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專利名稱：用于檢測(cè)目標(biāo)反應(yīng)與治療黃病毒感染癥狀之組合物及方法
用于檢測(cè)目標(biāo)反應(yīng)與治療黃病毒感染癥狀之組合物及方法相關(guān)申請(qǐng)案本申請(qǐng)案主張美國(guó)專利申請(qǐng)案第12/079，576號(hào)(2008年3月27日申請(qǐng))及美國(guó) 專利申請(qǐng)案第11/469，270號(hào)(2006年8月31日申請(qǐng))之巴黎公約優(yōu)先權(quán)，其主張美國(guó)臨 時(shí)申請(qǐng)案第60/713，463號(hào)(2005年8月31日申請(qǐng))之巴黎公約優(yōu)先權(quán)，上述各申請(qǐng)案之 揭示內(nèi)容全文皆以參考數(shù)據(jù)方式納入本說(shuō)明書中。本發(fā)明由臺(tái)灣國(guó)家科學(xué)委員會(huì)94F008-5、NSC 95-2320-B-010010及NSC 95-3112-B-010-017之計(jì)劃所支持。本發(fā)明亦由臺(tái)灣中央研究院94M002-1與國(guó)立陽(yáng)明大學(xué) 95A-CT8G02之計(jì)劃所支持。
背景技術(shù)：
在本說(shuō)明書中所參照之任何先前技術(shù)皆不或不應(yīng)被視做承認(rèn)或以任何形式暗示 該先前技術(shù)在任何國(guó)家構(gòu)成通識(shí)之一部分。本文所引用之所有文獻(xiàn)，其全文皆以參考數(shù)據(jù) 方式具體納入本說(shuō)明書中。免疫系統(tǒng)能使宿主生物區(qū)辨本身及非本身抗原，以及識(shí)別及清除侵入之病原體。 后天性免疫系統(tǒng)(adaptive immunity system)依存于高度多形(highly polymorphic) 分子，諸如主要組織兼容性復(fù)合體(MHC)之第I類及第II類抗原、T細(xì)胞受體及B細(xì)胞受 體，以向T細(xì)胞及B細(xì)胞呈遞抗原，因而導(dǎo)致免疫系統(tǒng)之活化。先天免疫系統(tǒng)識(shí)別此等多樣 性抗原之機(jī)制未明，直到Janeway提出模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)之觀念(Janeway，1989，Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54Pt 1，1-13)。該假說(shuō) 后來(lái)藉由鑒定出由下列受體識(shí)別之病原體相關(guān)性分子模式(PAMPs)而證明為正確，該等受 體為類鐸受體(TOLL-like receptors) (Aderem and Ulevitch, 2000Nature 406，782-7 ； Akira and Takeda,2004, Nat Rev Immunol 4,499-511 ；Athman and Philpott,2004,Curr Opin Microbiol 7，25-32)、凝集素(lectin)受體(Cambi and Figdor，2003，Curr Opin Cell Biol 15，539-46)、類免疫球蛋白(類 Ig)受體(Daws et al. ,2003, J Immunol 171， 594-9)、及NOD蛋白(Athman and Philpott, 2004, Curr Opin Microbiol 7，25_32)、以及其 它(Liu et al.，2001，J Biol Chem 276,34686-94 ；McDonald et al.，2005，J Biol Chem 280,20177-80)。除了由類鐸受體所識(shí)別且經(jīng)充分鑒定特征之PAMPs(Akira and Takeda, 2004, Nat Rev Immunol 4,499-511)之外，新近之研究顯示宿主免疫系統(tǒng)可經(jīng)由特異性碳水化合 物抗原而識(shí)別侵入之病原體。舉例言之，甘露糖受體可識(shí)別在病原體表面表現(xiàn)之具高甘露 糖分子部分(Stahl and Ezekowitz, 1998, Curr Opin Immunol 10，50-5)，同時(shí)樹狀細(xì)胞 凝集素-I(Dectin-I)受體可特異性地與β-葡聚糖結(jié)合，該β _葡聚糖為真菌壁表面之 多醣體之主要骨架(Brown and Gordon, 2001, Nature 413，36-7 ；Herre et al.，2004，Mol Immunol 40，869-76)。此等結(jié)果暗示與病原體相關(guān)之碳水化合物結(jié)構(gòu)為由免疫細(xì)胞之先天 性免疫受體所識(shí)別之標(biāo)靶之一。靈芝類(Ganoderma)及冬蟲夏草類(Cordyc印s)真菌為在中國(guó)為最盛行服用之草藥。