專利名稱：一種改進的用于對白細胞進行分類的試劑及方法
技術領域：
本發明涉及細胞分類所用的試劑及分類方法，特別是涉及一種對血液中的白細胞進行分類時所用的試劑及分類方法。
背景技術：
在臨床檢查領域中，用患者的全血對白細胞進行分類計數工作，在診斷各種疾病時是極其常見并且非常重要的。
迄今為止，用于白細胞分類的裝置及方法的專利發表了許多。其中，中國專利CN95115317.X公開了一種通過兩種試劑完成白細胞的五分類的方法。該兩種試劑除都含有非離子表面活性劑和緩沖劑外，第一試劑至少含一種離子表面活性劑和一種帶陰離子的有機化合物，將血細胞分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞以及嗜堿細胞加中性粒細胞四類，第二試劑至少含一種離子表面活性劑，將血細胞分成嗜堿細胞和其他細胞類群。該方法通過綜合兩種結果將白細胞五分類。檢測系統為激光散射法。
另外，美國專利5,677,183、5,618,733、5,731,206，以及申請號為88101677、審定號為CN1018586B的中國專利，均公開了利用光散射法結合兩個通道對白細胞進行5分類的方法。
但是，在利用這些現有方法對白細胞進行分類的過程中，單核細胞常常介于淋巴細胞與中性粒細胞之間，聚類性不明顯，與淋巴細胞及中性粒細胞的分界不明顯，導致分類結果與實際結果出現偏差。
發明內容
本發明的目的就是為了針對現有技術中的問題，提供一種能在一個通道內快速溶解紅細胞并對白細胞進行分類，并且提高單核細胞的聚類性，增強單核細胞分類效果，使分類結果更為準確的試劑及方法。
為實現上述目的，本發明采用了以下技術方案本發明公開了一種改進的用于對白細胞進行分類的試劑，所述試劑包括a、可以溶解紅細胞，且使白細胞的細胞膜部分損失的表面活性劑，所述表面活性劑選自陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑以及它們的組合；b、含有苯環或雜環的有機化合物，并且當所述表面活性劑為陽離子表面活性劑時，所述有機化合物為帶有陰離子基團的有機化合物，當所述表面活性劑為兩性表面活性劑或者兩性表面活性劑與陽離子表面活性劑的組合時，所述有機化合物為帶陰離子基團或帶陽離子基團的有機化合物；c、調節pH值的緩沖劑。
所述試劑進一步包括醇類，其在本發明的試劑中一方面發揮助溶劑的作用，另一方面對反應的過程起到促進與加速作用。
所述試劑進一步包括酸性有機物或色素。
優選的，所述緩沖劑是能夠將pH值調整在2～6范圍內的緩沖劑。
所述陽離子表面活性劑優選具有式I所示結構的季銨鹽型陽離子表面活性劑， 其中R1為C原子數6-14的烷基或鏈烯基，優選辛基、癸基或月桂基；R2及R3為C原子數1-4的烷基或鏈烯基，優選甲基、乙基或丙基；R4為C原子數為1-4的烷基或鏈烯基或芐基；X為鹵素原子。
所述兩性表面活性劑優選具有式II所示結構的兩性表面活性劑， 其中，R5為C原子數6-14的烷基或鏈烯基，優選辛基、癸基或月桂基；R6及R7為原子數1-4的烷基或鏈烯基，優選甲基、乙基或丙基。
本發明還公開了一種采用上述的試劑對白細胞進行分類的方法，所述方法包括步驟，將所述的試劑加入到全血樣本中，使白細胞分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞分別對應的3個集團以及與中性粒細胞和嗜堿粒細胞相對應的1個集團共計4個集團，然后通過測定細胞大小和形態信息對所分成的四個集團進行分類計數。
所述測定細胞大小信息利用激光散射法采用低角度散射光完成，測定角度為2-6度；所述測定細胞形態信息利用激光散射法采用高角度散射光完成，測定角度為8-20度。
由于采用了以上的方案，使本發明具備的有益效果在于
利用本發明的試劑及方法進行白細胞分類時，不僅能夠將白細胞分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞分別對應的3個集團，以及與中性粒細胞和嗜堿細胞相對應的1個集團共計4個集團，并且，所分出單核細胞集團聚類性明顯，與淋巴細胞、中性粒細胞的分界清晰；試劑處理后的血樣經散射光檢測后，對不同比例的單核細胞均能形成獨立的散點區，且位置固定，不受細胞核左(右)移的影響，使分類結果更符合實際情況。
