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胃泌素釋放肽前體定量測定試劑盒、其制備方法及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種胃泌素釋放肽前體（ProGRP）定量測定試劑盒及其檢測方法，包括磁分離試劑的制備、酶反應(yīng)物的制備、反應(yīng)增強劑的配制、校準(zhǔn)品稀釋液的配制、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的配制、清洗濃縮液的配制和底物溶液的配制七個步驟。本發(fā)明胃泌素釋放肽前體（ProGRP）定量測定試劑盒及其檢測方法具有較高的靈敏度和特異性，更短的獲得檢測結(jié)果的時間和更簡便的操作方式，還能區(qū)分小細(xì)胞肺癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），對肺癌的早期診斷具有重要意義。
【專利說明】胃泌素釋放肽前體定量測定試劑盒、其制備方法及檢測方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種胃泌素釋放肽前體（ProGRP)定量測定試劑盒、其制備方法及檢測 方法，所述定量測定試劑盒廣泛用于包括小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種肺癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療監(jiān) 測、復(fù)發(fā)監(jiān)測等。

【背景技術(shù)】
[0002] 由于人口老齡化、城市工業(yè)化、吸煙、空氣與環(huán)境污染、遺傳易感等因素的影響，我 國肺癌的發(fā)病率和死亡率迅速上升。根據(jù)《2012年腫瘤登記年報》統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示：肺癌已 代替肝癌成為我國首位惡性腫瘤死亡原因。目前，我國每4例惡性腫瘤死亡者中就有1例 是肺癌。
[0003] 肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（SCLC)和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)。 NSCLC約占肺癌的 80%，包括大細(xì)胞癌、腺癌和鱗癌。相比NSCLC，由于SCLC僅占肺癌的15 - 20%，因此不管是 診斷還是治療領(lǐng)域，SCLC獲得的關(guān)注度都較低。但SCLS卻是一種惡性化程度更高、病因更 復(fù)雜的腫瘤，具有快速和侵襲性生長的特點，易發(fā)生廣泛性壞死和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
[0004] 胃泌素釋放肽前體（ProGRP)作為小細(xì)胞肺癌（SCLC)新的標(biāo)記物，具有敏感性高、 特異性強的特點，并可準(zhǔn)確反映小細(xì)胞肺癌（SCLC)病情及對化療的反應(yīng)。因此，將對小細(xì)胞 肺癌（SCLC)的診斷具有較高敏感度，特異度和準(zhǔn)確率的胃泌素釋放肽前體（ProGRP)作為 提示小細(xì)胞肺癌（SCLC)的血清腫瘤標(biāo)志物，可為臨床鑒定小細(xì)胞肺癌（SCLC)提供參考依 據(jù)。胃泌素釋放肽前體作為血清腫瘤標(biāo)志物，不僅可用于小細(xì)胞肺癌（SCLC)的早期診斷， 還有助于判斷治療效果及早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。另外，胃泌素釋放肽前體還能區(qū)分小細(xì)胞肺 癌（SCLC)和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)。目前，國內(nèi)外采用酶聯(lián)免疫方法測定胃泌素釋放肽前 體（ProGRP)已處于臨床應(yīng)用階段，但是酶聯(lián)免疫法靈敏度不高，不易檢測出痕量胃泌素釋 放肽前體（ProGRP)，影響對小細(xì)胞肺癌（SCLC)檢測的準(zhǔn)確性。
[0005] ELISA技術(shù)由于其分析靈敏度不高，因而限制了其發(fā)展與使用。本發(fā)明結(jié)合了免疫 反應(yīng)的高特異性和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏性，儀器簡單，成本低廉，檢測范圍更廣，發(fā)展?jié)?力更大，因而受到了越來越多的關(guān)注。
[0006] 經(jīng)專利檢索表明，北京科美東雅生物技術(shù)有限公司在2008年有申請專利號為CN 101368966的專利--一種胃泌素釋放肽前體化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒。但這項專利 并沒有涉及磁顆粒，不會影響到我們公司對本發(fā)明的專利申報。本發(fā)明利用磁顆粒，能夠使 該發(fā)明的靈敏度提高、特異性增強，增加了診斷的準(zhǔn)確性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的在于提供一種靈敏度高、特異性強、操作簡單的胃泌素釋放肽前體 (ProGRP)板式磁顆粒化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒、其制備方法及其檢測方法。
