專利名稱：蛇毒去纖維酶特異性單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是蛇毒去纖維酶特異性單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物，以及它們在藥劑或診斷中的應用，本發明還涉及含有這些抗體、抗體片段，它們的混合物或衍生物的藥劑。
本發明另外還涉及表達這些抗體、抗體片段，它們的混合物或衍生物的細胞。
蛇毒去纖維酶(Ancrod)(成藥名Arwin，Aruin)是從馬來半島蝮蛇(Agkistrodon rhodostoma)的蛇毒中提取的一種酶。它是一種高度糖基化的絲氨酸蛋白酶，平均分子量大約為38000，它具有抗凝血劑的特性并有溶解血塊的能力。
血液正常的凝固是在凝血酶的作用下實現的，凝血酶除去了纖維蛋白分子的纖維蛋白肽A和B從而導致纖維蛋白的形成(EP-B-0 556906)，纖維蛋白是血栓的主要組分，血栓的其他組分有，例如，紅細胞或血小板。與凝血酶不同的是，蛇毒去纖維酶只剪切纖維蛋白原分子α(“A”)鏈的精氨酸-甘氨酸鏈接，這就釋放了纖維蛋白肽A、AP及AY(Cde等人，J.Vasadar，surgery，Vol 17，1993，288-292)。纖維蛋白原分子的β(B)鏈并不受蛇毒去纖維酶的攻擊，因而也就沒有被釋放。經蛇毒去纖維酶除去纖維蛋白肽之后所得的片段(去-“A”-纖維蛋白單體)最終可以多聚為薄薄的細絲。如此得到的非典型的、可溶性的纖維蛋白被內源性纖溶酶降解并且/或者由網狀內皮組織系統(reticuloendothelial system，＝Res，單核細胞/巨噬細胞系統)除去。凝血酶不再把這一去-“A”-纖維蛋白原分子剪切為天然的纖維蛋白，因為這一分子并不是凝血酶的底物。
蛇毒去纖維蛋白使血液纖維蛋白原的濃度發生劑量依賴性的降低。通過治療進行誘導并控制的低纖維蛋白原血癥把血漿粘度及紅細胞聚集的趨勢減少到如此程度以致血流的特性得到了至關重要的改善。這為患有狹窄癥的血管血流量的增加提供了條件。
蛇毒去纖維蛋白目前被用于治療，例如，外周動脈慢性失調，它正處于中風臨床第三階段的研究。
把蛇毒去纖維酶進行皮下注射是有利的。治療可以在醫院里進行，或者，如果可以確保根據治療監控的需要定期檢查纖維蛋白原的濃度，也可以在門診進行。可以把蛇毒去纖維酶進行靜脈施藥，但只有在例外的情況下才采用，而且必須住院觀察。
蛇毒去纖維酶的劑量與必須根據不同個體具體考慮。應把纖維蛋白原的濃度當作蛇毒去纖維酶劑量的一個函數，這是至關重要的。應把其緩慢地減少到每100ml血漿含70-100mg(＝治療范圍)。在治療的全過程，必須把纖維蛋白原濃度調節到這一范圍之內。在這些條件下血液的流動特性是令人滿意的。治療正常會持續3-4周，但需要時也可延長。
進行皮下施藥時，前4天每天給藥70I.E.(＝國際單位，1ml)，從第5天開始，根據纖維蛋白原的濃度，每天給藥70-140I.E.。如果纖維蛋白原濃度處于治療范圍，可以每周用藥2-3次，每次注射210-280I.E.。
進行靜脈內輸注時，開始時按每公斤體重2-3I.E.給藥，8小時給完。隨后蛇毒去纖維酶的劑量取決于所得的纖維蛋白原的濃度。通常再按每12小時每公斤體重1I.E.給藥就足夠了。
蛇毒去纖維酶在循環中的初始半衰期大約為3-5小時，但隨著濃度的降低逐步減慢，因此，在大約4天后，這時通常施用的蛇毒去纖維的90％已被除去，半衰期延長到9-12天。