圖1是利用本發明實施例1的試劑對A血樣進行白細胞四分類計數時的低角度散射光及高角度散射光的散射圖。
圖2是利用本發明實施例2的試劑對B血樣進行白細胞四分類計數時的低角度散射光及高角度散射光的散射圖。
圖3是利用本發明實施例3的試劑對C血樣進行白細胞四分類計數時的低角度散射光及高角度散射光的散射圖。
圖4(A)(B)(C)是利用對比例中的試劑分別對A、B、C血樣進行白細胞四分類計數時的低角度散射光及高角度散射光的散射圖。
具體實施例方式
本發明的試劑與方法不僅可用于對全血中的白細胞進行四分類(將白細胞分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞分別對應的3個集團，以及與中性粒細胞和嗜堿細胞相對應的1個集團共計4個集團)，并且利用本發明的試劑和方法進行白細胞分類時還能夠提高單核細胞分類結果的準確性。
將本發明的試劑加入全血中后，試劑中的成分能夠迅速溶解紅細胞，并使不同類型的白細胞發生形態與大小方面的差異，分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞相對應的3個集團以及與中性粒細胞和嗜堿粒細胞相對應的1個集團共4個集團。再使用激光散射法，采用低角度散射光測定細胞的大小信息以及采用高角度散射光測定細胞的形態信息，并通過對散射光進行檢測，從而能夠對四個集團的白細胞分別進行分類計數。其中，所分出單核細胞集團聚類性明顯，與淋巴細胞、中性粒細胞的分界清晰；試劑處理后的血樣經散射光檢測后，對不同比例的單核細胞均能形成獨立的散點區，且位置固定，不受細胞核左(右)移的影響，分類結果更符合實際情況。
本發明試劑的主要成分包括a、可以溶解紅細胞，且使白細胞的細胞膜部分損失的表面活性劑，所述表面活性劑選自陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑以及它們的組合；
b、含有苯環或雜環的有機化合物，并且當所述表面活性劑為陽離子表面活性劑時，所述有機化合物為帶有陰離子基團的有機化合物，當所述表面活性劑為兩性表面活性劑或者兩性表面活性劑與陽離子表面活性劑的組合時，所述有機化合物為帶陰離子基團或帶陽離子基團的有機化合物；c、調節pH值的緩沖劑。
作為上述的陽離子表面活性劑，優選季銨鹽型表面活性劑，其結構式可以如下式I所示 式I表示C原子總數為9-26的陽離子表面活性劑，其中R1為C原子數6-14的烷基或鏈烯基；R2及R3為C原子數1-4的烷基或鏈烯基；R4為C原子數為1-4的烷基或鏈烯基或芐基；X為鹵素原子。作為R1的原子數6-14的烷基或鏈烯基，可以是己基、辛基、癸基、月桂基、十四烷基等，特別優選辛基、癸基、月桂基等的直鏈烷基。作為R2及R3的C原子數1-4的烷基或鏈烯基可以是甲基、乙基、丙基、丁基、丁烯基等，特別優選甲基、乙基、丙基。
作為上述的兩性表面活性劑，優選具有式II所示結構的兩性表面活性劑 其中，R5為C原子數6-14的烷基或鏈烯基；R6及R7為原子數1-4的烷基或鏈烯基。作為R5的原子數6-14的烷基或鏈烯基，可以是己基、辛基、癸基、月桂基、十四烷基等，特別優選辛基、癸基、月桂基等的直鏈烷基。作為R6及R7的C原子數1-4的烷基或鏈烯基可以是甲基、乙基、丙基、丁基、丁烯基等，特別優選甲基、乙基、丙基。
上述表面活性劑，其用量應足以溶解紅細胞，并造成白細胞的細胞膜部分損失。表面活性劑在本發明的試劑系統中的具體用量為50-6000mg/L，優選200-5000mg/L，最優選500-4000mg/L。具體用量也可以根據使用的表面活性劑的種類作適當調整。
這種組合能使單核細胞和淋巴細胞從大小上完全分離，且位置固定，同時從形態上和粒細胞完全分離并且方便對細胞的數量進行識別。