[0008] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的： 一種胃泌素釋放肽前體定量測定試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，所述盒體內(nèi)設(shè) 有微孔板和位于盒體底部的支撐板，其中微孔板由48或96個微孔組成，支撐板上開有多個 孔，所述孔內(nèi)共放置有八個試劑瓶，所述八個試劑瓶內(nèi)分別含有磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn) 定增強劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有胃泌素 釋放肽前體（ProGRP )單克隆抗體包被的磁顆粒。
[0009] -種胃泌素釋放肽前體定量測定試劑盒的制備方法，其試劑準(zhǔn)備過程如下： 步驟一、磁分離試劑的制備 一、 磁珠緩沖液配制 (1) 、稱取緩血酸胺TRIS 4. 58g和NaCl 6. 81g于1L容器中，然后稱取0. 96g Tween-20 (吐溫20)于20mL容器中加適量水使其完全溶解后，再倒入上述1L容器中； (2) 、用移液器將防腐劑Proclin-300量取0. 2mL于10mL純化水的燒杯中完全溶解后， 倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800mL純化水，充分?jǐn)嚢瑁?(3) 、調(diào)節(jié)pH計測量其pH值，控制pH在7. 95-8. 05之間； (4) 、稱取BSA (牛血清白蛋白）3g倒入上述1L容器中； (5) 、最后1L容器定容至lOOOmL，用0. 2μηι濾器過濾；過濾完后貼好標(biāo)簽于2-8°C冷庫 貯存； 二、 磁分離試劑的制備 (1 )、將1. Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50 μ L DMS0中，取2mg抗ProGRP單克隆抗 體溶于pH 9. 5的0. lmol/L的PB緩沖液(磷酸鹽緩沖液）中至總體積為lmL ; (2)、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入 到上述ProGRP單克隆抗體溶液中，置室溫90min ; (3 )、然后將抗體溶液加入到Centr i con-10濃縮管中，放入到高速冷凍離心機中在 3000g下濃縮30min至體積為0. 5mL ； (4) 、取0. 5mL磁珠加入5mL反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2min后吸取上清； (5) 、每次加入1. 5mL pH9. 5的0. lmol/L的PB緩沖液，混勻30s，上架，去上清，重復(fù)操 作3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4h ; (6) 、加入 0· 3mL lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15min ; (7) 、每次加入1. 5mL pH7. 2的0. lmol/L的PB緩沖液清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30s， 上架，去上清，重復(fù)操作3次； (8) 、用100mL磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125mL玻璃瓶，即為0. 05%的ProGRP磁分離試 齊U ;磁珠保存液配方為 〇. 1% BSA，0. 05% Tween-20,0. 02% NaN3,20% 乙醇，4°C保存； (9) 、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的比例混勻，即得磁分離試劑； 步驟二、酶反應(yīng)物的制備 步驟三、反應(yīng)增強劑的配制 (1) 、稱取TRIS 1.56g和NaCl 4. 23g于1L容器中；用移液器將Proclin-300量取 0. 2mL于10mL純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中； (2) 、用量筒量取800mL純化水于上述1L容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓缓笳{(diào)pH 值，控制pH在7. 35-7. 45之間； (3) 、稱取阻斷劑Mak33 0. 9g于上述1L容器中；最后定容至lOOOmL，完全溶解后，用 0. 2 μ m濾器過濾； 步驟四、校準(zhǔn)品稀釋液的配制 步驟五、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的配制 步驟六、清洗濃縮液的配制 (1) 、稱取KC1 4g、NaCl 40g、蔗糖10g于1L容器中； (2) 、稱取0. 