與，例如，肝素及丙酮芐羥香豆素(Warfarin，華法會)不同的是，在治療期間，與蛇毒去纖維酶有關聯的非特異性出血較少(參閱Z.S.Latallo，“Retrospective Study on Complications and AdverseEffects of Treatmont with Thrombin-Like Enzymes-AMulticenter Trial”Thromb，Haemvstasis，50(1983)604-609)，盡管如此，此類出血的特效治療仍是必需而且合乎需求的。
蛇毒去纖維酶治療的禁忌癥有，例如，血友病、與受傷有關的出血危險、手術后及產后、潰瘍性腸紊亂、腫瘤、難控制的高血壓、急性腦梗塞以及急性肺結核、RES功能紊亂以及血塊降解功能失調，例如，處于高燒、嚴重的肝功能失調，顯然的及初發的體克或懷孕狀態。
如上所述，如果在治療期間把纖維蛋白原濃度緩慢降低并調節到70-100mg/100ml，出血的風險就會相對較低。應對具有潛在出血傾向，如患有腎結石或腎衰竭的患者進行特別仔細的監護。應避免通過動脈穿刺及肌肉注射施用其他藥物。當同時施用RES-阻礙藥物及致潰瘍藥、抗凝劑、抗血纖維溶解藥、血栓溶解劑及抑制血小板聚集的藥物時，當把蛇毒去纖維酶進行肌肉給藥時，都要提高警惕。肌肉給藥處的吸收通常很快以致太多去-“A”-纖維蛋白單體流走從而有導致血栓栓塞并發癥的危險。
在一個對429個患者進行的研究(Crit.Rev.Oncol.Hematol.15(1993)23-33)中，給這些從未接受過溶栓治療的患者施用蛇毒去纖維酶，出血病例的總數是9.8％(4.2％內出血；5.6％外出血)。
目前被用于中和蛇毒去纖維酶酶活性的是一種基于山羊血清免疫球蛋白制劑的解毒劑(Knoll AG publication，June 1983，命名為Arwin)。這一由多克隆抗體組成的解毒劑被用于嚴重的出血并發癥發生時或者出血危險的可能性增加時，例如與意外受傷相關聯的或者是當外科手術突然變得勢在必行時。在用蛇毒去纖維酶中和之后應接著施用4-5g的人纖維蛋白原。如果在施用人纖維蛋白原、血漿或血液之前沒有事先用解毒劑中和蛇毒去纖維酶，就會有急性播散性凝血的危險。
Stocker等人(Thrombosis Resenrch，Vol.6，1975189-194)研究了僅有Arwin存在時以及有多克隆解毒劑存在時的血栓發生并得以闡明解毒劑的作用。
除了把山羊的多克隆抗體用于上述目的外EP-B-0 395 375，EP-B-0 556 906及Burkhardt等人(FEBS，Vol 297，No.3，1992297-301)描述了用于監測蛇毒去纖維酶基因表達的、用于用蛇毒去纖維酶及蛇毒去纖維酶受體監測血液纖維蛋白原的單克隆和多克隆抗體，或者用抗體來純化蛇毒去纖維酶。
把山羊多克隆抗體用作蛇毒去纖維酶解毒劑的一個缺點是，例如，它們是由抗體混合物組成的，其中的許多抗體都不具有中和蛇毒去纖維酶的效果。如此大量的不同的抗體可能會導致快速的免疫反應并且，此外，導致相對較低的中和蛇毒去纖維酶的能力。另外，解毒劑中所含的抗體對蛇毒去纖維酶的親和力各不相同。由于多克隆抗體是從動物獲得的，因此很難被標準化，這意味著不同生產批次之間存在變化。
本發明的一個目標就是開發一種針對蛇毒去纖維酶的解毒劑，它不具有上述的缺點并易于被工業化生產。
我們業已發現這一目標可以由一新穎的單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物來實現，它們與蛇毒去纖維酶結合并抑制其活性，其結合的親和力介于1×10-7至1×10-12M之間，其體內中和效果與山羊多克隆抗體的相比較，至少改善100％。