表1列舉了能夠用于本發明的一些表面活性劑的種類及其最適用量。
表1表面活性劑的最適用量
無論使用哪一種表面活性劑，其對白細胞的溶解力，只要能使白細胞膜開孔到胞質可以部分溢出，與陽離子結合的有機化合物能夠進入的程度即可，最好使用遠遠少于使細胞完全裸核時的用量。表面活性劑的溶血效果與所帶側鏈(陽離子表面活性劑中的R1、兩性表面活性劑中的R5)的鏈長是成正比的，側鏈的C原子數越多，溶血能力越強，所需要的濃度就越低。
本發明的主要成分除表面活性劑外，還包括一種含有苯環或雜環的有機化合物，并且當所用的表面活性劑為陽離子表面活性劑時，該有機化合物選用帶有陰離子基團的有機化合物，當所用的表面活性劑為兩性表面活性劑或者兩性表面活性劑與陽離子表面活性劑的組合時，該有機化合物可以選用帶陰離子基團有機化合物，也可以選用帶陽離子基團的有機化合物。所述的雜環為C原子數大于6的雜環。
本發明中使用的陰離子或陽離子有機化合物，可以和細胞內不同離子結合導致細胞類群間形態差異。這種有機化合物，帶有苯環或C原子數大于6的雜環，以及陰離子基團(如羧基、磺酸基等)或陽離子基團(如N+，NH4+等)。陽離子有機化合物如吡啶、吡咯、2-吡啶基硫尿、2-萘胺等，陰離子有機化合物如1-萘乙酸、1，4，5，8-萘四甲酸、對苯二甲酸、鄰苯二甲酸、鉻變酸、萘磺酸及其衍生物和鹽類等。有機化合物在本發明的試劑系統中的使用量通常為50-1000mg/L，優選100-500mg/L。
本發明中，還含有調整PH用的緩沖劑。對于緩沖劑的種類沒有特定的要求，可以為常用緩沖體系如甲酸、鄰苯二甲酸、乙酸、磷酸、TRIS、硼酸、碳酸等。本發明中PH范圍對四分類也沒有絕對影響，但通過調節PH可以改變單核細胞的分類效果。在本發明中，分類單核細胞的最適PH為2-6。緩沖劑的使用量為10-200mM。
此外，本發明中還可以含有一定量的醇類。醇類在本發明的試劑中一方面發揮助溶劑的作用，另一方面對反應的過程起到促進與加速作用。本發明對醇類的種類沒有特別要求，甲醇、乙醇、異丙醇、2-苯氧乙醇等均可用于本發明。醇類占本發明的試劑的體積百分比濃度通常為0.05-5％左右。
此外，為了改善將嗜酸細胞從粒細胞中分離出來的效果，在本發明的試劑系統中加入一定量的酸性有機物或色素如酸性藍系列、直接藍、酸性綠、酸性黃、酸性橙、甲基紅、甲基橙、苯胺藍、茜素黃等。使用量為50-1000mg/L，優選100-500mg/L。
在本發明的試劑系統中，還可以加入一定量的NaCl以調整溶液的滲透壓至合適范圍。
本發明的試劑系統可以配制為一種試劑，也可以配制為兩種試劑組合使用。作為兩種試劑組合使用時，兩種試劑的pH值可以相同，也可以不同。
利用本發明的方法對白細胞進行分類的具體過程包括，將本發明的上述試劑加入全血中混合一定時間后，檢測細胞的形態和大小信息，根據細胞形態與大小的不同將細胞分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞相對應的3個集團以及與中性粒細胞和嗜堿細胞相對應的1個集團共4個集團，檢測系統同時對四類細胞進行分類計數。
血樣與本發明試劑的混合比例沒有特別的限制，但通常按照血樣與本發明試劑的體積比為1∶10～100的比例混合。通常在兩者混合10～30秒后就可以進行檢測。
本發明檢測細胞的形態和大小信息的方法優選使用激光檢測法。該方法可以采用測定角度為2-6度的低角度散射光來測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態信息。而散射光的檢測可以通過常用的光電二極管傳感器完成。
下面列舉具體的實施例。
實例1一種用于白細胞四分類的試劑，該試劑包括以下成分NaCl 0.3g乙醇 2.0g丙三醇 0.75g癸基三甲基溴化銨 6.1g1-萘乙酸 0.4g乙酸 1.95g酸性藍 0.15g補水到 1LPH 3.8按上述配方配制的試劑將PH調整到3.8，滲透壓120mOsm。
