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專利名稱：基于電化學氧化l－半胱氨酸的磺基丙氨酸修飾電極的制備方法
技術領域：
本發明涉及基于電化學氧化L-半胱氨酸的磺基丙氨酸修飾玻碳電極的制備方法。
背景技術：
美洛昔康是一種新型烯醇酸類非甾體抗炎藥，通過抑制環氧化酶-2(COX-2)，進而阻斷前列腺素(PGs)的合成而發揮抗炎作用。因其胃腸道副作用弱于其他非甾體抗炎藥，如雙氯滅痛、吡羅昔康、吲哚美辛等，許多國家已采用美洛昔康代替其他非甾體抗炎藥用于治療風濕性關節炎和骨關節炎。因為該藥能溶解于酸性溶液中，因而可能會引起局部的腸胃敏感反應等疾病。因此，快速準確的測定體液或血液中的美洛昔康濃度在生物化學和臨床診斷上具有非常重要的意義。現今臨床上多采用高效液相色譜測定，它的優點是高穩定性，但它儀器價格昂貴、靈敏度低、操作繁瑣。電化學測定法因其速度快、成本低、靈敏度和準確度高等優點而引起了人們的廣泛關注。到目前為止，可以用于美洛昔康的測定的電化學方法只有汞電極的極譜法以及碳糊電極的伏安法這幾種。由于汞會污染環境，實際應用中很少會使用汞電極。而碳糊電極的伏安法無法測定血清中美洛昔康的含量并且靈敏度比較低。因而還未有合適的電化學快速測定方法可以用于測定體液或血清中美洛昔康。
本發明的目的就是要提供一種基于電化學氧化L-半胱氨酸的磺基丙氨酸修飾玻碳電極的制備方法，由本法制得的磺基丙氨酸修飾電極，可用于快速、準確測定體液或血清中美洛昔康。
本發明的目的是這樣實現的，磺基丙氨酸修飾玻碳電極的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)先將玻碳電極表面用超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，在二次蒸餾水中超聲清洗，再用高純氮氣吹干預處理；(2)將預處理好的玻碳電極置于L-半胱氨酸-稀鹽酸溶液中，在-1.2V～+2.6V電位范圍內，以80mV·s-1～120mV·s-1的掃描速度循環掃描5周以上，取出用二次蒸餾水洗凈放入Britton-Robinson緩沖溶液中在-0.2V～+1.2V的電位窗口中掃循環伏安至穩定，采用二次蒸餾水洗凈后用氮氣吹干，制得磺基丙氨酸修飾玻碳電極。將該修飾電極于L-半胱氨酸-稀鹽酸溶液中4℃冰箱保存。
所述的將玻碳電極表面用超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，是先用0.3μm的超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，后用0.05μm的超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光。所述的L-半胱氨酸-稀鹽酸溶液為含2.5×10-3M L-半胱氨酸的0.04M HCl溶液。所述的Britton-Robinson緩沖溶液的濃度為0.04M，pH值為1.86。
本發明工藝先進，選材科學，制作方便。將玻碳電極表面預處理后置于含一定濃度的L-半胱氨酸-稀鹽酸溶液中以循環伏安法進行電氧化，然后用二次蒸餾水沖洗，制得磺基丙氨酸修飾電極。L-半胱氨酸價廉易得，電極修飾材料成本低。L-半胱氨酸在高電位下電氧化后最終得到的產物是磺基丙氨酸，該物質在玻碳電極表面能產生很強的吸附，即使是經過循環伏安掃描也不會掉落。該修飾電極與Nafion修飾電極相似，表面都帶有磺酸基。將該修飾電極與Nafion修飾電極的性能進行比較，發現這種修飾電極傳遞電子的能力以及靜電吸附能力比Nafion修飾電極更好。在Britton-Robinson緩沖溶液中，進行伏安測定，美洛昔康在該修飾電極上出現兩個靈敏的不可逆氧化峰，峰電流明顯增加，峰分辨率高于已有方法，同時檢測限也高于現有方法，適合于美洛昔康的快速、靈敏、高選擇性測定。將該電極用于血清中美洛昔康的電化學快速測定，結果令人滿意，為臨床分析檢測和疾病診斷提供一條新途徑，并且其生物相容性好，適合于各種生物體液的分析。L-半胱氨酸價廉易得，所以電極修飾材料成本低，該電極制作簡單、實驗操作方便、快速；樣品使用量小，對被測人員影響小；測定靈敏度和準確度高，有很好的穩定性和重現性；電極修飾層牢固，使用壽命6個月以上。