自靈芝(Ganoderma lucidum，亦稱為L(zhǎng)ing zhi、Reishi)萃取出之多醣體曾被用于傳 統(tǒng)中藥而作為抗腫瘤劑及免疫調(diào)節(jié)劑(Lien, 1990, Prog Drug Res 34,395-420 ；Wang et al.，2002，Bioorg Med Chem 10，1057-62 ；Shiao，2003，Chem Rec 3，172-80)，而從冬蟲夏 草(Cordyceps sinensis) (Cordyceps> Caterpillar fungus)萃取出者貝Ijll示會(huì)改變細(xì) 胞凋亡自穩(wěn)態(tài)(apoptotic homeostasis)，并會(huì)改善呼吸、腎臟、及心血管功能(Buenz et al. ,2005, J Ethnopharmacol 96,19-29 ；Zhu et al. , 1998, J Altern Complement Med 4, 289-303 ；Zhu et al.，1998，J Altern Complement Med 4，429-57)，以及增加全身對(duì)于胰島 素之敏感性(Balon et al. ,2002, J Altern Complement Med8，315-23)。不過(guò)，萃取物之 多醣體組成于多醣體系萃取自不同來(lái)源、不同菌株、及于不同生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)皆會(huì)發(fā)生 變化。仰賴高效液相層析(HPLC)及質(zhì)子-核磁共振之分析方法曾被用于研究單離自 (Ganoderma lucidum) H&l胃(Cordyceps sinensis)(He and
Seleen，2004，Int. J. Med. Mushrooms 6，253)。不過(guò)，高效液相層析圖系基于與靈芝酸 (ganoderic acid) A及C(靈芝之二種主要三萜化合物)或腺苷之比較。依據(jù)質(zhì)譜仍難以知 道萃取物是否含有多醣體之活性成分。本發(fā)明辨識(shí)出在受到黃病毒(諸如，登革熱病毒(Dengue virus)或日本腦脊髓炎 病毒(Japanese encephamyelitis virus))感染時(shí)會(huì)誘發(fā)細(xì)胞滲漏及其它負(fù)作用之細(xì)胞受 體。使用本發(fā)明所揭露之融合蛋白，其判定出病原體(諸如，黃病毒)會(huì)經(jīng)由糖苷鍵結(jié)而結(jié) 合之受體。一旦判定出該等受體，即可判定結(jié)合特定受體之作用，其中對(duì)于造成特定癥狀之 受體的尋靶可由能夠阻斷病原體與受體結(jié)合之試劑靶向。因此，就登革熱病毒及日本腦脊 髓炎病毒而言，TNF-α?xí)诓≡w結(jié)合DLVR1/CLEC5A受體時(shí)釋出。以單株抗體阻斷DLVRl/ CLEC5A受體可減少TNF- α之分泌，且同時(shí)不會(huì)影響負(fù)責(zé)進(jìn)行病毒清除之細(xì)胞激素的分泌， 因而使經(jīng)感染小鼠之存活率由零增加至約50%。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本說(shuō)明書揭示之特征，本發(fā)明提供一種方法，其包含取得融合蛋白質(zhì)族 群(complement)(其中各融合蛋白質(zhì)包含受體的結(jié)合區(qū)域(domain)以及提供受質(zhì) (substrate)固定之區(qū)域)，使融合蛋白質(zhì)與病原體接觸以確認(rèn)該病原體是否可與該融合 蛋白質(zhì)族群中至少一融合蛋白質(zhì)上之結(jié)合區(qū)域結(jié)合，及檢測(cè)該病原體是否與該融合蛋白質(zhì) 結(jié)合。「融合蛋白質(zhì)族群」乙辭代表至少一受體的許多不同結(jié)合區(qū)域。根據(jù)本說(shuō)明書揭示之特征，本發(fā)明提供一種方法，其包含取得易受病原體感染之 細(xì)胞，剔除至少一細(xì)胞受體基因，使該等細(xì)胞與該病原體接觸，及測(cè)量該等細(xì)胞之細(xì)胞激素 分泌量。根據(jù)本說(shuō)明書揭示之特征，本發(fā)明提供一種方法，其包含鑒定至少一可結(jié)合病原 體所展示之配體(Iigand)的細(xì)胞受體，以及對(duì)經(jīng)該病原體感染之動(dòng)物投予試劑，以阻斷該 配體與該受體之結(jié)合而調(diào)控該病原體之作用。根據(jù)本說(shuō)明書揭示之特征，本發(fā)明提供一種方法，其包含提供有效量的試劑，以調(diào) 節(jié)感染動(dòng)物之病原體的作用，以調(diào)節(jié)該病原體對(duì)該動(dòng)物上的作用。該試劑系針對(duì)至少一該 感染動(dòng)物原有細(xì)胞之細(xì)胞受體，以防止該受體與該病原體所展示之配體結(jié)合。
