專利名稱：磁性熒光微球及其制備方法和采用該磁性熒光微球進行生物分子檢測的方法
技術領域：
本發明涉及一種磁性熒光微球及其制備方法和采用該磁性熒光微球進行生物分子檢測的方法。
自1977年Horan首次利用流式細胞儀將高分子微球應用于免疫學檢測以來，以高分子微球作為載體的生物檢測技術已經滲透到細胞生物學、分子生物學、免疫學測定、醫學等各個領域，顯示出廣闊的應用前景。由于流式細胞儀具有可根據微球粒徑及所帶特征熒光信號對微球進行特異性識別的能力，因此如何利用高分子微球結合流式細胞儀建立高通量、自動化生物大分子的檢測技術，已成為目前微球技術新的研究熱點。
通過在高分子微球表面或內部摻入一種或多種熒光物質制備成的熒光高分子微球，最初被用作校準流式細胞儀和熒光顯微鏡的熒光準質微球，并逐漸被應用于細胞標記、生物分子標記及在活性條件下的示蹤，也可固定蛋白質分子并跟蹤其功能化過程。進入90年代，國外公司不斷開發出具有特征熒光標記的微球陣列、能對微球進行特異識別的流式細胞儀及其相應的分析軟件系統，并在此基礎上產生了具有多重分析能力的熒光微球技術，其應用范圍被進一步拓展到抗原-抗體檢測、酶-底物反應、核酸雜交、擴增、測序及核酸的基因型分析等領域。熒光微球可通過三個途徑實現[1].通過熒光染料與微球表面功能基團的共價結合使微球表面帶有一種或幾種熒光物質，參見美國專利U.S.Pat.No.5194300；U.S.Pat.No.4774189；[2].在高分子微球共聚過程中摻入一種或兩種熒光物質，參見美國專利U.S.Pat.No.5073498；U.S.Pat.No.4717655；[3].微球形成后，通過物理吸附作用使微球標記熒光，參見美國專利U.S.Pat.NO.5723218。通過前述方法可得到若干組分別具有不同熒光特征的熒光微球陣列，其中每一種微球都能以其特征熒光被流式細胞儀特異識別。根據待檢靶分子的不同，利用微球表面的功能基團將抗原、抗體、酶作用底物、受體配基、寡核苷酸等進行固定化，將經過上述處理的微球與待檢樣品混合，使這些生物分子與樣品中相應的靶物分子反應，通過一種熒光物質標記的報告分子與熒光微球-靶物復合物孵育，最后經流式細胞儀檢測，可對每一種熒光微球上發生的不同生物學反應進行識別、分析，并給出檢測結果，從而使熒光微球具有在同一試管中同步檢測多種靶物質的特征。
現有熒光微球技術雖具有較多優點，但仍存在下述缺陷由于要在同一個反應體系中完成對樣品多種靶物質的檢測，反應體系復雜，因此需要多步的清洗、離心或酶處理等純化步驟，除去干擾反應的物質，如二抗、引物、酶等，使得檢測步驟較為繁瑣，檢測周期較長；在多步的清洗、離心過程中，易造成熒光微球的丟失，影響實驗或檢測結果，甚至會導致實驗的失敗，在實際應用中只能通過增加微球的用量，使微球的用量遠遠超過實際檢測需要量，以防止微球丟失對結果的影響，但這必然增加了檢測成本。
磁性微球是二十世紀八十年代初發展起來的一種用于分離和純化的新型功能材料，其采用材料復合技術，將有機單體或高分子材料與磁粒子Fe3O4復合在一起，利用高分子直接包埋磁粒子或在磁流體存在下通過單體的乳液聚合、懸浮聚合、分散聚合等高分子聚合形成磁性高分子微球，即磁性微球。將磁性微球與抗體或抗原用物理吸附、化學偶聯等方法形成免疫磁性微球，可廣泛用于各種可溶性抗原的檢測、分離與純化、細胞標記與識別、核酸的分離、PCR檢測等。但該技術的缺點是檢測通量不高。
本發明的目的在于避免上述現有技術中的不足之處，而提供一種檢測通量大、靈敏度高、特異性強、檢測步驟較為簡便、檢測周期短、檢測結果準確、檢測成本低的磁性熒光微球的制備方法及采用其進行生物分子檢測的方法。
本發明的目的可通過以下措施來達到1].合成不同組具有特征熒光的磁性熒光高分子微球；2].在不同組微球表面固定相應所需的抗體、寡核苷酸等生物分子；3].將固定后的微球與待檢生物樣品反應后，加入熒光標記的報告基團，孵育；4].用流式細胞計數儀對微球表面發生的反應進行定性或定量分析。
