專利名稱：經摻雜的二氧化硅微球光學離子傳感元件的制作方法
技術領域：
本發明涉及微球基化學傳感元件，更具體說，涉及基于經慘雜的二氧化硅模板的微球光 學離子傳感元件。
背景技術：
作為致力于傳感元件微型化的一部分，微球基化學傳感元件和生物傳感元件的制造在過 去的十年中正在受到越來越大的關注。微球傳感平臺具有很多優點。微米級別的傳感元件可 以在設定的局部環境下例如單細胞中詢問被分析物的濃度。此外，所需的樣品的容量小得多， 從而可以提高靈敏度，縮短響應時間，相應降低試劑的成本，并且改進了檢測的下限。此外， 由于傳感數據的高度冗余性，讀出大量相同的微球可以提高精確度。微球基傳感原理已經成 功地被應用于各種讀出形式，例如光纖顯影和流式細胞計量術，例如，如題為"離子檢測微 球及其使用方法"的美國專利申請No. 2004/0058384所述，其中全部內容引入本文以作參考。在各種可以結合微球進行的分析測定中，中性載體基微球光極具有可靠的測試普通電解 液離子活性的能力。可以通過各種方法制備離子或分子傳感微球，包括如W. Seitz等人在Anal. Chim. Acta 400 (1999) 55以及Z. Shakhsher等人在Microchim. Acta 144 (2004) 147上所述的聚 合物溶脹法。微球還可以通過如S. Peter等人在Anal. Chim. Acta 442 (2001) 25上所述的非均 相聚合法、S. Shibata等人在Jpn. J. Appl. Phys. 37 (1998) 41上所述的包含微粒模板的表面吸附等人在Anal. Chem. 73 (2001) 315上所述的溶劑澆鑄法進行制備。如I. Tsagkatakis等人在Anal. Chem. 73 (2001) 6083上所述的類似于美國專利4,162,282所 公開的聲響式鑄造裝置己經被用于在適度的、無反應活性的條件下大量制造可控尺寸的光學 傳感微球。制得的光學離子傳感微球遵循經典的大容積光極理論，并且被用于測定Na+、 K+、 Ca2+、 Pb2，t3 Cl-。最近，如S. Peper、 A. Ceresa、 Y. Qin、 E. Bakker在Anal. Chem. Acta 500 (2003) 127上所述，在致力于避免增塑劑滲出的問題中，使用微粒鑄造裝置，開發出了基于甲基丙 烯酸甲酯-甲基丙烯酸癸酯(MMA-DMA)共聚母體的用于K+的不含增塑劑的微球。然而，上述方法存在如下的一個或多個缺點。制備微球所需要的設備要求特定的機械部 件和附件，而這在大多數研究實驗室中是無法獲得的。產生的微球懸浮在水中，可能無法適 應各種應用。微球的使用時間限定為小于6個月，更具體說為2 6周。這些早先的微粒的機 械穩定性較差；在聲波處理時可能會發生分裂，產生微末(碎片)從而干擾測定。此外，這 些早先的微粒會彼此或與容器壁結合。當微粒在較高的局部濃度下儲藏時更容易發生結合， 這通常發生在微粒在儲藏中產生沉積時。二氧化硅微粒已廣泛用于色譜柱中充填的固定相。如W. Pirkle等人在J. Org. Chem. 44 (1979) 1957、以及N. Oi等人在J. Chromatogr. 292 (1984) 427上所述，二氧化硅表面可進行 化學改性以滿足手性分離的需要。此外，如H. Figge等人在J. Chromatogr. 351 (1986) 393上 所述，二氧化硅表面可以涂布合適的聚合物以制成具有最佳分離特性的固定相。如K丄Albert等人在Anal. Chem. 72 (2000) 1947上所述，含有染料的摻雜二氧化硅微粒 被用于水蒸氣檢測，或如Y. Qin等人在Anal. Chem. 75 (2003) 3038上所述被用于生物分子標 記。然而，大多數摻雜二氧化硅微粒的使用僅限于單組分傳感系統，因此不適用于離子傳感 的用途。因此，需要一種改進的離子傳感微球。發明內容因此，本發明的目的在于一種在液體樣品中檢測目標離子濃度的傳感元件，該傳感元件包含摻雜有能夠與樣品中的目標離子結合的離子載體、和能夠針對離子載體與目標離子的 結合而產生可被檢測的信號的指示劑的粒狀二氧化硅。可檢測的信號與液體樣品中的離子濃 度有關。指示劑可以是有色離子載體。傳感元件還可以具有內增塑聚合物。傳感元件可任選地含有支承聚合物及增塑劑。支承 聚合物可以是PVC而增塑劑可以是二 (2-乙基己基)癸二酸酯(DOS)。
粒狀二氧化硅可以是球形或其他三維的形狀。粒狀二氧化硅可選被硅垸化。傳感元件還 可以包含親脂性的陽離子交換劑。親脂性的陽離子交換劑可以是四(3,5-二 (三氟甲基)-苯 基)硼酸鈉(NaTFPB)。本發明的另一個目的是使用傳感元件測定液體樣品中的離子的方法。由含水的硅膠微球 制成的傳感元件可選被干燥，從而制得干燥的傳感元件用于將其儲藏到使用前。可以將千燥 的傳感元件再懸浮化以制得再懸浮化的傳感元件并且用于檢測。傳感元件可任選地通過流式 細胞計數器以測定可以檢測的信號。該傳感元件也可以用于光纖束。