根據(jù)本說(shuō)明書揭示之特征，本發(fā)明提供一種方法，其包含提供有效量之抗DLVRl/ CLEC5A抗體給予受登革熱病毒感染之動(dòng)物，其中該抗DLVR1/CLEC5A抗體能防止由登革熱 病毒顆粒所呈現(xiàn)之配體與DLVR1/CLEC5A受體結(jié)合，其中TNF-α之分泌可受到抑制。根據(jù)本說(shuō)明書揭示之特征，本發(fā)明提供一種方法，其包含提供有效量之抗DLVRl/ CLEC5A抗體給予受日本腦脊髓炎病毒感染之動(dòng)物，其中該抗DLVR1/CLEC5A抗體能防止由 日本腦脊髓炎病毒所呈現(xiàn)之配體與DLVR1/CLEC5A受體結(jié)合，其中TNF-α之分泌可受到抑 制。根據(jù)本說(shuō)明書揭示之特征，本發(fā)明提供一種方法，其包含提供有效量之試劑給予 受登革熱病毒感染之動(dòng)物，其中該試劑可至少部分抑制至少一種促發(fā)炎性細(xì)胞激素之分 泌，且不影響干擾素-a (Interferon-α )之分泌。根據(jù)本說(shuō)明書揭示之特征，本發(fā)明提供一種小鼠，其包含易受登革熱病毒感染之 小鼠，以及sh-RNA顆粒以剔除該小鼠體內(nèi)之DLVR1/CLEC5A受體。根據(jù)本說(shuō)明書揭示之特征，本發(fā)明提供一種組合物，其包含醫(yī)藥制備物，包含有效 量之抗體，該抗體系抗動(dòng)物體內(nèi)至少一細(xì)胞受體，以調(diào)節(jié)該動(dòng)物體內(nèi)病原體感染之作用。該 調(diào)節(jié)至少包含抑制該動(dòng)物細(xì)胞之促發(fā)炎性細(xì)胞激素的分泌，且不影響可造成病毒清除之細(xì) 胞激素的分泌。根據(jù)本說(shuō)明書揭示之特征，本發(fā)明提供一種組合物，其包含醫(yī)藥制備物，包含有效 量之抗體，該抗體系對(duì)抗受登革熱病毒感染之動(dòng)物之DLVR1/CLEC5A受體，以調(diào)節(jié)該動(dòng)物體 內(nèi)登革熱病毒感染之作用。該調(diào)節(jié)至少包含抑制該動(dòng)物細(xì)胞之促發(fā)炎性細(xì)胞激素的分泌， 且不影響可造成病毒清除之細(xì)胞激素的分泌。


本專利或?qū)＠暾?qǐng)檔案含有至少一張以彩色制成之圖式。本專利或?qū)＠暾?qǐng)公開 案(含彩色圖式)之復(fù)印件將依請(qǐng)求及繳付必要費(fèi)用后由智財(cái)局提供。本說(shuō)明書揭示之上 述特征及目的將可在參照下列之?dāng)⑹霾⒔Y(jié)合附呈之圖式閱讀時(shí)更為明了，該等圖式中之類 似參照數(shù)目代表類似之組件，且其中圖IA顯示藉由RT-PCR擴(kuò)增，然后在0.8%瓊脂糖上分成各部分及藉由溴化乙錠 染色而顯現(xiàn)之先天性免疫受體之DNA片段。圖IB為經(jīng)表現(xiàn)之重組受體.Fc融合蛋白質(zhì)在 12% SDS-PAGE凝膠上之電泳圖譜。圖2Α顯示固定于膜上之生物素化GLPS F3與綴合有辣根過(guò)氧化酶(HRP)之鏈霉 抗生物素接觸后之點(diǎn)漬圖。圖2Β顯示固定于膜上之生物素化GLPS F3與樹狀細(xì)胞凝集 素-1 (Dectin-I). Fc融合蛋白質(zhì)接觸，繼而與綴合有HRP之山羊抗IgGl抗體一起培育后之 點(diǎn)漬圖。圖2C顯示圖2Β之吸漬圖之點(diǎn)密度分析。圖2D顯示競(jìng)爭(zhēng)者β-葡聚糖對(duì)于樹狀 細(xì)胞凝集素-1. Fc融合蛋白質(zhì)與固定于膜之GLPS F3之結(jié)合之點(diǎn)密度之影響。圖2Ε顯示 固定之GLPS F3與樹狀細(xì)胞凝集素-1 :Fc融合蛋白質(zhì)接觸，繼而于存在各種量之競(jìng)爭(zhēng)者多 醣體(β-葡聚糖、D-葡萄糖及D-半乳糖)下與綴合有HRP之山羊抗IgGl抗體一起培育 后之點(diǎn)漬圖。圖3顯示固定于膜之GLPS F3及GLPS F3C與27種不同的融合蛋白質(zhì)接觸后之點(diǎn) 漬之半定量分析，其中該等融合蛋白質(zhì)各包含所列之先天性免疫受體之細(xì)胞外區(qū)域且該細(xì)胞外區(qū)域與IgGl Fc偶合。圖4A顯示用圖3所列之27種融合蛋白質(zhì)檢測(cè)固定于膜之GLPS F3及GLPS F3C之點(diǎn)漬圖。圖4B顯示EDTA對(duì)于樹狀細(xì)胞凝集素-I(Dectin-I). Fe、DC-SIGNR. Fe、 KCR. Fc及TLT-2. Fc與固定于膜之GLPS F3之結(jié)合之影響。圖4C顯示用樹狀細(xì)胞凝集 素-1 (Dectin-I) · Fc、DC_SIGNR. Fe,KCR. Fc及TLT-2. Fc融合蛋白質(zhì)檢測(cè)固定于膜之β -葡 聚糖之點(diǎn)漬圖。圖5Α顯示用樹狀細(xì)胞凝集素-1. Fe、DC-SIGNR. Fe、KCR. Fc及TLT-2. Fc融合蛋白 質(zhì)檢測(cè)多醣體樣品之點(diǎn)漬圖。圖5Β顯示樣品編號(hào)之名稱及以半定量形式提供圖5Α之點(diǎn)密度。圖6Α顯示包覆在微量滴定平皿上之生物素化GLPS-F3之量，其系使用過(guò)氧化 酶-抗生物素蛋白綴合物檢定分析法測(cè)量及在OD 450nm讀數(shù)，以檢測(cè)黃色反應(yīng)產(chǎn)物。