225g Tween-20于100mL容器中加15mL水使其完全溶解后，倒入上述1L 容器中； (3) 、用移液器將？1*〇(^11-300量取0.2251^于盛有151^純化水的燒杯中完全溶解后， 倒入上述1L容器中； (4) 、用量筒量取800mL純化水于上述1L容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓?(5) 、調(diào)pH，控制其范圍在7. 35-7. 45之間； (6) 、最后定容至lOOOmL，完全溶解后用0. 2 μ m濾器過濾即得； 步驟七、底物溶液的配制 一、 底物溶液A的配制步驟 (1) 、稱取硼砂5. 721g、硼酸2. 474g、魯米諾1. 0g和對碘苯酚0· lmg于1L燒杯中； (2) 、用量筒量取400mL純化水于1L燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓{(diào)pH，控制其范圍 在 7. 95-8. 05 之間； (3) 、用0. 2μηι濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500mL,混勻后即得； 二、 底物溶液B的配制 (1) 、稱取硼砂5. 721g、硼酸2. 474g、過氧化脲0. lg和防腐劑PC300 250yL于1L燒 杯中； (2) 、用量筒量取400mL純化水于1L燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓{(diào)pH控制其范圍 在 7. 95-8. 05 之間； (3) 、用0. 2μηι濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500mL,混勻后即得。
[0010] 一種胃泌素釋放肽前體（ProGRP)的檢測方法，包括如下步驟： (一）樣品的前處理： 使用本試劑盒進(jìn)行實驗前，需先取出辣根過氧化物酶標(biāo)記的ProGRP抗體、校準(zhǔn)品/待 測樣品、ProGRP抗體磁顆粒、發(fā)光底物液和洗滌液，在室溫放置15-30min，使它們平衡到室 溫；之后，將恒溫箱或者水浴鍋調(diào)至37°C;準(zhǔn)備好合適的微量加樣器及對應(yīng)吸頭并且檢查化 學(xué)發(fā)光儀是否工作正常。
[0011] (二）操作步驟： (1) 、加50μ L胃泌素釋放肽前體（ProGRP)校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待測標(biāo)本至對應(yīng)微孔底部； (2) 、加50 μ L酶反應(yīng)物至每一微孔中； (3) 、加50 μ L反應(yīng)增強劑至每一微孔中； (4) 、加50 μ L磁分離試劑至每一微孔中； (5) 、用塑料薄膜覆蓋微孔，多管混勻器輕輕振蕩微孔板30s后，置37°C水浴30min ; (6) 、微孔板放至磁分離器上，確保每個微孔都與分離器表面接觸，沉淀2min ;緩慢的 倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的微孔板連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底 部以除去粘在微孔上的所有液滴； (7) 、清洗濃縮液用純化水稀釋20倍后，加200 μ L稀釋后的清洗液至每一微孔中，置多 管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ;加樣時應(yīng)避免加樣力度過大而導(dǎo)致磁珠濺出，且混勻要徹 底； (8) 、重復(fù)步驟（6)、（7)、（6) -遍； (9) 、加100 μ L底物溶液至微孔中混勻3s，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測； (10) 、以校準(zhǔn)品濃度的Log值為橫坐標(biāo)，RLU的Log值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(雙對 數(shù)曲線)，以各待測血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清的ProGRP的濃度，其中縱坐標(biāo)為發(fā) 光強度，橫坐標(biāo)為ProGRP濃度(單位為pg/mL)。
[0012] 本發(fā)明胃泌素釋放肽前體（ProGRP)定量測定檢測方法，所述底物溶液的制備包括 以下步驟： 工作原理： 本發(fā)明為雙抗體夾心法化學(xué)發(fā)光免疫分析法與磁微粒分離技術(shù)相結(jié)合的一種檢測方 法。在標(biāo)本、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品中加入定量的酶標(biāo)ProGRP抗原、結(jié)合著磁性微粒的ProGRP單 克隆抗體及穩(wěn)定增強劑。37°C孵育后，酶標(biāo)ProGRP抗原與標(biāo)本、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品中ProGRP 競爭的與結(jié)合著磁性微粒的ProGRP單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。