根據下列描述、附加的權利要求書和附圖，可以更好地理解本發明的特性、各方面以及 優點，其中-圖la所示為用于本發明的在用傳感成分摻雜之前的硅烷化的二氧化硅顆粒的掃描電子 顯微鏡圖圖lb所示為圖la中的顆粒摻雜了實施例Na-J的傳感成分后的掃描電子顯微鏡圖；圖2所示為由實施例Na-J的單二氧化硅基Na+選擇性微球光學傳感元件與(A)1(T2 M HC1和(B)l(MNaOH接觸時觀察到的空間分辨熒光光譜的三維圖；圖3a所示為由熒光顯微術所表征的根據實施例Na-J的微球在pH值7.4時的響應圖； 圖3b所示為由熒光顯微術所表征的根據實施例Ca-L的微球在pH值7.4時的響應圖； 圖4所示為含有各種被標準化至pH值為7.4的離子載體的光極由實驗所得的選擇性系數的表格；圖5a所示為由分解的流式細胞計量術所表征的根據實施例Na-J的微球在pH值7.4時的 響應圖；圖5b所示為由分解的流式細胞計量術所表征的根據實施例Ca-L的微球在pH值7.4時的 響應圖；圖6所示為根據實施例Na-H的Na+選擇性微球在光纖束被蝕刻的凹處上觀察到的空間分 布的顯微照相圖；以及圖7所示為根據實施例Na-H的五個臨近的Na+選擇性微球在光纖束被蝕刻的凹處上觀察 到的熒光光譜的三維圖。
具體實施方式
根據本發明的一個實施方式，目的在于基于摻雜粒狀二氧化硅模板的離子選擇性光學傳 感元件，及其制備和使用方法。本發明也是Analytica Chimica Acta, 537， 29 April 2005, pp. 135-143上題為"基于摻雜硅膠模板的微球光學離子傳感元件"的文獻的主題，其中全部內容 引入本文以作參考。該傳感元件優選由具有多孔的二氧化硅基質的微球構成。在本發明的一個實施方式中， 二氧化硅基質為購自瑞典EKA化學公司的平均粒徑大約為3.5 y m的球形二氧化硅Kromasil 100 A。其中，其他可以用于本發明的二氧化硅基質包括具有合理緊湊的尺寸分布的其他球形 二氧化硅，例如直徑為5、 7、 10、 13或16 n m的Kromasil 100 A。該傳感元件具有能夠與液體樣品中的目標離子結合并且對其具有較高選擇性的離子載 體。該傳感元件可以連同各種用于檢測不同目標離子的離子載體使用。該離子載體的例子包 括但不限于對于目標離子例如氫、Li+、 Na+、 K+、 Ca2+、或Mg2+、或金屬離子例如Pb2+、 Cu2+、 Hg2+、 Ag+、以及氧化物例如1)022+具有選擇性的離子載體。在本發明的一個實施方式中，離子載體為叔丁基杯[4]芳烴四乙酯(鈉離子載體X)。在本 發明的另一個實施方式中，離子載體為C^+離子載體AU-1嫁接在聚(丙烯酸正丁酯)中。 離子載體的濃度可以是由大約0.1到大約200 mmole/kg，并且優選為由大約10到大約50 mmole/kg。本發明可以使用的其他離子載體包括例如鉀離子載體I (纈安霉素)、鉀離子載體II (二((苯并-15-冠-4) -4'-基甲基)庚二酸酯)、鉀離子載體m (BME44; (2-十二烷基-2-甲基-1,3-丙二基-二 (N- (5，-硝基(苯并-15-冠-5) -4,-基)氨基甲酸酯))、氯離子載體I (5,10,15,20-四苯基-21氫,23氫-口卜吩錳(III)氯化物；Mn (III) TPPC1)、氯離子載體II (ETH9009; (4,5-二甲基-3，6-二辛氧基-l,2-二苯撐)-二陽(三氟乙酸汞))、鈉離子載體I (ETH 227; N,N，,N"-三庚基-N,N，，N"-三甲基-4,4',4"-次丙基三(3-氧雜丁酰胺))、鈉離子載體II (ETH 157; N,N，-二芐基-N,N'-二苯基-l,2-亞苯基二氧二乙酰胺)、鈉離子載體III (ETH2120; N,N,N，,N，-四環 己基-l,2-亞苯基二氧二乙酰胺)、鈉離子載體IV (DD-16-C-5， 2,3:11,12-二萘烷(Didecalino) -16-冠-5)、鈉離子載體V (ETH 4120; 4-十八酰氧甲基-N,N，N',N，-四環己基-l,2-亞苯基二氧 二乙酰胺)、鈉離子載體VI (二 ((12-冠-4)甲基)十二垸基甲基丙二酸)、鈉離子載體VIII(二 ((12-冠-4)甲基)2,2-二 (十二烷基丙二酸))、鈉離子載體X (4-叔丁基杯[4]芳烴-四乙 酸四乙酯)、鈣離子載體I (ETH001; (-) - (R,R) -N,N，- (二 (ll-乙氧基羰基)~)^一烷基) -N，N，-4,5-四甲基-3，6-二氧辛二酰胺；二乙基-N，N，- ((4R,5R) -4,5-二甲基-1，8-二氧代-3,6-二
