引物可以用于產生并入TM III-TM IV、 TM III-TM V、 TM III一 TM VI或TM III - TM VII的結合區。
設計簡并引物對的范例為本領域眾所周知的。例如，可進入COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer (C0DEH0P)策略計算機程序并且直接與用于從一組稱作味覺感受器配體結合區的相關蛋白質序列開始進行雜合引物預測的BlockMaker多序列比對站點連接(例如，參見Rose， Nucleic Acids Res. ， 26:1628-35 (1998);Singh, Biotechniques， 24:318-19(1998))。
合成寡核苷酸引物對的方式為本領域眾所周知的。可以使用"天然"堿基對或合成堿基對。例如，使用人造核堿基提供了操縱引物序列和生成更復雜的擴增產物混合物的通用手段。不同家族的人造核堿基能夠釆取通過內部鍵旋轉的多氫鍵取向，以便提供用于簡并分子識別的方式。將這些類似物摻入PCR引物的單一位置能夠生成擴增產物的復合文庫。例如，參見Hoops, Nucleic Acids Res" 25:4866-71(1997 )。非極性分子也可以用于模擬天然DNA堿基的形狀。腺嘌呤
的非氫鍵鍵合形狀模擬物相對于胸腺嘧啶的非極性形狀模擬物而言可以有效而選擇性地復制(例如，參見Morales, Nat. Struct. Bioi.，5:950-54 ( 1998 ))。例如，兩種筒并堿基可以為嘧啶堿基6H， 8H-3，4-二氫嘧啶并[4，5-c] [1，2]噁*-7-酮或嘌呤堿基N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(例如，參見Hill， PNAS， 95:4258-63 ( 1998 ))。本發明典型的簡并引物并入核堿基類似物5，-二曱氧基三苯甲基-N-苯甲酰基-2，-脫氧-胞苷，3，-[ (2-氰乙基)-(N， N-二異丙基)卜亞磷酰胺(序列中的術語"P"，參見上文)。這種嘧啶類似物與噤呤形成氫鍵，包括A和G殘基。
可以使用上述核酸探針分離基本上與本文披露的味覺感受器相同的多態變體、等位基因和種間同源物。另外，可以將表達文庫用于通過使用對T2R多肽形成的也可以識別并且選擇性結合T2R同源物的抗血清或純化的抗體以免疫學方式檢測表達的同源物克隆T2R多肽類及其多態變體、等位基因和種間同源物。
可以通過使用合適的(完全的和簡并的)引物對擴增(例如PCR)合適的核酸序列產生編碼味覺感受器配體結合區的核酸。擴增的核酸可以為來自任何細胞或組織的基因組DNA或來源于表達味覺感受器的細胞的mRNA或cDNA。
在一個實施方案中，可以構建包含編碼與轉運序列融合的T2R的核酸的雜合蛋白編碼序列。還提供了包含轉運基元和其它家族的化學感受器，特別是味覺感受器的誘發味覺的化合物結合區的雜合T2R。這些核酸序列可操作地與轉錄或翻譯控制元件，例如轉錄和翻譯起始序列、啟動子和增強子、轉錄和翻譯終止子、聚腺苷酸化序列和其它適用于將DNA轉錄成RNA的序列連接。在構建重組表達盒、載體和轉基因的過程中，啟動子片段可以用于指導所有所需細胞或組織中所需核酸的表達。
在另 一個實施方案中，融合蛋白可以包括C-末端或N-末端轉運序列。此外，融合蛋白可以包含額外的元件，例如用于蛋白質檢測、純化或其它應用的元件。有利于檢測和純化的結構域包括例如金屬螯合肽類，諸如聚組氨酸序列段、組氨酸-色氨酸組件或能夠在固定化金屬上純化的其它結構域；麥芽糖結合蛋白；能夠在固定化免疫球蛋白上純化的蛋白質A結構域；或用于FLAGS延伸/親和純化系統(ImmunexCorp， Seattle Wash.)的結構域。
38在轉運結構域(用于有效質膜表達)與新翻譯多肽的剩余部分之間
包含可切割接頭序列，諸如因子Xa (例如，參見0ttavi， Biochimie， 80:289-93 (1998))、枯草桿菌蛋白酶識別基元(例如，參見Polyak， Protein Eng. ， 10:615-19 (1997))、腸激酶(Invitrogen， San Diego， Calif.)等可以用于促進純化。例如， 一種構建體可以包括編碼核酸序 列的多肽，所述的核酸序列與6個組氨酸殘基連接，隨后是硫氧還蛋 白、腸激酶切割位點(例如，參見Williams, Biochemistry, 34:1787-97 (1995))和C-末端轉運結構域。組氨酸殘基有利于檢測和 純化，而腸激酶切割位點提供了從該融合蛋白的剩余部分中純化所需 蛋白質的手段。關于編碼融合蛋白的載體的技術和融合蛋白的應用充 分描述在科學和專利文獻中(例如，參見Kroll， DNA Cell. Biol，. 12:441-53 (1993))。
可以將作為單個表達載體或作為表達載體文庫的包含配體結合區
種常規技《表達，這些技術充分描述在科學和專利文獻中。例如，參 見Roberts, Nature, 328:731 (1987); Berger文獻同上；Schneider, Protein Exper. Purif. ， 6435:10 (1995) 5 Sambrook; Tijssenj Ausube 1 。來自生物試劑和實驗設備制造商的產品信息也提供了有關已 知生物學方法的信息。可以從獲自諸如ATCC或GenBank文庫這類來源 的天然來源分離載體或通過合成或重組方法制備它們。
可以在穩定或瞬時地在細胞中表達的表達盒、載體或病毒(例如附 加型表達系統)中表達核酸。可以將選擇標記摻入表達盒和載體中以便 在轉化細胞和序列上賦予選擇性表型。例如，選擇標記可以編碼附加 型維持和復制，以便無需整合入宿主基因組。例如，標記可以編碼抗 生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素)或除草 劑抗性(例如chlorosulfuron或Basta)以便允許選擇用所需DNA序歹寸 轉4t的那些細月包(例如，參見Blondelet-Rouault， Gene， 190:315-17 (1997); Aubrecht, J. Pharmacol. Exp. Ther.， 281:992-97 (1997))。 因為賦予底物，如新霉素或潮霉素抗性的選擇性標記基因只能用于組
39織培養中，所以化學抗性基因也用作體外和體內選擇性標記。
嵌合核酸序列可以編碼任何7-跨膜多肽內的T2R配體結合區。因 為7-跨膜受體多肽具有類似的一級序列和二級和三級結構，所以易于 通過序列分析鑒定結構域(例如胞外域、TM結構域、胞質域等)。例如， 同源性模擬、傅里葉分析和螺旋周期性檢測可以鑒定和表征具有7-跨 膜受體序列的七結構域。快速傅里葉變換(FFT)算法可以用于評價表征 所分析的序列的疏水性和變異性的特征的顯性周期。例如，可以如例 如Do腸lly， Protein Sci.， 2:55-70 (1993)所述進^f亍周期性檢測強 化和算出cc螺旋周期性指數。其它序列比對和模擬算法為本領域眾所 周知的(例如，參見Peitsch， Receptors Channels, 4:161-64 (1996); Kyte & Doolittle， J. Md. Biol.， 157:105-32 (1982);和Cronet， Protein Eng.， 6: 59-64 (1993)。
本發明還不僅包括具有指定核酸和氨基酸序列的核酸分子和多 肽，而且包括其片段，特別是例如40， 60， 80， 100， 150， 200或250 個核苷酸或250個以上核苷酸的片段以及例如10， 20， 30, 50， 70， 100或150個或150個以上氨基酸的多肽片段。任選地，所述的核酸 片段可以編碼能夠結合針對T2R家族成員產生的抗體的抗原性多肽。 此外，本發明的蛋白質片段可以任選地為能夠結合針對T2R家族成員 產生的抗體的抗原性片段。
還關注包含本文所述T2R多肽類中至少一種的至少10， 20， 30， 50， 70， 100或150個或150個以上氨基酸的嵌合蛋白質，其與代表 另 一種GPCR,優選7跨膜超家族成員的全部或部分的額外氨基酸偶聯。 這些嵌合體可以由本發明的受體和另一種GPCR制成，或它們可以通過 合并本發明的受體中的兩種或多種制成。在一個實施方案中，該嵌合 體的一個部分相當于或來源于本發明的T2R多肽的跨膜結構域。在另 一個實施方案中，嵌合體的一個部分相當于或來源于本文所述的T2R 多肽的跨膜區中的一個或多個，并且剩余的部分或多個部分可以來源 于另一種GPCR。嵌合受體為本領域眾所周知的，并且用于生成它們的 技術和用于摻入其中的G蛋白偶聯受體的結構域或片段的選擇和邊界也為眾所周知的。因此，本領域技術人員易于將該此知識用于生成這 類嵌合受體。例如，這類嵌合受體的應用可以提供本文具體披露的受 體之一所特有的味覺選擇性，其與另一種受體，諸如用于現有技術測 定系統中的眾所周知的受體信號轉導特征相聯系。
例如，諸如配體結合區、胞外域、跨膜結構域、胞質域、N-末端 結構域、C-末端結構域或其任何組合這類區可以與異源蛋白共價連接。 例如，T2R跨膜區可以與異源GPCR跨膜結構域連接或異源GPCR胞外 域可以與T2R跨膜區連接。其它選擇的異源蛋白可以包括例如，綠 色熒光蛋白、P-gal、谷氨酸受體和視紫質N-末端。
