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專利名稱：一種簡(jiǎn)單、快速、高效的植物分子標(biāo)記瓊脂糖凝膠電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種簡(jiǎn)單、快速且高效的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法，該方法尤其適用于植物分子標(biāo)記的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
近年來，植物分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速，并在重要農(nóng)藝性狀的遺傳作圖、基因定位、基因克隆、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定、雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理預(yù)測(cè)等研究領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。目前，廣泛用于植物分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)體系包括聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳，二者均通過比較目標(biāo)分子標(biāo)記擴(kuò)增條帶在凝膠上的遷移距離，而得知不同個(gè)體間在某個(gè)分子標(biāo)記座位匕的長(zhǎng)度多態(tài)性。但是，常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳從玻璃板的洗滌、晾干、制膠、灌膠、凝固、電泳、染色到最后的顯色過程需要4~5小時(shí)，進(jìn)行高通量實(shí)驗(yàn)時(shí)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，嚴(yán)重影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。盡管有一些經(jīng)過改良的聚丙烯酰胺凝膠電泳方法報(bào)道，但依然存在著操作步驟多，時(shí)間長(zhǎng)或分辨率低等缺點(diǎn)。最近，國(guó)外雖有一些公司已開發(fā)出或JH在開發(fā)高效聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)儀，但由于儀器設(shè)備非常昂貴，難以在廣泛普及。
瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種雜聚多糖，是由D型和L型半乳糖以a-l,3和(3-1,4糖苷鍵交替相連形成的線狀高聚物。該多糖遇冷水膨脹，溶于熱水成溶膠，冷卻后可以形成具有剛性的濾孔凝膠，孔徑范圍從50nm到大于200nm之間，其大小決定于瓊脂糖的濃度，濃度越大濾孔孔徑越小。瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂凝膠作為支持物，利用核酸分子在高于其等電點(diǎn)的電泳緩沖液中的電荷效應(yīng)和凝膠的分子篩效應(yīng)，使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達(dá)到分離的目的。
瓊脂糖凝膠因其親水性強(qiáng)、理化特性穩(wěn)定且制備步驟非常簡(jiǎn)單(配制不同濃度的凝膠時(shí)，只需稱取相應(yīng)數(shù)量的瓊脂糖粉末溶解在一定體積的電泳緩沖液中，在沸水浴或微波爐中加熱充分融解，冷卻至50 6(TC'加入溴化乙錠(Ethidiura Bromide, EB)染色劑混勻，灌入水平膠模，待其充分凝固后即可進(jìn)行電泳)而成為分離、鑒定和純化DNA片段最為簡(jiǎn)便和常用的方法之一。瓊脂糖凝膠由于凝膠容易制作，實(shí)驗(yàn)室中很少對(duì)其進(jìn)行回收和重復(fù)利用，通常是在電泳結(jié)束、紫外凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果后即被丟棄。這種做法一方面造成了瓊脂糖粉末和電泳緩沖液的大量浪費(fèi)，顯著地增加了分析測(cè)試的成本；另一方面在制備凝膠的過程中所加入的EB是一種強(qiáng)致癌物質(zhì)，長(zhǎng)期接觸會(huì)對(duì)人體造成一定的傷害；最后，在處理含有EB的凝膠及電泳緩沖液時(shí)不僅給實(shí)驗(yàn)室?guī)聿簧俾闊覍?duì)環(huán)境也會(huì)造成極大的污染。