把這些新穎的抗體用作蛇毒去纖維酶的解毒劑的有利地具有一些改善的特性。例如，它們是由一種抗體或一種抗體亞種構成的均一的、性質很明確的產品，這些產品不同的生產批次不存在變化。它們可以根據所需的任何數量進行生產，因為它們不是在動物中生產的，所以其產品不會帶有病毒或細菌污染。這些新穎的抗體，抗體片段、它們的混合物或衍生物具有抗原決定基特異性以及高結合及中和能力。因此治療時可以少量施用。由于產品具有均一性，而且因為其高結合及中和能力使其所用劑量減少，所以患者免疫反應的風險可以被顯著地降低。在各種不同的抗體、抗體片段或衍生物中，并不象多克隆抗體那樣，存在結合和中和能力的變化。把可以結合蛇毒去纖維酶不同抗原決定基的不同的抗體、抗體片段或衍生物混合在一起可以非常有效地中和蛇毒去纖維酶。
新穎的抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物對蛇毒去纖維酶的結合親和力有利地介于1×10-7至1×10-12M之間，優選地1×10-8至1×10-11M之間，特別優選地1×10-9至5×10-10M之間。
新穎的解毒劑在體內對蛇毒去纖維酶的中和效果與山羊多克隆抗體相比，改善至少100％，優選地250％，特別優選地500％。在體外，單克隆抗體的效果比多克隆抗體的也顯然較好。
新穎的單克隆抗體或其片斷原則上指的是所有免疫球蛋白種類如IgM，IgG，IgD，IgE，IgA或他們的亞種如IgG亞種或其混合物。IgG及其亞種是優選的，如IgG1，IgG2，IgG2a，IgG2b，IgG3或IgGM。IgG的亞型IgG1/κ及IgG2b/κ是特別優選的。此處所提及的片段指的是所有的截短的或修改的抗體片段，它們帶有一個或兩個對蛇毒去纖維酶有強結合及中和能力的抗原互補結合位點，例如可以是具有與抗體相對應的一個結合位點的多種抗體的某些部分，它可以由輕重鏈，如Fv，Fab或F(ab′)2片段，組成，也可以是單鏈片段。優選的是截短的雙鏈片段如Fv，Fab或F(ab′)2。這些片段可以例如用酶學的方法用例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶降解去除抗體的Fc部分，或者通過化學氧化或對抗體基因進行遺傳操作來獲得。經過遺傳操作的，不經截短的片段也可能是有利的。
抗體或片段可以單獨作用，也可以混合使用。
可以用熟練工作人員已知的方法把用于遺傳操作的抗體基因例如從雜交瘤細胞中提取出來。為此目的，培養生產抗體的細胞而且當細胞的光密度足夠時，把細胞中的mRNA用已知的方法分離出來，即用硫氰酸胍裂解細胞，用乙酸鈉進行酸化，用苯酚、氯仿/異戊醇進行提取，用異丙醇沉淀，再用乙醇清洗。然后用反轉錄酶從mRNA合成cDNA。可以把合成后的cDNA直接或在遺傳操作以后，例如通過定點誘變、插入、轉換、刪除或堿基互換等導入方法插入到合適的動物，真菌，細菌或病毒載體中并讓其在合適的宿主有機體內表達。用細菌或酵母菌載體，如pBR322，pUC18/19，pACY148，λ或酵母菌μ載體來克隆這些基因并讓其在細菌如E.coli或酵母菌如釀酒酵母中表達是優選的。
本發明進而涉及合成這些新穎抗體的細胞。它們可以是經過上述改造的動物、真菌、細菌或酵母菌細胞。它們有利地是雜交瘤細胞或trioma細胞，優選地是雜交瘤細胞。這些雜交瘤細胞可以使用用已知的方法進行生產；用蛇毒去纖維酶免疫動物并提取動物中生產抗體的B細胞，選擇那些含有與蛇毒去纖維酶結合的抗體的細胞并隨后把這些細胞融合到，例如，人或動物的，例如，小鼠骨髓瘤細胞，人類淋巴母細胞或異雜交瘤細胞中(Koehler等人，Nature 256，1975496)，或者用合適的病毒感染這些細胞以獲得永生細胞。通過融合生產的雜交瘤細胞系是優選的，鼠雜交瘤細胞系特別優選，更加特別優選的是那些可以分泌抗體MAK 1-2，MAK 2-29/3或MAK 3-27的雜交瘤細胞素，它已被存放在DSMZ(Deutsche Sammlung für Mikroorganismenund Zellkulturen in Braunschweig)，號碼為DSM ACC 2317，DSM ACC 2318及DSM ACC 2319。