用于表達本發明的T2R、片段或變體的宿主細胞也在本發明范圍 內。為了獲得高水平的克隆的基因或核酸，諸如編碼本發明的T2R、 片段或變體的cDNA的表達，本領域技術人員一般將所關注的核酸序列 亞克隆入表達栽體，該表達載體包含指導轉錄的強啟動子，轉錄/翻譯 終止子并且如果就編碼蛋白質的核酸而言，包含用于翻譯起始的核糖 體結合位點。合適的細菌啟動子為本領域眾所周知的并且例如描述在 Sambrook等中。然而，可以使用細菌或真核表達系統。
可以使用將外源性核苷酸序列導入宿主細胞的眾所周知的操作法 中的任一種。它們包括使用磷酸鈣轉染、聚凝胺、原生質體融合、電 穿孔、脂質體、顯微注射、血漿載體、病毒載體和用于將克隆的基因 組DNA、 cDNA、合成DNA或其它外源性遺傳物質導入宿主細力包的其它 眾所周知的方法(例如，參見Sambrook等)。唯一必要的是所用的特定 基因工程操作法能夠成功地將至少一種核酸分子導入能夠表達所關注 的T2R、片段或變體的宿主細胞。
在將表達載體導入細胞后，在有利于表達所關注的受體、片段或 變體的條件下培養轉染的細胞，然后使用標準技術從培養物中回收細 胞。這類技術的實例為本領域眾所周知的。例如，參見W0 00/06593, 以與本說明書披露內容一致的方式將該文獻引入作為參考。
用于檢測調節本發明的T2R活性的化合物的測定方法用于在體外和體內確定測試化合物是否特異性結合本發明的T2R 多肽的方法和組合物如下所述。可以監測細胞生理學的許多方面以便 評價配體結合天然存在的或嵌合T2R的作用。可以對表達T2R多肽的 完整細胞、對透化細胞或對通過標準方法產生的膜組分進行這些測定。
味覺感受器結合誘發味覺的化合物并且啟動將化學刺激轉換成電 信號。活化的或抑制的G蛋白質又可以改變耙酶、通道或其它效應蛋 白的特性。某些實例為在視覺系統中轉導素活化cGMP磷酸二酯酶、刺 激性G蛋白活化腺苷酸環化酶、Gq和其它關連G蛋白活化磷脂酶C和 Gi和其它G蛋白質調節不同的通道。還可以檢驗下游結果，諸如磷脂 酶C產生二酰基甘油和IP3和反過來IP3導致鉤動員。
本測定方法中的T2R蛋白質或多肽一般選自具有包含在SEQ ID N0S.:3， 5, 7， 9， 11， 13或15中的序列的多肽或其片段或保守性修 飾的變體。
另外，本測定方法中的T2R蛋白質或多肽可以來源于真核宿主細 胞并且可以包括與SEQ ID NOS.: 3， 5, 7， 9， 11， 13或15具有氨基
酸序列同一性的氨基酸序列或其保守性修飾的變體。 一般而言，氨基 酸序列同一性為至少30%，優選地為30-40%，更具體地說為50-60%, 70%, 75%， 80%, 85°/。， 90°/。， 95%， 96°/。， 97%, 98°/。或99%。任選地，本 測定方法中的T2R蛋白質或多肽可以包含T2R多肽的區，諸如胞外域、 跨膜區、胞質域、配體結合域等。任選地，T2R多肽或其部分可以與
可以使用如上所述的重組或天然存在的T2R蛋白質或多肽測試 T2R活性調節劑。可以分離，在細胞中表達，在來源于細胞的膜中表 達，在組織或動物中表達重組或天然存在的T2R蛋白質或多肽。例如， 可以使用舌切片，從舌上剖離的細胞，轉化的細胞或膜。可以使用本 文所述的體外或體內測定方法之一測試調節。
調節劑的檢測
用于體外和體內確定測試化合物是否特異性結合本發明的T2R受體的組合物和方法如下所述。可以監測細胞生理學的許多方面以便評
價配體結合本發明T2R多肽的作用。可以對表達化學感受器的細胞、
透化細胞或通過標準方法或體外使用重新合成的蛋白質產生的膜組分
進行這些測定。
在體內，味覺感受器結合味覺調節化合物并且啟動將化學刺激轉 換成電信號。活化的或抑制的G蛋白質又可改變靼酶、通道或其它效 應蛋白的特性。某些實例為在視覺系統中轉導素活化cGMP磷酸二酯 酶、刺激性G蛋白活化腺苷酸環化酶、Gq和其它關連G蛋白活化磷脂 酶C和Gi和其它G蛋白質調節不同的通道。還可以檢驗下游結果，諸 如磷脂酶C產生二酰基甘油和IP3和反過來IP3導致鉤動員。
另外，本測定方法中的T2R蛋白質或多肽可以來源于真核宿主細 胞并且可以包括與本文披露的T2R多肽具有氨基酸序列同一性的氨基 酸亞序列或其保守性修飾的變體。 一般而言，氨基酸序列同一性為至 少35-50%,或任選地為75%, 85%, 90%, 95%， 96%, 97%, 98%或99%。 任選地，本測定方法中的T2R蛋白質或多肽可以包含T2R蛋白質的結 構域，諸如胞外域、跨膜區、跨膜結構域、胞質域、配體結合域等。 此外，如上所述，T2R蛋白質或其結構域可以與異源蛋白共價連接以 便生成用于本文所述測定方法中的嵌合蛋白。
可以使用如上所述的重組或天然存在的T2R蛋白質或多肽測試 T2R受體活性調節劑。可以分離，在細胞中表達，在來源于細胞的膜 中表達，在組織或動物中表達重組或天然存在的T2R蛋白質或多肽。 例如，可以使用舌切片，從舌上剖離的細胞，轉化的細胞或膜。可以 使用本文所述的體外或體內測定方法之一測試調節。
1.體內結合測定
還可以使用可溶性或固態反應，應用本發明的T2R多肽檢驗味覺 轉導。在一個特定的實施方案中，可以將T2R配體結合域體外用于可 溶性或固態反應，以1更測定配體結合。
可以由N-末端結構域與胞外域的額外部分，諸如跨膜結構域的胞
43外環一起形成配體結合域。
已經將體外結合測定與其它GPCR,諸如代謝型谷氨酸受體一起使 用(例如，參見Han和Hampson， J. Biol. Chem. 274:10008-10013 (1999))。這些測定法可以包括置換放射性或焚光標記的配體，測定特 性熒光的改變或蛋白水解敏感性的改變等。
可以在溶液，任選地與固相結合的雙層膜，脂單層或小嚢泡中測 試與本發明的T2R多肽結合的配體。例如，可以使用光譜特征(例如熒 光、吸收度、折射率)、流體動力學(例如形狀)、色譜或溶解度特性的 改變測試調節劑的結合。
在本發明的一個優選實施方案中，使用w"GTPyS結合測定。如 上所述，在GPCR活化時，G蛋白復合物的Ga亞單位受到刺激以便將 結合的GDP換成GTP。可以在測定有推定配體存在下添加的放射性標 記的。5s]GTPYS與G蛋白結合的生化測定中測定配體介導的刺激G蛋 白交換活性。 一般而言，將包含所關注的化學感受器的膜與G蛋白混 合。將可能的抑制劑和/或活化劑和[35S]GTP y s加入到測定體系中并且 測定["s]GTPyS與G蛋白的結合。可以通過液體閃爍計數或通過本領 域中公知的任何其它方式，包括閃爍親近測定法(SPA)測定結合。在其 它測定方式中，可以使用熒光標記的[35s]gtp y s。
2.焚光偏振測定
在另 一個實施方案中，基于熒光偏振("FP")的測定法可以用于檢 測和監測配體結合。熒光偏振為用于測定平衡結合、核酸雜交和酶促 活性的通用實驗室技術。熒光偏振測定法的相似性在于它們無需分離 步驟，諸如離心、過濾、色譜、沉淀或電泳。這些測定可以實時，直
接在溶液中進行并且無需固定相。可以反復并且在添加試劑后測定偏 振值，因為測定偏振是快速的并且不會破壞樣品。 一般而言，這種技 術可以用于測定從低皮摩爾到微摩爾水平的熒光團的偏振值。這部分 描述了熒光偏振如何可以以簡單和定量方式用于測定配體與本發明的 T2R多肽的結合。當用平面偏振光激發熒光標記的分子時，它發射具有與其分子旋 動成反比的偏振度的光。大的熒光標記的分子在激發態過程中保持相
對穩定(就熒光素而言為4納秒)并且光的偏振在激發與發射之間保持 相對恒定。小的熒光標記的分子在激發態過程中快速旋轉并且偏振在 激發與發射之間顯著改變。因此，小分子具有低偏振值且大分子具有 高偏振值。例如，單鏈熒光素標記的寡核苷酸具有相對低的偏振值， 而當其與互補鏈雜交時，它具有較高的偏振值。當使用FP檢測并且監
測可以活化或抑制本發明的化學感受器的引起味覺的化合物結合時， 可以使用焚光標記的誘發味覺的化合物或自身熒光的誘發味覺的化合 物。
將熒光偏振(P)定義為1 P = Int - Int Int + Int。 如果PI為與激發光平面平行的發射光強度并且Int perp.為與激 發光平面垂直的發射光強度，那么為光強度之比的P為無維數。例如， Beacon和Beapon 2000系統可以與這些測定法結合4吏用。這類系統一 般以毫偏振單位表示偏振(l偏振單位=1000 mP單位)。
分子旋動與尺寸之間的關系由Perrin等式描述并且讀者可以參 照Jolley， M. E. (1991)在Journal of Analytical Toxicology, pp. 236-240中所述，該文獻中給出了該等式的全面解釋。概括地說， Perrin等描述了偏振與轉動弛豫時間成正比，所述的時間為分子通過 約68. 5度的角旋轉所需的時間。轉動弛豫時間與粘度(n)、絕對溫度 (T)、分子體積(V)和氣體常數(R)相關，由如下等式表示2轉動弛豫 時間=3 V RT。
轉動弛豫時間就小分子(例如熒光素)而言較短(約1納秒)，而就 大分子(例如免疫球蛋白)而言較長(約100納秒)。如果粘度和溫度保 持恒定，那么轉動弛豫時間和由此的偏振與分子體積直接相關。分子 體積的改變可以歸因于與其它分子的相互作用、解離、聚合、降解、 雜交或熒光標記分子的構象變化。例如，熒光偏振已經用于測定蛋白 酶DNA酶和RM酶對大的焚光素標記的聚合物的酶促切割。焚光偏振 也已經用于測定蛋白質/蛋白質相互作用、抗體/抗原結合和蛋白質/DNA結合的平衡結合。
A.固態和可溶性高流通量測定
