一種非生物學篩選抗病毒中藥有效成分的方法
【專利摘要】本發明公開了一種非生物學篩選抗病毒中藥有效成分的方法。該方法以流感病毒的特效藥物奧司他韋（OS）為模板分子，以丙烯酰胺和4-乙烯基吡啶為功能單體，合成非共價的奧司他韋分子印跡聚合物（OS-MIP），以此為固定相濕法裝填液相色譜柱，對中草藥及復方的有效成分群進行親和篩選，通過質譜鑒定有親和性的化合物成分，再通過體外的抗病毒實驗對化合物的活性進行驗證，從中藥中發現和模板分子具有相同抗流感病毒活性的化合物。本發明可被借鑒用于篩選鑒定其他活性的化合物，從而縮短藥物實體的篩選過程，加快替代藥物的研發過程，特別是在非生物學藥物篩選方法中具有重要的實際意義和廣闊的應用前景。
【專利說明】一種非生物學篩選抗病毒中藥有效成分的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及活性化合物的篩選鑒定方法，特別是涉及一種從中藥中分離篩選鑒定與預定模板分子活性相似化合物的非生物學方法。
[0002]
【背景技術】
[0003]基于化學合成的新藥研發越來越困難，經費投入呈幾何級數增加，研發周期也越來越長。因此，越來越多的新技術用于藥物的篩選與開發，如組合化學方法:快速生產建立包含成千上萬化合物的庫；高通量藥物篩選技術:采用各種快速高效的篩選檢測方法去發現藥物前體；基因組學、蛋白組學、代謝組學、ADMETox:將藥效學、代謝機理和毒性的研究提前到藥物發現這第一環節來進行；虛擬篩選和高內涵篩選技術:基于化學信息學和化學生物學進行藥物前體篩選；分子印跡技術:用于中藥成分及有關化合物的分離純化。
[0004]分子印跡技術(molecularlyimprinting technology, MIT)也稱為分子烙印技術，是源于人們對抗體-抗原或酶專一性的認識，合成對模板分子具有特定識別能力的聚合物的技術，是近二十年來出現且發展迅猛的一種高選擇性分離技術。由于MIT模仿了生物界的鎖匙作用原理，使制備的具有記憶功能的分子印跡聚合物(molecular imprintingpolymers, MIPs)擁有極高的選擇性,及很好的物理和化學穩定性,能夠抵抗很強的機械作用力，在高溫、高壓、酸、堿、高濃度離子及有機溶劑等各種惡劣條件下也能保持其原有的特性。在許多相關領域，如手性拆分、固相萃取、膜分離、模擬抗體的免疫分析、人造酶體系、化學或生物傳感器、催化劑、組合化學篩分、藥物篩選等，得到了越來越廣泛的應用。
[0005]中藥作為我國悠久的傳統疾病防控藥物，許多中藥及其復方對病毒性疾病有著良好的預防與治療作用。但中藥及其復方中包含的化合物結構類型多樣，是天然的組合化學庫，而且各成分含量懸殊，許多成分未知，導致從中分離純化有效成分費時費力，而且容易丟失微量的有效成分。
[0006]基于分子識別原理，利用MIPs制成親和色譜柱，利用色譜分離技術的高速高效性和質譜測定技術的高靈敏度和獨有的混合解析能力，在線連接HPLC-MS，理論上可以直接從中藥復雜體系中分離、篩選出有效成分并進行直接鑒定。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種非生物學篩選抗病毒中藥有效成分的方法。該方法是一種基于分子印跡、液相色譜和質譜聯用技術分離篩選鑒定與模板分子活性類似的化合物的非生物學方法，可以從中草藥及其復方制劑的有效成分群中，篩選鑒定得到與模板分子活性相似的化合物。
[0008]本發明可以用于從其他成分復雜的體系中，篩選鑒定與已知藥物活性類似的化合物。
[0009]一種非生物學篩選抗病毒中藥有效成分的方法，其步驟包括: a.奧司他韋分子印跡聚合物及其液相色譜柱的制備
以奧司他韋(模板分子)0.1 mmol、功能單體0.69 mmol、乙二醇二甲基丙烯酸酯(交聯劑)5 mmol、30%丙烯酰胺和70% 4-乙烯基吡啶作為功能單體、甲苯作為致孔劑、15 mg偶氮二異丁腈作為引發劑，60 °C油浴熱引發聚合反應，所得質地堅硬的白色塊狀聚合物，對其進行研磨篩分，收集粒徑在25?45 Mffl之間的顆粒，在索氏提取器中，采用甲醇:乙酸體積比為90: 10對其進行洗脫，以除去模板分子奧司他韋；50°C減壓干燥，在2000 psi的壓力下，濕法裝填150 mmX4.6 mm的液相色譜柱,將該色譜柱接入色譜儀，以合適的流動相對其進行洗脫、平衡，直至出現較為平穩的基線。
