一種用于檢測氧化應激標志物d-ROMs的體外檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種通過檢測血液中總的活性氧代謝物(ROMs)含量從而評價人體內整體氧化應激水平的應用方法，該方法包括：將含有ROMs的血清加入酸緩沖液配制的芳香胺(DMPD)，二價鐵及三價鐵在酸緩沖液中從血清蛋白中釋放；ROMs的主要成分過氧化氫物(ROOH)與二價鐵及三價鐵反應，生成烷氧自由基(RO*)和過氧化自由基(ROO*)；自由基氧化DMPD，生成粉紅色產物；產物用自動生化儀505nm波長讀數，讀取OD值與ROMs濃度呈比例。本發明檢測ROMs的方法為一步法，測定儀器為臨床生化診斷最基本的和必備的生化分析儀，具有操作簡便、精密度高、重復性好等優點。針對ROMs的氧化應激分析可作為治療方案制定或預后判斷等的依據，具有相當重要的臨床意義。
【專利說明】一種用于檢測氧化應激標志物d-ROMs的體外檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及通過檢測血液中總的活性氧代謝產物(ROMs)含量從而評價人體內整體氧化應激水平。ROMs的主要成分為過氧化氫物(ROOH)，可作為體內氧化應激的標志物。該方法可用于測定氧化應激相關疾病:心血管疾病、神經變性疾病、代謝綜合征、腫瘤等；暴露于危險因素的評價:吸煙、酗酒、不適當的運動、飲食不平衡；以及評估增加氧化水平的治療:口服避孕藥、放化療、血液透析、干預旁路。
【背景技術】
[0002]氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species, R0S)和活性氮自由基(reactive nitrogen species, RNS)產生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統和抗氧化系統的動態平衡失衡，從而導致DNA氧化損傷和蛋白質的表達異常，最終引起組織損傷。
[0003]自由基具有不成對電子的原子或基團。自由基非常活潑，很容易與其他物質發生化學反應，生成活性氧代謝物(ROMs)。活性氧代謝物與氧自由基相比在血液中更穩定，因此可以在血液中被檢測到，其評價氧化應激水平也更為準確。ROMs的主要成分為過氧化氫物(R00H)，因此，d-R0Ms檢測主要是檢測血液中的過氧化氫物，而不是直接檢測人體的自由基數量。血液中d-R0Ms的正常范圍為250-300UNIT CARR(U CARR);數值大于300U CARR表明機體處于氧化應激狀態(1U CARR等于0.8mg/L H2O2)。
[0004]與全球體外診斷產品市場相對成熟不同，我國體外診斷市場仍處于發展的初級階段。我國的診斷試劑市場規模僅為全球市場的1/14，人均消費量約為全球人均消費量的17%左右，即仍處于產品研發與生產的投入初期。因此，我國體外診斷市場的生存、發展和壯大依然是一個漫長的過程。隨著生物技術的快速發展，我國體外診斷產業將面臨更大的機遇和挑戰。并且，我國人口眾多，市場龐大，其中蘊含的經濟利益和社會效益更是無法估量。研制價廉物美、操作簡便的體外診斷方法和診斷試劑產品無疑是非常必要且具重要意義的。
[0005]目前國際上針對ROMs的氧化應激分析評估系統通常包括檢測試劑、參考品(校準品、質控品)、分光光度儀整套系統，雖然在檢測重復性、準確性上有很大優勢，但相對操作過程復雜、經濟花費較大。國內對于ROMs的檢測，生產廠家幾乎都沒有生產相應質控品的經驗和實力，因此市場上缺乏公眾認可的檢測ROMs的國產產品。本發明所涉及檢測ROMs的方法為一步法，測定儀器為臨床生化診斷最基本的和必備的檢驗設備自動生化分析儀，具有操作簡便、檢測速度快、精密度高、重復性好等優點。針對ROMs的氧化應激分析可作為治療方案制定或預后判斷等的依據，因此具有相當重要的臨床意義。
【發明內容】