在另一個實施方案中，本發明提供了使用T2R多肽的可溶性測定 法；或表達T2R多肽的細胞或組織。在另一個實施方案中，本發明提 供了以高流通量方式基于固相的體外測定法，其中使T2R多肽或表達 T2R多肽的細胞或組織與固相基質或味覺刺激化合物結合且與T2R受 體接觸，并且使用合適的標記或針對T2R受體產生的抗體檢測結合。
在本發明的高流通量測定中，在一天內可以篩選多達數千種不同 的調節劑或配體。特別是，可以使用微量滴定板的各孔進行針對所選 擇的潛在調節劑的單獨測定，或如果要觀察濃度或孵育時間效應，那 么每5-10個孔可以測試一種單一調節劑。因此，單一標準微量滴定板 可以檢測約100 (例如96)種調節劑。如果使用1536個孔的平板，那 么單一平板可以容易地檢測約1000 -約1500種不同的化合物。還能 夠檢測在各平板孔中的多種化合物。能夠每天檢測幾個不同的平板； 能夠使用本發明的綜合系統進行多達約6, 000-20， 000種不同化合物 的測定篩選。近來已經研發了用于試劑操作的微觀流控方法。
所關注的分子可以與固態成分通過共價或非共價鍵，例如通過標 記直接或間接結合。所述的標記可以為多種成分中的任一種。 一般而 言，使結合標記的分子(標記結合物)固定在固體支持物上并且使所關 注的標記的分子(例如所關注的味覺轉導分子)通過標記和標記結合物 的相互作用與固體支持物結合。
基于文獻中充分描述的已知的分子相互作用，可以使用許多標記 和標記結合物。例如，如果標記具有天然結合物，例如，生物素、A 蛋白或G蛋白，那么它可以與合適的標記結合物(抗生物素蛋白、鏈霉 抗生物素、中性抗生物素(neutravidin)、免疫球蛋白的Fc區等) 聯用。也可以廣泛利用具有天然結合物，諸如生物素的分子的抗體和 合適的標記結合物(參見SIGMA Immunochemicals 1998目錄SIGMA， St. Louis Mo.)。
46類似地，任何半抗原或抗原化合物可以與合適的抗體聯用以便形 成標記/標記結合物對。數以千計的特異性抗體為商購的并且許多額外 的抗體描述在文獻中。例如，在一種常用的構型中，標記為第一種抗 體并且標記結合物為識別第一種抗體的第二種抗體。除抗體-抗原相互 作用外，受體-配體相互作用也適合作為標記和標記結合物對。例如， 細胞膜受體的激動劑和拮抗劑(例如細胞受體-配體相互作用，諸如運 鐵蛋白、c-kit、病毒受體配體、細胞因子受體、趨化因子受體、白細 胞介素受體、免疫球蛋白受體和抗體、鈣黏素家族、整聯蛋白家族、
選凝素家族等；例如，參見Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993))。類似地，毒素和毒液、病毒表位、激素(例如 阿片制劑、類固醇等)、胞內受體(例如，它們介導各種小配體，包括 類固醇、曱狀腺激素、類視黃醇和維生素D;肽類的作用)、藥物、凝 集素、糖類、核酸(線性和環狀聚合物構型)、寡糖類、蛋白質、磷脂 類和抗體均可以與各種細胞受體發生相互作用。
合成的聚合物，諸如聚氨基甲酸酯類、聚酯類、聚碳酸酯類、.聚 脲類、聚酰胺類、聚乙烯亞胺類、聚亞芳基硫醚類、聚硅氧烷類、聚 酰亞胺類和聚乙酸酯類也可以形成合適的標記或標記結合物。許多其 它標記/標記結合物對也可用于本文所述的測定系統中，因為這對本領 域技術人員而言在閱讀本說明書后即可顯而易見。
常用的連接物，諸如肽類、聚醚類等也可以用作標記并且包括多 肽序列，諸如約5 - 200個氨基酸的聚甘氨酸序列。這類撓性連接物為 本領域技術人員公知的。例如，聚(乙二醇)連接物可購自Shearwater Polymers, Inc. Huntsville， Ala。這些連接物任選地具有酰胺鍵、
巰基鍵或異功能鍵。
使用目前可利用的多種方法中的任一種使標記結合物與固相基質 固定。固相基質通常通過使該基質的全部或部分接觸化學試劑而衍生 或官能化，所述的化學試劑使化學基團固定在與標記結合物的一部分 反應的表面上。例如，適合于與較長鏈部分連接的基團可以包括胺類、 羥基、巰基和羧基。氨基烷基硅烷類和羥基烷基硅烷類可以用于使各種表面，諸如玻璃表面官能化。這類固相生物聚合物陣列的構建充分
描述在文獻中。例如，參見Merrifield， J. Am. Chem. Soc， 85:2149-2154 (1963)(描述了例如肽類的固相合成)；Geysen等，J. Immun. Meth. ， 102:259-274 (1987)(描述了插針上的固相成分的合 成)；Frank & Doring, Tetrahedron, 44:60316040 (1988)(描述了 纖維素圓盤上的各種肽序列的合成)；Fodor等，Science, 251:767-777 (1991) ; Sheldon 等，Clinical Chemistry, 39 (4): 718-719 (1993);和Kozal等，Nature Medicine, 2 (7):753759 (1996)(均描述了固定在固相基質上的生物聚合物的陣列)。
法，諸如加熱、通過UV照射交聯等,
3.基于細胞的測定
在一個優選的實施方案中，在真核細胞中以未修飾的形式表達 T2R蛋白質或將其表達為嵌合、變體或截短的受體，這些受體具有或
列。可以在任何真核細胞，諸如HEK-293細胞中表達這類T2R多肽。 優選這些細胞包含功能性G蛋白，例如Gal5,其能夠使嵌合受體與胞 內信號傳導途徑或與信號蛋白，諸如磷脂酶C偶聯。可以使用任何標 準的方法，諸如通過經檢測細胞中FURA-2依賴性焚光檢測胞內鉀改變 來檢測T2R受體在這類細胞中的活化。這類測定是在本申請中提供的 實驗發現的基礎。
活化的GPCR受體通常為使該受體C-末端尾(并且也可能是其它 位點)磷酸化的激酶的底物。因此，活化劑會促進32P從放射性標記的 ATP轉移至該受體，可以使用閃爍計數器檢測這一過程。C-末端尾的 磷酸化會促進抑制蛋白樣蛋白質的結合并且干擾G蛋白的結合。就 GPCR信號轉導和檢測信號轉導的方法的一般性綜述而言，例如，參見 Methods in Enzymology， vols. 237 and 238 (1994)and volume 96 (1983); Bourne等，Nature, 10:349:117-27 (1991); Bourne等，
48Nature, 348:125-32 (1990); Pitcher等，A畫.Rev. Biochem.， 67:653-92 (1998)。
可以通過比較用推定的T2R調節劑處理的T2R多肽的反應與未處 理的對照樣品或包含已知"陽性"對照的樣品的反應來評價T2R調節。 這類推定的T2R調節劑可以包括抑制或活化T2R多肽活性的分子。在 一個實施方案中，將用活化T2R的化合物處理的對照樣品指定為相對 T2R活性值為100。當T2R活性值相對于對照樣品而言為約90%，任選 地為50°/。，任選地為25-0%時，實現對T2R多肽的抑制。當T2R活性值 相對于對照樣品而言為110%，任選地為150%, 200-500°/。或1000-2000% 時，實現對T2R多肽的活化。
可以通過確定表達T2R多肽的細胞或膜的離子極化(即電位)的改 變來評價離子流的改變。確定細胞極化改變的一種方式是使用電位鉗 和膜片鉗技術(例如，參見"細胞粘附"式、"內定夕卜"式和"全細胞"式， 例如Ackerman等，New Engl. J Med. ， 336:1575-1595 (1997))測定 電流的改變(由此測定極化的改變)。使用標準便利地確定全細胞電流。 其它公知的測定方法包括放射性標記的離子流測定法和使用電壓敏 感性染料的熒光測定法(例如，參見Vestergarrd-Bogind等，J. Membrane Biol， 88: 67-75 (1988); Gonzales & Tsien， Chem. Biol.， 4:269-277 (1997); Daniel等，J. Pharmacol. Meth. ， 25: 185-193 (1991); Holevinsky等，J. Membrane Biology, 137:59-70 (1994))。
可以通過檢驗上述參數中的任一個測定測試化合物對多肽功能的 影響。影響GPCR活性的任何合適的生理學改變均可以用于評價測試化 合物對本發明多肽的影響。當使用完整細胞或動物確定功能結果時， 還可以測定多種效應，諸如遞質釋放、激素釋放、已知的和未表征的 遺傳標記(例如RNA印跡)的轉錄改變、諸如細胞生長這類細胞代謝的 改變或pH改變和諸如Ca. sup. 2+、 IP3、 cGMP或cAMP這類胞內第二信 使的改變。
GPCR的優選測定方法包括負荷了離子或電壓敏感性染料的細胞 以便報告受體活性。用于確定這類受體活性的測定法也可以使用已知的其它G蛋白偶聯受體的激動劑和拮抗劑作為對照品以便評價測試化 合物的活性。在用于鑒定調節化合物(例如激動劑、拮抗劑)的測定 法中，分別使用離子敏感性或膜電壓熒光指示劑監測胞質或膜電壓中 離子水平的改變。可以使用的離子敏感性指示劑和電壓探針披露在 Molecular Probe 1997目錄中。就G蛋白偶聯受體而言，混棲G蛋白， 諸如G-和Gai6可以用于選擇的測定法中(Wilkie等，Proc. Nat" Acad. Sci.， 88:10049-10053 (1991))。