上述的雜交瘤細胞系分泌特別優選的IgG類型抗體。所形成的抗體MAK 1-2，MAK 2-39/3及MAK 3-27屬于IgG亞型IgG1/κ，IgG2b/κ，以及IgG1/κ。這些優選的抗體結合到蛇毒去纖維酶分子的不同的抗原決定基上，這在抗體自身的競爭性結合試驗中已經示明。特別優選的抗體MAK 1-2結合到它的抗原決定基上可導致蛇毒去纖維酶最廣泛的中和反應，因此其中和酶活性所需的抗體數量最少。比起通常被用于出血癥治療的基于山羊多克隆抗體的由Knoll AG(Ludwigshafen)當成解毒劑銷售的解毒劑，單克隆抗體具有明顯更強的中和效果。
此處應該提及的新穎單克隆抗體的衍生物有肽、來源于抗體抗原結合區域的模擬肽、以及結合到固體或流體載體，如聚乙二醇、玻璃、合成多聚物如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯或天然多聚物如纖維素、瓊脂糖，上的抗體、片段或肽，或者與酶、毒素或具有放射活性或不具放射活性的標記物如3H、123I、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、55Fe、59Fe、90Y、99mTc、75Se結合在一起的抗體、片段或肽，或者與熒光/化學發光標記物，如rhodamine(若丹明)、熒光素、異硫氰酸鹽、藻紅蛋白、藻蘭蛋白、熒光胺、金屬螯合物、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白鏈菌素或生物素共價結合的抗體、片段或肽。
新穎的抗體、抗體片段、它們的混合物及衍生物可以被直接使用，也可以在干燥后，如冷凍干燥之后，或者在與上述的載體相連接之后，或者在與其他有醫藥活性的輔助物質一起配制以生產藥劑之后被使用。此處應該提及的有活性的輔助物質的例子有其他的抗體、具有殺微生物或抑制微生物作用的抗菌活性物質，如通常的抗生素或者磺胺藥物、抗癌劑、水、緩沖液、鹽水、酒精、脂肪、石蠟、惰性賦形物或其他通常被用作腸道外產品的物質，如氨基酸、增稠劑或糖。這些藥劑被用于控制疾病，優選地控制凝血紊亂，有利地控制外周血液系統的紊亂，或控制中風。
新穎的解毒劑可以口服，或者非經腸-通過皮下、肌肉、靜脈內或腹膜內-施用，其中肌肉或靜脈內施藥是優選的。
新穎的抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物可以被直接用于診斷，或者可以在與如上所述的固體或液體載體、酶、毒素、具放射活性或不具放射活性標記物或者與熒光/化學發光標記物偶聯以后再被使用。在上述情形中，可以在廣泛的各種有機體(如人或動物)的廣泛的各種體液中或者在廣泛的各種液體，如酵母菌、細菌、真菌的培養基中，或者人或動物細胞的培養基中監測到蛇毒去纖維酶。
實施例1.雜交瘤細胞系的制備免疫、融合、選擇以及表征是根據文獻中描述的技術進行的(如J.H.Peters；Monoklonale Antikorper，Herstellurg und Charakterisienong；Springer Verlag；A.M.Campbed；Monodonal Antibody andImmunosensor Technology；Elsevier出版，第2至7章及第8章，1991)。