在外加磁場中直接沉淀， 不需離心即可分離。倒去上清液，清洗沉淀的復(fù)合物，然后加入酶促化學(xué)發(fā)光底物。底物在 酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時便發(fā)出光 子，形成發(fā)光反應(yīng)，即可使用發(fā)光儀檢測反應(yīng)的發(fā)光強度。在檢測范圍內(nèi)，反應(yīng)的發(fā)光強度 與樣本中的ProGRP濃度成反比。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是： 1、本發(fā)明將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應(yīng)體系，與 現(xiàn)有技術(shù)相比，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單，無放射性污染，試劑盒成本低， 臨床適用性強。
[0014] 2、本發(fā)明對所用的原材料進(jìn)行篩選實驗和質(zhì)量檢定，包括包被抗體的活性，磁顆 粒的吸附性能和變異大小，（HRP)的活性、化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強度及發(fā)光持續(xù)時間等，對 于（HRP)的標(biāo)記可以有不同的方法，通過反復(fù)探索和對比試驗最終找到了簡單、產(chǎn)率高、成 本低、質(zhì)量可靠的標(biāo)記方法。
[0015] 3、本發(fā)明采用一種新的專用穩(wěn)定增強劑以及清洗濃縮液，使得反應(yīng)過程更加穩(wěn)定 可靠，實驗數(shù)據(jù)靈敏有效，在提高產(chǎn)品性能的同時，并且大大降低了產(chǎn)品成本。
[0016] 4、試劑盒中的磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，清洗濃縮液、 稀釋液以及底物溶液均是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提 供了有力保障。
[0017] 5、本發(fā)明采用微孔板磁顆粒整合了兩種技術(shù)，主要體現(xiàn)在：（1)利用磁顆粒在相 同體積的情況下表面積最大的原理，能夠結(jié)合更多的抗體，從而使得反應(yīng)的靈敏度更高，線 性范圍更寬；（2)可以同時批量測量，適合大批量血清篩查。
[0018] 綜上，本發(fā)明胃泌素釋放肽前體（ProGRP)定量測定試劑盒及其檢測方法具有較高 的靈敏度和特異性，更短的獲得檢測結(jié)果的時間和更簡便的操作方式，還能區(qū)分小細(xì)胞肺 癌（SCLC)和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)，對肺癌的早期診斷具有重要意義。
[0019]

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1為本發(fā)明胃泌素釋放肽前體（ProGRP)定量測定試劑盒及其檢測方法的結(jié)構(gòu)示意 圖。
[0020] 圖2為圖1去掉盒蓋和微孔板后的俯視圖。
[0021] 圖3為圖1中微孔板的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022] 其中： 盒體1 盒蓋2 支撐板3 孔4 試劑瓶5 微孔板6 微孔7。
[0023]

【具體實施方式】 參見圖1-圖3,本發(fā)明胃泌素釋放肽前體（ProGRP)定量測定試劑盒，包括盒體1和盒 體上方的盒蓋2,所述盒體1內(nèi)設(shè)有微孔板6和位于盒體1底部的由泡沫塑料制成的支撐板 3,其中微孔板6由48或96個微孔7組成，支撐板3上開有多個孔4,所述孔4內(nèi)共放置有八 個試劑瓶5,所述八個試劑瓶5內(nèi)分別含有磁分離試劑、酶反應(yīng)物、穩(wěn)定增強劑、校準(zhǔn)品、質(zhì) 控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有胃泌素釋放肽前體（ProGRP) 單克隆抗體包被的磁顆粒。
[0024] 制備方法 步驟一、磁分離試劑的制備 一、磁珠緩沖液配制 1、 稱取 TRIS 4. 58g 和 NaCl 6. 81g 于 1L 容器中，然后稱取 0. 96g Tween-20 于 20mL 容 器中加適量水使其完全溶解后，再倒入上述1L容器中； 2、 用移液器將Proclin-300量取0. 2mL于10mL純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述 1L容器中，然后在上述1L容器中加入800mL純化水，充分?jǐn)嚢瑁?3、 調(diào)節(jié)pH計測量其pH值，控制pH在7. 95-8. 05之間； 4、 稱取BSA 3g倒入上述1L容器中； 5、 最后1L容器定容至1000mL，用0. 2 μ m濾器過濾；過濾完后貼好標(biāo)簽于2-8°C冷庫貯 存。