一種磁性熒光微球，其特殊之處在于它是包括磁性納米粒子和高分子微球構成的磁性高分子微球及熒光分子的直徑為0.7～30μm的磁性熒光高分子微球，所述的磁性納米粒子占磁性熒光高分子微球總重量的10～50％，熒光分子占磁性熒光高分子微球總重量的0.01～20％。
上述磁性納米粒子通過熒光染料共聚在高分子微球內部摻入熒光分子，或通過吸附或化學鍵合在微球表面標記熒光分子即構成磁性熒光高分子微球。
上述磁性納米粒子的粒徑以5～12nm為佳。
上述磁性高分子微球可以是粒徑為0.7～2μm、磁含量為磁性高分子微球總重量10～20％的磁性高分子種子微球。
一種如上所述磁性熒光微球的制備方法，其特殊之處在于該方法的制備包括1].用三價鐵和二價過渡金屬鹽混合水溶液通過化學共沉淀法制備具有超順磁性的金屬氧化物磁性納米粒子；2].采用高分子聚合法制備高分子微球；3].標記熒光染料；4].最后，得到磁性熒光高分子微球。
上述制備磁性納米粒子的二價過渡金屬鹽可為Fe(II)、Mn(II)、Ni(II)、Zn(II)或Cu(II)金屬鹽等。
上述超順磁性金屬氧化物磁性納米粒子的制備可加入表面活性劑，形成表面具有疏水性的磁性納米粒子。
上述磁性高分子微球可以是粒徑為0.7～2μm的磁性高分子種子微球，該磁性高分子種子微球的制備方法可采用微懸浮聚合法，其包括1].用分散劑對制備得到的磁性納米粒子進行表面處理，使其具有疏水性，并分散到溶有單體分子的有機相中，然后將引發劑和交聯劑溶入體系中；2].將上述磁性納米粒子、單體、引發劑、交聯劑等混合物加入含有懸浮劑的水中，借助攪拌作用經高速剪切乳化，形成穩定的懸浮液；3].升溫，引發聚合，制備出粒徑為0.7～2μm、磁含量為10～20％的磁性高分子種子微球。
上述分散劑可采用聚乙二醇；所述的引發劑可采用過氧化苯甲酰(BPO)或十二烷酰過氧化物。
上述磁性高分子微球可采用懸浮聚合法的制備，其包括1].用長鏈脂肪酸對磁性納米級粒子進行親油化處理，使其表面形成一層親油層；將親油化處理的磁性納米級粒子與親油性單體溶液混合，形成油相；2].溶解至少一種表面活性劑于水溶液中形成水相、分散油相于水相中形成水包油型懸浮液；3].熱引發聚合反應，形成磁性高分子微球。
上述高分子微球可由有機單體分子聚合或共聚而成，所述的有機單體分子可采用苯乙烯、丙烯酸、丙烯晴、丙烯酰胺、丙烯醛、丁二烯、乙酸內酯、對苯二甲酸乙二醇酯、異戊二烯、二乙烯基苯或甲基丙烯酸甲酯等。
上述對磁性高分子微球標記染料可包括對所述磁性種子高分子微球進行二次溶脹時，在溶脹劑中摻入兩種不同的熒光染料及功能性的共聚單體，使熒光物質通過共聚摻入磁性微球，制備出磁性熒光微球。
上述對磁性高分子微球標記熒光染料的方法可包括1].首先制備活性溶脹乳劑，對粒徑為0.7～2μm的磁性種子微球進行第一次溶脹，形成活性溶脹后的種子乳膠液，然后加入穩定劑；穩定劑以采用堿性金屬鹵化物溶于溶脹用乳化劑的水性溶液為宜，濃度可為0.001～0.1M；堿性金屬鹵化物可以是鉀或銫的氯化物、溴化物、碘化物等，以氯化鉀為最佳；2].在含有兩種不同比例疏水熒光染料、反應單體和引發劑以及表面活性劑、等成分存在的條件下，加入上述種子乳膠液進行二次溶脹，使單體和引發劑等滲透至種子乳膠顆粒中，得到含熒光染料的溶脹顆粒混合物；最后升溫，引發共聚得到粒徑均勻分布的磁性熒光微球；所述的兩種熒光染料是具有重疊的激發波長、具有不同的發射波長、既可被同一波長的激光所激發、又能分別被流式細胞儀識別的熒光染料。
上述對磁性高分子微球標記熒光染料可通過物理吸附法制備磁性熒光微球，將磁性高分子微球加入含有兩種熒光染料的氯仿溶液，在25-55℃下攪拌2-5小時，直至磁球吸附熒光染料達到飽和為止，抽真空除去有熒光染料溶液，產物用磷酸鹽緩沖液稀釋、儲存。