取A血樣30μl，在其中加入0.98ml上述試劑。混合13秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為2-6度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態信息。
結果如圖1所示，單核細胞能形成獨立的散點區，且位置固定，聚類性明顯，與淋巴細胞、中性粒細胞的分界清晰；同時白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞及中性粒細胞+嗜堿細胞四類。
實例2一種用于白細胞四分類的試劑，該試劑包括以下成分NaCl 0.2g十二烷基谷氨酸 1g十二烷基三甲基氯化銨 2.8g2-苯氧乙醇 3g鄰苯二甲酸 1g酸性藍 0.4g補水到 1L
PH 2.5按上述配方配制的試劑將PH調整到2.5，滲透壓100mOsm。
取B血樣30μl，在其中加入2ml上述試劑。混合15秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為2-6度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態信息。
所得到結果如圖2所示，單核細胞能形成獨立的散點區，且位置固定，聚類性明顯，與淋巴細胞、中性粒細胞的分界清晰；同時白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞及中性粒細胞+嗜堿細胞四類。
實例3一種用于白細胞四分類的試劑，該試劑包括以下成分NaCl 0.3g十二烷基甘氨酸 1g甲醇 5g2-萘胺 0.5g磷酸二氫鈉 2.9g磷酸氫二鈉 2.3g酸性藍 0.4g補水到 1LPH 5.8按上述配方配制的試劑將PH調整到5.8，滲透壓200mOsm。
取C血樣30μl，在其中加入1.5ml上述試劑。混合18秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為2-6度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態信息。
所得到結果如圖3所示，單核細胞能形成獨立的散點區，且位置固定，聚類性明顯，與淋巴細胞、中性粒細胞的分界清晰；同時白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞及中性粒細胞+嗜堿細胞四類。
上述實施例中所用的A、B、C三份血樣分別含有不同比例單核細胞，上述實施例表明，利用本發明的試劑及方法進行白細胞分類時，不僅能夠將白細胞進行四分類，并且，對不同比例的單核細胞均能形成獨立的散點區，且位置固定，不受細胞核左(右)移的影響，使分類結果更符合實際情況。
對比例一種用于白細胞四分類的試劑，該試劑由以下成分組成NaCl 0.2g甲醇 3g聚氧乙烯(23)十六烷基醚(Brij 35)(非離子表面活性劑) 1.4g十二烷基磺酸鈉(SDS)(陰離子表面活性劑) 1.2g甲酸 1.3g酸性藍 0.15g補水到 1LPH 3.8按上述配方配制的試劑將PH調整到3.8，滲透壓130mOsm。
取上述實施例中所用的A、B、C三份血樣各30μl，分別在其中加入1.5ml上述試劑。混合15秒后開始用激光檢測法檢測白細胞。采用測定角度為2-6度的低角度散射光測定細胞的大小信息，并采用測定角度為8-20度的高角度散射光測定細胞的形態信息。
結果如圖4中(A)、(B)、(C)所示，圖中顯示雖然白細胞被分成淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞及中性粒細胞+嗜堿細胞四類，但單核細胞介于淋巴細胞與中性粒細胞之間，聚類性不明顯，與淋巴細胞及中性粒細胞的分界不明顯，且位置不穩定。
權利要求