[0025] 二、磁分離試劑的制備 1、 將1. Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50 μ L DMS0中，取2mg抗ProGRP單克隆抗體 溶于pH 9. 5的0· lmol/L的PB緩沖液中至總體積為lmL ; 2、 確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到 上述ProGRP單克隆抗體溶液中，置室溫90min ; 3、 然后將抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中，放入到高速冷凍離心機中在3000g 下濃縮30min至體積為0. 5mL ; 4、 取0. 5mL磁珠加入5mL反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2min后吸取上清； 5、 每次加入1. 5mL pH9. 5的0. lmol/L的PB緩沖液，混勻30s，上架，去上清，重復(fù)操作 3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4h ; 6、 加入 0· 3mLlmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15min ; 7、 每次加入1. 5mL pH7. 2的0. lmol/L的PB緩沖液清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30s，上 架，去上清，重復(fù)操作3次； 8、 用100mL磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125mL玻璃瓶，即為0. 05%的ProGRP磁分離試劑； 磁珠保存液配方為 〇· 1% BSA，0. 05% Tween-20,0· 02% NaN3,20% 乙醇，4°C保存。
[0026] 9、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中 磁分離試劑。
[0027] 步驟二、酶反應(yīng)物的制備 一、酶反應(yīng)物稀釋液的配制 1、 取TRIS 4.846g、HCl 2847yL于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢?使試劑完全溶解； 2、 調(diào) pH，控制 pH 在 7.35-7.45; 3、 稱取BSA 4g倒入上述燒杯中； 4、 最后燒杯定容至400mL，用0. 2 μ m濾器過濾即得。
[0028] 二、辣根過氧化物酶（HRP)與ProGRP抗原的偶聯(lián) 1、 取ProGRP-3-cmo-BSA抗原lmg放置于lmL玻璃管中； 2、 取200 μ L DMS0溶解抗原使抗原的終濃度到達(dá)5mg/mL，然后充分混勻； 3、 按照lmol抗原加入10mol的辛二酸二琥珀酰亞胺酯的摩爾比例加辛二酸二琥珀酰 亞胺酯到上述2溶液中，37°C恒溫箱中反應(yīng)1. 5h ; 4、 按照3mol抗原加入lmol的（HRP)的摩爾比往上述3的溶液中添加（HRP)，然后加入 lmL的pH為7. 4濃度為0. 1M的PB緩沖液，置于37度恒溫箱中反應(yīng)3h ; 5、 將上述4的溶液用ro-io柱純化，收集純化液，按照1:3000的體積添加獲得的酶反 應(yīng)物稀釋液，混合均勻即得酶反應(yīng)物。
[0029] 步驟三、反應(yīng)增強劑的配制 1、 稱取TRIS 1.56g和NaCl 4. 23g于1L容器中；用移液器將Proclin-300量取0. 2mL 于10mL純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中； 2、 用量筒量取800mL純化水于上述1L容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓缓笳{(diào)pH值， 控制pH在7. 35-7. 45之間； 3、 稱取Mak33 0. 9g于上述1L容器中；最后定容至1000mL，完全溶解后，用0. 2 μ m濾 器過濾。
[0030] 步驟四、校準(zhǔn)品稀釋液的配制 1、 稱取TRIS 7. 268g和HC1 4270yL于1L的容器中，定容至600mL; 2、 用量筒量取小牛血清300mL，加入上述溶液中，校準(zhǔn)品稀釋液備用。
[0031] 步驟五、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的配制 校準(zhǔn)品濃度分別為〇,30，150,300,600，1200pg/mL ;質(zhì)控品濃度分別為0· 75,7. 5pg/ mL〇 步驟六、清洗濃縮液的配制 1、稱取KCl 4g、NaCl 40g、蔗糖10g于1L容器中； 2、 稱取0. 225g Tween-20于lOOmL容器中加15mL水使其完全溶解后，倒入上述1L容 器中； 3、 用移液器將Proclin-300量取0. 225mL于盛有15mL純化水的燒杯中完全溶解后，倒 入上述1L容器中； 4、 用量筒量取800mL純化水于上述1L容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓?5、 調(diào)pH，控制其范圍在7. 35-7. 45之間； 6、 最后定容至lOOOmL，完全溶解后用0. 2 μ m濾器過濾即得。