上述對磁性高分子微球標記熒光染料可包括用微乳液聚合法制備納米級的非磁性高分子微球(5-100nm)，使兩組納米級微球表面分別吸附兩種不同的熒光染料，再將帶有熒光染料的納米微球通過共價結合偶聯在制得的磁性微米級微球表面，調節微米級磁性微球表面的兩種吸附不同熒光物質的納米微球的比例，以調節磁性微球的熒光特征；所述的兩種熒光染料是具有重疊的激發波長、具有不同的發射波長、既可被同一波長的激光所激發、又能分別被流式細胞儀識別的熒光染料。
上述對磁性高分子微球標記熒光染料可包括在熒光磁性微球表面具有通過單體共聚形成的帶有功能基團的高分子殼層。
一種采用上述磁性熒光微球進行生物分子檢測的方法，其特殊之處在于該方法的檢測步驟包括1].在磁性熒光微球表面偶聯生物活性物質磁性熒光微球通過其表面的功能基團將多種生物活性物質以共價鍵偶聯在其表面；2].通過磁性熒光微球表面偶聯的生物活性物質，將待檢樣品中相應的分子捕獲至微球表面進行反應，使微球成為生物學反應的固相載體；3].通過磁分離器進行磁性分離，對捕獲至微球表面的反應物進行富集、分離和純化；4].通過流式細胞儀識別具有不同熒光特征的微球，對每種微球表面所發生的生物學反應進行區分；通過對待檢分子或能與待檢分子特異結合的分子上標記的第三種熒光物質的檢測，得到對待檢樣品定性及定量的分析檢測結果。
上述在磁性熒光微球表面偶聯的生物活性物質可為抗體，其偶聯的方法是將表面帶羧基的磁性熒光微球30mg與碳二亞胺(EDC)溶液混和后，加入1.5mg抗體，在室溫下攪拌24小時，加入牛血清白蛋白30mg/ml，孵育4小時終止反應；磁性分離，棄上清，用PH7.4的PBS洗一次，重新懸浮于PBS中保存。
上述在磁性熒光微球表面偶聯生物活性物質可以是寡核苷酸探針，其步驟是用碳二亞胺作為偶聯劑，加入1.5mg寡核苷酸探針，在室溫下攪拌24小時，加入牛血清白蛋白30mg/ml，孵育4小時終止反應；磁性分離，棄上清，用PH7.4的PBS洗一次，重新懸浮于PBS中保存。
上述生物活性物質可為抗原-抗體，其檢測方法是將待檢樣品與包被特異抗原的磁性熒光微球混合，避光作用10分鐘，將相應待檢抗體捕獲至微球表面；用磁性分離器分離，將微球-抗原-抗體復合物純化、富集；在上述復合物中加入FITC標記的二抗，避光作用10分鐘，用流式細胞儀檢測。
本發明與現有熒光微球技術相比具有如下優點本發明將具有超順磁性的納米粒子引入熒光高分子微球，制備出若干組具有不同熒光特征同時又具備良好磁響應性的磁性熒光高分子微球陣列，簡稱磁性熒光微球，以其作為生物活性物質和生物學反應的固相載體，能夠對待檢樣品進行多重、定性、定量分析，且自動化程度高。由于微球具備超順磁性，因而不需經離心及其它純化步驟，只需通過一步簡單的磁性分離，就可對捕獲至微球表面的反應物進行富集、分離和純化，從而提高檢測的靈敏度和特異性，同時縮短了檢測時間；此外磁性分離還可以避免微球的丟失，節省微球的用量，降低該技術的檢測成本。本發明可廣泛用于免疫學檢測、基因診斷、SNP基因分型及生物大分子相互作用的研究等。
下面將結合具體實施例對本發明作進一步詳述本發明磁性熒光微球的制備方法分為三個步驟步驟1制備具有超順磁性的磁性納米級粒子磁性納米級粒子可采用化學共沉淀法制備。該方法用Fe3+和Fe2+在堿性條件下反應得到Fe3O4晶體沉淀。采用其它二價過渡金屬鹽，如Mn(II)、Ni(II)、Zn(II)、Cu(II)等亦可替代Fe(II)用于磁性納米級粒子的制備。若要使磁性納米級粒子分散得較好，可在介質中加入表面活性劑或改變水溶液的pH值。磁性納米粒子的粒徑以小于30nm為宜，以在5～12nm之間最佳。
步驟2制備磁性高分子微球方法1采用微懸浮聚合法制備磁性高分子種子微球(1).用分散劑對步驟1得到的磁性納米粒子進行疏水表面處理后使其具有疏水性，并分散到溶有單體的有機相中，然后將引發劑和交聯劑溶入體系中；(2).將上述磁性納米粒子-單體等混合物加入含有懸浮劑的水中，借助攪拌作用經過高速剪切乳化，形成穩定的懸浮液；(3).升溫，引發聚合，制備出粒徑為0.7～2μm，磁含量為10～20％的磁性高分子微球。由于該種磁性高分子微球粒徑較小，故又稱磁性高分子種子微球。
