乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白及其制備方法和應用。所述的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的氨基酸組成如SEQ?ID?NO.9所示或與SEQ?ID?NO:9所示的氨基酸序列具有90%同源性。其制備方法包括：重組質粒pET-28a-S的構建；重組質粒pET-28a-S-S1的構建；乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的表達和純化。所述的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白具有較高的靈敏度和特異性，可應用于生物醫藥領域，特別是應用在乙肝病毒表面抗體膠體金檢測試紙條中。
【專利說明】乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白及其制備方法，及其在免疫層析分析領域中的應用。
技術背景
[0002]乙型肝炎病毒(HBV)是一種DNA病毒，它的感染是一個世界性的公共衛生問題，中國有約1.3億慢性乙肝病毒攜帶者，其中乙肝表面抗原的攜帶率約10%，每年約有30萬人最終死于乙肝有關的慢性疾病，是慢性傳染病中的頭號殺手。慢性HBV感染患者主要表現為肝損傷以及脂肪變性和纖維化相關的代謝紊亂，長期感染患者還可能發展成為肝硬化和肝細胞癌。乙型肝炎的治療可分為兩大類:一類是抗病毒治療。抗病毒治療主要是α干擾素和核苷類藥物，干擾素主要刺激細胞介導的免疫反應來抑制HBV，同時通過攻擊靶細胞而消除病毒；核苷類藥物可以通過抑制HBV的復制控制病毒的增殖。另一類是免疫治療。主要是宿主針對受病毒感染的干細胞的免疫反應和引起炎癥的細胞因子的介導的，免疫治療可以打破免疫耐受狀態，誘導機體有效的機體免疫，抑制并清除病毒。這兩種治療均有一定的療效，但在治療的整個過程中要定期檢測體內的病毒標志物(HBsAg、HBeAg、抗-HBe和HBV-DNA)的水平，以及時調整治療方案。因此，乙肝有關的慢性疾病的診斷和監控是當前我國亟待解決的重大課題之一。
[0003]乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎病毒(HBV)外殼的一種結構成分,在病毒吸附至易感細胞受體中起重要作用。HBsAg存在于患者血清小球型顆粒、管型顆粒和Dane顆粒中，HBV感染后絕大多數感染者外周血中會出現HBsAg，其定性檢測是判斷乙型肝炎病毒感染狀態的常規指示，對乙型肝炎臨床早期診斷抗病毒治療方案的選擇及預后判斷均具有重要意義；另外，HBsAg也是乙肝疫苗重要的免疫原之一。
[0004]早期HBsAg主要是從乙型肝炎病毒感染者血液中獲得，該種血液存在著不良因素，可能混有其他病原體或其他型的肝炎病毒。近年來隨著乙肝治療水平的提高和計劃免疫的推行，高效價血源HBsAg的獲取越來越困難。因此，借助分子生物學和基因工程技術的迅速發展，目前國際上應用的免疫學檢測技術和疫苗主要是酵母或CHO細胞表達的S蛋白，但大約有5%-10%的人群存在免疫逃避。盡管近年來許多科研工作者投身乙肝表面抗原的研究，中國預防獸醫學院病毒研究所也成功研制CHO細胞中表達的含S和PreSl基因的乙肝表面抗原，但是細胞株的表達量低，導致產量低，成本居高不下，遠遠不能滿足市場的需求。
[0005] HBsAg主要由S、前SI和前S2三個亞基組成。其中S由226個氨基酸組成，是乙肝預防性疫苗的組成成分。但含有前SI抗原的第3代預防性疫苗Hepacare,其抗體陽轉率可以達到95%左右，免疫原性明顯優于單純的S蛋白。研究顯示，前SI抗原的21-28位氨基酸是一個T細胞識別位點，第12-32和32-53位氨基酸是B細胞決定簇，第21-47位氨基酸是HBV結合肝細胞的主要區域，針對它的抗體可以封閉該位點并阻止HBV的再感染。因此我們將表達前SI的肝細胞結合位點aa21-47編碼基因串聯到HBsAg編碼基因的碳端，使其與S蛋白以嵌合蛋白的形式在大腸桿菌中大量表達，以期可以得到成本低、特異性好、靈敏度高的乙肝表面抗原，為免疫學檢測技術和高效廉價疫苗的開發提供生物原材料，有效降低檢測成本和疫苗生產成本。
【發明內容】
[0006]本發明的目的之一在于制備特異性強、靈敏度高的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白。
[0007]為解決上述技術問題，本發明提供的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的氨基酸組成如SEQ ID N0.9所示；或所述乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白氨基酸組成與SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有90%同源性。
[0008]本發明的目的之二在于提供一種操作簡單成本低的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的制備方法。
[0009]為達到以上目的，本發明提供以下技術方案:
[0010]一種乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的制備方法，包括以下步驟:
[0011]a.重組質粒pET-28a-S的構建:將堿基組成如SEQ ID N0.2的序列經過限制性內切酶BamHI和HindIII雙酶切后，克隆入經同樣雙酶切的質粒pET_28a中，獲得重組質粒pET_28a_S ；