[0032] 步驟七、底物溶液的配制 一、底物溶液A的配制步驟 1、 稱取硼砂5. 721g、硼酸2. 474g、魯米諾1. 0g和對碘苯酚0. lmg于1L燒杯中； 2、 用量筒量取400mL純化水于1L燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓{(diào)pH，控制其范圍在 7. 95-8. 05 之間； 3、 用0. 2μηι濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500mL,混勻后即得。
[0033] 二、底物溶液B的配制 1、 稱取硼砂5. 721g、硼酸2. 474g、過氧化脲0. lg和PC300 250 μ L于1L燒杯中； 2、 用量筒量取400mL純化水于1L燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓{(diào)pH控制其范圍在 7. 95-8. 05 之間； 3、 用0. 2μηι濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500mL,混勻后即得。
[0034] 所得的產(chǎn)品分裝即為半成品，抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定 合格才能組裝成胃泌素釋放肽前體（ProGRP)微孔板式磁顆粒化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑 盒，組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。
[0035] 使用方法 (1)樣品的前處理： 使用本試劑盒進(jìn)行實驗前，需先取出辣根過氧化物酶標(biāo)記的ProGRP抗體、校準(zhǔn)品/待 測樣品、ProGRP抗體磁顆粒、發(fā)光底物液和洗滌液，在室溫放置15-30min，使它們平衡到室 溫；之后，將恒溫箱或者水浴鍋調(diào)至37°C;準(zhǔn)備好合適的微量加樣器及對應(yīng)吸頭并且檢查化 學(xué)發(fā)光儀是否工作正常。
[0036] (2)操作步驟： 1、 加50 μ LProGRP校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待測標(biāo)本至對應(yīng)微孔底部； 2、 加50 μ L酶反應(yīng)物至每一微孔中； 3、 加50 μ L反應(yīng)增強劑至每一微孔中； 4、 加50 μ L磁分離試劑至每一微孔中； 5、 用塑料薄膜覆蓋微孔，多管混勻器輕輕振蕩微孔板30s后，置37°C水浴30min ; 6、 微孔板放至磁分離器上，確保每個微孔都與分離器表面接觸，沉淀2min ;緩慢的倒 轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的微孔板連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部 以除去粘在微孔上的所有液滴； 7、 清洗濃縮液用純化水稀釋20倍后，加200 μ L稀釋后的清洗液至每一微孔中，置多管 混勻器上輕輕振蕩混勻30s ;加樣時應(yīng)避免加樣力度過大而導(dǎo)致磁珠濺出，且混勻要徹底； 8、 重復(fù)步驟6、7、6 -遍； 9、 加100 μ L底物溶液至微孔中混勻3s，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測； 10、 如遇到高值HOOK樣本，為了避免出現(xiàn)高值HOOK效應(yīng)，建議臨床醫(yī)師根據(jù)其余測試 指標(biāo)選擇合適的稀釋倍數(shù)對樣品進(jìn)行稀釋。
[0037] 以校準(zhǔn)品濃度的Log值為橫坐標(biāo)，RLU的Log值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(雙對數(shù) 曲線)，以各待測血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清的ProGRP的濃度，其中縱坐標(biāo)為發(fā)光 強度，橫坐標(biāo)為ProGRP濃度(單位為pg/mL)。
[0038] 性能指標(biāo) 1) 準(zhǔn)確性：試劑盒校準(zhǔn)品與國家校準(zhǔn)品同時測定，兩條劑量-反應(yīng)曲線不顯著偏離平 行。以國家校準(zhǔn)品為對照品，試劑盒校準(zhǔn)品試劑盒的實際值與標(biāo)示值之比應(yīng)該在〇. 90-1. 10 的范圍內(nèi) 2) 劑量-反應(yīng)曲線的線性：用雙對數(shù)數(shù)學(xué)模型擬合，在0_1200pg/mL濃度范圍內(nèi)，劑 量-反應(yīng)曲線的相關(guān)系數(shù)（r)的絕度值不低于0. 9900 3) 精密性：CV彡15%;重復(fù)性：CV彡10% 4) 最低檢出量：彡1.35pg/mL 5) 質(zhì)控血清測定值：應(yīng)在質(zhì)控范圍內(nèi) 6) 特異性：交叉反應(yīng)率應(yīng)小于0. 2% 7) 穩(wěn)定性：將試劑盒37°C放置3天，測定結(jié)果應(yīng)符合上述1)飛）項要求。