本發明的分散劑可采用聚乙二醇(PEG)；引發劑可采用過氧化苯甲酰(BPO)、十二烷酰過氧化物(LPO)等。
方法2采用懸浮聚合制備磁性高分子微球(1).用長鏈脂肪酸對磁性納米級粒子進行親油化處理，使其表面形成一層親油層；將親油化處理的磁性納米級粒子與親油性單體溶液混合，以形成油相；
(2).溶解至少一種表面活性劑于水溶液中形成水相、分散油相于水相中形成水包油型懸浮液；(3).熱引發聚合反應，形成磁性高分子微球。具體可參見中國專利CN1253147A；專利申請號98124516.1。
適用于本發明的有機單體如苯乙烯、丙烯酸、丙烯晴、丙烯酰胺、丙烯醛、丁二烯、乙酸內酯、對苯二甲酸乙二醇酯、異戊二烯、二乙烯基苯、甲基丙烯酸甲酯等。為得到表面含有功能基團如-COOH、-NH2、-OH、-CHO、-SO3H等的高分子微球，可采用帶有功能基團的兩種或兩種以上有機單體共聚，如丙烯酸與苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯與甲基丙烯酸共聚得到表面具有含羧基的微球；用甲基丙烯酸羥乙酯HEMA及丙烯醛分別與苯乙烯共聚得到含羥基-OH和醛基-CHO的微球。
步驟3對磁性高分子微球標記熒光染料方法1對步驟2-方法1中得到的磁性種子高分子微球進行二次溶脹，同時在溶脹劑中摻入兩種不同的熒光染料及功能性的共聚單體，使熒光物質通過共聚摻入磁性微球內部，制備出磁性熒光微球。具體步驟如下(1).首先用1-氯十二烷作為一次溶脹劑，對粒徑為2μm的磁性種子微球進行第一次溶脹，形成活性溶脹后的種子乳膠液，然后加入穩定劑以使種子微球在溶脹和聚合過程中保持穩定。其它可選擇的一次溶脹劑包括1-氯壬烷乳、1-溴十二烷、十六烷醇等。
(2).在含有兩種不同比例疏水熒光染料、有機單體和引發劑以及表面活性劑等成分存在的條件下，加入上述種子微球進行二次溶脹，使單體和引發劑等滲透至種子微球中，得到含熒光染料的溶脹顆粒混合物；最后升溫，引發共聚。得到粒徑均勻分布的磁性熒光微球。
通過改變兩種熒光染料的比例，可得到具有不同熒光特征的微球。具有相同熒光特征的微球構成一組，具有不同熒光特征的微球可構成多組，每組微球可分別包被不同的生物分子。多組微球可滿足同步檢測不同靶分子的需求。
方法2通過物理吸附法制備磁性熒光微球將磁性高分子微球加入含有兩種不同比例熒光染料的有機溶劑中，在25～55℃下攪拌2-5小時，直到磁球吸附熒光染料達到飽和為止，用磁式分離器對反應后的混合物進行分離，除去反應中多余的熒光染料和其它有機溶劑，然后將磁性熒光微球用磷酸鹽緩沖液清洗并稀釋儲存于4℃冰箱中。
方法3用微乳液聚合法制備納米級高分子微球(5～100nm)，使兩組納米級微球表面分別吸附兩種不同的熒光染料，再將帶有熒光染料的納米微球通過共價結合偶聯在磁性高分子微球表面，通過調節微米級磁性微球表面的兩種吸附不同熒光物質的納米微球的比例可達到精確調節磁性微球的熒光特征的目的。為防止納米熒光微球從磁性高分子微球表面脫落，可通過單體共聚在熒光磁性微球表面形成帶有功能基團的高分子殼層。
本發明熒光染料的選擇選擇油溶性的熒光染料，制備多種具有不同熒光特征的磁性熒光微球陣列，可選用兩種熒光染料按不同的比例摻入。這兩種熒光染料以具有重疊的激發波長，而具有不同的發射波長為佳，不同的發射波長相差至少大于10nm，以大于50nm最佳，從而使兩種熒光物質既可被同一波長的激光光源所激發，而在不同的發射波長處分別測定各自的熒光強度并通過兩個強度的比例確認熒光微球。如紅色熒光物質7-Aminoactinomycin D(Ex＝546，Em＝647nm)和桔黃色熒光物質PO-PROTM-3iodide(Ex＝539，Em＝567nm)。