[0012]b.重組質粒pET-28a-S_Sl的構建:將堿基組成如SEQ ID N0.6的序列采用限制性內切酶HindIII和NotI雙酶切后，克隆入經同樣雙酶切的重組質粒pET_28a_S中，獲得重組質粒 pET-28a-S-Sl ；`
[0013]c.乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的表達和純化:將步驟b所得重組質粒pET-28a-S-Sl轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)，用異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導表達，超聲破碎，離心棄上清，沉淀用含7.5-8.5Μ脲的Tris-HCl溶液溶解后離心取上清，用Ni2+親和層析柱純化，即得到乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白。
[0014]進一步，步驟a是:以SEQ ID N0.1為模板，以SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4為引物，進行PCR擴增，擴增產物經限制性內切酶BamHI和HindIII雙酶切后，克隆入經同樣雙酶切的質粒pET-28a中，獲得重組質粒pET-28a-S。
[0015]進一步，步驟b是:以SEQ ID N0.5為模板，以SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8為引物，進行PCR擴增，擴增產物經采用限制性內切酶HindIII和NotI雙酶切后，克隆入經同樣雙酶切的重組質粒pET-28a-S中，獲得重組質粒pET-28a-S-Sl。
[0016]進一步，步驟c為:將步驟b所得的重組質粒pET-28a-S_Sl轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，用終濃度為lmmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷于溫度30-37°C，誘導表達4-6小時，收集菌體，超聲破碎，離心棄上清，沉淀用含7.5-8.5M脲的Tris-HCl (pH 7.8)溶液溶解后，離心取上清，用Ni2+親和層析柱純化，得到所述乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白。
[0017]本發明的目的之三在于該乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白在生物醫藥領域的應用，特別是乙肝檢測試劑產品中的應用，從而為疾病的臨床檢測技術的開發提供優質的生物原材料。
[0018]為達到上述目的本發明提供以下技術方案:[0019]乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白在HBV快速檢測免疫層析技術及HBV重組嵌合疫苗中的應用。
[0020]本發明的效果在于①該嵌合蛋白SSl包括乙肝表面抗原sAg的主要抗原表位和兩個親水區(P35-52、P99-156);②該嵌合蛋白SSl包括在病毒及亞病毒顆粒的裝配中起主要成分，可以刺激機體產生中和性抗體或稱為保護性抗體；并且包含免疫原性更強的前SI的肝細胞結合位點。③本發明的SSl重組嵌合蛋白為病毒樣顆粒，其大小與天然病毒相近，在體內容易被樹突細胞捕獲，進而傳遞給T細胞，激活CTL反應，而且SSl在體內大部分被樹突和巨噬細胞捕獲，對體細胞的影響很小，不存在免疫耐受和免疫反毒問題。④本發明的SSl重組嵌合蛋白含有SI的肝細胞結合位點aa21-47，研究表明SI具有比S更強的免疫原性，可以增加蛋白的反應原性和免疫原性，解決當前乙肝表面抗原的免疫逃避問題。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]為了使本發明的目的、技術方案更加清楚明了、便于理解，下面將結合附圖對本發明的相關內容作進一步詳細闡述，其中:
[0022]圖1為S編碼基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中第一泳道是DNA (DL2000)分子量標準，第二泳道為PCR擴增產物；
[0023]圖2為SI編碼基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中第一泳道是DNA (DL2000)分子量標準，第二泳道為PCR擴增產物；
[0024]圖3為SSl重組 嵌合蛋白編碼基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中第一泳道是DNA (DL 2000)分子量標準，第二泳道為PCR擴增產物； [0025]圖4為重組載體pET-28a-S_Sl的PCR鑒定及酶切鑒定圖，其中第一泳道為重組載體酶切產物，第二泳道為空載體pET-28a，第3泳道為酶切的陰性空白對照，第4泳道為DNA(DL 5000)分子量標準；
[0026]圖5為乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的SDS-PAGE電泳圖,其中第一泳道是蛋白分子量標準圖，第二泳道為陽性克隆菌株誘導后的樣品；
[0027]圖6為乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的Western Blot檢測結果。