氧雜亞辛基)-二 (12-甲基氨基-十二酸酯))、鈣離子載體II (ETH 129; N,N,N'，N，-四環-3-氧雜戊二酰胺)、鈣離子載體III (A23187;鈣霉素)、鈣離子載體IV (ETH5234; N,N-二環 己基-N，,N'-二 (十八烷基)-3-氧雜戊二酰胺)，以上離子載體均購自Fluka (密爾沃基，威斯 康星州)。該傳感元件還包含能夠在應答離子載體與目標離子的結合中產生可被檢測信號的指示 劑。在本發明的一個實施方式中，指示劑為有色離子載體。有色離子載體可以定量和/或檢測 樣品中的目標離子。當通過與離子載體結合的目標離子交換質子時有色離子載體發生去質子 化，并且有色離子載體的質子化的改變會造成其光學特性的可測性的改變。有色離子載體可以是例如9- (二乙基氨基)-5-十八酰亞氨基-5氫-苯并[a]盼惡嗪(有色 離子載體I, ETH5294)。本發明可以使用的其他指示劑包括例如有色離子載體II; ETH2439; 9-二甲基氨基-5- (4- (16-丁基-2,14-二氧代-3，15-二氧雜二十垸基)苯基亞氨基)苯并[a]吩惡 嗪、有色離子載體VI; ETH7075; 4',5'-二溴熒光素十八烷基酯、以及有色離子載體III; ETH 5350; 9- (二乙基氨基)-5- ((2-辛基癸基)亞氨基)苯并[a]吩惡嗪。該傳感元件還可以包含內增塑聚合物例如聚(丙烯酸正丁酯)或甲基丙烯酸甲酯(MMA) 和甲基丙烯酸癸酯單體的共聚物(如2002年12月5日提交的美國專利申請號No. 10/313,090 所述)，其中全部內容引入本文以作參考。此外，該傳感元件還包括支承聚合物和增塑劑。支承聚合物可以是例如高分子量聚氯乙 烯(PVC)。增塑劑可以是例如購自FIuka (密爾沃基，威斯康星州)的二 (2-乙基己基)癸 二酸酯(DOS)。其他的增塑劑包括二 (2-乙基己基)鄰苯二甲酸酯和2-硝基苯基辛基醚。本發明的傳感元件還可以包括其他添加劑，例如離子交換劑，以促進目標離子從樣品上 脫出以及目標離子向離子載體的遷移。離子交換劑優選為親脂性的陽離子交換劑。親脂性的 陽離子交換劑可以是例如購自美國Dojindo分子科技公司的四(3，5-二 (三氟甲基)-苯基) 硼酸鈉(NaTFPB)。其他陽離子交換劑包括卡巴(carba)-閉環十二硼酸酯、尤其是鹵化碳硼烷陰離子。鹵化碳 硼垸陽離子交換劑的例子包括三甲基銨-2,3，4,5,6，7,8,9,10，ll,12十一溴碳硼烷(TMAUBC)(參 見美國專利申請號No. 10/313,090)、以及i^一氯化碳硼烷(UCC)、六溴化碳硼烷(HBC)和 十一碘化碳硼烷(UIC)陰離子的鹽(例如三甲基銨鹽)。下面對根據本發明的一個實施方式的微球的制備進行描述。如K. Wygladacz等人在Sens. Actuators B 83 (2002) 109、以及M.E. McGovern等人在Langmuir (1994) 360上所述，摻雜前 可以進行硅垸化以提高二氧化硅顆粒的疏水性，并且其中全部內容引入本文以作參考。優選
將二氧化硅模板小心地密封在瓶中或其他容器中，并且保持在真空中以除去孔內的空氣。然 后在二氧化硅顆粒中摻雜適當的傳感成分。將包括離子載體和指示劑的傳感成分溶解于適當的溶劑例如四氫呋喃(THF)中，并且與二氧化硅模板緩和地混合。然后用例如鋁箔覆蓋混合物，隨后優選將其置于黑暗中一直到 在溶劑蒸發時傳感成分進入多孔的二氧化硅模板中。在使用前優選將制得的微球放置在黑暗 中保持干燥。微球光學傳感元件優選用陽離子交換劑("R-")，離子載體("L")和1"1+-選擇性有色離 子載體("Ind")摻雜。對于這種大容積光極，將帶("z+")電荷的陽離子分析物("Iz+") 從水溶液中萃取至有機傳感相中，從而通過下列陽離子交換機理消除氫離子Iz+ (水相)+nL (有機相)+zIndH+ (有機相)+zR'(有機相)=Lnz+ (有機相)+zlnd (有機相)+zR-(有機相)+zH+ (水相) (1)結合電荷和質量平衡，并且定義質子化"Ind"的摩爾分數為("l一a")，分析物的活性 可以表達為<formula>formula see original document page 9</formula>在pH值已知的緩沖溶液中，可以通過有色離子載體的質子化的程度("l一a ")測定分 析物離子的活性，("l一a")可基于所觀察到的對于有色離子載體的質子化的("Rpro")和 未質子化形式的("Rdep")發射強度進行計算在下文中將參考實施例進行討論，熒光顯微法和流式細胞計量術可以顯示出本發明的微 球光學傳感元件的響應遵循經典的大容積光極理論。檢測范圍與生理電解液的級位一致，并 且由此所獲得的選擇性數據與由那些不含二氧化硅的傳感顆粒所獲得的選擇性數據類似。此 外，本發明的微球光學傳感元件如果以干燥形態儲藏則具有大于6個月的保存期限。實施例Ca+離子載體AU-1的制備根據Y. Qin、 S. Peper、 A. Radu、 A. Ceresa、 E. Bakker在Anal. Chem. 75 (2003) 3038上9
