一種新型檢測個體化胰島素的免疫質譜試劑盒及制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測、評估個體化胰島素水平的免疫質譜試劑盒及制備方法，為一種非侵入性的體外檢測方法。本方法用抗體吸附表面基質及質譜法進行鑒別檢測發現一種新型變異的胰島素。變異的胰島素或5835.65Da峰值可用于個體化胰島素水平的檢測及評估。通過5835.65Da峰值或被抗體吸附表面基質上捕獲的變異的胰島素，用標準化質控血清控制下的定量性質譜分析來檢測，可以應用到已經脫離人體體液的生物標志組合的檢測試劑盒的開發。本方法精確、方便且快捷。
【專利說明】一種新型檢測個體化胰島素的免疫質譜試劑盒及制備方法【技術領域】
[0001]本發明涉及一種非侵入性檢測、評估胰腺癌伴有重型糖尿病病人試劑盒的新方法，其特征是采用質譜法對樣品中已被磁珠或抗體捕獲的胰島素進行精確地鑒別、檢測。
【背景技術】
[0002]隨著人類基因組計劃的實施和完成，科學家們提出了后基因組(post-genome)計劃的概念，研究要點轉移到功能基因組學上，而生物功能主要體現物質是蛋白質。1994年，澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams首先提出蛋白質組(proteome)的概念，指的是“一種基因組所表達的全部蛋白質”，即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質。對于蛋白質組的研究是功能基因組學研究的核心，稱為蛋白質組學(proteomics)。蛋白質組學被認為是后基因組研究中最主要的部分。與基因組相比，蛋白質組的組成更復雜，功能更活躍，應用前景更廣泛。蛋白質組學從細胞整體水平進行蛋白質屬性的研究，如表達水平、翻譯后修飾及相互作用等，并由此獲得對于疾病過程、細胞生理生化特征和調控網絡的廣泛完整的認識。 所以，蛋白質組學技術正在逐步成為生物學、醫學及制藥學等的重要研究手段。
[0003]不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質功能。因此，鑒定人體內表達的蛋白質的區別，可用于體外疾病樣本診斷及篩查，并最終用于藥物開發和疾病治療。而要進行蛋白質表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內分子的復雜混合物的程度。但細胞內許多物質往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規手段難以進行化學結構及蛋白質序列鑒定分析。用抗體及質譜聯合可克服這一技術缺點。
【發明內容】
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[0004]本發明的目的是建立一種在生物樣品中檢測變異的胰島素的免疫質譜試劑盒和制備方法。該方法為疾病的早期檢測提供了新的途徑，并為進一步發現新的變異的或修飾的生物標志提供了基礎。
[0005]本發明涉及一種非侵入性檢測的新方法，其特征是采用質譜法對樣品中已被抗胰島素抗體捕獲的變異的胰島素進行精確地鑒別、檢測的方法。
[0006]變異的胰島素的免疫質譜試劑盒制備及檢測方法:
[0007]—小管標有抗胰島素抗體的磁珠,50微升；
[0008]一小管結合緩沖液(磷酸鹽緩沖液，PBS buffer, pH 7.0-8.0)，500微升；
[0009]一小管洗滌液(去離子水)，500微升；
[0010]一小管洗脫液(1-2%三氟乙酸)，50微升；
[0011]一小管以50%乙腈、0.5%三氟乙酸的制備的吸能分子標準溶液，50微升。
[0012]上述各小管置于4°C冷藏盒中。
[0013]具體操作步驟如下:(I)將生物樣品稀釋在結合緩沖液中；用O型血，男女相等，混合制備質譜的標準化質控血清；所述步驟(2)將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在已標記上抗胰島素抗體的基質上,常用與抗體結合的基質可選擇Protein A、Protein G、或streptavidin-biotin系統；基質的支持物用陶瓷珠、磁性珠、多聚體或Sepharose beads ；所述基質的支持物采用陶瓷珠、磁性珠、多聚體或Sepharose beads之中的任一種；所述步驟(3)用洗滌液洗滌；在樣品完全干燥前將第一份洗滌液加到該位點；洗滌液在位點上至少停留10秒；徹底清除第一份洗滌液，用第二份洗滌液重復以上步驟；用I?2%三氟乙酸洗脫液徹底洗滌磁珠，將生物標志洗脫至質譜專用的金屬片上，自然干燥金屬片，加0.5μ L以50%乙腈、0.5%三氟乙酸制備的吸能分子標準溶液；吸能分子用sinapinic acid或alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid ;所述步驟(4)用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀，用波長337nm的氮激光儀和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析變異的胰島素；用儀器的軟件進行定量性質譜自動調控:每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用于定量的標準峰4091.1Da或6634.0Da強度調至質譜儀信號強度最大值的50%。用計算機分析數據進行數據重疊展示5807.65Da或5835.65Da生物標志。
[0014]本發明中變異的胰島素是利用一臺高精確度的質譜儀來發現的；該設備的質量精確度約為0.001%。