因此，發(fā)展和優(yōu)化瓊脂糖凝膠電泳方法是一個(gè)值得特別關(guān)注的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述瓊脂糖凝膠電泳中存在的難題而提出的一種具有廣泛適用性尤其適用于高通量植物SSR標(biāo)記位點(diǎn)遺傳變異檢測(cè)的快速、高效的瓊脂糖凝膠電泳方法。所述方法包括對(duì)經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后的凝膠進(jìn)行進(jìn)一步處理的步驟，具體如下，在上一輪的檢測(cè)之后，將已記錄好圖像的凝膠放置在電泳槽中，接通電源將DNA樣品跑出膠外，對(duì)凝膠進(jìn)行洗滌，以去除對(duì)下一輪電泳檢測(cè)的干擾；然后進(jìn)行染膠步驟，將洗滌完后的凝膠浸泡在含有終濃度為0.5叫/ml EB的電泳緩沖溶液中2小時(shí)，所述凝膠經(jīng)過上述處理后即可用于下一輪對(duì)下一個(gè)分子標(biāo)記PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。
可選擇的，為了操作方便，將已記錄好圖像的凝膠用小手術(shù)刀在點(diǎn)樣孔上方沿著與點(diǎn)樣孔平行的方向?qū)⒛z切割成四個(gè)均等的25X4.5 cm左右的長(zhǎng)條，注意保持點(diǎn)樣孔的完整性，將其平行等距離放臂在電泳槽中。
可選擇的，所述瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)包括制膠、電泳、檢測(cè)步驟，制膠過程如下，準(zhǔn)備好膠模，凝膠托盤的規(guī)格25X20cm，等距離平行插四排梳子，稱取7.5g瓊脂糖粉末至500ml的三角錐瓶中，加入250ml0.5XTBE電泳緩沖溶液中，搖勻，在微波爐中加熱至瓊脂糖完全
熔化成為溶膠，冷卻至60。C以下，再在瓶中加入50pl終濃度為0.5(ig/ml的EB，充分混勻，
將溶膠倒入膠模，凝固后即成為凝膠；電泳過程如下，小心拔出插在凝膠中的梳子，將凝M放入電泳槽中，加入0.5XTBE電泳緩沖溶液至液面覆蓋凝膠l-2mm，用移液排槍吸取4.5 pl的含上樣緩沖液的PCR產(chǎn)物小心加入梳子孔，待所有樣品上完樣后，接通電源，調(diào)節(jié)電壓至4-5V/cm，核酸分子從負(fù)極移到」下極，待上樣緩沖液跑到合適位置時(shí)，停止電泳，約需45-60min;檢測(cè)過程如下，將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置于凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)的平臺(tái)中間，打開紫外光，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶，在電腦中觀察并保存圖像。
凝膠在經(jīng)過所述處理后，能夠循環(huán)使用， 一塊凝膠可以重復(fù)利用IO次以上，依然能確保電泳條帶清晰，分辨率高，重復(fù)性好。
本發(fā)明所述瓊脂糖凝膠電泳方法是對(duì)已使用過的瓊脂糖凝膠進(jìn)行進(jìn)一步跑膠、洗漆、染色等處理，實(shí)現(xiàn)凝膠的重復(fù)利用，從而滿足了高通量植物SSR標(biāo)記位點(diǎn)遺傳變異的快速檢測(cè)。本發(fā)明提出的快速、高效的瓊脂糖凝膠電泳方法，是利用瓊脂糖凝膠的親水性、理化結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和高分辨率而形成的一種新的瓊脂糖凝膠電泳方法，該方法對(duì)植物并沒有特異性， 只要被研究的植物有需要通過電泳分離的分子標(biāo)記，均可以采用該方法將所研究的個(gè)體基因 型區(qū)分開來，故具有廣泛的適用性。
本發(fā)明所述高通量植物SSR標(biāo)記位點(diǎn)遺傳變異的快速檢測(cè)是按照以下操作步驟完成的 首先提取植物基因組DNA備用；然后開發(fā)和合成該植物中分子標(biāo)記，利用這些引物對(duì)不同 群體或群體內(nèi)不同個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，擴(kuò)增產(chǎn)物在3%的 含有EB的瓊脂糖凝膠(凝膠托盤的規(guī)格為25X20 cm，四排梳子)上電泳檢測(cè)，用紫外凝膠
成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果，旨輪電泳結(jié)束；將已終止電泳的凝膠用小手術(shù)刀在點(diǎn)樣孔上方沿著 與點(diǎn)樣孔平行的方向逐行將凝膠切割成四個(gè)均等的長(zhǎng)條(25X4.5 cm，注意保持點(diǎn)樣孔的完
整性)，將長(zhǎng)形凝膠平行放置在電泳槽中，接通電源繼續(xù)電泳對(duì)凝膠進(jìn)行洗滌，直至凝膠中的 DNA樣品跑出膠外，以去除對(duì)下一次PCR產(chǎn)物檢測(cè)的干擾；最后，將洗滌完的凝膠浸泡在