受體活化啟動了隨后的胞內事件，例如第二信使的增加。活化某 些G蛋白偶聯受體刺激通過磷脂酶C介導的磷脂酰肌醇水解肌醇三磷 酸(IP3)的形成(Berridge & Irvine, Nature, 312:315-21 (1984))。 IP3反過來刺激胞內鈣離子貯備的釋放。因此，胞質鉤離子水平的改 變或第二信使水平，諸如IP3的改變可以用于評價G蛋白偶聯受體功 能。表達這類G蛋白偶聯受體的細胞可以展示出增加的胞質4丐水平， 這里由于從胞內貯備中的鉤釋放和通過質膜離子通道的胞外4丐進入所 起的作用。
在一個優選的實施方案中，通過在含有使受體與磷脂酶C信號轉 導途徑連接的混棲G蛋白的異源細胞中表達T2R基因測定T2R多肽活 性(參見Offermanns & Simon， J. Biol. Chem. ， 270:15175-15180 (1995))。任選地，細胞系為HEK-293 (其通常不表達T2R基因)且混 棲G蛋白為Gal5(Offermanns & Simon，文獻同上)。通過測定胞內Ca2+ 水平的改變檢測味覺轉導調節，所述的改變是對通過給予與T2R多肽 關聯的分子調節T2R信號轉導途徑的響應。任選地使用熒光Ca"指示 劑染料和熒光成像測定"2+水平的改變。
在另一個實施方案中，可以按照美國專利US 5， 436， 128分析磷脂 酰肌醇(PI)水解，將該專利引入本文作為參考。簡言之，該測定方法 包括用3H-肌醇將細胞標記48或48小時以上。用測試化合物將標記 的細胞處理l小時。裂解經處理的細胞并且用氯仿-曱醇-水提取，此 后，通過離子交換色鐠法分離肌醇磷酸并且通過閃爍計數進行定量。 通過計算在有激動劑存在下的cpm與有緩沖對照品存在下的cpm之比
50確定刺激倍數。同樣，通過計算在有拮抗劑存在下的cpm與有緩沖對 照品(其可以包含激動劑，也可以不含激動劑)存在下的cpm之比確定 抑制倍數。
其它受體測定法可以包括確定胞內環核苷酸，例如cAMP或cGMP 的水平。在受體活化導致環核苷酸水平下降的情況下，可以優選的是 使細胞接觸增加胞內環核苷酸水平的活性劑，例如福斯高林，此后在 測定中將受體活化化合物加入到細胞中。在一個實施方案中，可以使 用免疫測定法測定^^內cAMP或cGMP的改變。描述在Offermanns & Simon, J. Bio. Chem. ， 270:15175-15180 (1995)中的方法可以用于 確定cAMP的水平。同樣，描述在Felley-Bosco等，Am. J. Resp. Cell and Mol. Biol. ， 11:159- 164 (1994)中的方法可以用于測定cGMP 的水平。此外，用于測定cAMP和/或cGMP的測定試劑盒描述在美國專 利US 4， 115， 538中，將該專利引入本文作為參考。
在另一個實施方案中，可以測定轉錄水平以便評價測試化合物對 信號轉導的作用。使包含所關注的T2R多肽的宿主細胞與測試化合物
接觸足夠的時間以便進行任何相互作用，然后測定基因表達水平。可 以根據經驗，諸如通過控制時間進程并且測定作為時間函數的轉錄水 平來確定進行這類相互作用的時間長度。可以通過使用本領域技術人 員已知為合適的任何方法測定轉錄的量。例如，可以使用RNA印跡檢 測所關注的蛋白質的mRM表達或可以使用免疫測定法鑒定其多肽產 物。另外，可以如美國專利US 5， 436，128 (引入本文作為參考)中所 述使用應用報道基因的基于轉錄的測定法。報道基因可以為，例如， 氯霉素乙酰轉移酶、螢光素酶、p-半乳糖苷酶、P-內酰胺酶和堿性 磷酸酶。此外，所關注的蛋白質可以通過與第二報道分子，諸如綠色 焚光蛋白連接被用作間接報道分子(例如，參見Mistili & Spector， Nature Biotechnology, 15:961-964 (1997))。
然后將轉錄的量與在沒有測試化合物存在下的相同細胞中的轉錄 量進行比較，或可以將其與在缺乏所關注的T2R多肽的基本上相同的 細胞中轉錄的量進行比較。基本上相同的細胞可以來源于由此制備重組細胞，但尚未通過導入異源DNA被修飾的相同的細胞。轉錄量方面 的任何差異均表明測試化合物以某種方式改變了所關注的T2R多肽的 活性。
4.表達化學感受器的轉基因非人動物
表達本發明的一種或多種味覺感受器序列的非人動物也可以用于
內特異性結合哺乳動:的味覺跨膜受體復合物使被編碼化學感受器 的核酸或其配體結合區穩定或瞬時轉染的非人動物與測試化合物接 觸，并且確定該動物是否通過特異性結合受體多肽復合物對測試化合 物作出反應。
合特異性受體或受體組的味覺刺激物的測定法。這類載體感染的表達 人味覺感受器序列的動物可以用于體內篩查味覺刺激物及碎對例如細 胞生理學(例如對味覺神經元)、對CNS或行為的作用。
的。可以通過多種手段測定多種單個細胞、器官或完整動物參數。例 如，可以通過用感染物，例如腺病毒表達載體遞送在動物味覺組織中 表達本發明的T2R序列。
內源性味覺感受器基因可以保持功能性并且野生型(天然)活性仍 然可以存在。在其它情況中，如果需要通過導入的外源性雜合受體實 現全部味覺感受器活性，那么優選使用基因敲除系。構建非人轉基因 動物，特別是轉基因小鼠以及選擇和制備用于產生轉化細胞的重組構 建體的方法為本領域眾所周知的。
基于如下前提構建"基因敲除"細胞和動物可以通過將新的DM
平，所述的新的DNA序列用于間斷欲抑制的基因的DNA序列的某一部 分。此外，"基因捕獲插入"可以用于破壞宿主基因，并且小鼠胚胎干 (ES)細胞可以用于產生基因敲除的轉基因動物(例如，參見Holzschu，
52Transgenic Res 6:97-106 (1997))。 一般通過互補核酸序列之間的 同源重組插入外源序列。外源序列為所要修飾的靶基因的某一部分， 諸如外顯子、內含子或轉錄調節序列或能夠影響乾基因表達水平的任 何基因組序列；或其組合。在多能胚胎干細胞中通過同源重組的基因 尋靶能夠精確地修飾所關注的基因組序列。任何技術都可以用于產生、 篩選、繁殖基因敲除動物，例如，參見Bijvoet， Hum. Mol. Genet. 7:53—62 (1998); Meredith, J. MoL Med. 75:208-216 (1997); Tojo， Cytotechnology 19: 161-165 (1995); Mudgett， Methods MoL Biol. 48:167-184 (1995); Longo， Transgenic Res. 6:321-328 (1997); 美國專利US5, 616， 491; US5， 464， 764; US 5， 631， 153; US 5， 487， 992; US 5， 627， 059; US 5， 272， 071; W0 91/09955; W0 9 3/09222; W0 96/29411; WO 95/31560; W0.91/12650。
本發明的核酸還可以用作產生"基因敲除"人細胞及其子代的試 劑。同樣，本發明的核酸也可以用作在小鼠中產生"基因敲入"的試劑。 人或大鼠T2R基因序列可以替代小鼠基因組中的直向同源物T2R。按 照這種方式，產生表達人或大鼠T2R的小鼠。然后可以將這種小鼠用 于分析人或大鼠T2R的功能，和用于鑒定這類T2R的配體。
調節劑
測試的作為T2R家族成員調節劑的化合物可以為任何小的化合物 或生物實體，諸如蛋白質、糖、核酸或脂質。另外，調節劑可以為T2R 家族成員的基因工程形式。 一般而言，測試化合物可以為小的化學分 子和肽類。基本上任何化合物均可以在本發明的測定方法中用作潛在 的調節劑或配體，不過，通常可以將化合物溶于水或有機(尤其是基于 DMSO的)溶液。可以設計測定方法以便通過使測定步驟自動化并且為 測定提供來自任何便利來源的化合物來篩選大的化學文庫，所述的測 定一般平行進行(例如，在自動測定法中的微量滴定板上的微量滴定格 中)。應該意識到有許多化合物的供應商，包括Sigma (St. Louis, Mo.)， Aldrich (St. Louis, Mo.)， Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.)， FlukaChemika-Biochemica Analytika (Buchs， Switzerland)等。
在一個實施方案中，高流通量篩選方法包括提供包含大量潛在的 治療化合物(潛在的調節劑或配體化合物)的組合化學或肽文庫。然后 如本文所述在一種或多種測定法中篩選這類"組合化學文庫"或"配體 文庫"以便鑒定那些展示出所需特征活性的文庫成員(特別是化學種類 或亞類)。由此鑒定的化合物可以用作常規的"引導化合物"或自身可以 用作潛在的或實際的消費產品。
組合化學文庫為通過化學合成或生物合成，通過合并許多化學" 結構單元"，諸如試劑產生的不同化合物的集合。例如，通過按照每種
可能的方式為指定化合物長度(即，多肽化合物中氨基酸的數目)合并 一組化學結構單元(氨基酸)形成線性組合化學文庫，諸如多肽文庫。 可以通過這類化學結構單元的組合混合合成數以百萬計的化合物。