所述的方法合成Ca2+離子載體N,N-二環己基-N'-苯基-N，-3- (2-丙酰)氧苯基-3-氧雜戊二酰胺 (AU-1)，其中全部內容引入本文以作參考，并且如下所述將2。/。(w/w)和5。/。(w/w)的AU-1 接枝于聚(丙烯酸正丁酯)。丙烯酸正丁酯購自Polysciences (沃靈頓，PA)。首先，使用下述方法合成AU-1。步驟l:向二甘醇酐(U6g， lOmmol)在100 mL的 無水二氯甲烷中的經攪拌的溶液中加入二環己胺(3.62 g, 20mmo1)。將混合物在室溫下攪拌 3小時。然后，向反應混合物中加入20mL6N的HCl。將固體過濾去，分離濾液中的有機層 并且用無水硫酸鈉進行干燥。使用旋轉蒸發器除去二氯甲垸。從乙酸乙酯中重結晶出3-氧雜 戊酸-N,N'-二環己酰胺(I)的白色晶體，其產率為92% (2.74g)。步驟2:在N2保護下將3-羥基二苯胺(3.33g， 18mmo1)溶解于25mL的無水THF中。接著，將三乙胺(1.98g， 19.5 mmol)加入上述溶液。然后，在N2氣氛中在-5 。C下使用注射器將丙烯酰氯(1.62 g， 18 mmol) 逐滴加入反應混合物。25分鐘后，加入30mL的飽和NaHCO3溶液以中止反應。然后分離有 機相，并進行水洗。將溶劑蒸發后，使用快速色譜法U:lEtOAc/己垸)純化粗制產物。從而 制得了淺黃色固體間-苯胺基苯基丙烯酸酯(11)，其產率為60% (2.88 g)。步驟3:在室溫下 邊攪拌邊向I (0.736 g)和II (0.529 g)在30 mL的無水CH2C12中所形成的溶液中加入Et3N (0.8 g)。然后加入0.612 g的B0P-C1。將混合物回流24小時。使用10 mL的飽和NaHC03 和水洗滌反應混合物。分離并蒸發溶劑后得到有機相。使用快速色譜法(l:5EtOAc/己垸)純 化剩余物。從而得到了淺黃色固體(C31H38N205， MW518.65)，其產率為50%。通過熱引發自由基溶液聚合合成結合了 AU-1的聚合物。對含有丙烯酸正丁酯(1 g)和 適量的離子載體AU-1 (2或5 wt.%)的乙酸乙酯溶液用N2吹掃10分鐘，然后加入5.1 mg 的聚合引發劑偶氮二異丁腈(98% (AIBN)，購自Aldrich (密爾沃基，威斯康星州))。持續 攪拌該均相溶液，并將溫度設為卯。C，并保持16小時。反應結束后，將溶液蒸發，并且將聚合物重新溶于10mL的二惡垸。在劇烈攪拌下將聚 合物溶液的等分試樣(2mL)加入100mL的蒸餾水中。收集白色沉淀并且溶于25 mL的二 氯甲垸，然后用無水Na2S04脫水并過濾。將溶液蒸發，并將獲得的透明聚合物在實驗室環境 條件下進行干燥。從而合成了兩批接枝于聚(丙烯酸正丁酯)的不同濃度的離子載體AU-1: (1) 2wt.o/o的AU-l (38.6mmol/kg)和(2) 5 wt.。/。的AU-1 (96.5 mmol/kg)。微球的制備使用下列方法制備多種不同類型的微球。在摻雜前先進行硅烷化。使用甲苯清洗平均粒 徑大約為3.5 um的球形二氧化硅顆粒Kromasil 100 A以除去雜質，抽真空以除去空氣，并
且在平底反應器中與3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(10%， V/V，在甲苯中)混 合。使用水回流將溫度在60 70。C下保持3 4小時。隨后除去過量的反應物和溶劑，并且 清洗硅垸化的微球并繼續抽真空。然后用合適的傳感成分摻雜硅垸化的二氧化硅模板，總質量為20 mg (摻雜成分+ 二氧 化硅模板)。在稱重前后將二氧化硅模板小心地密封在瓶中并且保持真空，以除去微孔中的空 氣。將傳感成分溶于THF并且緩和地與二氧化硅模板混合。然后用155鋁箔覆蓋混合物，并 且在黑暗中保持72小時。同時在溶劑蒸發時使傳感成分進入多孔的二氧化硅模板。在表征前 將制得的微球放置在黑暗中保持干燥。鈉選擇性微球將由40mmol/kg的鈉離子載體(X)、 10 mmol/kg的ETH 5294、 20 mmol/kg的NaTFPB 和多種組成的DOS (10、 20、 30、 40、 50%， w/w)組成的Na-A Na-E型分別與適量的二氧 化硅模板(17.1、 15.1、 13.1、 11.1或9.1mg)混合。經改性的組合物(同樣是20mg的總質 量)由如上所述同樣濃度的鈉離子載體(X)、 ETH 5294、 NaTFPB組成，除了 DOS被分別 替換為5或10%的聚(丙烯酸正丁酯)(Na-F和Na-G型)或5 wt.n/。