采用磁性熒光微球進行生物分子檢測的方法步驟1磁性熒光微球表面偶聯生物活性物質(生物活性分子)根據檢測需要，磁性熒光微球可通過其表面的功能基團將多種生物活性物質以共價鍵偶聯在其表面，這些生物活性物質包括抗原、抗體、激素受體、酶、核酸、寡核苷酸、半抗原等。
步驟2用磁性熒光微球進行生物學檢測磁性熒光微球表面偶聯的生物活性物質，可與待檢樣品中相應的分子發生反應，使微球成為生物學反應的固相載體；因微球具備超順磁性，無需離心及其它的純化步驟，而只通過磁分離器進行一步簡單的磁性分離，就可對捕獲至微球表面的反應物進行富集、分離和純化，不但提高了檢測的靈敏度和特異性，同時縮短了檢測時間；由于磁性微球中按不同的比例摻入兩種熒光物質可得到若干組具有不同熒光特征的微球陣列，每種微球均可通過自身標記的特征性熒光被流式細胞儀識別，因此流式細胞儀就能對每種微球表面所發生的生物學反應進行區分，這就使得在一個試管或反應孔中使用多組磁性熒光微球對同一樣品進行多重分析成為可能；普通的流式細胞儀每秒鐘可對5,000個微球上的熒光信號進行分析并給出數據，因此通過對待檢分子或其它能與待檢分子特異結合的分子上標記的第三種熒光物質，如FITC、PE等信號強度的檢測，可得到對待檢樣品定性及定量的分析檢測結果。
本發明磁性熒光微球制備方法的具體實例制備方法實施例一步驟1化學共沉淀法制備磁性納米粒子將0.5mol/l的Fe2+溶液和0.5mol/l的Fe3+液，按1∶2體積比取樣加入到三口燒瓶中，攪拌均勻后，加入適量分散劑聚乙二醇，升溫到70℃，緩慢滴加濃氨水，攪拌，反應30分鐘，制備出粒徑為20nm左右的Fe3O4粒子。反應產物經磁性分離后，用蒸餾水反復洗滌至中性，以懸液狀態保存。(現有技術)步驟2懸浮聚合法合成聚苯乙烯磁性種子微球用聚乙二醇分散劑將Fe3O4進行表面處理后分散到苯乙烯中，加入引發劑十二烷酰過氧化物(LPO)和交聯劑二乙烯苯(DVB)，然后將上述混合液分散在水中，經過高速剪切乳化，形成穩定的懸浮液，倒入裝有攪拌器、溫度計、回流冷凝管和氮氣氛導管的250ml四口燒瓶中，將燒瓶移入恒溫水槽中進行微乳聚合，聚合溫度為80℃，聚合時間為2.0h。聚合反應結束后。加入SDS作為分散劑，然后將濾液經過磁分離后即可得到粒徑約2μm的聚苯乙烯種子磁球。
步驟3制備帶羧基的聚(苯乙烯-丙烯酸甲酯)磁性熒光微球2ml 1-氯十二烷(CDD)與0.25％的SDS 5ml水溶液混勻作為一次溶脹劑，將10ml 10％磁性聚苯乙烯種子微球與0.25％50mlSDS溶液中混勻后，加入已配制好的一次溶脹劑，同時加入20ml的30％丙酮溶液使CDD更容易滲入微球，攪拌12小時；取2ml上述懸浮液加入20ml蒸餾水和40ml0.25％SDS，磁性分離，得到一次溶脹的種子微球。400mg4％過氧化苯甲酰引發劑溶入10ml含苯乙烯(90％)和丙烯酸甲酯(10％)溶液中，再加入等體積0.25％SDS，混勻，再按不同比例加入熒光染料7-氨基放線菌素D(7-Aminoactinomycin D)和PO-PROTM-3iodide制成單體-引發劑-熒光染料的均質混合溶液，然后取20ml上述混和溶液加入上述經一次溶脹后的種子微球，通入氮氣保護，加熱70℃，2小時引發溶脹種子的快速聚合。得到粒徑5-6μm的磁性熒光微球。制備方法實施例二步驟1制備磁性納米粒子，同實施例一的步驟1。
步驟2制備帶羧基的磁性聚苯乙烯微球。
將上述Fe3O4納米粒子35g加入苯乙烯50g、甲基丙烯酸(MAA)5g、二乙烯苯10g、過氧化苯甲酰(BPO)5g組成的有機相中，略經攪拌即可形成穩定分散的油相磁性膠體溶液；在1升圓柱形攪拌式反應器中加入500ml蒸餾水和10g聚乙烯醇，50℃恒溫攪拌0.5小時后引入上述油相磁性膠體，調節攪拌速度至800rpm，升溫到80℃反應6小時，再升溫到95℃熟化4小時；冷卻后，經磁性分離、洗滌等工序，即可得到粒徑在5-15μm帶羧基的磁性聚苯乙烯微球。