[0010]b.奧司他韋分子印跡液相色譜柱(OSMIP-LC)對OS和其他化合物的親和分離 色譜條件:Agilent 1200 LC，0S-MIP 自制液相色譜柱(150 mm X 4.6 mm, 25-45
Mffl)，柱溫30°C;流動相為甲醇-乙腈-甲酸(體積比為75: 25: 0.01)，流速為0.075 ml/min,數據采集軟件為MassHunter,壓力約170 bar。
[0011]質譜條件:Agilent 6410A QQQ電噴霧(ESI)串聯四級桿質譜儀，噴霧器壓力30psi，毛細管電壓+4000 V，N2流速10 L/min，溫度350 °C，采集周期為200 ms，模式Scan。
[0012]c.基于奧司他韋分子印跡聚合物與液相色譜、質譜聯用，分離篩選鑒定與模板分子活性相似的抗病毒中藥有效成分。
[0013]上述篩選鑒定所得的抗病毒中藥與模板分子的母體結構相同，或完全不同
實驗表明，制備的奧司他韋非共價分子印跡聚合物，理化性質穩定，重現性好，可以從中草藥及其復方制劑的有效成分群中，利用質譜和色譜技術對化合物的成分進行鑒定，發現篩選到親和性與模板分子相似的化合物苦參堿，以及親和性更強的化合物為槐定堿。體外抗H9N2亞型禽流感病毒的活性實驗結果表明，親和性與模板分子相似的化合物苦參堿，其具有與模板分子奧司他韋相似的抗H9N2亞型禽流感病毒的活性；而未和性較模板分子更強的化合物槐定堿及其他化合物，在體外則沒有抗H9N2亞型禽流感病毒的活性。
[0014]本發明的優點和產生的有益效果是:
我國中草藥資源豐富，是天然的化合物庫。可以以此活性類似化合物的篩選鑒定方法為依托，合成某些活性化合物的分子印跡聚合物，結合液相色譜和質譜聯用技術，從中草藥及其復方、甚至微生物的發酵液的化學成分群中，篩選鑒定得到與模板分子活性類似的化合物。特別是對于醫學臨床中沒有備選藥物，或者毒副作用較大的藥物，以及采用常規生物學篩選方法而危險較大的化合物，可以采用此技術；對于發現新的活性類似的藥物實體，可以加快藥物篩選的過程。綜上所述，本發明所涉及的技術將在藥物研發領域，具有較大的實際意義和廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1 OSMIP-LC對混合物的分離效果；其中a為總離子流圖，b為37.7 min時的提取質譜圖，c為147.8 min時的提取質譜圖。
[0016]圖2連翹苷石油醚提取部分的親和篩選圖譜；其中a為總離子流圖，b為31.2 min時的提取質譜圖。
[0017]圖3鴨跖草乙酸乙酯提取部分的親和篩選圖譜；其中a為總離子流圖，b為34.2min時的提取質譜圖。[0018]圖4炎毒熱清氯仿提取部分的親和篩選圖譜；其中a為總離子流圖，b為134.5min時的提取質譜圖，c為41.3 min時的提取質譜圖。
[0019]圖5不同化合物標準品在OSMIP-LC柱上的色譜特性；其中a為苦參堿，b為氧化苦參堿，c為槐定堿，d為氧化槐定堿。
[0020]圖6化合物活性預期保留時間差異的趨勢圖。
【具體實施方式】
[0021]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0022]下述實施例中所用方法未特殊說明處，均為常規方法。
[0023]1.奧司他韋分子印跡聚合物及其液相色譜柱的制備
采用均勻設計法優化聚合物制備過程中的參數，奧司他韋(模板分子)0.1 mmol、功能單體0.69 mmol、乙二醇二甲基丙烯酸酯(交聯劑)5 mmol、30%丙烯酰胺和70% 4-乙烯基批啶作為功能單體、甲苯作為致孔劑、15 mg偶氮二異丁腈作為引發劑，60 1:油浴熱引發聚合反應，所得質地堅硬的白色塊狀聚合物，對其進行研磨篩分，收集粒徑在25?45 Mm之間的顆粒，在索氏提取器中，采用甲醇-乙酸(90: 10，V/V)對其進行洗脫，以除去模板分子奧司他韋；50°C減壓干燥,在2000 psi的壓力下,濕法裝填150 mmX4.6 mm的液相色譜柱,將該色譜柱接入色譜儀，以合適的流動相對其進行洗脫、平衡，直至出現較為平穩的基線。