[0015]變異的胰島素生物標志物首先能夠被具有能與生物標志物結合的抗體或磁珠基質WCX吸附表面捕獲，非吸附物能從基質上洗脫，吸附到底基的生物標志物在飛行質譜儀中被檢測。生物標志物通過離子發生源，如激光，被離子化，產生的離子被一個離子感受集合器收集，然后質量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測器將檢測的離子信息轉換為質荷比。用儀器的軟件進行定量性質譜自動調控:每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用于定量的4091.1Da或6634.0Da標準峰強度調至質譜信號強度最大值的50%。生物標志物的檢測明顯地將與信號強度的檢測有關。這樣，生物標志物的數量與質量都可以被檢測出來。
[0016]飛行質譜對待分析物的分析生成飛行時間譜。該飛行時間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個樣本所產生的單獨的脈沖信號，而是一系列脈沖的信號之和。這樣降低了干擾，并增加了動態范圍。該飛行時間數據受數據處理軟件的影響。軟件中數據處理主要包括轉換飛行時間與質荷比而產生質譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。
[0017]通過對生物標志物的吸附和檢測而產生的數據可利用計算機的數據分析程序進行分析。該計算機程序分析這些數據以顯示檢測出的標記物的數量，并顯示信號的強度和確定被檢測的每個生物標志物的分子量。數據分析還能包括一系列的確定生物標志物的信號強度和矯正數據對預定統計分布狀態的偏離。例如，通過計算與某些參數相關的每個峰值的高度，可規范觀測到的峰。該參數可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學成分產生的不重要的干擾，這可以設置調零。
[0018]計算機可以將計算結果數據轉換成各種形式來表現。其標準譜可以表示，但在一種形式中只有峰高和質量信息可以在譜帶中保留，產生一個較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標志物更易顯現。在另一種形式中，兩個或更多的譜比較，便于突顯獨特的生物標記物和那些高于或低于校準樣本的生物標志物。
[0019]軟件分析一般包括展示從待分析物得到的信號的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進行選擇，可用軟件自動檢測峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號具有信噪比高于一個選擇閾值并標記出在峰信號的質心處的峰的質量這樣的方式操作。在一個有效的程序中，比較許多譜線以認定出現在質譜中某一選定范圍內同樣的一些峰。該軟件的一個版本聚集所有出現在確定的質量范圍內的各條光譜的峰，對所有在質量(質荷比)中值附近的峰指定一個質量(質荷比)簇。
[0020]對生物標志的檢測需要將一個樣本放基質的一個吸附點上，接著進行清洗。向吸附點上加入SINAPINIC酸等并讓其干燥。而后，用質譜測定法對基質進行分析，而一個顯示了蛋白質分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質分子的質量-電荷比的基礎上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。
[0021]因為本項發明中的生物標記是通過分子的質量和特異性抗體來標識的，因而它們可通過質譜測定法進行檢測而直接知道它們特定的身份。這種方法比以抗體為基礎的ELISA及免疫熒光法等夾心法更準確。
[0022]然而，如果有必要，這些生物標志也可通過，比如，確定多肽的氨基酸序列來進行鑒別。例如，一個生物標志能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8pr0teaSe)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestion fragments)的分子量可被用來在數據庫中搜索序列,這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合。或者，如果此生物標志不是已知數據庫中的蛋白質分子，在生物標志的N極氨基酸序列(N-terminal amino acid sequence)的基礎上，可使用降解探針，而后，這些探針會被用來描繪由探測到了生物標志的樣本所生成的基因組或cDNA庫。最后，蛋白質生物標志可用蛋白質梯狀排序法(protein ladder sequencing)進行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用酶解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個單個氨基酸分子的方法進行處理后，可生成蛋白質梯度(protein ladders)。然后,用質譜對此梯度進行分析。階梯狀碎片(ladder fragments)在質量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的氨基酸。
[0023]特異性是指某一物質或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質或某種疾病的特征。通過某些特征可以識別某種物質或某種疾病，從而把它和其他物質或疾病區分開來。對專有特征的識別往往依賴于特殊的檢測方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就要用有關特異性抗體來檢測。自蛋白質組學研究有新發展以來，這種傳統意義上特異性檢測和界定方法有了很大的突破，如一個蛋白質不同片段變異是不同類型腫瘤的標志。根據基因到蛋白質表達的復雜過程，一種特異性基因的產物——蛋白質必定有相關多組分蛋白質的表達。通過對這些不同組分的檢測形成一個綜合模式圖(蛋白指紋圖譜)，將這種圖譜(如某種腫瘤)與其他圖譜(如正常人或其他疾病)相比較，進而識別這種特異蛋白(如腫瘤抗原或其片段)，從而將正常人與患某種疾病病人的離體血液區分開來。