[0006]針對現有氧化應激分析評估系統存在的問題，本發明的目的在于提供一種操作簡單、成本低廉、成功率高和穩定性好的檢測ROMs的方法。
[0007]為實現上述目的，本發明涉及一種檢測ROMs的方法，該方法包括:
[0008]1)全血離心,分離血清和血細胞；
[0009]2)取適量步驟1)中血清，加入Tris酸緩沖液配制的適宜濃度的芳香胺(DMPD，N，
N- 二甲基對苯二胺二鹽酸鹽)溶液；
[0010]3)血清中二價鐵及三價鐵在酸緩沖液中從血清蛋白中釋放，過氧化氫物(R00H)與二價鐵及三價鐵反應，生成烷氧自由基(R0*)和過氧化自由基(ROCf)；
[0011]4)步驟3)中生成的烷氧自由基(R(f)和過氧化自由基(ROCf)將芳香胺氧化，生成粉紅色產物；
[0012]5)粉紅色產物用波長為505nm的自動生化分析儀讀數，顏色強度與讀取0D值(ROMs濃度)呈比例；
[0013]6)在以上步驟進行的同時，步驟1)中血清以不同濃度的H202代替，余步驟不變，以不同濃度H202反應產物讀取的0D值做標準曲線，由此計算出血清中過氧化氫物(R00H)相當于H202的濃度。
[0014]其中，步驟3)和步驟4)中化學反應的原理圖如下所示:
[0015]1A) R-00H+Fe2+ — R-0*+Fe3++0F
[0016]IB) R-0*+A-NH2 — R-0> [A_NH2*]+
[0017]2A) R-00H+Fe3+ — R_00*+Fe2++H+
[0018]2B) R-00*+A-NH2 — R-00> [A_NH2*]+
[0019]本發明的有益效果在于:本發明檢測ROMs的方法操作非常簡單，檢測成本低，結果準確可靠，而且具有高重復性，可快速準確檢測血液中總的活性氧代謝物(ROMs)含量從而評價人體內整體氧化應激水平。為臨床上評估疾病的危險因素，確定疾病的治療方案和判斷疾病的預后提供可靠的理論依據。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1血清反應產物0D值讀取示意圖，單位時間內的0D值變化與濃度呈正比。
[0021]圖2為配制的DMPD試劑的穩定性觀察。在DMPD試劑配制完成的4天時間內，每天重復檢測同一份血清樣本，0D值讀值穩定。
[0022]圖3為本發明檢測ROMs的方法與國際上認可度較高的日本WISMERLL公司產品的準確性比較。結果顯示兩組測定結果具有良好的兩兩相關性，相關系數大于0.99。
【具體實施方式】
[0023]下面參考附圖，對本發明進行更全面的說明，附圖中示出了本發明測定結果的計算方法，本測定系統的穩定性以及與國際上認可度較高的日本WISMERLL公司產品的準確性比較。充分說明了本發明操作簡單，檢測成本低，結果準確可靠，并且具有高重復性的特點。
[0024]本發明的原理主要在于:將含有ROMs的血清加入酸緩沖液配制的芳香胺(DMPD，N，N-二甲基對苯二胺二鹽酸鹽)；二價鐵及三價鐵在酸緩沖液中從血清蛋白中釋放；ROMs的主要成分過氧化氫物(R00H)與二價鐵及三價鐵反應，生成烷氧自由基(R(f)和過氧化自由基(R0(f)；自由基氧化芳香胺，生成粉紅色產物；產物用自動生化儀505nm波長讀數，讀取OD值與ROMs濃度呈比例。
[0025]該方法具體為:
[0026]1.全血1500g離心15min，吸取25 μ L上層血清。
[0027]2.以濃度為10mM的Tris-Cl (PH值為2)溶解DMPD粉末，配制成濃度為5mM的溶液。
[0028]3.取100 μ L步驟2)中DMPD溶液，與步驟I)中血清混合；同時分別配制濃度為0.625mM、l.25mM、2.5mM、5mM、10mM、20mM、40mM 的 H2O2 溶液，各取 25 μ L 與步驟 2)中 DMPD 溶液混合。
[0029]4.步驟3)中混合產物立即用奧林巴斯AU5400生化儀的505nm波長讀數，顏色強度與OD值(ROMs濃度)呈比例。