組合化學文庫的制備和篩選為本領域技術人員眾所周知的。這類 組合化學文庫包括，但不限于肽文庫(例如，參見美國專利 US5,010，175， Furka， Int. J. Pept. Prot. Res. ， 37:487-93 (1991) 和Houghton等，Nature, 354:84-88 (1991))。還可以使用產生化學 多樣性文庫的其它化學物質。這類化學物質包括，但不限于類肽(例 如WO 91/19735);編碼的肽類(例如W0 93/20242);隨機生物寡聚物(例 如W0 92/00091);苯并二氮萆類(例如美國專利US 5， 288， 514); diversomers，諸如乙內酰脲類、苯并二氮萆類和二肽類(Hobbs等， PNAS. , 90:6909-13 (1993));插烯多肽類(Hagihara等,J. Amer. Chem. Soc， 114:6568 (1992));具有葡萄糖主鏈的非肽類肽模擬物 (Hirschmann等，J. Amer. Chem. Soc， 114:9217-18 (1992));小化 合物文庫中的類似有機合成物(Chen等，J. Amer. Chem. Soc, 116:2661 (1994));低聚氨基曱酸酯類(Cho等，Science, 261:1303
(1993) );肽基膦酸酯類(Campbell等，J. Org. Chem. ， 59:658
(1994) );核酸文庫(Ausubel， Berger，和Sambrook，所有文獻均參見 上文)；肽核酸文庫(美國專利US 5， 539， 083);抗體文庫(Vaughn等， Nature Biotechnology, 14 (3) :309-14 (1996)和PCT/US96/10287);
54碳水化合物文庫(Liang等，Science, 274: 1520-22 (1996)和美國專 利US 5,593, 853);小有機分子文庫(苯并二氮萆類，Baum， C&EN， Jan 18，第33頁(1993);噻唑烷酮類和間噢唑酮類，美國專利US 5， 549， 974;吡咯烷類，美國專利US 5， 525， 735和US 5， 519， 134; 嗎啉代化合物，美國專利US 5，506， 337;苯并二氮萆類，US 5， 288， 514 等)。
用于制備組合文庫的裝置為可商購的(例如，參見357 MPS， 390 MPS (Advanced Chem. Tech， Louisville Ky.) ， Symphony (Rainin， Woburn, Mass.)， 433A (Applied Biosystems, Foster City, Calif.), 9050 Plus (Millipore， Bedford, Mass.))。此外，許多組合文庫自 身為可商購的(例如，參見ComGe證，Princeton, N. J. ; Tripos, Inc., St. Louis, Mo. ; 3D Pharmaceuticals, Exton， Pa. ; Martek Biosciences; Columbia, Md.等)。
在本發明的一個方面中，T2R調節劑可以用于任何食品、糖果、 藥物組合物或其組分以由此以所需方式調節產品、組合物或組分的 味道。例如，可以加入強化苦味感覺的T2R調節劑以便使產品或組合 物具有苦味，而可以加入阻斷苦味感覺的T2R調節劑以便阻斷產品或 組合物的苦味。
本發明所鑒定的化合物的應用
可以將按照本發明鑒定的化合物加入到食品、飲料或藥物組合物 中，以便調節，優選阻斷因苦味化合物，例如雷尼替丁、對乙酰氨基 酚、地那銨和/或士的寧或結構相關和其它體苦味化合物活化hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hTlR13、 MT2R54、 hT2R61和/或hT2R75引起的苦味。 例如，阻斷對乙酰氨基酚或相關化合物活化hT2R54的化合物可以用作 藥物中的添加劑以便阻斷與對乙酰氨基酚相關的苦味。例如，可以將 這些化合物加入到包含對乙酰氨基酚的兒科用藥物制劑中或以有效抑 制苦味的用量加入。
阻斷hT2R8或hT2R54、 hT2R75活化的化合物可以用于食品、飲料或藥物產品中以便阻斷雷尼替丁或其它活化這些受體的苦味化合物， 例如結構相關化合物的苦味。特別是，預計使用所披露的測定方法鑒
關的苦味。
此外，抑制地那銨活化hT2R8、 hT2R10、 hT2R13、 hT2R54、 hT2R61 或hT2R75的化合物可用作食品、飲料或藥物制劑中的添加劑以便阻斷 可歸因于這些受體活化的苦味。因為地那銨為非常強烈的苦味化合物， 所以抑制這些受體的化合物應當有效抑制多種苦味化合物的苦味。這 一結果通過如下事實證實地那銨活化許多不同的苦味味覺感受器并 且進一步已知地那銨4汙生物也活化T2R。類似地，在阻斷hT2R8、hT2R9、 hT2R10、 hT2R54和/或hT2R75活化的測定方法中鑒定的化合物有可能 用作食品、飲料和藥物中的添加劑，以便阻斷與活化這類受體的化合 物，例如士的寧或相關化合物的苦味。優選地，在品嘗試驗，例如人 品嘗試驗中證實在基于主題T2R細胞的測定方法中鑒定的化合物的味 覺調節特性。
試劑盒
T2R基因及其同源物為用于鑒定味覺感受器細胞，用于法醫和親 子關系確定以及用于檢驗味覺轉導的有用工具。與T2R核酸，諸如T2R 探針和引物特異性雜交的T2R家族成員特異性試劑和與T2R蛋白質， 例如T2R抗體特異性結合的T2R特異性試劑用于檢驗味細胞表達和味 覺轉導調節。
對樣品中的T2R家族成員中存在DM和RNA的核酸測定方法包括 許多本領域技術人員公知的技術，諸如DNA印跡分析、RNA印跡分析、 斑點印跡、RNA酶保護、Sl分析、擴增技術，諸如PCR和原位雜交。 例如，在原位雜交中，靶核酸從其細胞環境中釋放，如此可用于細胞 內的雜交，同時維持細胞形態以便隨后的解釋和分析。下列文章中提 供了原位雜交技術的概述Singer等，Biotechniques， 4:230250 (1986); Haase等，Methods inVirology， vol. VII， 189-226 (1984);和 Names 等,eds.， Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (1987)。此外，可以使用上述各種免疫測定技術檢測T2R 蛋白質。 一般將測試樣品同時與陽性對照(例如表達重組T2R蛋白質的 樣品)和陰性對照進行比較。
本發明還提供了用于篩選T2R家族成員調節劑的試劑盒。這類試 劑盒可以由易于得到的材料和試劑制備。例如，這類試劑盒可以包含 下列材料中的任意一種或多種T2R核酸或蛋白質、反應試管和測試 T2R活性的說明書。任選地，該試劑盒包含功能性T2R多肽。可以按 照本發明制備各種各樣的試劑盒和成分，這取決于試劑盒的預期使用 者和該使用者的具體需求。
由于一般性地描述了本發明，所以通過參照下列實施例更易于理 解本發明，這些實施例作為說明提供，而并非打算起限定作用。應當 理解可以在不背離本發明的實質和范圍的情況下對本文披露的典型實 施方案進行各種改進和改變。
實施例 實施例1
在本實施例中，我們證實苦味化合物雷尼替丁特異性活化具有本 申請中包含的DNA序列的hT2R8、 hT2R54和hT2R75人苦味感受器。
些受體的活化。簡言之，通過基于磷酸Ca2+或脂質的系統使用包含特 定hT2R54核酸序列的質粒瞬時轉染穩定表達大T-細胞抗原和嵌合G 蛋白(G16gust44)的人胚胎腎細胞。將瞬時轉染的細胞接種入24孔培 養平板并且使功能表達進行總計48小時。然后將細胞與對鈣具有特異 性的熒光染料(Fluo-4或Fura-2; Molecular Probe)—起孵育，所述 的熒光染料提供快速、簡便和可靠的用于檢測細胞內部鈣濃度改變的 基于熒光的方法。將雷尼替丁加入到細胞中引起導致PLC活化和隨后 胞內鉤濃度增加的信號級聯放大。這種釣濃度的增加改變了細胞內部 鈣染料的熒光特性。使用熒光顯微鏡檢和特定設計軟件(ImagingWorkbench, Axon)監測這些改變。我們使用這種方法觀察到雷尼替丁 在10mM下特異性活化各自表達hT2R8、hT2R54和hT2R75的細胞(增加 胞內鉤濃度)，但對蔗糖無反應。
實施例2
將在其細胞表面上穩定表達高水平的hT2R8或hT2R54的 HEK-G16gust44細胞系用于高流通量篩選測定。在這一平臺中，在測 定前18-24小時將細胞接種入96孔或384孔培養平板。然后將細胞與 熒光鈣敏感性染料(Molecular Devices)—起孵育并激發且在標準焚 光強度平板讀出器(FLIPR或VIPR)中讀取。我們使用這種方法能夠進 一步表征雷尼替丁對hT2R8和hT2R54的作用。我們發現雷尼替丁以典 型的劑量反應關系活化hT2R8和hT2R54 (參見附圖2)。
實施例3
在本實施例中，我們證實苦味化合物對乙酰氨基酚特異性活化具 有本申請中SEQ ID N0: 10中包含的DM序列的hT2R54人苦味感受器。
對該受體的活化。簡言之，通過基于磷酸0&2+或脂質的系統使用包含 特定hT2R54核酸序列的質粒瞬時轉染穩定表達大T-細胞抗原和嵌合G 蛋白(G16gust44)的人胚胎腎細胞。將瞬時轉染的細胞接種入24孔培 養平板并且使功能表達進行總計48小時。然后將細胞與對鈣具有特異 性的熒光染料(Fluo-4或Fura-2; Molecular Probe)—起孵育，所述 的熒光染料提供快速、簡便和可靠的用于檢測細胞內部鉤濃度改變的 基于熒光的方法。將對乙酰氨基酚加入到細胞中引起導致PLC活化和 隨后胞內鈣濃度增加的信號級聯放大。這種鈣濃度的增加改變了細胞 內部鈣染料的熒光特性。使用熒光顯微鏡檢和特定設計軟件(Imaging Workbench, Axon)監測這些改變。我們使用這種方法觀察到對乙酰氨 基酚特異性活化表達hT2R54的細胞(增加胞內鈣濃度)(參見附圖3)。