【具體實施方式】
[0028]以下實施例是對本發明具體操作進行詳盡描述，凡在實施例中未注明實驗條件的均采用常規分子生物學實驗條件，或按照相關產品的使用說明書操作。
[0029]實施例1重組嵌合蛋白HBsAg的設計
[0030]首先根據國內外已報道的乙肝表面抗原的序列及抗原表位信息，選擇合成乙肝表面抗原S和PreSl的編碼基因。
[0031]S
[0032]ATGGAGAACATCGCCAGTGGCCTGTTAGGTCCTTTACTGGTGCTGCAGGCC
[0033]GGCTTTTTCCTGCTGACCAAGATCCTGACCATCCCGCAGAGCCTGGACAGC
[0034]TGGTGGACCAGCCTGAACTTCTTAGGCGGCACCCCTGTTTGTCTGGGCCA
[0035]GAACAGCCAGAGCCAGATCAGCAGCCACAGTCCGACCTGTTGCCCTCCGA
[0036]TTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGCCTGCGCCGCTTCATCATCTTCCTGTG
【權利要求】
1.氨基酸組成如SEQID N0.9所示的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白或與SEQ IDN0:9所示的氨基酸序列具有90%同源性的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白。
2.—種乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的制備方法，其特征是，包括以下步驟: a.重組質粒pET-28a-S的構建:將堿基組成如SEQID N0.2的序列經過限制性內切酶BamHI和HindIII雙酶切后，克隆入經同樣雙酶切的質粒pET_28a中，獲得重組質粒pET_28a_S ； b.重組質粒pET-28a-S-Sl的構建:將堿基組成如SEQIDN0.6的序列采用限制性內切酶HindIII和NotI雙酶切后，克隆入經同樣雙酶切的重組質粒pET_28a_S中，獲得重組質粒 pET-28a-S-Sl ； c.乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白的表達和純化:將步驟b所得重組質粒pET-28a-S-Sl轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)，用異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導表達，超聲破碎，離心棄上清，沉淀用含7.5-8.5Μ脲的Tris-HCl溶液溶解后離心取上清，用Ni2+親和層析柱純化，即得到乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，所述步驟a是:以SEQID N0.1為模板，以SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4為引物，進行PCR擴增，擴增產物經限制性內切酶BamHI和HindIII雙酶切后，克隆入經同樣雙酶切的質粒pET-28a中，獲得重組質粒pET_28a_S。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征是，所述步驟b是:以SEQID N0.5為模板，以SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8為引物，進行PCR擴增，擴增產物經采用限制性內切酶HindIII和NotI雙酶切后，克隆入經同樣雙酶切的重組質粒pET_28a_S中，獲得重組質粒pET-28a-S-Sl。
5.根據權利要求2-4`任一項所述的制備方法，其特征是，所述步驟c為:將步驟b所得的重組質粒pET-28a-S-Sl轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，用終濃度為0.5-1.0mmol/L的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷于溫度30-37°C，誘導表達4-6小時，收集菌體，超聲破碎，離心棄上清，沉淀用含7.5-8.5M脲的Tris-HCl (pH 7.8)溶液溶解后，離心取上清，用Ni2+親和層析柱純化，得到所述乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白。
6.權利要求1所述的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白在乙肝病毒表面抗體檢測中的應用。
7.權利要求1所述的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白在乙肝病毒表面抗體膠體金檢測試紙條中的應用。
8.權利要求1所述的乙肝病毒表面抗原重組嵌合蛋白在HBV重組嵌合疫苗中的應用。
【文檔編號】G01N33/558GK103864903SQ201210537143
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月12日 優先權日:2012年12月12日
【發明者】才蕾, 任艷娜, 唐時幸, 王繼華 申請人:廣州萬孚生物技術股份有限公司
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