步驟3通過物理吸附法制備磁性熒光微球將磁性高分子微球加入含有兩種熒光物質的二甲基亞砜(MDSO)溶液，此吸附液中一般熒光分子的濃度為0.1～1wt％，將5～10ml濃度是0.5～2wt％磁性微球稀釋液加入0.5ml熒光分子的DMSO中，在25-55℃下攪拌2-5小時，直到磁球吸附熒光染料達到飽和為止，磁性分離出去多余的熒光染料溶液，產物用磷酸鹽緩沖液清洗后稀釋、儲存。制備方法實施例三步驟1制備磁性納米粒子 同實施例一——步驟1；步驟2制備表面帶羧基的磁性聚苯乙烯微球 同實施例二——步驟2；步驟3制備表面帶胺基的納米級熒光微球先將少量約1/3的苯乙烯等單體、乳化劑SDS、助乳化劑1-戊醇、去離子水配成均相微乳液；將該微乳液攪拌并升溫至25～80℃，向上述反應體系通氮氣5～10分鐘后，加入引發劑過硫酸鉀(KPS)形成反應體系；同時將剩余單體、含胺基的功能單體甲基丙烯酸胺乙酯(AEM)、交聯劑二乙烯苯(DVB)，逐滴加入反應體系，維持1～6小時滴完，伴以400～650轉/分速度攪拌；滴加完畢繼續反應0.5～3.5小時，即可得到表面帶胺基的納米微球。反應體系中，乳化劑濃度為2～40wt％，單體濃度為1～50wt％，功能單體濃度為0.2～20wt％，引發劑濃度為0.5～10mM。納米微球吸附熒光分子的方法同例2.(3)。
步驟4制備磁性熒光微球表面帶羧基的磁性熒光微球30mg與碳二亞胺(EDC)溶液混和后，加入按一定比例混合的兩組表面分別吸附兩種不同熒光染料的表面帶胺基的納米微球共3.0mg，在室溫下攪拌24小時。磁性分離，棄上清。用PH7.4的PBS洗一次，磁性分離，棄上清。即得到偶聯納米熒光微球的磁性微球。
在上述產物中加入苯乙烯50g、甲基丙烯酸(MAA)5g、二乙烯苯(DVB)10g組成的有機相中作用1小時后，將其引入盛有500ml蒸餾水圓柱形攪拌式反應器中，加入過硫酸鉀5g，調節攪拌速度至800rpm升溫至95℃，升溫到80℃反應2小時，再升溫到95℃熟化2小時，即可在偶聯納米熒光微球的磁性微球表面形成帶有功能基團的高分子殼層。冷卻后，經磁性分離、洗滌、等工序，即可得到帶羧基的磁性熒光聚苯乙烯微球。生物分子檢測實施例一磁性熒光微球表面偶聯抗體表面帶羧基的磁性熒光微球30mg與碳二亞胺(EDC)溶液混和后，調節溶液的pH為4.5左右，加入1.5mg抗體，在室溫下反應1～2小時，加入牛血清白蛋白(30mg/ml)，孵育4小時終止反應。磁性分離，棄上清，用pH7.4的PBS洗一次，重新懸浮于PBS中保存。生物分子檢測實施例二含羧基的磁性熒光微球表面偶聯寡核苷酸探針仍采用碳二亞胺作為偶聯劑，將例4中的抗體換為寡核苷酸探針，長度可在5-500mer，最好為20-30mer。生物分子檢測實施例三應用磁性熒光微球技術進行抗原-抗體的免疫學檢測待檢樣品與包被特異抗原的磁性熒光微球混合，避光作用10分鐘，以將相應待檢抗體捕獲至微球表面。磁性分離器分離，將微球-抗原-抗體復合物純化、富集。在上述復合物中加入FITC標記的二抗，避光作用10分鐘，流式細胞儀檢測。生物分子檢測實施例四應用磁性熒光微球技術進行HLA-DNA分型檢測將HLA等位基因序列特異性寡核苷酸探針(SSOP)分別與不同的微球偶聯，制備帶有不同分型探針的磁性熒光微球。
待檢血樣收集；DNA抽提；HLA特定亞型DNA片段擴增，在擴增體系中加入FITC標記的ddNTP，使PCR擴增產物標記FITC；將結合有SSOP分型探針的磁性熒光微球與PCR擴增產物混合避光孵育1小時；磁性分離器分離；流式細胞儀檢測，軟件分析結果。
本發明未作特殊限定的微球均指高分子微米級微球。
權利要求
1.一種磁性熒光微球，其特征在于它是包括磁性納米粒子和高分子微球構成的磁性高分子微球及熒光分子的直徑為0.7～30μm的磁性熒光高分子微球，所述的磁性納米粒子占磁性熒光高分子微球總重量的10～50％，熒光分子占磁性熒光高分子微球總重量的0.01～20％。
2.如權利要求1所述的磁性熒光微球，其特征在于所述的磁性納米粒子通過熒光染料共聚在高分子微球內部摻入熒光分子，或通過吸附或化學鍵合在微球表面標記熒光分子構成磁性熒光高分子微球。