[0030]在圖1中，示混合產物加入自動生化儀后，10分鐘時間內讀取34次OD值，血清組的第33次OD值與第17次OD值之差為Λ OD0,各H2O2組的第33次OD值與第17次OD值之差分別為 AOD^ AOD2, A0D3、AOD4, AOD5, AOD6, AOD7,以 H2O2 溶液濃度為橫坐標，AOD1,Δ OD2, Δ OD3> Δ OD4, Δ OD5, Δ OD6, Δ OD7為縱坐標，繪制標準曲線。根據標準曲線和Λ OD0值即求出血清中活性氧代謝產物等價于H2O2的濃度。
[0031]在圖2中，示本測定系統的穩定性觀察。在DMI3D試劑配制完成的4天時間內，每天重復3次檢測同一份血清樣本，四組OD值讀數沒有顯著性差異(P > 0.05)。說明本測定系統穩定性良好。
[0032]在圖3中，對本發明檢測ROMs的方法與國際上認可度較高的日本WISMERLL公司測定方法進行準確性評估。分別以兩種方法對含不同濃度ROMs的血清測定后，做相關分析發現，兩種測定體系間具良好的兩兩相關性，相關系數大于0.99。說明本檢測系統準確性良好。
[0033]上述作為氧化應激標志物的d-ROMs的體外檢測法，可作為治療方案制定或預后判斷等的依據，不是以診斷為目的，不屬于疾病的診斷方法。
[0034]除非特殊定義，本發明描述所用的術語是在有關【技術領域】中公知的術語。標準的化學符號及縮寫符號可以與其全名互換使用。
[0035]除非特殊指明，本發明所用到但未明確闡述或簡單闡述的技術和方法是指本【技術領域】通常使用的技術和方法，可按照本領域公知的技術和方法進行。試劑盒的使用是根據制造商或供應商提供的說明書進行。
【權利要求】
1.一種操作簡單、成本低廉、成功率高的檢測ROMs的方法，其特征在于，該方法包括: 1)全血離心，分離血清和血細胞； 2)取適量步驟I)中血清，加入Tris酸緩沖液配制的適宜濃度的芳香胺(DMPD，N，N-二甲基對苯二胺二鹽酸鹽)溶液； 3)血清中二價鐵及三價鐵在酸緩沖液中從血清蛋白中釋放，過氧化氫物(ROOH)與二價鐵及三價鐵反應，生成烷氧自由基(R0*)和過氧化自由基(ROCf)； 4)步驟3)中生成的烷氧自由基(RCf)和過氧化自由基(ROCf)將芳香胺氧化，生成粉紅色產物； 5)粉紅色產物用波長為505nm的自動生化分析儀讀數，顏色強度與讀取OD值(ROMs濃度)呈比例。 6)在以上步驟進行的同時，步驟I)中血清以不同濃度的H2O2代替，余步驟不變，以不同濃度H2O2反應產物讀取的OD值做標準曲線，由此計算出血清中過氧化氫物(ROOH)相當于H2O2的濃度。
2.如權利要求1所述檢測ROMs的方法，其特征在于，步驟2)中所述酸緩沖液為:濃度為 10mM 的 Tris-Cl (PH 值為 2)。
3.如權利要求1所述檢測ROMs的方法，其特征在于，步驟2)中所述芳香胺為:100mM的Tris-Cl酸緩沖液配制的濃度為5mM的DMPD。
4.如權利要求1所述檢測ROMs的方法，其特征在于，步驟6)中所用已知濃度的H2O2代替血清，測定的OD值可做標準曲線，用以計算血清中過氧化氫物(R00H)相當于H2O2的濃度。
5.一種如權利要求1所述通過檢測血液中總的活性氧代謝物(ROMs)含量從而評價人體內整體氧化應激水平的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，針對ROMs的氧化應激分析可作為治療方案制定或預后判斷等的依據，具有相當重要的臨床意義。
【文檔編號】G01N21/78GK104251858SQ201310264756
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年6月28日 優先權日:2013年6月28日
【發明者】王辰, 郭健, 楊汀, 王萌, 肖飛, 鄒麗輝, 鐘琳曄 申請人:王辰
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