含有終濃度為0.5 pg/ml EB的電泳緩沖溶液中2個(gè)小時(shí)，即可重復(fù)利用，進(jìn)行下一輪PCR產(chǎn) 物的檢測(cè)。由于凝膠能夠多次重復(fù)利用，從而實(shí)現(xiàn)了高通量植物SSR標(biāo)記位點(diǎn)遺傳變異的快 速檢測(cè)。
本發(fā)明的有益效果
(1) 克服了國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)行的瓊脂糖凝膠電泳方法中存在著試劑藥品的過度浪費(fèi)、染色劑對(duì)人 體的危害、以及凝膠和電泳緩沖液的廢棄物對(duì)環(huán)境產(chǎn)生極大污染的缺點(diǎn)，大大提高了瓊脂 糖凝膠和電泳緩沖液的利用效率，節(jié)約了人力和成本。分析不同標(biāo)記時(shí)不需重新制備凝膠， 一塊膠至少可重復(fù)利用10次，進(jìn)行IO個(gè)以上標(biāo)記的檢測(cè)，僅需4元左右的瓊脂糖粉，而 常規(guī)檢測(cè)需花費(fèi)40元以上，節(jié)省了 IO倍以上的成本。
(2) 通過對(duì)凝膠的洗滌和染膠，避免了在多次重復(fù)利用凝膠時(shí)樣品間的交叉污染及EB濃度的 降低導(dǎo)致成像模糊不清。經(jīng)過洗滌和染色過的凝膠，電泳條帶清晰，分辨率高，重復(fù)性好。
(3) 鑒定快速，用300個(gè)SSR標(biāo)記分析一個(gè)包括200個(gè)株系的植物分離群體的遺傳變異僅需 1.5個(gè)月的時(shí)間。本發(fā)明采用改進(jìn)的瓊脂糖凝膠電泳方法大大簡(jiǎn)化凝膠制作步驟，顯著提 高了檢測(cè)效率，廣泛適用于植物遺傳作圖、基因定位和克隆、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳多 樣性分析等領(lǐng)域的SSR分子標(biāo)記檢測(cè)。
綜上所述，本發(fā)明對(duì)電泳后的瓊脂糖凝膠進(jìn)行跑膠、洗滌和染色后再度利用，并通過對(duì) 高粱分離群體進(jìn)行大量SSR分子標(biāo)記加以驗(yàn)證，大大減少了瓊脂糖粉末和電泳緩沖液的使用， 節(jié)省了制備凝膠的時(shí)間、人力和物力，同時(shí)也保證了高質(zhì)量的分辨效果和可重復(fù)性。相比利 用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)植物分離群體進(jìn)行大量分子標(biāo)記檢測(cè)具有較大的時(shí)間和成本優(yōu)勢(shì)。這個(gè)平臺(tái)的建立，不僅能夠?yàn)檠芯空咛峁┯嘘P(guān)植物遺傳作圖、分子標(biāo)記輔助育種和種質(zhì) 資源遺傳多樣性分析等領(lǐng)域中的高效SSR分子標(biāo)記瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法，而且還可創(chuàng)建 一個(gè)資源節(jié)約型和環(huán)境友好型的實(shí)驗(yàn)室。同時(shí)本發(fā)明拓展了瓊脂糖凝膠電泳的功用效能和應(yīng) 用范圍，具有極大商業(yè)價(jià)值，商家可以在此發(fā)明的基礎(chǔ)上為滿足市場(chǎng)需求可直接制備并出售 不同瓊脂糖濃度的預(yù)制凝膠。


圖1:本發(fā)明所述瓊脂糖凝膠電泳方法用于植物分子標(biāo)記檢測(cè)時(shí)的流程圖2:顯示第一輪第一個(gè)引物對(duì)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖3:顯示第二輪第二個(gè)引物對(duì)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖4:顯示第三輪第三個(gè)引物對(duì)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖5:顯示第四輪第四個(gè)引物對(duì)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖6:顯示第五輪第五個(gè)引物對(duì)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖7:顯示第六輪第六個(gè)引物對(duì)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖8:顯示第七輪第七個(gè)引物對(duì)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖9:顯示第八輪第八個(gè)引物對(duì)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖10:顯示第九輪第九個(gè)引物對(duì)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果；