的PVC (Na-H型)或(5 wt。/。的PVC+10 wt。/。的DOS) (Na-I型)。Na-J型含有39.3 mmol/kg的鈉離子載體(X)、 9.7 mmol/kg的ETH 5294、 19.1 mmol/kg的NaTFPB、 2 wt.。/o的PVC和10 wt.。/o的DOS,以及17.6 mg的二氧化硅模板(總質量20mg)。鈣選擇性微球用離子載體Ca (IV)摻雜的微球使用N,N-二環己基-N，，N，-二 (十八垸基)-3-氧雜戊酰胺(Ca離子載體IV， ETH 5234) (10.9、 21.5、 39.0或48.9 mmol/kg)、 ETH 5294 (2.0、 4.1 、 5.0或6.2 mmol/kg)、 NaTFPB (3.4、 6.0、 7.5或9.1 mmol/kg)和10% (w/w)的DOS分別摻雜16.0、 15.5、 15.1和14.7 mg的二 氧化硅模板制得Ca-A、 B、 C和D型。Ca-E Ca-G型含有39.0 mmol/kg的Ca (IV)離子載體、5.0 mmol/kg的ETH 5294、 7.5 mmol/kg的NaTFPB、以及5或10 wt.。/。的聚(丙烯酸正丁酯)(Ca-E和Ca-F型)或5 wt.% 的PVC (Ca-G型)。用接枝于聚(丙烯酸正丁酯)的AU-1離子載體摻雜的微球Ca-H Ca-K型具有2 wt.。/。的接枝于聚(丙烯酸正丁酯)的AU-1。 Ca-H Ca-K型分別
具有占總質量的15、 30、 40或50% (w/w)的聚合物，所述聚合物轉化成5.8、 11.6、 15.4 禾口 19.3 mmol/kg的AU-1; 0.6、 1.2、 3.0或3.6mmol/kg的ETH5294; 1.1、 2.3、 4.6或5.8 mmol/kg的NaTFPB;以及10 wt.。/。的DOS和17.4、 14.3、 9.7或8.0 mg的二氧化硅模板。Ca-L型具有5 wt。/。的接枝于聚(丙烯酸正丁酯)的AU-1。最近AU-1被接枝于MMA-DMA 共聚物基質以制備無增塑劑的離子傳感系統例如離子選擇性膜和光極薄膜。參見Y. Qin、 S. Peper、 A. Radu、 A. Ceresa、 E. Bakker在Anal. Chem. 75 (2003) 3038所述。如先前Heng和 Hall所報道，聚(丙烯酸正丁酯)是一種有用的內增塑聚合物，L.Heng、 E. Hall發表于Anal. Chem. 72 (2000) 42。 Ca-L型具有16 wt.。/。的聚合物(30.1 mmol/kg的Ca2+離子載體AU-1 )、 4.2 mmol/kg的ETH 5294、 8.0 mmol/kg的NaTFPB和10 wt.。/o的DOS，摻雜于11.9 mg的硅 烷化的二氧化硅模板。實施例測試在PARISS圖像光譜儀(Light Form, Belle Mead, NJ)上結合Nikon Eclipse E400顯微 鏡[15]進行熒光顯微測試。系統配備了兩個EDC 1000LCCD相機(Electrim公司，普林斯頓， 新澤西州)以及一個外延熒光汞燈(Southern Micro Instruments, GA)，另外還有一個由Pariss 光譜圖像軟件(Light Form)控制的電動載物臺(Prior Optiscan ES9, Fulbourn， Cambs， U.K.)。 對于所制得微球的表征和分辯光譜，將一塊Nikon Plan Fluro 40X0.75的物鏡和一個EX510 560 nm的濾光鏡結合使用。曝光時間選擇200 600 ms以滿足熒光強度。微球被置于緩沖樣品溶液中，并放置在黑暗中保持20 40分鐘。10毫摩爾的HC1或10 mM的NaOH被分別用于在完全質子化或去質子化的狀態下記錄光譜。隨機選擇6 10個微 球以記錄光譜。通過計算ETH 5294在645和675 nm處的兩個熒光強度峰的比例可以獲得 質子化的程度。使用通過將標準激光替換為635 nm的二極管激光并且配置了對測定波長范圍在650 675 nm內的熒光具有選擇性的濾光鏡和檢測器的經改進的Beckman Coulter EPICS XL流式細 胞儀進行流式細胞測試。使用650nm的長通發射濾光鏡和660 ( ±15) nm的通帶濾光鏡收 集在650 675 nm之間發射的熒光。將該硅膠基微球浸入緩沖樣品溶液20 30分鐘，以使其 平衡。在5 kV下使用Zeiss DSM 940掃描電子顯微鏡，根據I. Tsagkatakis等人在Anal.Chem. 73 (2001) 6083上具體描述的方法，獲得二氧化硅模板和摻雜微球傳感元件的SEM圖像，其中 全部內容引入本文以作參考。