給Balb/c雌鼠通過腹膜施用100mg已經通過交聯使其酶活性失活的蛇毒去纖維酶，根據以下方案在2-3周內完成施藥1.于100μl磷酸鹽緩沖液中+100μl完全弗氏佐劑2.于100μl磷酸直緩沖液中+100μl不完全弗氏佐劑3.-5.于200μl磷酸鹽緩沖液中在最后一次施用抗原三天以后，移取脾臟，把細胞清洗并分離，并把淋巴細胞融合到淋巴瘤細胞系SP2/0-Ag/4(＝ATCC CRL1581)中。這是這樣來完成的把它們以5∶1比率混合，與1.5ml的PEG溶液(＝聚乙二醇溶液)在37℃保溫1分鐘并與PBS(＝磷酸鹽緩沖液)混合(1ml的30秒，3ml的30秒，16ml的60秒)。經過清洗以后，把細胞培養在選定的培養基〔DMEM(＝Dulbecco’sModified Eagle Medium)；10％FCS(＝胎牛血清)；10％Condimed H1(Boehringer Mannheim)；HAT添加劑(＝次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷添加劑)；ITS添加劑(＝胰島素轉鐵蛋白、亞硒酸鹽添加劑)；丙酮酸鹽；谷氨酸鹽；鏈霉素/青霉素〕，溫度是37℃，二氧化碳濃度7.5％。
按照如下的步驟用一微量滴定板，用特異性ELISA鑒定那些特定分泌抗蛇毒去纖維酶抗體的雜交瘤細胞-在微量滴定板的每一孔中覆蓋0.1ml的蛇毒去纖維酶或其他參照蛋白以確定其特異性(1μg/ml 0.05M NaHCO3pH 9.2)，溫度4℃，時間16小時-在每一孔中用0.3ml的1％BSA/PBS飽和，溫度23℃，時間0.5-1小時-用PBS/0.05％Tween20洗三次-用細胞培養基上清(50μl，用50μl PBS/0.1％ BSA〔＝牛血清白蛋白〕/0.05％Tween20稀釋)于23℃溫育2-4小時-如上法清洗-每孔用0.1ml的溶于0.1％BSA/PBS中的經生物素酰化處理的抗鼠IgG抗體于23℃溫育2-4小時-如上法清洗-每孔用0.1ml溶于0.1％BSA/PBS中抗生物素蛋白鏈菌素-過氧化物酶復合物于23℃溫育0.5小時-如上法清洗-每孔加入0.1ml過氧化物酶底物-每孔加入0.1ml的2M H2SO4終止反應-測量450nm的吸收值過氧化物酶底物把0.1ml的TMB溶液(42mM四甲基聯苯胺，溶于二甲亞砜中)與10ml的底物緩沖液(0.1M乙酸鈉，pH 4.9)相混合，然后加入14.7μl的H2O2。
通過亞克隆把發生陽性抗體反應的雜交瘤分離出來并對；各個克隆重新進行試驗。把具有最強反應性的抗體用于體外中和化驗中。通過這種方法可以分離大量的陽性雜交瘤，即產生抗蛇毒去纖維酶抗體的細胞。2.單克隆抗體的生產及其性質的確定單克隆抗體是從無血清細胞培養基的上清中純化的。這是這樣來完成的把雜交瘤逐步從DMEM/HT/10％FCS及DMEM/10％FCS轉移到無血清細胞培養基(HT＝次黃嘌呤，氨基喋呤)，如SF-3(Cytogen)，PFHM-II(Gibco)，HL-1(Bio Whittaker)，Uttra Doma PF(Bio Whittaker)等中。隨后用蛋白質A-瓊脂糖及蛋白質G-瓊脂糖進行親和層析純化。
當把細胞培養基上清上到層析柱上之后，用3M NaCl/1.5M甘氨酸pH 8.9把非特異性結合的蛋白質洗脫出來；具有抗蛇毒去纖維酶抗體反應性的蛋白則用500mM NaCl/0.59％乙酸洗脫。