圖ll:顯示第十輪第十個(gè)引物對(duì)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
具體實(shí)施方案
為了充分公開本發(fā)明的簡(jiǎn)單快速瓊脂糖凝膠電泳方法，以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一
步的詳細(xì)說明
1. 植物DNA樣品的提取發(fā)明中所采用的植物為禾本科高粱屬的高粱重組自交系分離
群體，用改良的CTAB小樣法提取各株系葉片的總DNA。
2. PCR體系的設(shè)置PCR體系15^1，反應(yīng)液組成為10xBuffer1.5 pl， MgCl2 (25 mmol/L) 0.9|al,dNTP(10mmol/L )1.2^1,模版DNA(20ng/^1)2.5 pl，高粱SSR正反向引物(IO pmol/L) 各0.2(xl， r叫DNA聚合酶(5U/|_il) 0.1 (TaKaRa生產(chǎn))，滅菌ddH20 8.4 pl。
3. PCR條件的設(shè)定與運(yùn)行PCR反應(yīng)程序?yàn)?4。C預(yù)變性5min; 94。C變性30s， 55°C 退火30s， 72。C延伸45s; 35個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10 min， 4'C保存。
4. PCR產(chǎn)物的檢測(cè)使用本發(fā)明所述的瓊脂糖凝膠電泳方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明所涉及的瓊脂糖凝膠電泳方法是對(duì)已使用過的瓊脂糖凝膠進(jìn)一步進(jìn)行跑膠、洗滌、染色處理，重復(fù)利用凝膠來實(shí)現(xiàn)的，其具體操作方法如下
(1) 制膠準(zhǔn)備好膠模，凝膠托盤的規(guī)格25X20 cm，等距離平行插四排梳子。稱取將 7.5g瓊脂糖粉末至500ml的三角錐瓶中，加入250ml0.5XTBE電泳緩沖溶液中，搖勻。在微 波爐中加熱至瓊脂糖完全熔化成為溶膠，冷卻至6(TC以下，再在瓶中加入50pl EB (終濃度
0.5pg/ml)充分混勻，將溶膠倒入膠模，凝固后即成為凝膠。
(2) 電泳小心拔出插在凝膠中的梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入0.5XTBE電泳緩 沖溶液至液面覆蓋凝膠l-2mm。用移液排槍吸取4.5 pl的含上樣緩沖液的PCR產(chǎn)物小心加入 梳子孔，待所有樣品上完樣后，接通電源，調(diào)節(jié)電壓至4-5V/cm，核酸分子從負(fù)極移到正極。 待上樣緩沖液跑到合適位置時(shí)，停止電泳，約需45-60min。
(3) 檢測(cè)將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置于凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)的平臺(tái)中間，打開紫外光， 可見到發(fā)出熒光的DNA條帶，在電腦中觀察并保存圖像，首輪檢測(cè)結(jié)束。
(4) 洗滌將已記錄好圖像的凝膠用小手術(shù)刀在點(diǎn)樣孔上方沿著與點(diǎn)樣孔平行的方向?qū)?凝膠切割成四個(gè)均等的長(zhǎng)條(25X4.5 cm)，注意保持點(diǎn)樣孔的完整性，平行等距離放置在電 泳槽中，接通電源將DNA樣品跑出膠外，對(duì)凝膠進(jìn)行洗滌，以去除對(duì)下一次電泳的干擾。
(5) 染膠將洗滌完后的凝膠浸泡在含有終濃度為0.5 pg/mlEB的電泳緩沖溶液中2小 時(shí)，即可用于對(duì)下一個(gè)分子標(biāo)記PCR產(chǎn)物的檢測(cè)，如此循環(huán)往復(fù)。
5.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖2顯示了第一輪電泳的結(jié)果；圖3 — 11顯示了依次使用 經(jīng)過上述處理后的凝膠所進(jìn)行的第二輪到第十輪瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。經(jīng)驗(yàn)證， 一塊凝膠 可以重復(fù)利用至少10次，依然能確保電泳條帶清晰，分辨率高，重復(fù)性好。
權(quán)利要求