58實施例4
將在其細胞表面上穩定表達高水平的hT2R54的HEK-G16gust44 細胞系用于高流通量篩選測定。在這一平臺中，在測定前18-24小時 將細胞接種入96孔或384孔培養平板。然后將細胞與熒光釣敏感性染 料(Molecular Devices) —起孵育并激發且在標準熒光強度平板讀出 器(FLIPR或VIPR)中讀取。我們使用這種方法能夠進一步表征對乙酰 氨基酚對hT2R54的作用。我們發現對乙酰氨基酚以典型的劑量反應關 系活化hT2R54(參見附圖4)。
實施例5
在本實施例中，我們證實強苦味化合物苯甲酸地那銨特異性活化 具有本申請中包含的DNA序列的hT2R8、 hT2R10、 hT2R13、 hT2R54、 hT2R61和hT2R75人苦p木感受器。
對這些受體的活化。簡言之，通過基于磷酸0&2+或脂質的系統使用包 含特定hT2R54核酸序列的質粒瞬時轉染穩定表達大T-細胞抗原和嵌 合G蛋白(G16gust44)的人胚胎腎細胞。將瞬時轉染的細胞接種入24 孔培養平板并且使功能表達進行總計48小時。然后將細胞與對鉤具有 特異性的焚光染料(Fluo-4或Fura-2; Molecular Probe)—起賻育, 所述的熒光染料提供快速、簡便和可靠的用于檢測細胞內部鉤濃度改 變的基于熒光的方法。將苯甲酸地那銨加入到細胞中引起導致PLC活 化和隨后胞內鈣濃度增加的信號級聯放大。這種鈞濃度的增加改變了 細胞內部鈣染料的熒光特性。使用焚光顯微鏡檢和特定設計軟件 (Imaging Workbench, Axon)監測這些改變。我們使用這種方法觀察到 苯甲酸地那銨特異性活化各自表達hT2R8、 hT2R10、 hT2R13、 hT2R54、 hT2R61和hT2R75的細胞(增加胞內鉤濃度)(參見附圖5)。
實施例6
將在其細胞表面上穩定表達高水平的hT2R8的HEK-G16gust44細胞系用于高流通量篩選測定。在這一平臺中，在測定前18-24小時將 細胞接種入96孔或384孔培養平板。然后將細胞與熒光鉤敏感性染料 (Molecular Devices)—起孵育并激發且在標準熒光強度平板讀出器 (FLIPR或VIPR)中讀取。使用這種方法我們發現苯甲酸地那銨以典型 的劑量反應關系活化hT2R8(參見附圖6)。
實施例7
在本實施例中，我們證實強苦味化合物士的寧特異性活化具有本 申請中包含的DNA序列的hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hT2R54和hT2R75 人苦味感受器。
受體的活化。簡言之，通過基于磷酸Ca2+或脂質的系統使用包含特定 hT2R54核酸序列的質粒瞬時轉染穩定表達大T-細胞抗原和嵌合G蛋白 (G16gust44)的人胚胎腎細胞。將瞬時轉染的細胞接種入24孔培養平 板并且使功能表達進行總計48小時。然后將細胞與對鈣具有特異性的 熒光染料(Fl'uo-4或Fura-2; Molecular Probe)—起孵育，所述的熒 光染料提供快速、簡便和可靠的用于檢測細胞內部鈣濃度改變的基于 熒光的方法。將士的寧加入到細胞中引起導致PLC活化和隨后胞內鈣 濃度增加的信號傳導級聯。這種鈣濃度的增加改變了細胞內部鈣染料 的熒光特性。使用熒光顯微鏡檢和特定設計軟件(Imaging Workbench, Axon)監測這些改變。我們使用這種方法觀察到士的寧特異性活化各自 表達hT2R8、 hT2R9、 hT2R10、 hT2R54和hT2R75的細胞(增加胞內鈣
濃度)。
Se誦yx hT2R8 DNA序列(SEQ ID NO: 2)
60ACATGTAGAAAAATTGCCTGCATGATATGA
蛋白質序列(SEQ ID NO: 3)
MFSPADNIFlIIilTGEFILGILGNGi'IAIiVNW:iDWIKKKKISTVDY工I/rN liVlAiaCLlSVMVVNGIVIVLOTDVYTKNKQQlVIFTFWTFANYLNMWIT TCLNVFYFLKIASSSHPLFLWLKWjaDMVVHWIIiLGCFAISIJ^SLIAAI VLSCDYRFHA工細KRN工TEMEWSKIPYFEPLTLFNLFAIVPF工VSLIS FFLLVRSLWRHTKOlKLYATGSRDPSTEVHVRAIKTMTSFIFFBTIiYYIS S工LMTFSYLMTKYKLAVEFGEIAA工IjYPLGHSL工LIV畫KLRQTFVRMIi TCRKIACMI
Se誦yx hT2R9 MA序列(SEQ ID NO: 4)
AAGTGTTTCCTTAGAAGMGAAAGCCTTTTGTTCCATAG
蛋白質序列(SEQ ID NO: 5)
MPSAIEAIYIIiaAGEI/riGIWGNGFIVLVNCIDWLKRRDISLIDIIljlS
SCIiSIFYLLKIANISHPFFFWIiKLKlNkvMLAII^GSFLlSIillSVPKND DMWYHliFKVSHEENITWKFKVSKIPGTFKQI/TLNIiGVMVPFILCIiISFFL
MTSSAMPQGKLVU!IGD工VTV工FPSSHSFIIi工MGNSiaREAEXKMIiRFV
Se議yx hT2R10 DNA序列(SEQ ID NO: 6)
TACTCGGCCGTT
GCGTTCTEHACG3
TTTACTAGTCTC
ATTTTAGGTGATAGGAAAAATCTCAGAGTCACATAG
蛋白質序列(SEQ ID NO: 7)
MLRVVEGIFIFVWSESVFGVIiGNGFIGIiVNCIDCAKNKIjSTIGFII/rGIi AISR工FL工WI3:iTDGFIQ3CFS卯mSGNIi工EYISYFWV:CGNQSSMWFAT SLSIFYFLKIAWFSNYIFLWLKSBTNMVIiPFMIVFIjKrSSKLMFMIAKI ]jNDYKTKNDTVWDIiMMYKSEYF工KQ工IiIiNLGV工FFmjSIiITCIF:LIIS:L WRHNRQMQSNVTGLRDSNTEMVKAMKVIilSFIILFIIiYFlGMAIEISCF
RKMIiRVT
Se誦yx hT2R13 DNA序列(SEQ ID NO: 8)
蛋白質序列(SEQ ID NO: 9)
MESAIiPSIFTIiVIIAEFIIGMIiSNGFIVIiINCIDWVSKRELSSVDKIJjII
TIFSlBTIXKIASFSSPAmrijKWRVNKVILMIIjIiGTIiVFLFLNrjIQINM HIKDWLDRYERNTTWFSMSDFETFSVSVKFTMTMFSI/TPFTVAFISFIjL
IilFSIiQKHIiQKMQIjNYKGHRDPRTKVHTNALKIVISniliFYASFEVLCVIiI
SWISELYQNTV工YMLCETlGVFSPSSHSmiIiGNAKLRQAFIiLVAAKVW AKR
Se誦yx hT2R54 DNA序列(SEQ ID NO: 10)
G A
c A
c G
T c
Ace
c G G
A c &
T A ad G A T
ia c
c T
A G
T T
c A
G -A
c T
A c
eA A G
TAT
T G T
A G A
ATT
A G T
G T c TGTGAAAGGAGAGAAGACTTCATCTCCATAG
蛋白質序列(SEQ ID NO: 13)
MITHXPIIFSSIiVVVTH/IGNBTUSIGFIAIA/NSIESFKROKISFADQII/rA LAVSRVGIjLWVL3jIiNWYSTVIiNPAFNS窗RTTAYNIWAVINHFS亂AT TLSIFYIiLKlANFSNFIFLHIiKRRVKSVIliVMLLGPLI^IiACHIiFVINMN EIVRTKEFEGNMTWKIKLKSAMYFS,VTMVANLVPFTI1T"SFMt1I1IC SliCKHLKKMQIiRGKGS0DPS窗HIfCTVISFLIiIiOaYFIiSIM工SVW SFGSI;ENKPVFMrcKAIRFSYPSIHPFIIiIWGNKKLKQTFriSVFW卿YW VKGEKTSSP
Senomyx hT2R75 DNA序列(SEQ ID NO: 14)
蛋白質序列(SEQ ID NO: 11)
MTKLCDPAESELSPFLITL工LAVLLAEYIilGIIMGF雄IHAAEWVQNK AVSTSGRILVFLSVSRIAIiQS副LEITISSTSLSFYSEDAVYYAFKlSF IFIiNFCS:LWFAAWIjSFFYFVK畫FSYPIjFIiKIjRWRITGLIPW:L;LWIiSVF ISFSHSMFCINICTVYCNNSFPIHSSNSTKKTTXiSEINVVGLAFFFNLGI VTPLIMniljTATUilljSIjraHTLHMGSNATGSNDPSMEAHMGAlKAISYF IiILYIFNAVALFIYLSNMFDINSLWNNLCQIIMAAYPASHSILLIQDNPG LRRAWKRLQLRLHLYPKEWTIi
Senomyx hT2R61 DNA序列(SEQ ID NO: 12)
c
G
T
c
G
c
G
G
G
G
G
T
G
c
c
T
T
T c
c c
G G
c T
c c
A G
G c
T T
G a!