圖6B 系以圖之方式描述各種受體.Fc融合蛋白質(zhì)對(duì)固定于于微量平皿上之GLPS-F3之親和性。 各受體.Fc融合蛋白質(zhì)之絕對(duì)結(jié)合率記載在左側(cè)Y軸(以O(shè)D 450nm讀數(shù)表示)，以及右側(cè) Y軸記載與樹狀細(xì)胞凝集素-1. Fc之結(jié)合率相較下之相對(duì)結(jié)合率。圖7系以圖說(shuō)明在與為多醣體之甘露聚糖及β-葡聚糖，以及與為單醣之D-甘 露糖(Man)、D-葡萄糖(Glc)、N-乙酰基-葡萄糖胺(GlcNAc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙酰 基-半乳糖胺(GalNAc)、L-巖藻糖(Fuc)及唾液酸之競(jìng)爭(zhēng)性檢定分析中，各種受體.Fc融 合蛋白質(zhì)與GLPS-F3之結(jié)合百分率。圖8A系以圖說(shuō)明在與人類IgG陰性對(duì)照組相較下，受體.Fc融合蛋白質(zhì)與登革熱 病毒之結(jié)合率。圖8B顯示登革熱病毒與三種受體.Fc融合蛋白質(zhì)及人類IgG陰性對(duì)照組之 免疫復(fù)合物之西方轉(zhuǎn)漬圖，其中使用對(duì)抗登革熱病毒E蛋白質(zhì)之抗體檢測(cè)。圖8C以圖顯示 EDTA抑制登革熱病毒與DC-SIGN. Fc融合蛋白質(zhì)之結(jié)合，但不會(huì)抑制登革熱病毒與DVLR1. Fc融合蛋白質(zhì)之結(jié)合。圖8D顯示DVLR1. Fc融合蛋白質(zhì)與用PNGaseF、二硫蘇糖醇(DTT)、 熱或UV照射處理之登革熱病毒之結(jié)合率以及與未經(jīng)處理之登革熱病毒(non)之結(jié)合率。圖9A顯示DVLRl在各種免疫細(xì)胞類型中之表現(xiàn)，其藉由使用抗-DVLRl抗體之流 動(dòng)式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)量。DVLRl之表現(xiàn)被示出，其中DVLRl之圖形輪廓(如虛線所示)與抗體 同種型(isotype)對(duì)照組(陰影區(qū))不相符。圖9B顯示DC-SIGN在各種免疫細(xì)胞類型中 之表現(xiàn)，其藉由使用抗-DC-SIGN抗體之流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)測(cè)量。DC-SIGN之表現(xiàn)被示出，其中 DC-SIGN曲線(虛線)與抗體同種型對(duì)照組(陰影區(qū))不相符。圖IOA顯示在與活登革熱病毒或經(jīng)UV照射之登革熱病毒(UV-DV)接觸之⑶14+ 巨噬細(xì)胞中NS3蛋白質(zhì)表現(xiàn)之流式細(xì)胞計(jì)量分析(其中使用抗-NS3抗體)結(jié)果，并與匹配 之抗體同種型對(duì)照組(陰影區(qū))比較。圖IOB圖示在以不同感染重復(fù)數(shù)(multiplicities of infection, MOI)之登革熱病毒感染之⑶14+巨噬細(xì)胞中或以經(jīng)UV照射之登革熱病毒 感染之CD14+巨噬細(xì)胞中，細(xì)胞外登革熱病毒滴度之經(jīng)時(shí)變化。圖IOC系說(shuō)明在以不同感 染重復(fù)數(shù)(MOI)登革熱病毒感染之⑶14+巨噬細(xì)胞中全部DAP12及磷酰化DAP12之免疫轉(zhuǎn) 漬圖。圖IOD系說(shuō)明用活登革熱病毒或經(jīng)UV照射之登革熱病毒以MOI = 5感染后，于不同 時(shí)間在該等經(jīng)登革熱病毒感染之CD14+巨噬細(xì)胞中所有DAP12及磷酰化DAP12之免疫轉(zhuǎn)漬 圖。圖11系例示說(shuō)明用活登革熱病毒感染之前，藉由電穿孔導(dǎo)入pLL3. 7載體(對(duì)照組)或DVLRl-shRNA之⑶14+巨噬細(xì)胞中，所有DAP12及磷酰化DAP12之免疫轉(zhuǎn)漬圖。圖12A顯示用活登革熱病毒或經(jīng)UV照射之登革熱病毒以指定之MOI感染⑶14+ 巨噬細(xì)胞后6小時(shí)，TNF-α之分泌。圖12Β顯示用活登革熱病毒或經(jīng)UV照射之登革熱病 毒以指定之MOI感染⑶14+巨噬細(xì)胞后12小時(shí)，TNF-α之分泌。圖12C顯示⑶14+巨噬 細(xì)胞感染后TNF-α分泌隨時(shí)程之測(cè)量值。圖 13Α 顯示在 DC-SIGN-shRNA 或 DVLRl-shRNA、或者載體對(duì)照組(pWTSI 及 pLL3. 7) 轉(zhuǎn)染之⑶14+巨噬細(xì)胞中，藉由西方轉(zhuǎn)漬測(cè)得之DC-SIGN及DVLRl之表現(xiàn)。圖1 顯示在 用登革熱病毒染之前，藉由電穿孔導(dǎo)入DC-SIGN-shRNA、DVLRl-shRNA、或者pLL3. 7載體對(duì) 照組之⑶14+巨噬細(xì)胞中，NS3表現(xiàn)之流動(dòng)式細(xì)胞計(jì)量分析(使用抗-NS3抗體)。陰影區(qū) 為NS3抗體之同種型對(duì)照組。