[0024]具體操作步驟:
[0025]以下是用本發明提供的一個操作方案實例。
[0026]1.樣品處理及標準化質控血清制備
[0027]將生物樣品稀釋在結合緩沖液中，視需要離心澄清樣品。質譜的標準化質控血清制備定義符合如下標準:供血者10人，5男5女，血型為O型；年齡為18-30歲；民族漢。生化指標正常，包括:總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢查、腎功檢查；無遺傳病家族史；無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。[0028]2.樣品上樣
[0029]將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在磁性珠子(磁珠)作為支持物的基質上[a.可用WCX基質的磁珠，陰離子表面(WCX, Weak Cationic Exchanger, 一羧酸基團)基質磁珠(實施例1);或用b.已標記上抗胰島素抗體基質的磁珠(實施例2)]?？梢詫①|譜的標準化質控血清用于質譜的定量方法?；|的支持物可以是陶瓷珠、磁性珠、多聚體或Sepharose beads。
[0030]3.洗滌
[0031]用洗滌液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌液加到該位點。洗滌液在位點上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復以上步驟。
[0032]4.洗脫
[0033]I-2%三氟乙酸徹底洗滌整個磁珠陣列點，將生物標志洗脫至質譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5 μ L吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸的制備的標準溶液)。
[0034]吸能分子可用sinapinic acid 或 alpha-cyano-4_hydroxycinnamic acid 等。
[0035]5.質譜的定量控制及測試
[0036]用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀，用氮激光儀(337nm)和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析滯留與各位點的生物標志或蛋白質。用計算機分析數據進行數據重疊展示；可展示5807.65Da或5835.65Da生物標志。
[0037]定量性質譜調控:每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用于定量的標準峰4091.1Da或6634.0Da強度調至信號強度最大值的50%。
[0038]用統計學方法，通過WCX磁珠試劑盒的血清蛋白指紋峰分析，發現下述一種分子量為5835.65及5807.65Da蛋白指紋可以用于區分正常人血清、胰腺癌伴有重型糖尿病病人的血清、糖尿病病人的血清:
[0039]表一、WCX磁珠試劑盒的血清蛋白指紋峰分析
[0040]
【權利要求】
1.一種來自胰腺癌伴有重型糖尿病病人的生物樣品中的生物標志，該生物標志為變異的胰島素；其分子量特征為5835.65Da ;該生物標志的鑒定是通過以下步驟實現: (1)樣品處理及質譜標準化質控血清制備； (2)樣品上樣至基質上； (3)洗漆； (4)質譜的定量控制及質譜測試； 其中所述步驟(I)將生物樣品稀釋在結合緩沖液中；用O型血，男女相等，混合制備質譜的標準化質控血清；所述步驟(2)將質譜的標準化質控血清及樣品點樣在已標記上抗胰島素抗體的基質上，基質的支持物用陶瓷珠、磁性珠、多聚體或Sepharose beads ;所述步驟(3)用洗滌液洗滌；在樣品完全干燥前將第一份洗滌液加到該位點；洗滌液在位點上至少停留10秒；徹底清除第一份洗滌液，用第二份洗滌液重復以上步驟；用I?2%三氟乙酸洗脫液徹底洗滌磁珠，將生物標志洗脫至質譜專用的金屬片上，自然干燥金屬片，加0.5μ L以50%乙腈、0.5%三氟乙酸制備的吸能分子標準溶液；吸能分子用sinapinic acid或alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid ;所述步驟(4)用激光解吸/離子化飛行時間質譜儀，用波長337nm的氮激光儀和80cm或120cm飛行管分析陣列去分析變異的胰島素；用儀器的軟件進行定量性質譜自動調控:每次測試前，用質譜的標準化質控血清，將標準化質控血清中用于定量的標準峰4091.1Da或6634.0Da強度調至質譜儀信號強度最大值的50%。
2.權利要求1中所述的變異的胰島素在制備試劑盒中的用途，其特征在于，用于制備檢測胰腺癌伴有重型糖尿病病人中的變異的胰島素的免疫質譜試劑盒。
3.權利要求2中所述的變異的胰島素為甲基化的胰島素，其化學結構為: A 鏈:GIVEQCCTSICSLYQLENYCN B 鏈:FVNQHLCGSHLVEALYLVCGE R(CH3)2G F F Y T P K T。
【文檔編號】G01N33/68GK103454428SQ201210180854
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年6月5日 優先權日:2012年6月5日
【發明者】許洋 申請人:許洋
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