A G
G T
ATA
T c
A T
G G G
A G A G
G
G
c
T
G
c
c
c CH
c A
c G
T G
c c
G G
T G
c T
c T
c G
A G
ATA
T , —，
c
c
c c
c
T A
c c
GAT
T T A
T c G
AAA
」c c
T c c
G G fttj
c G
G T A
G c A
T c T
G c G
G A G
T c T
Tec
GAT
c c G
T T A
A T G
Ei c T
A c
G I
T PC A T
G A G c
G T T G
T T A G
, G G
T G
T c
T A c A
c A
T c
c G
A T
c
G T
A G
T T c
c T T
A c T
c c
c ;
G
c
-G
T c G
A G G
T T A
A O G c &
c
3 T G w
c G T &
mi -:
c T G
D c貓
G
c
c
c
G
G
T
T A
A G
G T
T G
G T
G c
a! cGTGAAAGGAGAGAAGCCTTCATCTTCATAG
蛋白質序列(SEQ ID NO: 15)
M工TFIiP:i工FSIIiIVVTFVIGNFANGFIA扁S工EWFKRQKISFADQIIiTA IiAVSRVGLIiWVIiVLNWYATEIiNPAFNS工EVRITAYNVWAVINHFSNWIiAT SIiSIFYLLKIAMFSNLIFIiHIiKRRVKSVVIiVIIiLGPIiLFIiVCHIiFVINMN QIIWTKEYEGNMTWKIKLRSAMYLSNTTVTlLANLVPrTLTIilSFIiLLIC SliCKHLKKMQLHGKGSQDPSMKVHIKALQTVTSFLLLCAIYFLSIIMSVW SFESLENKPVFMFCEAIAFSYPSTHPFILIWGNKKIiKQTFIiSVliWHVRYW VKGEKPSSS
盡管前面的詳述已經描述了本發明的幾個實施方案，但是應當理 解以上描述僅為例示性的而并不用來限定所披露的本發明。本發明僅 由隨后的權利要求所限定。
a: T
c G
;G G c T T
-c A A T c
_ T c A c G
-T G T G G
-T- c c c G
-c c c T T
:T c T T T
-A T G A T
-T A T c T
-A G c G G
一 T幾T T c
:c c T n: T
-c T c T T
-c c A c T
;a: T T G c
一 G A T A T
;T G T A T
CAT
T c A
c T c
CCA
G c A
T G a;
T G G
<! G G
A T G
A G G
c G c A
c T T c
G c c G
ATA
T G 5
c
c T T
G G c
TAT
T T c
c T T
G T T
<=^ G c
6權利要求
1. 用于鑒定調節對雷尼替丁作出特異性反應的選自hT2R8、hT2R54和hT2R75的人苦味味覺感受器的化合物的測定方法，該方法包括i. 篩選對雷尼替丁或結構相關化合物誘導被雷尼替丁或結構相關化合物活化的hT2R8、hT2R54、hT2R75或其片段、變體、直向同源物、突變體或嵌合體的活化具有作用的化合物；和ii. 基于所述化合物對由雷尼替丁或結構相關化合物活化所述感受器的作用確定其是否調節與hT2R8、hT2R54和/或hT2R75相關的苦味。
2. 權利要求1所述的測定方法，其中所述的hT2R8選自i. SEQ ID NO: 3中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID N0:2中包含的序列雜交的核 酸序列編碼；或Hi.具有與SEQ ID NO: 3中包含的多肽具有至少90°/。序列同一性 的氨基酸序列。
3. 權利要求1所述的測定方法，其中所述的hT2R54選自 i. SEQ ID NO: ll中包含的氨基酸序列；U.由在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 10中包含的序列雜交的核 酸序列編碼；或iii. 具有與SEQ ID NO: 11中包含的多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
4. 權利要求1所述的測定方法，其中所述的hT2R75選自 i. SEQ ID NO: 15中包含的氨基酸序列；U.由在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 14中包含的序列雜交的核 酸序列編碼；或iii.具有與SEQ ID NO: 15中包含的多肽具有至少90°/。序列同一 性的氨基酸序列。
5. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感 受器在細胞膜上表達。
6. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感 受器在分離的細胞膜上表達。
7. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感 受器在完整細胞上表達。
8. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感 受器在真核細胞上表達。
9. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感 受器由兩棲動物、哺乳動物或昆蟲細胞表達。
10. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺 感受器在選自HEK293、 BHK、 C0S、 HEK293T、 CHO和爪蟾卵母細胞的細 胞上表達。
11. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其為熒光測定法。
12. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其為結合測定法。
13. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，該方法通過測定 所述化合物對胞內離子濃度的影響來檢測該化合物的作用。
14. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述的 化合物對胞內鈉或4丐的作用。
15. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述的 化合物對細胞膜電位的作用。
16. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述的 化合物對所述的味覺感受器的轉錄的作用。
17. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中基于所述的 化合物在阻斷所述的味覺感受器與雷尼替丁的相互作用的能力選擇該 化合物。
18. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述的 化合物對胞內cAMP、 cGMP或IP3的作用。
19. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器包含所述味覺感受器的胞外域或跨膜區。
20. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的測定 方法使用鈣特異性熒光染料檢測鉤的改變。
21. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的測定 方法使用選自Fluo-3、 Fluo-4和Fura-2的染料檢測胞內鈣的改變。
22. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺 感受器在溶液中。
23. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其為檢測光語特 征、流體動力學特征或溶解度的改變的結合測定法。
24. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述的 化合物對所述的味覺感受器與G蛋白復合的作用。
25. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述的 化合物對所述的味覺感受器與G蛋白復合的作用，所述的G蛋白選自 轉導素、味轉導素、G^和G^。
26. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其為熒光偏振測 定法。
27. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器與固相基質結合。
28. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其為高流通量測定法。
29. 權利要求1-4中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺 感受器由HEK293細胞表達。
30. 用于鑒定調節特異性應答對乙酰氨基酚的苦味味覺感受器的 化合物的測定方法，其中所述的味覺感受器是hT2R54，該方法包括i.篩選對對乙酰氨基酚或結構相關化合物誘導被對乙酰氨基酚 或結構相關化合物活化的hT2R54或其片段、變體、直向同源物、突變 體或嵌合體的活化具有作用的化合物；和i i.基于所述化合物對由對乙酰氨基酚或結構相關化合物活化所 述感受器的作用確定其是否調節hT2R54。
31. 權利要求30所述的測定方法，其中所述的hT2R54選自i. SEQ ID NO: 11中包含的多肽；ii. 由與SEQ ID NO: 10中包含的核酸序列特異性雜交的核酸序列 編碼的多肽；或iii. 與SEQ ID NO: 11中包含的多肽具有至少90%序列同一性的 多肽。
32. 權利要求30或31所述的測定方法，其中所述的味覺感受器 在分離的細胞膜上表達。
33. 權利要求30或31所述的測定方法，其中所述的味覺感受器 在完整的細胞上表達。
34. 權利要求30或31所述的測定方法，其中所述的味覺感受器 在真核細胞上表達。
35. 權利要求30或31所述的測定方法，其中所述的味覺感受器 在兩棲動物、哺乳動物或昆蟲細胞上表達。
36. 權利要求30或31所述的測定方法，其中所述的味覺感受器 在選自HEK293、 BHK、 C0S、 HEK293T、 CHO和爪蟾卵母細胞的細胞上表 達。
37. 權利要求30或31所述的測定方法，其為熒光測定法。
38. 權利要求30或31所述的測定方法，其為結合測定法。
39. 權利要求30或31所述的測定方法，用于通過測定所述化合 物對胞內離子濃度的作用來檢測該化合物的作用。
40. 權利要求30或31所述的測定方法，用于檢測所述化合物對 胞內鈉或鉤的作用。
41. 權利要求30或31所述的測定方法，用于檢測所述化合物對 細胞膜電位的作用。
42. 權利要求30或31所述的測定方法，用于檢測所述化合物對 所述的味覺感受器的轉錄的作用。
43. 權利要求30或31所述的測定方法，其中基于所述化合物阻 斷所述的味覺感受器與對乙酰氨基酚相互作用的能力選擇所述的化合物。
44. 權利要求30或31所述的測定方法，用于檢測所述的化合物 對胞內cAMP、 cGMP或IP3的作用。
45. 權利要求30或31所述的測定方法，其中所述的味覺感受器 包含所述的味覺感受器的胞外域或跨膜區。
46. 權利要求30或31所述的測定方法，其中所述的測定方法使用鈣特異性熒光染料檢測鈣的改變。
47. 權利要求30或31所述的測定方法，其中所述的測定方法使 用選自Fluo-3、 Fluo-4和Fura-2的染料檢測胞內鉤的改變。
48. 權利要求30或31所述的測定方法，其中所述的味覺感受器 在溶液中。
49. 權利要求30或31所述的測定方法，其為檢測光譜特征、流體動力學特征或溶解度改變的結合測定法。
50. 權利要求30或31所述的測定方法，用于檢測所述化合物對 所述的味覺感受器與G蛋白復合的作用。
51. 權利要求30或31所述的測定方法，用于檢測所述的化合物 對所述的味覺感受器與G蛋白復合的作用，所述的G蛋白選自轉導素、 味轉導素、G^和Ge^。
52. 權利要求30或31所述的測定方法，其為熒光偏振測定法。
53. 權利要求30或31所述的測定方法，其中所述的味覺感受器與固相基質結合。
54. 權利要求30或31所述的測定方法，其為高流通量測定法。
55. 權利要求30或31所述的測定方法，其中所述的味覺感受器 由HEK293細月包表達。
56. 用于鑒定調節對苯曱酸地那銨作出特異性反應的苦味味覺感 受器的化合物的測定方法，所述的苦味味覺感受器選自hT2R8、 hT2R10、 hTlR13、 hT2R54、 hT2R61和hT2R75，該方法包括i.篩選對苯甲酸地那銨或結構相關化合物誘導被苯曱酸地那銨 或結構相關化合物活化的hT2R8、 hT2R10、 hTlR13、 hT2R54、 hT2R61和hT2R75或其片段、變體、直向同源物、突變體或嵌合體的活化具有 作用的化合物；和ii.基于所述化合物對由苯曱酸地那銨或結構相關化合物活化所 述感受器的作用確定其是否調節hT2R8、 hT2R10、 hTlR13、 hT2R54、 hT2R61和hT2R75。
57. 權利要求56所述的測定方法，其中所述的hT2R8選自i. SEQ ID NO: 3中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 2中包含的序列雜交的核 酸序列編碼；或iii. 具有與SEQ ID NO: 3中包含的多肽具有至少90%序列同一性 的氨基酸序列。
58. 權利要求56所述的測定方法，其中所述的hT2R10選自i. SEQ ID NO: 4中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID N0:6中包含的序列雜交的核 酸序列編碼；或iii. 具有與SEQ ID NO: 4中包含的多肽具有至少90°/。序列同一性 的氨基酸序列。