用與上述的類似的ELISA來確定抗體的亞型，但此次不用經生物素酰化處理的抗鼠IgG抗體，而是使用下列的經生物素酰化處理的亞型特異性抗體抗鼠IgG1、抗鼠IgM、抗鼠IgG2a、抗鼠κ、抗鼠IgG2b、抗鼠λ及抗鼠IgG3。
經過分離的雜交瘤細胞系MAK 1-2，MAK 2-29/3及MAK 3-27(參看例1)的抗體類型及亞型分別被確定為IgG1/κ、IgG2b/κ及IgG1/κ。
單克隆抗體的親和常數是用文獻公開的各種不同的技術來確定的，例如采用平衡透析法，免疫沉淀反應法或ELISA法(如J.H.Peters；Monoklonale Antikorper，Herstellung und Charakterisierung；Springer Verlag；A.M.Campbell；Monoclonal Antibody andImmunosensor Technology；Verlag Elsevier；第11章，1991)。
ELISA方法(J.Immunol.Methods 77(1985)305-319)揭露了天然蛇毒去纖維酶下列的親和力(表格I)表格I抗蛇毒去纖維酶單克隆抗體的親和力
3.用單克隆抗體(＝MAK)細胞培養基上清在體外對蛇毒去纖維酶進行中和反應。
通過蛇毒去纖維酶誘導的纖維蛋白的混濁度來對抗量的中和能力進行定量。這是這樣來完成的在用BSA飽和處理過的微量滴定板中把不同濃度比率的蛇毒去纖維酶與抗體(細胞培養基上清或純化后的抗體)于37℃進行溫育，然后加入人纖維蛋白原(1.5mg)。在37℃溫育后，在340nm對所產生的纖維蛋白進行定量(＝光密度＝OD)。
當用于中和的抗體的量增加時，蛇毒去纖維酶活性就可以被中和。這表現為光密度(＝OD)的降低(表格II)。
抗體MAK 1-2特別有效，即使蛇毒去纖維酶的濃度相對較高，也可以把其完全中和(表格II，OD值對應于空白)。表格II中的空白含有除蛇毒去纖維酶之外的所有成分。對于各種不同劑量的蛇毒去纖維酶(每毫升50，25及12.5ng蛇毒去纖維酶)，當不加入各種不同的單克隆抗體時，其OD值最高(表格II)。
MAK 2-29及3-27對蛇毒去纖維酶的親和力與MAK 1-2相當或更好(表格I)，但是只有使用與蛇毒去纖維酶的相相比更高的抗體劑量，其抗體-抗原結合才能導致酶活性的中和。
表格II用MAK的細胞培養基上清中和蛇毒去纖維酶
4.用經過純化的單克隆抗體“在體外”中和蛇毒去纖維酶可以通過比較纖維蛋白混濁度化驗的50％中和值來評價經過純化的單克隆抗體的體外中和效率。
50％中和值是這樣獲得的OD陰性對照+(OD陽性對照-OD陰性對照)/2陰性對照不加蛇毒去纖維酶(無纖維蛋白形成)陽性對照蛇毒去纖維酶+纖維蛋白原(最高程度地形成纖維蛋白)。
不同的抗體/蛇毒去纖維酶比率導致不同的OD值，50％中和點是用以下抗體濃度達到的
通過達到50％中和所需的抗體量的比率可以推斷，在所選定的體外條件下，與基于山羊多克隆抗體的解毒劑相比較，單克隆抗體MAK1-2在預先溫育1小時后可改善至少2倍，在預先溫育2小時之后可改善大約4倍。5.