1.一種改進的用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述試劑包括a、可以溶解紅細胞，且使白細胞的細胞膜部分損失的表面活性劑，所述表面活性劑選自陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑以及它們的組合；b、含有苯環或雜環的有機化合物，并且當所述表面活性劑為陽離子表面活性劑時，所述有機化合物為帶有陰離子基團的有機化合物，當所述表面活性劑為兩性表面活性劑或者兩性表面活性劑與陽離子表面活性劑的組合時，所述有機化合物為帶陰離子基團或帶陽離子基團的有機化合物；c、調節pH值的緩沖劑。
2.根據權利要求1所述的一種改進的用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述試劑進一步包括醇類。
3.根據權利要求2所述的一種改進的用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述試劑進一步包括酸性有機物或色素。
4.根據權利要求1所述的一種改進的用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述緩沖劑是能夠將pH值調整在2～6范圍內的緩沖劑。
5.根據權利要求1～4任意一項所述的一種改進的用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述陽離子表面活性劑為具有式I所示結構的季銨鹽型陽離子表面活性劑， 其中R1為C原子數6-14的烷基或鏈烯基；R2及R3為C原子數1-4的烷基或鏈烯基；R4為C原子數為1-4的烷基或鏈烯基或芐基；X為鹵素原子。
6.根據權利要求5所述的一種改進的用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述R1為辛基、癸基或月桂基，所述R2及R3為甲基、乙基或丙基。
7.根據權利要求1～4任意一項所述的一種改進的用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述兩性表面活性劑為具有式II所示結構的兩性表面活性劑， 其中，R5為C原子數6-14的烷基或鏈烯基；R6及R7為原子數1-4的烷基或鏈烯基。
8.根據權利要求7所述的一種改進的用于對白細胞進行分類的試劑，其特征在于所述R5為辛基、癸基或月桂基，所述R6及R7為甲基、乙基或丙基。
9.一種采用權利要求1～4中任意一項所述的試劑對白細胞進行分類的方法，其特征在于所述方法包括步驟，將所述的試劑加入到全血樣本中，使白細胞分成與淋巴細胞、單核細胞、嗜酸粒細胞分別對應的3個集團以及與中性粒細胞和嗜堿粒細胞相對應的1個集團共計4個集團，然后通過測定細胞大小和形態信息對所分成的四個集團進行分類計數。
10.根據權利要求9所述的一種對白細胞進行分類的方法，其特征在于所述測定細胞大小信息利用激光散射法采用低角度散射光完成，測定角度為2-6度；所述測定細胞形態信息利用激光散射法采用高角度散射光完成，測定角度為8-20度。
全文摘要
本發明公開了一種改進的用于對白細胞進行分類的試劑，所述試劑包括a.選自陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑以及它們的組合的表面活性劑；b.含苯環或其他雜環的有機化合物，且當表面活性劑為陽離子表面活性劑時，有機化合物帶有陰離子基團，當表面活性劑為兩性表面活性劑或兩性與陽離子表面活性劑的組合時，有機化合物帶陰離子或帶陽離子基團；c.調節pH值的緩沖劑。本發明的試劑及方法不僅能進行白細胞的四分類，并且，所分出單核細胞集團聚類性明顯，分界清晰；試劑處理后的血樣經散射光檢測后，對不同比例的單核細胞均能形成獨立的散點區，位置固定。
文檔編號G01N33/49GK101078720SQ200610021028
公開日2007年11月28日 申請日期2006年5月22日 優先權日2006年5月22日
發明者許文娟, 劉牧龍 申請人:深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