在測試前，將干燥的微球沉積在鋁棒上并且噴涂10 20nm的Au/Pd大約60秒。 樣品緩沖溶液使用納米純化去離子水配制所有的緩沖溶液(18.2 M Q cm)。分別在10'3 M的Tris(三(羥 甲基)氨基甲烷，購自Fluka (密爾沃基，威斯康星州))或1(T2M的MES中配制1(T5 1 M 的NaCl或CaCl2，并且對于Tris將pH值調至7.4 (或對于MES調至5.5)。如M. Lerchi等人 在Anal. Chem. 64 (1992) 1534上以及E. Bakker等人在Anal. Chem. 64 (1992) 1805上所詳述 的，對于選擇性測試使用分液法，其中全部內容引入本文以作參考。大容積光極的選擇性測試需要有對所包含的每種離子的完整的校準曲線。這些曲線是對 于各種試樣在相同的pH值下用相同的薄膜組合物獲得的理想曲線。各個校準提供了所有被 測物離子的有關熱力學交換和共萃取常數和化學計算等性狀的最精確的信息。可以獲得對于任何干擾離子的初級選擇性系數的各個離子的響應曲線可以通過E. Bakker 等人在Anal. Chem. 64 (1992) 1805上所述的公式27和36進行作圖并計算。在pH值為7.4并且含有1 M的一種干擾離子鹽的10'3 M的Tris緩沖液中記錄響應。對 于基于二氧化硅模板的Na+選擇性微球，被測定的干擾陽離子為K+、 Mg^和Ca2+，而對于 CaW選擇性微球，測定的為K+、 Na+和Ma"。測試結果 Na+選擇性微球使用增塑劑DOS制得的Na-A型微球定性地響應于Na+活性的變化。然而顆粒間的偏差 和與理論預期的響應行為之間的偏差很大，并且24小時后，在顯微鏡下可以檢測到被增塑組 分的浸出。在其他組合物Na-B Na-E中，都使用了不同濃度的增塑劑DOS，隨著增塑劑含 量的增大被增塑組分的實際浸出的程度也會增大。在Na-F Na-J型中，其中的增塑劑DOS被替換為聚(丙烯酸正丁酯)或向混合配方中 加入了PVC，結果顯示如Na-J型加入PVC會大幅提高制得的微球的響應特性。圖2所示為 具有染料的Na-J型二氧化硅基Na+傳感微球在其被完全質子化(10^M的HC1)和去質子化 (1(^M的NaOH)形式下的3D響應光譜，所述的二種形式其峰的形狀都類似于PVC基微 球的。這證實了有色離子載體摻雜進入二氧化硅模板后的基本功能。染料ETH 5294 (有色離子 載體I)是H+選擇性有色離子載體，它在摻雜二氧化硅模板中具有在645nm (去質子化)和675 nm (質子化)的雙熒光最大發射。通過獲得這兩個峰的強度比，使用公式(2)可以計算 出有色離子載體的質子化程度。比值測定的優點在于可以獲得可靠的信號據而減少了圖像漂 白的危害，并且減少了光源不穩定和微球尺寸變化的影響。圖3A所示為用熒光顯微法表征的Na-J型微球在pH值7.4時相應的Na+響應曲線與相關 的的選擇性的圖。圖上的數據點為平均實驗值，并且錯誤欄指的是由5 10個獨立測試所觀 察到的標準偏差。使用實驗組合物由公式(2)推導出理論曲線。對于理論曲線的合適的離子交換常數(公 式(2)中的Ke》和對于不同傳感系統對普通干擾離子的選擇性系數如表4所示，并且與通 過聲響式微粒鑄造儀制得的不含二氧化硅的PVC-DOS顆粒所獲得的數據相比較。本發明的微球對于K+、 C^+和Mg^具有與通過聲響式微粒鑄造儀制得的不含二氧化硅的 PVC-DOS顆粒大致相同的選擇性。對于由二氧化硅模板制得的微球，測試范圍適用于直接測 試人類唾液(受激，pH值為7.0~7.5, Na+典型為4.3 28 mM)。由二氧化硅模板制得的微 球也可以被用于測定IO倍稀釋的人類血漿(pH值為7.4， Na+為135 150mM)。C^+選擇性微球在組合物不同的含有離子載體Ca (IV)、 ETH 5294、 NaTFPB和DOS的Ca-A~Ca-D型 微球中沒有觀察到適當的鈣響應。在Ca-E Ca-G型中，使用了不同的基質，包括聚(丙烯 酸正丁酯)，或者加入了PVC,觀察到的鈣的響應仍然不能令人滿意。在Ca-H Ca-K型微球中，使用接枝于聚(丙烯酸正丁酯)上的AU-1 (2%， w/w)，可 以發現結果有色離子載體的官能濃度過低，無法可靠地進行熒光顯微法測定。進一步提高接 枝于離子載體的濃度會造成微球嚴重積聚。在Ca-L型微球中，在聚(丙烯酸正丁酯)聚合物中AU-1的濃度為5% (w/w)，可以觀 察到對Ca"的選擇性很好。圖3B所示為對于Ca-L型在pH值為7.4時觀察到的(^2+的響應 以及根據公式(2)的理論校準曲線。在生理樣品中觀察到的Ca-L型微球對普通千擾陽離子的選擇性與從薄光極薄膜獲得的 數據一致(參見圖4)。由于Na+的含量非常大所以是重要的干擾，對于Na+的選擇性超過三 個數量級。當有色離子載體半質子化時(a =0.5)，在pH值為7.4時Ca"活性相應為 1 mM，說 明測定范圍適合直接測定pH值為7.4的人類血漿中的Ca"(