用三夾層ELISA對蛇毒去纖維酶進行定量如下列方案所示，用三夾層ELISA結合兩種抗體來確定診斷用樣品，如各種不同的體液，中的蛇毒去纖維酶- 在微量滴定板的每一孔中覆蓋100μl稀釋于0.05M NaHCO3(pH 9.2)中的5μg/ml MAK 1-2或MAK 3-27；4℃過夜- 用PBS/0.05％Tween20清洗微量滴定板；每孔200μl- 每孔用300μl 1％BSA/PBS飽和；23℃，0.5小時- 如上法清洗- 把溶于PBS/0.1％BSA/0.05％為Tween20的蛇毒去纖維酶從50ng/ml開始，配制11種標準2倍稀釋液；每孔100μl；平行使用各種不同的樣品稀釋液；于23℃溫育2小時- 如上法清洗- 用稀釋于PBS/0.1％BSA/0.05％Tween20的1ng/ml的MAK 2-29溫育，每孔100μl；23℃，2小時- 如上法清洗- 用1∶10000稀釋于PBS/0.1％BSA/0.05％Tween20的經過生物素酰化處理的抗鼠IgG2b溫育；每孔100μl；23℃，2小時- 如上法清洗- 用1∶10000稀釋于PBS/0.1％BSA/0.05％Tween20的抗生物素蛋白鏈菌素-過氧化物酶復合物溫育；每孔100μl；23℃，0.5小時- 如上法清洗- 每孔加入100μl的過氧化物酶底物(把10ml底物緩沖液(0.1M乙酸鈉pH 4.9)與100μl的TMB溶液(42mM四甲基聯苯胺，溶于二甲亞砜中)相混合并加入14.7μl的3％H2O2)。
- 每孔加入100μl 2M H2SO4終止反應- 測量450nm的吸收值。
可以發現，當使用單克隆抗體MAK 1-2及MAK 3-27以及兩者結合使用時，蛇毒去纖維酶在從大約3000至10pg/ml的濃度范圍內都是可以計量及可以檢測的。絕對的檢測局限低于這些可計量值(
圖1)。6.競爭性ELISA用競爭性ELISA來鑒定蛇毒去纖維酶上結合MAK的抗原決定基- 在微量滴定板的每一孔中覆蓋100μl稀釋于0.05MNaHCO3，pH 9.2中的蛇毒去纖維酶；4℃過夜- 用PBS/0.05％Tween20清洗微量滴定板；每孔200μl- 每孔用300μl 1％BSA/PBS飽和；23℃，0.5小時- 如上法清洗- 在如上法制備的微量滴定板中的各種不同的混合物中分別加入10ng/ml的經過生物素酰化處理的單克隆抗體MAK 1-2-生物素，MAK 2-29/3-生物素以及MAK 3-27-生物素，它們分別與蛇毒去纖維酶結合，然后根據初始抗體情況，在各個混合物中加入各種不同濃度(11μg/ml-1ng/ml)的不同的抗體(MAK 1-2，MAK 2-29/3或MAK 3-27)以便試驗抗體所有可能的組合形式從而檢測它們結合位置可能存在的重疊。把含有各種不同的抗體組合形式的混合物于PBS/0.1％BSA/0.05％Tween20中于23℃溫育2小時然后進行如下處理- 如上法清洗- 用1∶10000稀釋于PBS/0.1％BSA/0.05％Tween20的抗生物素蛋白鏈菌素-過氧化物酶復合物溫育；每孔100μl；23℃，0.5小時- 如上法清洗
- 每孔加入100μl過氧化物酶底物(把10ml底物緩沖液(0.1M乙酸鈉，pH 4.9)與100μl TMB溶液(42mM四甲基聯苯胺，溶于二甲亞砜中)相混合，再加入14.7μl 3％的H2O2)。
- 每孔加入100μl 2M H2SO4終止反應- 測量450nm的吸收值。
在所有采用的抗體組合形式中都沒有觀察到OD的減少，這意味著各種不同的單克隆抗體在結合到蛇毒去纖維酶上時并沒有相互替代。它們結合到蛇毒去纖維酶分子上不同的抗原決定基上。因此，可以有不只一個的抗體同時與蛇毒去纖維酶發生相互作用。因此，結果需要，可以把這些各不相同的新穎的單克隆抗體組合使用以便迅速、最佳地中和蛇毒去纖維酶的效果。4.蛇毒去纖維酶的體內中和給鼠從尾靜脈輸注每公斤體重10I.E.的蛇毒去纖維酶30分鐘以進行麻醉。蛇毒去纖維酶輸注進行10分鐘后，把各種不同的試驗物質-單克隆、多克隆抗體或安慰劑-通過靜脈按每公斤體重1ml進行輸注。在蛇毒去纖維酶輸注開始前、開始后30分鐘及開始后的60分鐘分別從頸動脈采集血樣(8體積血液+2體積0.11M檸檬酸直抗凝劑)。把經過檸檬酸鹽處理的血液離心獲得血漿，用Clauss凝血法確定纖維蛋白原的含量(通過把確定量鼠纖維蛋白原加入到無纖維蛋白原鼠血漿中來獲得校準曲線)。