圖13C系例示說(shuō)明在用登革熱病毒感染之前(t = 0)，藉由電 穿孔導(dǎo)入DC-SIGN-shRNA、DVLRl-shRNA或載體對(duì)照組之CD14+巨噬細(xì)胞之上清液中病毒滴 度之時(shí)程分析。圖14A顯示用登革熱病毒感染之前(t = 0)，藉由電穿孔導(dǎo)入DC-SIGN-shRNA、 DVLRl-shRNA或載體對(duì)照組之⑶14+巨噬細(xì)胞中各種細(xì)胞激素之之分泌之時(shí)程分析。圖14B 顯示于相同條件下細(xì)胞激素IFN-α之時(shí)程分析。圖15顯示由感染有登革熱病毒且用對(duì)抗DVLRl之指定單株抗體以指定濃度治療 之⑶14+巨噬細(xì)胞分泌入培養(yǎng)上清液中之TNF- α之ELISA測(cè)量值。圖16a圖式說(shuō)明各種受體.Fc融合蛋白對(duì)于登革熱病毒之結(jié)合。圖16b顯示登革 熱病毒與三種受體.Fc融合蛋白及一種人類IgG陰性控制組之免疫復(fù)合物的西方轉(zhuǎn)漬，以 對(duì)抗登革熱病毒E蛋白之抗體探測(cè)。圖16c圖標(biāo)由EDTA可抑制登革熱病毒對(duì)DC-SIGN. Fc 融合蛋白之結(jié)合，但不會(huì)抑制對(duì)于DLVR1/CLEC5A融合蛋白之結(jié)合。圖16d顯示藉由添加 DC-SIGN. Fc及DLVR1/CLEC5A融合蛋白而產(chǎn)生登革熱病毒對(duì)人類細(xì)胞結(jié)合之增加。16e 圖示各種糖之添加可抑制登革熱病毒對(duì)DC-SIGN. Fc融合蛋白之結(jié)合。16f圖標(biāo)PNGaseF對(duì) 于登革熱病毒對(duì)DLVR1/CLEC5A融合蛋白之結(jié)合的效應(yīng)。圖17a說(shuō)明DC-SIGN在人類PBMCs中之表現(xiàn)模式。圖17b說(shuō)明DVLR1/CLEC5A在 人類PBMCs中之表現(xiàn)模式。圖Ife顯示免疫轉(zhuǎn)漬，其說(shuō)明使用針對(duì)磷酰酪胺酸及DAP12之抗體，測(cè)定人類巨噬 細(xì)胞中之登革熱病毒誘導(dǎo)之DAP12磷酰化Qh p. i.)。圖18b顯示免疫轉(zhuǎn)漬，其說(shuō)明由登革 熱病毒及經(jīng)UV-失活之登革熱病毒誘導(dǎo)之DAP12磷酰化的動(dòng)力學(xué)。圖18c顯示免疫轉(zhuǎn)漬， 其說(shuō)明shRNAs使DVLR1/CLEC5A及DC-SIGN. Fc融合蛋白之表現(xiàn)下降(knock down)以及抑 制登革熱病毒(m. ο. i. = 5)-媒介之DAP12磷酰化的能力。圖18d顯示shRNAs對(duì)于巨噬 細(xì)胞中之登革熱病毒進(jìn)入及復(fù)制的效應(yīng)。圖18e顯示抗-DVLR1/CLEC5A mAb、抗-DC-SIGN mAb、及小鼠IgG對(duì)于非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)NS3表現(xiàn)的效應(yīng)。圖18f圖示說(shuō)明shRNAs對(duì)于經(jīng)感染 巨噬細(xì)胞之登革熱病毒滴度的效應(yīng)之時(shí)程檢定分析。圖19a圖標(biāo)說(shuō)明巨噬細(xì)胞之登革熱病毒及經(jīng)UV失活之登革熱病毒誘導(dǎo)性TNF-α 分泌的劑量-相關(guān)性。圖19b說(shuō)明登革熱病毒感染(m. ο. i. = 5)后之TNF-α表現(xiàn)的動(dòng) 力學(xué)。圖 19 圖示說(shuō)明 DVLR1/CLEC5A 及 DC-SIGNshRNA 對(duì)于 TNF- α、IL-6、MIPl-α、IL-8、 IP-IO及INF-α自經(jīng)登革熱病毒感染(m. o. i. = 5)之巨噬細(xì)胞分泌的效應(yīng)。在圖19d圖 示說(shuō)明以特異性shRNA對(duì)于登革熱病毒誘導(dǎo)性TNF-α及INF-α分泌之各種分泌途徑所進(jìn)行之下降(knock down)實(shí)驗(yàn)效應(yīng)。圖19e圖示說(shuō)明拮抗性抗_DVLRl/CLEC5AmAbs可抑制 反應(yīng)登革熱病毒血清型1-4之TNF- α分泌。使用Μ. R. mAb (抗-甘露糖受體mAb，mlgGl) 及小鼠IgM(mlgM)作為陰性控制組。圖20a說(shuō)明經(jīng)登革熱病毒、登革熱病毒/抗-E、及登革熱病毒/抗-prM免疫復(fù)合 物感染之巨噬細(xì)胞的NS3表現(xiàn)。圖20b說(shuō)明經(jīng)DV2感染之巨噬細(xì)胞的TNF- α及INF- α分 泌量。圖20c說(shuō)明經(jīng)抗-prM/登革熱病毒及抗-E/登革熱病毒免疫復(fù)合物感染之巨噬細(xì)胞 的TNF-α及INF-α分泌量。圖21a圖示說(shuō)明HMEC-I單層之通透性以及上清液中之TNF-α含量的時(shí)程分析。 