3.如權利要求1或2所述的磁性熒光微球，其特征在于所述的磁性納米粒子的粒徑為5～12nm。
4.如權利要求3所述的磁性熒光微球，其特征在于所述的磁性高分子微球是粒徑為0.7～2μm，磁含量為磁性高分子微球總重量10～20％的磁性高分子種子微球。
5.一種如權利要求1所述磁性熒光微球的制備方法，其特征在于該方法的制備包括1].用三價鐵和二價過渡金屬鹽混合水溶液通過化學共沉淀法制備具有超順磁性的金屬氧化物磁性納米粒子；2].采用高分子聚合法制備高分子微球；3].標記熒光染料；4].最后，得到磁性熒光高分子微球。
6.如權利要求5所述的磁性熒光微球的制備方法，其特征在于所述制備磁性納米粒子的二價過渡金屬鹽為Fe(II)、Mn(II)、Ni(II)、Zn(II)或Cu(II)金屬鹽。
7.如權利要求5或6所述的磁性熒光微球的制備方法，其特征在于所述的超順磁性金屬氧化物磁性納米粒子的制備中包括加入表面活性劑，形成表面具有疏水性的磁性納米粒子。
8.如權利要求5所述的磁性熒光微球的制備方法，其特征在于所述的磁性高分子微球是粒徑為0.7～2μm的磁性高分子種子微球時，該磁性高分子種子微球的制備方法為微懸浮聚合法，包括1].用分散劑對制備得到的磁性納米粒子進行表面處理，使其具有疏水性，并分散到溶有單體分子的有機相中，然后將引發劑和交聯劑溶入體系中；2].將上述磁性納米粒子、單體、引發劑、交聯劑等混合物加入含有懸浮劑的水中，借助攪拌作用經高速剪切乳化，形成穩定的懸浮液；3].升溫，引發聚合，制備出粒徑為0.7～2μm、磁含量為10～20％的磁性高分子種子微球。
9.如權利要求8所述的磁性熒光微球的制備方法，其特征在于所述的分散劑為聚乙二醇；所述的引發劑為過氧化苯甲酰(BPO)或十二烷酰過氧化物。
10.如權利要求5所述的磁性熒光微球的制備方法，其特征在于所述磁性高分子微球采用懸浮聚合法的制備，其包括1].用長鏈脂肪酸對磁性納米級粒子進行親油化處理，使其表面形成一層親油層；將親油化處理的磁性納米級粒子與親油性單體溶液混合，形成油相；2].溶解至少一種表面活性劑于水溶液中形成水相、分散油相于水相中形成水包油型懸浮液；3].熱引發聚合反應，形成磁性高分子微球。
11.如權利要求5或10所述的磁性熒光微球的制備方法，其特征在于所述的高分子微球由有機單體分子聚合或共聚而成，所述的有機單體分子為苯乙烯、丙烯酸、丙烯晴、丙烯酰胺、丙烯醛、丁二烯、乙酸內酯、對苯二甲酸乙二醇酯、異戊二烯、二乙烯基苯或甲基丙烯酸甲酯。
12.如權利要求5或8所述的磁性熒光微球的制備方法，其特征在于所述的對磁性高分子微球標記染料包括對所述磁性種子高分子微球進行二次溶脹時，在溶脹劑中摻入兩種不同的熒光染料及功能性的共聚單體，使熒光物質通過共聚摻入磁性微球，制備出磁性熒光微球。
13.如權利要求12所述的磁性熒光微球的制備方法，其特征在于所述對磁性高分子微球標記熒光染料的方法包括1].首先制備活性溶脹乳劑，對粒徑為0.7～2μm的磁性種子微球進行第一次溶脹，形成活性溶脹后的種子乳膠液，然后加入穩定劑；所述的穩定劑為堿性金屬鹵化物溶于溶脹用乳化劑的水性溶液，濃度為0.001～0.1M；所述的堿性金屬鹵化物為鉀或銫的氯化物、溴化物或碘化物；2].在含有兩種不同比例疏水熒光染料、反應單體和引發劑以及表面活性劑成分存在的條件下，加入上述種子乳膠液進行二次溶脹，使單體和引發劑等滲透至種子乳膠顆粒中，得到含熒光染料的溶脹顆粒混合物；最后升溫，引發共聚得到粒徑均勻分布的磁性熒光微球；所述的兩種熒光染料是具有重疊的激發波長、具有不同發射波長、既可被同一波長的激光所激發、又能分別被流式細胞儀識別的熒光染料。
14.如權利要求11所述的磁性熒光微球的制備方法，其特征在于所述的對磁性高分子微球標記熒光染料是通過物理吸附法制備磁性熒光微球，其是將磁性高分子微球加入含有兩種熒光染料的氯仿溶液，在25-55℃下攪拌2-5小時，至磁球吸附熒光染料達到飽和為止，抽真空除去有熒光染料溶液，產物用磷酸鹽緩沖液稀釋、儲存。