59. 權利要求56所述的測定方法，其中所述的hT2R13選自i. SEQ ID NO: 9中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 8中包含的序列雜交的核 酸序列編碼；或iii. 具有與SEQ ID NO: 9中包含的多肽具有至少90°/。序列同一性 的氨基酸序列。
60. 權利要求56所述的測定方法，其中所述的hT2R54選自i. SEQ ID NO: 11中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 10中包含的序列雜交的核 酸序列編碼；或iii. 具有與SEQ ID NO: 11中包含的多肽具有至少90%序列同一 性的氨基酸序列。
61. 權利要求1所述的測定方法，其中所述的hT2R61選自i. SEQ ID NO: 13中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 12中包含的序列雜交的核 酸序列編碼；或iii. 具有與SEQ ID NO: 13中包含的多肽具有至少90%序列同一 性的氨基酸序列。
62. 權利要求56所述的測定方法，其中所述的hT2R75選自i. SEQ ID NO: 15中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 14中包含的序列雜交的核 酸序列編碼；或iii. 具有與SEQ ID NO: 15中包含的多肽具有至少90%序列同一 性的氨基酸序列。
63. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的味 覺感受器以細胞膜表達。
64. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器以分離的細胞膜表達。
65. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器以完整細胞表達。
66. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器以真核細胞表達。
67. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的味 覺感受器由兩棲動物、哺乳動物或昆蟲細胞表達。
68. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的味 覺感受器由選自HEK293、 BHK、 COS、 HEK293T、 CHO和爪蟾卵母細胞的 細胞表達。
69. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其為熒光測定法。
70. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其為結合測定法。
71. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，用于通過測定所述化合物對胞內離子濃度的作用來檢測該化合物的作用。
72. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述化合物對胞內鈉或鉤的作用。
73. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述化合物對細胞膜電位的作用。
74. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述化合物對所述的味覺感受器的轉錄的作用。
75. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中基于所述化合物阻斷所述的味覺感受器與地那銨相互作用的能力選擇所述的化合物。
76. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述的化合物對胞內cAMP、 cGMP或IP3的作用。
77. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器包含所述的味覺感受器的胞外域或跨膜區。
78. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的測定方法使用鉤特異性熒光染料檢測鈣的改變。
79. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的測定方法使用選自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料檢測胞內鈣的改變。
80. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器在溶液中。
81. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其為檢測光鐠特征、流體動力學特征或溶解度改變的結合測定法。
82. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述化合物對所述的味覺感受器與G蛋白復合的作用。
83. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述的化合物對所述的味覺感受器與G蛋白復合的作用，所述的G蛋白選自轉導素、味轉導素、G^和Ga"。
84. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其為熒光偏振測定法。
85. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器與固相基質結合。
86. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其為高流通量測定法。
87. 權利要求56 - 62中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器由HEK293細胞表達。
88. 用于鑒定調節對士的寧作出特異性反應的人味覺感受器的化合物的測定方法，所述的人味覺感受器選自hT2R8、 hT2R9、 hTlR10、hT2R54和hT2R75，該方法包括合物活化的hT2R8、 hT2R9、 hTlR10、 hT2R54和hT2R75或其片段、變體、直向同源物、突變體或嵌合體的活化具有作用的化合物；和器的作用確定其是否調節與hT2R8、 hT2R9、 hTlR10、 hT2R54和hT2R75相關的苦味。
89. 權利要求88所述的測定方法，其中所述的hT2R8選自i. SEQ ID NO: 3中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 2中包含的序列雜交的核酸序列編碼；或iii. 具有與SEQ ID NO: 3中包含的多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
90. 權利要求88所述的測定方法，其中所述的hT2R9選自i. SEQ ID NO: 5中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 4中包含的序列雜交的核酸序列編碼；或iii. 具有與SEQ ID NO: 5中包含的多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
91. 權利要求1所述的測定方法，其中所述的hT2R10選自i. SEQ ID N0:4中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID N0:6中包含的序列雜交的核酸序列編碼；或iii. 具有與SEQ ID NO: 7中包含的多肽具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
92. 權利要求88所述的測定方法，其中所述的hT2R54選自i. SEQ ID NO: 11中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 10中包含的序列雜交的核酸序列編碼；或Hi.具有與SEQ ID NO: 11中包含的多肽具有至少90°/。序列同一性的氨基酸序列。
93. 權利要求88所述的測定方法，其中所述的hT2R75選自i. SEQ ID NO: 15中包含的氨基酸序列；ii. 由在嚴格雜交條件下與SEQ ID NO: 14中包含的序列雜交的核酸序列編碼；或iii. 具有與SEQ ID NO: 15中包含的多肽具有至少90°/。序列同一性的氨基酸序列。
94. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器在細胞膜上表達。
95. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器在分離的細胞膜上表達。
96. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器在完整細胞上表達。
97. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器在真核細胞上表達。
98. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器由兩棲動物、哺乳動物或昆蟲細胞表達。
99. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所迷的味覺感受器由選自HEK293、 BHK、 COS、 HEK293T、 CHO和爪蟾卵母細胞的細胞表達。
100. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其為焚光測定法。
101. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其為結合測定法。
102. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，用于通過測定所述化合物對胞內離子濃度的作用來檢測該化合物的作用。
103. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述化合物對胞內鈉或釣的作用。
104. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述化合物對細胞膜電位的作用。
105. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述化合物對所述的味覺感受器的轉錄的作用。
106. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中基于所述化合物阻斷所述的味覺感受器與士的寧相互作用的能力選擇所述的化合物。
107. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述的化合物對胞內cAMP、 cGMP或IP3的作用。
108. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器包含所述的味覺感受器的胞外域或跨膜區。
109. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所述的測定方法使用鈣特異性熒光染料檢S鈣的改變。
110. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所述的測定方法使用選自Fluo-3、Fluo-4和Fura-2的染料檢測胞內鈣的改變。
111. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器在溶液中。
112. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其為檢測光譜特征、流體動力學特征或溶解度改變的結合測定法。
113. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述化合物對所述的味覺感受器與G蛋白復合的作用。
114. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，用于檢測所述的化合物對所述的味覺感受器與G蛋白復合的作用，所述的G蛋白選自轉導素、味轉導素、G^和G^。
115. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其為熒光偏振測定法。
116. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所述的味覺感受器與固相基質結合。
117. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其為高流通量測定法。
118. 權利要求88-93中任意一項所述的測定方法，其中所述的p未覺感受器由HEK293細胞表達。
全文摘要
本發明涉及以下發現T2R味覺感受器家族中的特異性人味覺感受器對特定的苦味配體，即，對乙酰氨基酚、雷尼替丁、士的寧和地那銨作出反應。本發明進一步涉及這些感受器在鑒定配體的測定法中的應用，所鑒定的配體調節這些味覺感受器的活化并且可以用作食品、飲料和藥物中的添加劑以調節(阻斷)與T2R-相關的苦味。
文檔編號G01N33/53GK101467040SQ200680009985
公開日2009年6月24日 申請日期2006年1月6日 優先權日2005年2月8日
發明者H·唐, H·許, Q·李, 李曉東 申請人:塞諾米克斯公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