[0039] 發(fā)明胃泌素釋放肽前體（ProGRP)定量測定試劑盒及其檢測方法具有較高的靈 敏度和特異性，更短的獲得檢測結(jié)果的時間和更簡便的操作方式，還能區(qū)分小細(xì)胞肺癌 (SCLC)和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC)，對肺癌的早期診斷具有重要意義。
【權(quán)利要求】
1. 一種胃泌素釋放肽前體定量測定試劑盒，包括盒體（1)和盒體上方的盒蓋（2)，其特 征是：所述盒體（1)內(nèi)設(shè)有微孔板（6)和位于盒體（1)底部的支撐板（3)，支撐板（3)上開 有多個孔（4)，所述孔（4)內(nèi)共放置有八個試劑瓶（5)，八個試劑瓶（5)分別含為磁分離試劑 瓶、酶反應(yīng)物瓶、穩(wěn)定增強劑瓶、校準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶、清洗濃縮液瓶、稀釋液瓶以及底物溶 液瓶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的胃泌素釋放肽前體定量測定試劑盒，其特征在于：所述微孔 板（6)上設(shè)置48或96個微孔（7)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的胃泌素釋放肽前體定量測定試劑盒，其特征在于：所述 磁分離試劑瓶內(nèi)含有胃泌素釋放肽前體單克隆抗體包被的磁顆粒。
4. 制備權(quán)利要求1所述的一種胃泌素釋放肽前體定量測定試劑盒的方法，其特征在 于：所述試劑瓶中試劑準(zhǔn)備過程如下： 步驟一、磁分離試劑的制備 一、 磁珠緩沖液配制 (1) 、稱取TRIS 4. 58g和NaCl 6. 81g于1L容器中，然后稱取0. 96g吐溫20于20mL容 器中加適量水使其完全溶解后，再倒入上述1L容器中； (2) 、用移液器將防腐劑量取0. 2mL于10mL純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L 容器中，然后在上述1L容器中加入800mL純化水，充分?jǐn)嚢瑁? (3) 、調(diào)節(jié)pH計測量其pH值，控制pH在7. 95-8. 05之間； (4) 、稱取BSA 3g倒入上述1L容器中； (5) 、最后1L容器定容至1000mL，用0. 2μπι濾器過濾；過濾完后貼好標(biāo)簽于2-8°C冷 庫貯存； 二、 磁分離試劑的制備 (1 )、將1. Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50 μ L DMS0中，取2mg抗ProGRP單克隆抗 體溶于pH 9. 5的0. lmol/L的PB緩沖液中至總體積為lmL ; (2)、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入 到上述ProGRP單克隆抗體溶液中，置室溫90min ; (3 )、然后將抗體溶液加入到濃縮管中，放入到高速冷凍離心機中在300 0 g下濃縮 30min至體積為0. 5mL ； (4) 、取0. 5mL磁珠加入5mL反應(yīng)杯中，放入專用試管架，經(jīng)磁鐵吸附2min后吸取上清； (5) 、每次加入1. 5mL pH9. 5的0. lmol/L的PB緩沖液，混勻30s，上架，去上清，重復(fù)操 作3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應(yīng)4h ; (6) 、加入 0· 3mLlmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15min ; (7) 、每次加入1. 5mL pH7. 2的0. lmol/L的PB緩沖液清洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30s， 上架，去上清，重復(fù)操作3次； (8) 、用100mL磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入125mL玻璃瓶，即為0. 05%的ProGRP磁分離試 齊U ;磁珠保存液配方為 〇. 1% BSA，0. 05% Tween-20,0. 02% NaN3,20% 乙醇，4°C保存； (9) 、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1:1的比例混勻，即得磁分離試劑； 步驟二、酶反應(yīng)物的制備 步驟三、反應(yīng)增強劑的配制 (1) 、稱取TRIS 1.56g和NaCl 4. 23g于1L容器中；用移液器將Proclin-300量取 0. 2mL于10mL純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中； (2) 、用量筒量取800mL純化水于上述1L容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓缓笳{(diào)pH 值，控制pH在L 35-7. 