1.2 mM)，或pH值為7.0 7.5的受激人類唾液(0.8 2.8mM)。 對于制得的基于摻雜硅膠模板的微球，可以觀察到典型的平衡時間大約為10min，與常 規的經塑化的PVC微粒相比平衡時間稍長，但短于MMA-DMA基微粒。摻雜了經接枝的AU-1 的鈣選擇性光學傳感微球與使用易溶的離子載體的鈉選擇性微球相比顯示了更長的平衡時間 (大約25分鐘)。微球的流式細胞計量術分析流式細胞計量術適用于基于增塑PVC的熒光微球光學傳感元件的表征，其中記錄了有色 離子載體ETH 5294的去質子化形式的單參數柱狀圖以檢測熒光的變化。流式細胞計數器和 熒光顯微鏡都被應用于制得的微球的表征。雖然流式細胞計數器不能如同熒光顯微鏡那樣空 間分辯或光譜分辯單個微粒的熒光，但可以提供大量微粒的統計行為的信息。在FL1通道(具有650nm的長通濾光鏡和660nm的通帶濾光鏡(土15nm))的柱狀圖 中，觀察到的計數的數量對峰通道熒光的對數值作圖，并且由累計微粒計數的數量產生高斯 (Gaussian)形的曲線。隨著樣品離子的濃度增大，會發現ETH 5294的去質子形式的熒光強度 也隨之增大，并且造成高斯曲線的峰移位，反映出離子響應。大約10,000個微球的整個柱狀 圖的系數變化(CV)范圍在7.13 29.33，這比通過聲響式鑄造法制得的常規PVC微粒中所 觀察到的更大，表明尺寸的再現性較差，而且這受原始硅膠模板的尺寸分布限制。圖5A和5B所示為通過流式細胞計數器獲得的鈉(Na-H型)或鈣選擇性(Ca-L型)微 球的校準曲線和相關的選擇性數據。假設了制得的微球的光極性狀，使用公式(4)，質子化 的程度("l一a")為單參數柱狀圖中FL1通道的熒光峰位置(P)所示對于圖5A中的鈉響應的理論曲線(公式(2))， 1ogKex為-5.6，并且對于鈣，1ogKex為-9.1。 這些數據與通過熒光顯微鏡在單個微粒上所獲得的數據相似(Na+的logKex = -5.0， Ca"的bgKex為-9.0，參見圖4)。圖4中還顯示了電位干擾的實驗選擇性系數(10gl^se、j的值)。測試范圍也與熒光顯微鏡法接近。總之，通過流式細胞計量術和熒光顯微鏡法獲得的響應和選 擇性數據可以互相很好地對應，并且兩種技術都適用于表征本發明的微球。二氧化硅基微球對于光纖光學傳感元件陣列的應用常規的PVC光學離子傳感微球已經被成功地應用于能夠對數萬傳感元件的響應進行平
行檢測的光纖束。光纖束已經被發現并作為這一功能的平臺，主要因為它們可以簡易被蝕刻 從而形成高度一致性的與所制得微球傳感元件構成尺寸吻合的"凹處"。通過將光纖束的傳感 端浸泡在不同濃度的分析物緩沖液中，可以從光纖束的另一端獲取有色離子載體熒光光譜并 使用熒光顯微鏡加以表征。在一條直徑為2mm的光纖束上，有大約3500條其纖心直徑為約 4.6 um的獨立光纖絲。對不同離子具有選擇性的經增塑的PVC微球已任意沉積在同一條光纖束上，從而實現多 重光學傳感。作為可以替代經增塑的PVC微球，根據本發明的基于摻雜硅膠微粒的離子檢測 微球能夠沉積在光纖束的被蝕刻的末端。根據本技術領域內已知的方法將六棱的光纖束進行打磨、清結、侵刻蝕并且經聲波處理， 如J.R Epstein等人在Biosens. Bioelectron 18 (2003) 541上所述，其中全部內容引入本文以作 參考。將根據樣品Na-H制得的Na+選擇性微球與去離子水混合，并將1 P m的部分懸浮混 合物放置于光纖束的被蝕刻的凹處端。當微球沉淀入凹處中后，使用去離子水洗去過剩的微 粒。然后，在獲得光譜響應前，將光纖束的被蝕刻端浸入1(^M的HC1中20分鐘。如圖6所示，在熒光模式下觀測到90%的微粒覆蓋在光纖束上。所制得微球的直徑(約 為3.5 um)與經蝕刻的凹處的尺寸(約為4.6 u m)相適合。圖7所示是從光纖束的經蝕刻 的凹處中所發現的五個Na+選擇性微球(樣品Na-H)的被觀察到的三維熒光光譜圖。相同的 形狀和接近的光亮度值顯示了相鄰的微球的熒光光譜具有很好的復現性。根據本發明的微球滿足許多規范并成功地應用于生理樣品，包括可靠的離子響應和對于 普通干擾離子的選擇性。二氧化硅模板的存在并沒有影響傳感化學，并且微球的響應體現了 大容積光極的傳感原理。檢測到的響應與從光極薄膜以及聲響式鑄造的聚合物微球獲得的結 果相當。此外，本發明的微球不需要如在常規PVC基微球情況下的熟化過程。本發明的微球在進 行摻雜后可以立即使用。由于其具有高密度，本發明的微球可以被離心分離，并且無論干燥 或在溶液中都易于處理。當本發明的微球在被密封并在黑暗環境中保持干燥時可以保存六個月以上。然后可以將 微球重新懸浮以制得重新懸浮的復合物。在對Na-H和Ca-L型微球摻雜六個月后再次進行流 式細胞計量術進行測量，發現最后所得到的響應復現了最初的測量。通過以上對本發明的描述，顯然可以在不背離之前的敘述以及之后的權利要求書中所述 的容本發明的范圍和明晰的含義下可進行許多修改和改進。盡管已經采用優選的形式對本發明進行了詳盡描述，但也可以使用其他方式。因此，附