[0024]2.奧司他韋分子印跡液相色譜柱(OSMIP-LC)對OS和其他化合物的親和分離 色譜條件:Agilent 1200 LC，0S-MIP 自制液相色譜柱(150 mm X 4.6 mm, 25-45
Mffl)，柱溫30°C;流動相為甲醇-乙腈-甲酸(體積比為75: 25: 0.01)，流速為0.075 ml/min,數據采集軟件為MassHunter,壓力約170 bar。
[0025]質譜條件:Agilent 6410A QQQ電噴霧(ESI)串聯四級桿質譜儀，噴霧器壓力30psi，毛細管電壓+4000 V，N2流速10 L/min，溫度350 °C，采集周期為200 ms，模式Scan。
[0026]混合物樣品中含有阿司匹林、連翹苷、綠原酸，以及模板分子OS，在上述的色譜和質譜條件下，自制的OSMIP-LC柱，可以實現其他成分與模板分子的有效分離(見圖1)。而對于模板分子之外的成分，則不能實現其相互之間的有效分離。從圖1的總離子流圖(TIC)和質譜圖中可以看出，阿司匹林、連翹苷和綠原酸在OSMIP-LC柱上的保留時間是一致的，均為37 min左右；而模板分子OS保留時間為150 min左右。以上實驗結果說明，自制的OS-MIP液相色譜柱，對模板分子有良好的選擇性與親和性，而對模板分子以外的其他化合物沒有選擇性，可以用于混合物中模板分子及其結構類似物的分離篩選。
[0027]3.0SMIP-LC對中草藥及其復方制劑化學成分群的親和篩選
(I)OSMIP-LC對單味中草藥分部位提取物的親和篩選
圖2和圖3分別顯示了 0SMIIP-LC對單味中草藥分部位提取物的親和篩選結果。
[0028]從圖2和圖3中的總離子流圖上可以看出，連翹苷、鴨跖草的分部位提取物的保留時間均在30?40 min之間；質譜圖中顯示，成分較為復雜。以上結果說明，上述分部位提取物中的成分，與自制的OS-MIP之間沒有親和性；自制的OSMIP-LC柱對這些成分亦不能實現有效地分離。
[0029](2)對中藥復方制劑分部位提取物的親和篩選
選取臨床上對畜禽病毒性疾病療效確切的中藥復方制劑炎毒熱清等，采用不同極性的溶劑進行分部位提取化學成分群，旋轉蒸發除去溶劑，以甲醇溶解殘渣，采用0.22 μπι有機系濾膜過濾，濾液密封低溫保存，備用。
[0030]對復方制劑的分部位提取物，采用0SMIP-LC-MS聯用技術，對其進行親和篩選、分離。在中藥復方炎毒熱清的氯仿提取物中，得到了如下的圖譜(圖4)。
[0031]在TIC圖上，出現了兩個明顯的色譜峰，其中沒有親和性的成分，保留時間在30?40 min之間，化合物成分較為復雜，其中含有連翹苷[M + Na]+557.20。有親和性的成分，保留時間在130?150 min之間，而模板分子OS的保留時間為150 min，說明自制的分子印跡聚合物對該成分有親和性。質譜圖上該化合物的分子量為248.30，圖上顯示的離子分別為[M + Η]+249.30、[Μ + Na]+271.20、[2M + Na]+519.40。
[0032]4.被篩選出化合物的成分鑒定
根據中藥及復方制劑中組方的中藥成分，查詢相關文獻，認為分子量為248.20的化合物為苦參堿或槐定堿。對鑒定出的化合物進行0SMIP-LC-MS驗證。
[0033]稱取苦參堿和槐定堿，以及他們的氧化物氧化苦參堿和氧化槐定堿標準品適量，色譜甲醇溶解，0.22 μ m微孔濾膜濾過，在前述的色譜、質譜條件下進樣。結果如下。
[0034]圖5分別顯示了苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿和氧化槐定堿4種化合物，在自制OSMIP-LC柱上的色譜特性。上述的4幅TIC圖中，各化合物在自制色譜柱上的保留時間為超過150 min,均較模板分子OS的保留時150 min長。說明自制的色譜柱對此4種化合物有一定的親和性。在自制OSMIP-LC柱上，苦參堿的保留時間為170 min，氧化苦參堿為240min,槐定堿為310 min,氧化槐定堿為210 min ;而中草藥復方制劑炎毒熱清,有親和性的成分，其保留時間約為140 min (見圖4)，結合分子量，因而判定該成分為苦參堿；然而由于復方制劑中其他成分的相互干擾，而引起目標成分(圖4，140 min)與其標準品的保留時間之間有差異(圖5a，170 min)。