在每一(試驗物質)組中使用6只小鼠(表格III)表格III試驗物質及其使用量<
<p>表格IV使用各種不同抗體時纖維蛋白原濃度的測量<
可以發現，MAK 1-2在每公斤體重1.435mg的濃度下可以在蛇毒去纖維酶輸注開始30分鐘后阻止纖維蛋白原水平的進一步下降。山羊多克隆抗體要有每公斤體重8.6mg才能達到同樣效果。當基于多克隆抗體的解毒劑的濃度是每公斤體重1.5mg，即與MAK 1-2的濃度相當時，并不產生效果(看表格IV中的對照)。
以輸注60分鐘后纖維蛋白原的濃度為基礎可以推斷在試驗條件下MAK 1-2的中和效果比多克隆解毒劑的要改善6倍。可以推定MAK1-2的(實際)中和效果還要高。
權利要求
1.一種單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物，它與蛇毒去纖維酶結合并抑制其活性，其結合親和力范圍是1×10-7M至1×10-12M，其中和效果與山羊多克隆抗體比較改善至少100％。
2.一種如權利要求1中所述的單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物，其中抗體是IgG類型。
3.一種如權利要求1或2中所述的單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物，其特征在于，它是抗體MAK 1-2，MAK 2-29/3或MAK 3-27或其混合物。
4.一種表達如權利要求1至3中任一所述的單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物的細胞。
5.一種如權利要求4中所述的細胞，其特征在于，它來源于-雜交瘤細胞系。
6.一種如權利要求4或5中所述的細胞，其中的雜交瘤細胞系是DSM ACC 2317，DSM ACC 2318及DSM ACC 2319。
7.一種含有權利要求1至3中任一所述的單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物的藥劑。
8.權利要求1至3中任一所述的單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物在藥劑中的應用。
9.權利要求1至3中任一所述的單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物在生產治療凝血疾病的藥劑中的應用。
10.權利要求1至3中任一所述的單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物在診斷中的應用。
全文摘要
蛇毒去纖維酶特異性單克隆抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物被用于藥劑及診斷中。同時公開了達到這些抗體、抗體片段、它們的混合物或衍生物的細胞。
文檔編號G01N33/573GK1262690SQ98807040
公開日2000年8月9日 申請日期1998年6月23日 優先權日1997年7月10日
發明者T·蘇布科夫斯基, W·霍恩貝爾格 申請人:Basf公司
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