圖1是玻碳電極在含有2.5×10-3M L-半胱氨酸的0.04M鹽酸溶液中的循環伏安圖；掃描電位為-1.20～+2.60V；掃速為0.10V·s-1。
圖2(A)是濃度為5.0×10-7M美洛昔康在Nafion修飾電極上循環伏安圖；圖2(B)是濃度為5.0×10-7M美洛昔康在磺基丙氨酸修飾電極上循環伏安圖，掃速為0.10V·s-1，掃描范圍為+0.4～+1.4V，以Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，底液為0.04M的Britton-Robinson緩沖液(25℃，pH 1.86)。
圖3是磺基丙氨酸修飾玻碳電極對濃度為3.5×10-6M美洛昔康(實線)和空白底液(虛線)的線性掃描伏安圖，富集電位為-0.20V，富集時間為300s，靜止時間30s，掃速為0.10V·s-1，靈敏度為1.0×10-5A·V-1，掃描范圍為+0.4～+1.4V，以Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極，底液為0.04M的Britton-Robinson緩沖液(25℃，pH 1.86)。
圖4是不同濃度的美洛昔康在磺基丙氨酸修飾玻碳電極上的線性掃描伏安圖，(a)0.5μM，(b)2μM，(c)3.5μM，(d)6.5μM，(e)7.5μM，(f)8.5μM。插入圖美洛昔康的+1.088V的氧化峰電流與濃度的線性關系圖。
具體實施例方式
將裸玻碳電極進行預處理將玻碳電極表面分別用0.3μm、0.05μm的超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，然后在二次蒸餾水中超聲清洗五分鐘，再用高純氮氣吹干待用。
磺基丙氨酸修飾電極的制備將預處理好的玻碳電極置于含2.5×10-3M L-半胱氨酸的0.04MHCl溶液中(CHI660B電化學工作站，鉑絲為輔助電極，Ag/AgCl為參比電極)，在-1.2V～+2.6V(vs.Ag/AgCl)電位范圍內，以0.10V·s-1的掃描速度循環掃描10周(圖1)，取出用二次蒸餾水洗凈放入pH＝1.86的Britton-Robinson緩沖溶液(0.04M)中在-0.2V～+1.2V(vs.Ag/AgCl)的電位窗口中掃循環伏安至穩定。最后，電極經二次蒸餾水洗凈后用氮氣吹干即制得磺基丙氨酸修飾電極。該修飾電極于含2.5×10-3M L-半胱氨酸的0.04M HCl溶液中4℃冰箱保存。
磺基丙氨酸膜的特性將Nafion修飾電極和磺基丙氨酸修飾電極分別與Ag/AgCl電極和鉑絲對電極組成三電極系統置于含一定濃度美洛昔康的20.0ml pH＝1.86的Britton-Robinson(0.04M，25℃)底液中，電位從+0.4V掃描至+1.4V，采用循環伏安法記錄i-E曲線(圖2)。磺基丙氨酸和Nafion類似，都含有磺酸基，在pH＝1.86的Britton-Robinson(0.04M，25℃)底液中帶負電荷，可對美洛昔康產生吸附。但是由圖1中(A)和(B)的比較可以看出，磺基丙氨酸修飾電極與Nafion修飾電極相比，對美洛昔康的響應更高，峰形也更好。這證明磺基丙氨酸膜具有比Nafion膜更快的電子傳遞功能和更強的靜電吸附能力。實驗還證明這類修飾膜即使經過多次循環掃描也不會掉落，比較穩定，可以用做一種新的修飾膜。
將磺基丙氨酸修飾電極、Ag/AgCl電極和鉑絲對電極的三電極系統置于含一定濃度美洛昔康的20.0ml pH＝1.86的Britton-Robinson(0.04M，25℃)底液中，在-0.20V電位攪拌富集300s，然后靜止30s，電位從+0.4V掃描至+1.4V，采用線性掃描伏安法記錄i-E曲線(圖3)，美洛昔康出峰電位分別為p1+0.695V；p2+1.088V。峰電流響應靈敏并且p2峰不受尿酸和抗壞血酸的干擾，因而可適用于快速準確測定血清中的美洛昔康。