[0035]分子印跡聚合物，是根據模板分子的結構定制的吸附材料，對模板分子及其結構類似物的親和性較強。因而推測，在分子印跡色譜柱上，親和性與模板分子相似的化合物，其在結構上與模板分子相似，應該具有和模板分子相似的活性。
[0036]OS是目前治療流感的特效藥物，以OS為模板分子合成分子印跡聚合物，并以此制備液相色譜柱，用以從中藥及其復方制劑中親和篩選分離與其結構相似的，具有抗病毒活性的化合物，結合質譜聯用技術對篩選出的化合物進行成分鑒定。為了驗證這一篩選、分離、鑒定一體化技術的適用性和有效性，對篩選出的化合物苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐定堿、連翹苷、綠原酸等進行體外抗禽流感病毒實驗。
[0037]5.對篩選鑒定出的化合物進行體外抗禽流感病毒的活性檢測
選取苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐定堿、連翹苷、綠原酸，同時以阿司匹林、奧司他韋、雙黃連注射液、炎毒熱清注射液(中藥復方)等作為對照藥物。
[0038]實驗所用的毒株為雞H9N2亞型禽流感病毒，實驗用的細胞為犬腎細胞(MDCK)。先行測定所選取藥物對細胞的最大無毒濃度，然后在37 °C條件下將一定濃度的H9N2病毒培養液與細胞吸附I h后，棄去病毒液，加入含有不同濃度藥物的細胞維持液(不含血清)，37V 5% CO2培養，分別在24、48、72 h觀察細胞的病變情況并檢測各個濃度下細胞培養上清液是否有血凝現象。結果見表I。
[0039]表I各藥物體外抗雞H9N2禽流感病毒活性的實驗結果
【權利要求】
1.一種非生物學篩選抗病毒中藥有效成分的方法，其步驟包括: a.奧司他韋分子印跡聚合物及其液相色譜柱的制備 以0.1 mmol奧司他韋為模板分子、0.69 mmol功能單體、5 mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑、30%丙烯酰胺和70% 4-乙烯基吡啶作為功能單體、甲苯作為致孔劑、15 mg偶氮二異丁腈作為引發劑，60 °C油浴熱引發聚合反應，所得質地堅硬的白色塊狀聚合物，對其進行研磨篩分，收集粒徑在25?45 Mffl之間的顆粒，在索氏提取器中，采用甲醇-乙酸，甲醇-乙酸體積比為90: 10，對其進行洗脫，以除去模板分子奧司他韋；50 °C減壓干燥，在2000 psi的壓力下,濕法裝填150 mm X 4.6 mm的液相色譜柱,將該色譜柱接入色譜儀，以合適的流動相對其進行洗脫、平衡，直至出現較為平穩的基線； b.奧司他韋分子印跡液相色譜柱(OSMIP-LC)對OS和其他化合物的親和分離 液相色譜條件:Agilent 1200 LC, 0S-MIP 自制 150 mm X 4.6 mm, 25-45 Mm液相色譜柱，柱溫30°C;流動相為甲醇-乙腈-甲酸，甲醇:乙腈:甲酸體積比為75: 25: 0.01，流速為0.075 ml/min,數據采集軟件為MassHunter,壓力約170 bar ； 質譜條件:Agilent 6410A QQQ電噴霧串聯四級桿質譜儀，噴霧器壓力30 psi，毛細管電壓+4000 V，N2流速10 L/min，溫度350 °C，采集周期為200 ms，模式Scan; c.基于奧司他韋分子印跡聚合物與液相色譜、質譜聯用，分離篩選鑒定與模板分子活性相似的抗病毒中藥有效成分。
2.根據權利要求1所述一種非生物學篩選抗病毒中藥有效成分的方法，其特征在于:篩選鑒定所得的抗病毒中藥與模板分子的母體結構相同，或完全不同。
【文檔編號】G01N30/06GK103940932SQ201310016583
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月17日 優先權日:2013年1月17日
【發明者】李劍勇, 楊亞軍, 劉希望, 張繼瑜, 李冰, 周緒正, 劉玉榮, 魏小娟, 牛建榮 申請人:中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