15.如權利要求11所述的磁性熒光微球的制備方法，其特征在于所述的對磁性高分子微球標記熒光染料包括用微乳液聚合法制備納米級非磁性高分子微球，使兩組納米級微球表面分別吸附兩種不同的熒光染料，再將帶有熒光染料的納米微球通過共價結合偶聯在制得的磁性微米級微球表面，調節微米級磁性微球表面的兩種吸附不同熒光物質的納米微球的比例，以調節磁性微球的熒光特征；所述的兩種熒光染料是具有重疊的激發波長、具有不同的發射波長、既可被同一波長的激光所激發、又能分別被流式細胞儀識別的熒光染料。
16.如權利要求15所述的磁性熒光微球的制備方法，其特征在于所述的對磁性高分子微球標記熒光染料包括在熒光磁性微球表面具有通過單體共聚形成的帶有功能基團的高分子殼層。
17.一種采用如權利要求1所述磁性熒光微球進行生物分子檢測的方法，其特征在于該方法的檢測步驟包括1].在磁性熒光微球表面偶聯生物活性物質磁性熒光微球通過其表面的功能基團將多種生物活性物質以共價鍵偶聯在其表面；2].通過磁性熒光微球表面偶聯的生物活性物質，將待檢樣品中相應的分子捕獲至微球表面進行反應，使微球成為生物學反應的固相載體；3].通過磁分離器進行磁性分離，對捕獲至微球表面的反應物進行富集、分離和純化；4].通過流式細胞儀識別具有不同熒光特征的微球，對每種微球表面所發生的生物學反應進行區分；通過對待檢分子或能與待檢分子特異結合的分子上標記的第三種熒光物質的檢測，得到對待檢樣品定性及定量的分析檢測結果。
18.如權利要求17所述的采用磁性熒光微球進行生物分子檢測的方法，其特征在于所述在磁性熒光微球表面偶聯的生物活性物質為抗體，其偶聯的方法是將表面帶羧基的磁性熒光微球30mg與碳二亞胺(EDC)溶液混和后，加入1.5mg抗體，在室溫下攪拌24小時，加入牛血清白蛋白30mg/ml，孵育4小時終止反應；磁性分離，棄上清，用PH7.4的PBS洗一次，重新懸浮于PBS中保存。
19.如權利要求17所述的采用磁性熒光微球進行生物分子檢測的方法，其特征在于所述在磁性熒光微球表面偶聯生物活性物質是寡核苷酸探針，其步驟是用碳二亞胺作為偶聯劑，加入1.5mg寡核苷酸探針，在室溫下攪拌24小時，加入牛血清白蛋白30mg/ml，孵育4小時終止反應；磁性分離，棄上清，用PH7.4的PBS洗一次，重新懸浮于PBS中保存。
20.如權利要求17所述的采用磁性熒光微球進行生物分子檢測的方法，其特征在于所述的生物活性物質為抗原-抗體，其檢測方法是將待檢樣品與包被特異抗原的磁性熒光微球混合，避光作用10分鐘，將相應待檢抗體捕獲至微球表面；用磁性分離器分離，將微球-抗原-抗體復合物純化、富集；在上述復合物中加入FITC標記的二抗，避光作用10分鐘，用流式細胞儀檢測。
全文摘要
一種磁性熒光微球及其制備方法和采用該磁性熒光微球進行生物分子檢測的方法。本發明是在合成高分子微球時引入磁性納米粒子制備出磁性微球，在其中摻入熒光染料，使微球具有特征熒光，并能被流式細胞計數儀識別分析。磁性熒光微球表面可結合各種生物分子，這些生物分子與樣品中相應的靶物分子反應，以熒光標記的測定底物等作為檢測生物學反應的報告基團，通過熒光信號的測定值對靶物分子進行定性和定量分析。應用磁性熒光微球進行生物大分子檢測，既能對反應物進行快速分離和純化，又能在一個反應管、孔內對待檢樣品的多個靶分子同時進行檢測，可廣泛應用于免疫學檢測、核酸雜交、基因型分析等領域。
文檔編號G01N33/533GK1475805SQ0213936
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月15日 優先權日2002年8月15日
發明者崔亞麗, 陳超, 王瓊 申請人:陜西西大北美基因股份有限公司
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