圖4是不同濃度的美洛昔康在電氧化L-半胱氨酸修飾電極上的線性掃描伏安圖和美洛昔康的+1.088V的氧化峰電流與濃度的線性關系圖。由圖可見在4.3×10-8～8.5×10-6M的范圍內美洛昔康的+1.088V的氧化峰電流與濃度是成線性關系的，線性方程為ipa(μA)＝21.544+8.401C(10-6M)且檢測限是1.5×10-9M(信噪比≥3)，相對標準偏差r＝0.999。
美洛昔康藥片實樣含量的測定取幾片美洛昔康藥片(宏強，揚子江制藥廠，生產批號04110402，標示量為7.5mg/片)，將其碾成粉末，稱取200.0mg該粉末移入裝有40.0ml無水乙醇的50.0ml容量瓶中，然后超聲5min，用無水乙醇稀釋至50.0ml，即得美洛昔康藥片實樣溶液。表1是由該法測定該美洛昔康藥片實樣含量所得結果與藥典中的酸堿滴定法測得的結果的比較。由該表可見該法具有更高的準確性和可靠性。
表1

血清中美洛昔康的測定將磺基丙氨酸修飾電極，Ag/AgCl電極和鉑絲對電極的三電極系統置于含一定濃度美洛昔康的20.0ml pH＝1.86的Britton-Robinson(0.04M，25℃)底液中，在-0.20V電位攪拌富集300s，然后靜止30s，電位從+0.4V掃描至+1.4V，采用線性掃描伏安法記錄i-E曲線。根據氧化峰電流值采用標準加入法通過定量測定血清中的尿酸，每次測定后在空白pH＝1.86的Britton-Robinson(0.04M，25℃)緩沖液中在+0.4～+1.4V電位范圍內循環伏安掃描10圈至穩定，再進行下一次測定。線性掃描伏安實驗時，掃描速度為0.10V.s-1。表2為用磺基丙氨酸修飾電極測定血清中的美洛昔康回收率的結果。由該表可見該法能適用于簡單、快速、準確地檢測血清中的美洛昔康。
表2

權利要求
1.一種基于電化學氧化L-半胱氨酸的磺基丙氨酸修飾玻碳電極的制備方法，其特征是包括以下步驟(1)先將玻碳電極表面用超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，在二次蒸餾水中超聲清洗，再用高純氮氣吹干預處理；(2)將預處理好的玻碳電極置于L-半胱氨酸—稀鹽酸溶液中，在-1.2V～+2.6V電位范圍內，以80mV·s-1～120mV·s-1的掃描速度循環掃描5周以上，取出用二次蒸餾水洗凈放入Britton-Robinson緩沖溶液中在-0.2V～+1.2V的電位窗口中掃循環伏安至穩定，采用二次蒸餾水洗凈后用氮氣吹干，制得磺基丙氨酸修飾玻碳電極。將該修飾電極于L-半胱氨酸—稀鹽酸溶液中4℃冰箱保存。
2.根據權利要求1所述的基于電化學氧化L-半胱氨酸的磺基丙氨酸修飾玻碳電極的制備方法，其特征是所述的將玻碳電極表面用超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，是先用0.3μm的超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光，后用0.05μm的超細Al2O3懸浮液在絲綢上拋光。
3.根據權利要求1所述的磺基丙氨酸修飾玻碳電極的制備方法，其特征是所述的L-半胱氨酸—稀鹽酸溶液為含2.5×10-3M L-半胱氨酸的0.04M HCl溶液。
4.根據權利要求1所述的磺基丙氨酸修飾玻碳電極的制備方法，其特征是所述的Britton-Robinson緩沖溶液的濃度為0.04M，pH值為1.86。
全文摘要
本發明公開了一種基于電化學氧化L－半胱氨酸的磺基丙氨酸修飾玻碳電極的制備方法。先將玻碳電極表面進行預處理；將預處理好的玻碳電極置于L－半胱氨酸—稀鹽酸溶液中進行循環伏安掃描，取出用二次蒸餾水洗凈放入Britton－Robinson緩沖溶液中循環伏安掃描至圖形穩定，用二次蒸餾水洗凈后用氮氣吹干制得磺基丙氨酸修飾玻碳電極。本發明工藝先進，選材科學，制作方便、成本低。用于血清中的美洛昔康的測定，靈敏度和準確度高，速度快，電極修飾層牢固，使用壽命長。
文檔編號G01N27/30GK1865968SQ20061004001
公開日2006年11月22日 申請日期2006年4月29日 優先權日2006年4月29日
發明者王赪胤, 王志賢, 邵曉秋, 劉清秀, 楊功俊, 胡效亞 申請人:揚州大學