圖21b圖示說(shuō)明TNFR2. Fc及抗-DVLR1/CLEC5A對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞單層通透化的抑制作用。圖2 圖標(biāo)說(shuō)明登革熱病毒與人類及小鼠DVLR1/CLEC5A. Fc融合蛋白的結(jié)合親和 力。圖22b顯示mDVLRl/CLEC5A在小鼠脾細(xì)胞中之表現(xiàn)。圖22c顯示mDVLRl/CLEC5A在小 鼠骨髓(BM)-衍生性巨噬細(xì)胞及小鼠似巨噬細(xì)胞RaW64. 7細(xì)胞系中之表現(xiàn)。圖23a圖標(biāo)說(shuō)明由登革熱病毒與小鼠巨噬細(xì)胞細(xì)胞系RaW64. 7及穩(wěn)定表現(xiàn)人類 DC-SIGN之RaW64. 7細(xì)胞之結(jié)合所產(chǎn)生之TNF- α釋出比較。圖23b圖示說(shuō)明在mAb之存 在下使穩(wěn)定表現(xiàn)人類DC-SIGN之RaW64. 7細(xì)胞與DV2共同進(jìn)行培育所產(chǎn)生之TNF- α分泌。 圖23c圖示說(shuō)明抗-DVLR1/CLEC5A mAbs (3D2H6及10D7H;3)可以劑量-相關(guān)性之方式抑制 DV2-誘導(dǎo)之TNF-α釋出。圖 M 說(shuō)明經(jīng) DV2/PL046 或 DV2/NGC-N 系挑戰(zhàn)之 STATl+ 小鼠的 Kaplan-Meier 存 活曲線。圖2 說(shuō)明對(duì)抗小鼠DVLR1/CLEC5A培育之mAb 3D2H6及10D7H3對(duì)于經(jīng)登革熱 病毒挑戰(zhàn)之STAT1+小鼠的皮下及腸道出血之效應(yīng)。圖2 說(shuō)明對(duì)抗DVLRl/CLEC5A之 mAb(3D2H6及10D7H3)對(duì)于經(jīng)登革熱病毒挑戰(zhàn)之STATl+小鼠的血漿滲漏進(jìn)入生命器官之 效應(yīng)。圖25c圖示說(shuō)明借著自器官萃取Evans藍(lán)顯示之生命器官血管通透性。圖25d說(shuō)明 于有及無(wú)抗-DVLR1/CLEC5A mAbs或TNFR2. Fc存在下，經(jīng)登革熱病毒挑戰(zhàn)之STATl+小鼠 之TNF-α及IP-10之血清含量以及病毒滴度。圖25e圖示說(shuō)明在拮抗性抗-小鼠DVLRl/ CLEC5A mAbs或TNFR2. Fc存在下，經(jīng)DV2挑戰(zhàn)之STATl缺陷小鼠的存活。圖沈說(shuō)明DVLR1/CLEC5A涉及JEV媒介之DAP12磷酸化作用及自人類巨噬細(xì)胞之 TNF- α分泌。在圖26a中，分別以ELISA測(cè)定DVLR1/CLEC5A (1 μ g)與JEV及登革熱病毒 (DV) (5 X IO6PFU)之交互作用。DV與人類DVLR1/CLEC5A (長(zhǎng)度188氨基酸)具交互作用，但 與可變剪接形式sDVLRl/CLEC5A(aa 43-65缺失)則否。相對(duì)的，JEV僅與sDVLRl/CLEC5A具 交互作用，但與全長(zhǎng)DVLR1/CLEC5A則否。在圖26b中，登革熱病毒可在人類巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo) DAP12磷酸化作用(在p. i.)。以抗-DAP12mAb沈淀經(jīng)DV感染之巨噬細(xì)胞中的DAP12， 在SDS-PAGE分離后將其轉(zhuǎn)漬至硝基纖維素膜上，接著再與對(duì)抗磷酰酪胺酸及DAP12之抗體 分別進(jìn)行培育。JEV誘導(dǎo)之DAP12磷酸化作用(m. o. i. =5)由pLL3. 7/DVLR1/CLEC5A抑 制。在圖^c中，其顯示人類巨噬細(xì)胞反應(yīng)JEV感染之TNF-α分泌的動(dòng)力學(xué)(左)。JEV 誘導(dǎo)之TNF-α分泌由pLL3. 7/DVLR1/CLEC5A mAb抑制(右)。數(shù)據(jù)系以三次獨(dú)立試驗(yàn)之平 均值士 s. d.表示。
具體實(shí)施例方式在下列本發(fā)明具體例之詳述中，其參照附呈之圖式閱讀時(shí)更為明了，其中類似之 參照數(shù)目代表類似之組件，且其中系以說(shuō)明方式顯示可實(shí)施本發(fā)明之特定具體例。此等具 體例系以足夠之細(xì)節(jié)進(jìn)行敘述，以使所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可據(jù)以實(shí)施本發(fā)明，且需明 了者，可使用其它具體例，且可在不偏離本發(fā)明范圍之情形下進(jìn)行邏輯、機(jī)械、生物、電學(xué)、 功能、及其它之改變。下文之詳述因此不應(yīng)被視為任何限制，而本發(fā)明之范圍僅由附呈之申 請(qǐng)專利范圍定義。在本文中，「或」一辭應(yīng)可被理解為定義一種論理上之選言，且不應(yīng)被視 為一種排他性選言，除非其被標(biāo)示為「或不」(xor) —辭。在一具體例中，本發(fā)明提供一種融合蛋白質(zhì)，其包含先天性免疫受體之碳水化合 物識(shí)別區(qū)域及異源多肽。