1.一種簡(jiǎn)單快速，適用于高通量植物SSR標(biāo)記位點(diǎn)遺傳變異快速檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳方法，所述方法包括對(duì)經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后的凝膠進(jìn)行進(jìn)一步處理的步驟，具體如下，在上一輪的檢測(cè)之后，將已記錄好圖像的凝膠放置在電泳槽中，接通電源將DNA樣品跑出膠外，對(duì)凝膠進(jìn)行洗滌，以去除對(duì)下一輪電泳檢測(cè)的干擾；然后進(jìn)行染膠步驟，將洗滌完后的凝膠浸泡在含有終濃度為0.5μg/ml EB的電泳緩沖溶液中2小時(shí)，所述凝膠經(jīng)過上述處理后即可用于下一輪對(duì)下一個(gè)分子標(biāo)記PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，為了操作方便，將已記錄好圖像的凝膠用小手術(shù)刀在點(diǎn)樣孔上方沿著與點(diǎn)樣孔平行的方向?qū)⒛z切割成四個(gè)均等的25X4.5 cm左右的長(zhǎng)條，注意保持點(diǎn)樣孔的完整性，將其平行等距離放置在電泳槽中。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其中所述瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)包括制膠、電泳、檢測(cè)步驟，制膠過程如下，準(zhǔn)備好膠模，凝膠托盤的規(guī)格25X20 cm,等距離平行插四排梳子，稱取7.5g瓊脂糖粉末至500ml的三角錐瓶中，加入250ml 0.5XTBE電泳緩沖溶液中，搖勻，在微波爐中加熱至瓊脂糖完全熔化成為溶膠，冷卻至60°C以下，再在瓶中加入5(^1終濃度為0.5 pg/ml的EB，充分混勻，將溶膠倒入膠模，凝固后即成為凝膠；電泳過程如下，小心拔出插在凝膠中的梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入0.5XTBE電泳緩沖溶液至液面覆蓋凝膠l-2mm，用移液排槍吸取4.5 W的含上樣緩沖液的PCR產(chǎn)物小心加入梳子孔，待所有樣品上完樣后，接通電源，調(diào)節(jié)電壓至4-5V/cm，核酸分子從負(fù)極移到正極，待上樣緩沖液跑到合適位置時(shí)，停止電泳，約需45-60min;檢測(cè)過程如下，將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置于凝膠自動(dòng)成像系統(tǒng)的平臺(tái)中間，打開紫外光，可見到發(fā)出熒光的DNA條帶，在電腦中觀察并保存圖像。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述方法，凝膠在經(jīng)過所述處理后，能夠循環(huán)使用， 一塊凝膠可以重復(fù)利用至少10次，依然能確保電泳條帶清晰，分辨率高，重復(fù)性好。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l一4任一項(xiàng)所述的方法，當(dāng)用于高通量植物SSR標(biāo)記位點(diǎn)遺傳變異快速檢測(cè)時(shí)，進(jìn)一步包括提取植物基因組DNA備用、開發(fā)和合成該植物中分子標(biāo)記，和利用這些引物對(duì)不同群體或群體內(nèi)不同個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單快速，適用于高通量植物SSR標(biāo)記位點(diǎn)遺傳變異快速檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳方法，方法包括對(duì)經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后的凝膠進(jìn)行進(jìn)一步處理的步驟，凝膠經(jīng)過處理后即可用于下一輪對(duì)下一個(gè)分子標(biāo)記PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。凝膠在經(jīng)過處理后，能夠循環(huán)使用，一塊凝膠可以重復(fù)利用10次以上，依然能確保電泳條帶清晰，分辨率高，重復(fù)性好。從而實(shí)現(xiàn)了高通量植物SSR標(biāo)記位點(diǎn)遺傳變異的快速檢測(cè)，同時(shí)克服了國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)行的瓊脂糖凝膠電泳方法中所存在著的試劑藥品過度浪費(fèi)、染色劑對(duì)人體的危害、以及凝膠和電泳緩沖液的廢棄物對(duì)環(huán)境產(chǎn)生極大污染的缺點(diǎn)，大大提高了瓊脂糖凝膠和電泳緩沖液的利用效率，節(jié)約了人力和成本。
文檔編號(hào)G01N27/447GK101671731SQ20091016039
公開日2010年3月17日 申請(qǐng)日期2009年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月5日
發(fā)明者松 嚴(yán), 余傳漲, 華 王, 翟國(guó)偉, 鄒桂花, 陶躍之 申請(qǐng)人:鄒桂花