45之間； (3) 、稱取阻斷劑0. 9g于上述1L容器中；最后定容至lOOOmL，完全溶解后，用0. 2μπι 濾器過濾； 步驟四、校準(zhǔn)品稀釋液的配制 步驟五、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的配制 步驟六、清洗濃縮液的配制 (1) 、稱取KC1 4g、NaCl 40g、蔗糖10g于1L容器中； (2) 、稱取0. 225g Tween-20于100mL容器中加15mL水使其完全溶解后，倒入上述1L 容器中； (3) 、用移液器將防腐劑量取0. 225mL于盛有15mL純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上 述1L容器中； (4) 、用量筒量取800mL純化水于上述1L容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓? (5) 、調(diào)pH，控制其范圍在7. 35-7. 45之間； (6) 、最后定容至lOOOmL，完全溶解后用0. 2 μ m濾器過濾即得； 步驟七、底物溶液的配制 一、 底物溶液A的配制步驟 (1) 、稱取硼砂5. 721g、硼酸2. 474g、魯米諾1. 0g和對碘苯酚0· lmg于1L燒杯中； (2) 、用量筒量取400mL純化水于1L燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓{(diào)pH，控制其范圍 在 7. 95-8. 05 之間； (3) 、用0. 2μηι濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500mL,混勻后即得； 二、 底物溶液B的配制 (1) 、稱取硼砂5. 721g、硼酸2.474g、過氧化脲0. lg和防腐劑250yL于1L燒杯中； (2) 、用量筒量取400mL純化水于1L燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓{(diào)pH控制其范圍 在 7. 95-8. 05 之間； (3) 、用0. 2μηι濾器過濾收集濾液，用純化水定容至500mL,混勻后即得。
5.使用權(quán)利要求4制備的胃泌素釋放肽前體試劑盒進(jìn)行檢測的方法，其特征在于所述 方法包括如下步驟： (一） 樣品的前處理： 使用本試劑盒進(jìn)行實驗前，需先取出辣根過氧化物酶標(biāo)記的ProGRP抗體、校準(zhǔn)品/待 測樣品、ProGRP抗體磁顆粒、發(fā)光底物液和洗滌液，在室溫放置15-30min，使它們平衡到室 溫；之后，將恒溫箱或者水浴鍋調(diào)至37°C;準(zhǔn)備好合適的微量加樣器及對應(yīng)吸頭并且檢查化 學(xué)發(fā)光儀是否工作正常； (二） 操作步驟： (1) 、加50 μ L胃泌素釋放肽前體校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、待測標(biāo)本至對應(yīng)微孔底部； (2) 、加50 μ L酶反應(yīng)物至每一微孔中； (3) 、加50 μ L反應(yīng)增強劑至每一微孔中； (4) 、加50 μ L磁分離試劑至每一微孔中； (5) 、用塑料薄膜覆蓋微孔，多管混勻器輕輕振蕩微孔板30s后，置37°C水浴30min ; (6) 、微孔板放至磁分離器上，確保每個微孔都與分離器表面接觸，沉淀2min ;緩慢的 倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的微孔板連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底 部以除去粘在微孔上的所有液滴； (7 )、清洗濃縮液用純化水稀釋20倍后，加200 μ L稀釋后的清洗液至每一微孔中，置多 管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ;加樣時應(yīng)避免加樣力度過大而導(dǎo)致磁珠濺出，且混勻要徹 底； (8) 、重復(fù)步驟（6)、（7)、（6) -遍； (9) 、加100 μ L底物溶液至微孔中混勻3s，迅速用準(zhǔn)備好的發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測； (10) 、以校準(zhǔn)品濃度的Log值為橫坐標(biāo)，RLU的Log值為縱坐標(biāo)繪制出雙對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線， 以各待測血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清的ProGRP的濃度，其中縱坐標(biāo)為發(fā)光強度， 橫坐標(biāo)為ProGRP濃度，單位為pg/mL。
【文檔編號】G01N33/577GK104089949SQ201410297442
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】奚偉紅, 朱丹丹, 王京, 高淑舫, 陳美
申請人:江蘇福隆生物技術(shù)有限公司