先天性免疫受體意指1)由白血球受體復(fù)合物(LRC)中之基因及人類染色體19上之LRC-相關(guān)基因所編 碼之受體，其包括，但不限于CD66家族(CEACAM1及PSG1)、SIGLEC家族、NGK7、FCGRT、ILT/ LILRA/LILRB(CD8Q 家族、LAIR 家族、KIR(CD158)家族(包括 KIR2DL 亞家族、KIR2DS 亞家 族及 KIR3DL 亞家族)、FCAR (CD89)、NKp46 (NCRl)及 GPVI (GP6)；以及2)由在人類染色體12上之天然殺手受體復(fù)合物(NKC)中之基因所編碼之受體， 其包括，但非限于，MAFA-L (KLRGl)、A2M、NKR-PlA (KLRBl)、LLtl (CLEC2D)、CD69 (CLEC2C)、 KLRFl、AICL (CLEC2B)、CLEC-2 (CLECFS2)、Lox-I (OLRl)、CD94 (KLRDl)、NKG2-D (KLRKl)、 NKG2-F(KLRC4),NKG2-E(KLRC3)、NKG2_C(KLRC2)、NKG2_A(KLRCl) ,Ly49L(KLRAl)及 PRB3 ；以及3)所有人類及小鼠C-型凝集素(CLEC)家族基因、所有人類之類唾液酸結(jié)合性 Ig(SIGLEC)基因、所有人類之在骨髓細(xì)胞上表現(xiàn)之激發(fā)受體(TREM)基因、所有人類之類 TREM(TREML/TLT)基因、所有人類之類鐸受體(TLI )基因以及所有在人類染色體發(fā)現(xiàn)之人 類之類Fc受體(包括FCRLl至FCLR6，亦包括FCLRMl及FCLR1C)基因。使用人類基因組組織(Human Genome Organization, HUGO)搜索引擎網(wǎng)站可以查 到能應(yīng)用于本發(fā)明方法中之此等分類中的其它基因。亦可參考Immunological Reviews 2001Vol. 181 :20-38中之基因座說(shuō)明，該文全文以參考數(shù)據(jù)方式納入本文。來(lái)自非人類物種之任何上述基因之直系同源物(orthologues)亦可用于本發(fā)明 之方法中。可被考慮用于本發(fā)明之C-型凝集素基因包括，但不限于，下列人類基因ASGR1、 ASGR2 (CLEC4H2)、CD207 (CLEC4K/ 郎罕細(xì)胞特異性蛋白)、CD209 (DC-SIGN/CLEC4L)、 CD302 (CLEC13A)、CLECIA、CLEClB(CLEC-2)、CLEC2A、CLEC2B、CD69、CLEC2D、CLEC2L、CLEC3A、 CLEC3B、CLEC30、CLEC3Q、CLEC4A、CLEC4C、CLEC4D(CLEC-6)、CLEC4E、CLEC4F(KCLR)、CLEC4G、 CLEC4M(DC-SIGNR)、CD209、DLVR1/CLEC5A、CLEC6A(樹狀細(xì)胞凝集素-2)、CLEC7A(樹狀 細(xì)胞凝集素-1)、CLEC9A、CLEClOA, CLECl 1A、CLEC12A、CLEC14A、FCER2、KLRBl、KLRFl、 LY75 (DEC205)、MRCl、MRClLl、MRC2 (Endo 180)、OLRl、PLA2R1、DCALl 及 COLECIO0 此等 基因之任一者之同源物(homologues)亦在考慮之列，來(lái)自其它種動(dòng)物諸如小鼠(mice) 及大鼠(rats)之直系同源物(orthologues)亦同。同源物(homologues)及直系同源 物(orthologues)與列舉之C-型凝集素(lectin)基因之任一者之相同性可為50 %、 70%,80%,80. 6%,83%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%, 99. 1%,99. 2%,99. 3%,99. 4%,99. 5%,99. 6%,99. 7%,99. 8%或 99. 9% 被特別考慮之直系同源物為小鼠中之庫(kù)佛氏(Kupffer)細(xì)胞受體(mKCR)基因(與人類CLEC4F同源)。被考慮用于本發(fā)明之TREM基因及TREML基因包括，但非限于，下列人類基因 類⑶300抗原家族成員B(⑶300LB)、類⑶300抗原家族成員G(⑶300LG)、TREMU TREM2、 TREMLl (TLTl)、TREML2 (TLT2)、TREML3 (TLT3)及 TREML4 (TLT4)。此等基因之任一者之同源 物亦在考慮之列，來(lái)自其它種動(dòng)物諸如小鼠及大鼠之直系同源物亦同。同源及直系同源物 與此等列舉之TLR基因之任一者之相同性可為50%、70%、80%、80. 6%、83%、85%、90%、 91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 1 %,99. 2 %,99. 3 %,99. 4