加的權利要求書的精神和范圍并不受以上優選所述內容的限制。除了至少一些互斥的特征和/ 或步驟的組合之外，說明書中公開的所有特征，包括權利要求書、說明書摘要、附圖和公開 的任何方法或過程中的所有步驟，均可以任意組合形式進行組合。除非另有明確的指出，說 明書中公開的每個特征，包括權利要求書、說明書摘要和附圖，可以用起相同、相當或相似 作用的特征所取代。因此，除非另有明確的指出，公開的每個特征僅僅是非特殊系列中相當 或相似的特征的一個例子。 、權利要求書中的任何部分，凡是沒有標明"方法"用于實現特定功能或"步驟"用于實 現特定功能的，均不應理解為在35U.S.C § U2中規定的"方法"和"步驟"條款。
權利要求
1.一種用于測定液體樣品中目標離子濃度的傳感元件，含有粒狀二氧化硅，所述二氧化硅摻雜有一種能結合目標離子的離子載體；以及一種針對離子載體和目標離子間的結合能夠產生可檢測信號的指示劑；其中所述可檢測信號與液體樣品中目標離子濃度相關。
2. 如權利要求1所述的傳感元件，其特征在于，所述指示劑為有色離子載體。
3. 如權利要求1所述的傳感元件，其特征在于，所述離子載體為叔丁基杯[4]芳烴四乙酯。
4. 如權利要求1所述的傳感元件，其特征在于，所述傳感元件進一步含有內增塑聚合物。
5. 如權利要求4所述的傳感元件，其特征在于，所述內增塑聚合物為聚(丙烯酸正丁酯)。
6. 如權利要求4所述的傳感元件，其特征在于，所述離子載體為接枝于內增塑聚合物的 AU陽1。
7. 如權利要求1所述的傳感元件，其特征在于，所述傳感元件進一步包含支承聚合物和 增塑劑。
8. 如權利要求7所述的傳感元件，其特征在于，所述支承聚合物為PVC，所述增塑劑為 DOS。
9. 如權利要求1所述的傳感元件，其特征在于，所述粒狀二氧化硅為球形顆粒。
10. 如權利要求1所述的傳感元件，其特征在于，所述粒狀二氧化硅被硅烷化。
11. 如權利要求1所述的傳感元件，其特征在于，所述傳感元件進一步包含親脂性陽離 子交換劑。
12. 如權利要求ll所述的傳感元件，其特征在于，所述親脂性陽離子交換劑為NaTFPB。
13. —種檢測液體樣品中目標離子的方法，所述方法包含下列步驟a) 使多個如權利要求1所述的傳感元件與液體樣品接觸，從而使離子載體與樣品中的目 標離子結合；以及b) 測定可檢測的信號。
14. 如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述測定可檢測的信號的步驟包含使所述 傳感元件通過流式細胞計數器。
15. —種用于檢測液體樣品中離子濃度的傳感元件的制備方法，包含下列步驟a) 獲得大量硅膠微球，所述硅膠微球含有水；b) 對所述微球摻雜離子載體和指示劑以制得傳感元件的懸浮液，所述離子載體能夠結合樣品中的離子，所述指示劑針對離子載體和目標離子的結合能夠產生可檢測的信號；以及 C)干燥所述傳感元件以基本上除去所有的水。
16. 如權利要求15所述的方法，其特征在于，進一步包含再次使已干燥的傳感元件懸浮以制得再次懸浮的傳感元件的步驟。
17. —種用于檢測液體樣品中離子濃度的裝置，包含a) —種具有多個纖維的光纖束，每個纖維具有帶凹陷的樣品端；以及b) 多個微粒，每個微粒包含摻雜了能夠結合樣品中離子的二氧化硅基質；和針對離子載體和目標離子的結合能夠產生可檢測信號的指示劑；其中所述可檢測信號與液體樣品中目標離子的濃度相關；以及 多個微粒位于纖維的凹陷處中。
18. —種用權利要求15所述的方法制得的傳感元件，用于檢測液體樣品中離子的濃度。
19. 一種用權利要求16所述的方法制得的傳感元件，用于檢測液體樣品中離子的濃度。
全文摘要
一種用于測定液體樣品中目標離子濃度的傳感元件，含有一種摻雜了下述物質的粒狀二氧化硅一種能夠結合目標離子的離子載體；以及一種能夠針對離子載體和目標離子的結合能夠產生可檢測信號的指示劑。可檢測信號與液體樣品中目標離子的濃度相關。
文檔編號G01N31/22GK101133317SQ200680003573
公開日2008年2月27日 申請日期2006年1月31日 優先權日2005年1月31日
發明者卡塔斯娜·維格拉達茲, 埃里克·巴克, 超 徐, 玉 秦, 羅伯特·雷特爾, 邁克爾·L·貝爾 申請人:貝克曼·考爾特公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