99. 5 %,99. 6 %,99. 7 %,99. 8 %或99. 9 %。被特別考慮之直系同源物包括來(lái)自小鼠之 mTREMl、mTREM2、mTLTl 及 mTLT4。被考慮用于本發(fā)明之TLR基因包括，但不限于，下列人類基因TLR1、TLR2、TLR3、 TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLRlU TLR12 及 TLR13。此等基因之任一者 之同源物亦在考慮之列，來(lái)自其它種動(dòng)物諸如小鼠及大鼠之直系同源物亦同。同源物及 直系同源物與所列舉之TLR基因之任一者之相同性可為50%、70%、80%、80.6%、83%、 85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 1 % ,99. 2 % ,99. 3 %, 99. 4%,99. 5%,99. 6%,99. 7%,99. 8%或 99. 9%。被考慮用于本發(fā)明之SIGLEC基因包括，但不限于，下列人類基因⑶22、⑶33、髓 鞘相關(guān)醣蛋白(MAG)、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC7、SIGLEC8、SIGLEC9、SIGLEC10、SIGLEC11、 SIGLEC12、SIGLEC13及唾液酸黏附素(SN)。此等基因之任一者之同源物亦在考慮之列，來(lái) 自其它種動(dòng)物諸如小鼠及大鼠之直系同源物亦同。同源物及直系同源物與所列舉之SIGLEC 基因之任一者之相同性可為 50%,70%,80%,80. 6%,83%,85%,90%,91%,92%,93%, 94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 1 %,99. 2 %,99. 3 %,99. 4 %,99. 5 %,99. 6
99. 7%,99. 8%或 99. 9% 適用于本發(fā)明之其它先天性免疫受體包括在下述實(shí)施例中所記載者。融合蛋白質(zhì)可包含先天性免疫受體之整個(gè)細(xì)胞外區(qū)域，該細(xì)胞外區(qū)域包括碳水化 合物識(shí)別區(qū)域；或者融合蛋白質(zhì)可包含該細(xì)胞外區(qū)域之一部分，包括碳水化合物識(shí)別區(qū)域； 或者融合蛋白質(zhì)可僅包含碳水化合物識(shí)別區(qū)域。異源多肽可包含能與先天性免疫受體之碳水化合物識(shí)別區(qū)域融合，以致該異源多 肽在活體內(nèi)或試管中皆不會(huì)干擾碳水化合物區(qū)域與其同系(cognate)特異性碳水化合物 之結(jié)合之任何多肽。異源多肽較佳為免疫球蛋白，諸如人類IgGl、IgGh、IgG2b、IgG3、IgG4、 IgM、IgE、IgD、IgAa&IgA2或者來(lái)自其它種動(dòng)物之免疫球蛋白。較佳以免疫球蛋白之片段， 例如IgG之Fc片段，做為異源多肽。在較佳之具體例中，該異源多肽為不會(huì)與人類Fc受體 結(jié)合之免疫球蛋白變型。該等變型在本技術(shù)中已為熟知。舉例言之，可使用包含下列突變 之人類 IgGl Fc 變型L234A、L235E, G237A 及 P331S。該異源多肽尚可包含一個(gè)或一個(gè)以上允許融合多肽固定在固體支撐物上或從復(fù) 合物混合物中純化之功能區(qū)域。舉例言之，該異源多肽可包含His6tag以允許融合蛋白質(zhì) 依照本技術(shù)中所熟知之方法附接在Ni-NTA固體支撐物上。再舉例言之，該異源多肽可包含 麩胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase)區(qū)域，以致生成之融合蛋白質(zhì)可吸附 在，例如，麩胱甘肽珠粒或由麩胱甘肽衍生之微量滴定平皿中。該異源多肽亦可包含一分子或一分子以上之生物素或生物素衍生物。以此方式，融合蛋白質(zhì)可固定在綴合有鏈霉抗生物素蛋白之固體支撐物上，或者可使綴合有鏈霉抗生 物素蛋白之酶與融合蛋白質(zhì)結(jié)合。 融合蛋白質(zhì)視需要在異源多肽與先天性免疫受體之碳水化合物識(shí)別區(qū)域之間復(fù) 可包含連結(jié)子(linker)。該連結(jié)子可為肽類連結(jié)子，或者其可為非肽類連結(jié)子，諸如聚乙二在融合蛋白質(zhì)中，碳水化合物識(shí)別區(qū)域可為相對(duì)于異源多肽之C-端或者可為相 對(duì)于異源多肽之N-端。本發(fā)明之融合蛋白質(zhì)可藉由蛋白質(zhì)制造技術(shù)中已知之任何方法制備。融合蛋白 質(zhì)較佳使用本技術(shù)熟知之重組DNA技術(shù)及蛋白質(zhì)表現(xiàn)技術(shù)制備。舉例言之，編碼先天性免 疫受體之碳水化合物識(shí)別區(qū)域之DNA，可藉由使用對(duì)該特定目標(biāo)先天性免疫受體之碳水化 合物識(shí)別區(qū)域具特異性之引物進(jìn)行mRNA之反錄酶PCR(RT-PCR)而制備。然后可將生成之 DNA，連同編碼異源多肽序列之DNA，以可譯讀之方式選殖入表現(xiàn)載體中。本發(fā)明所使用之表 現(xiàn)載體典型地含有復(fù)制源、位于5’端(即其上游)之啟動(dòng)子、并接續(xù)編碼融合蛋白質(zhì)之DNA 序列、轉(zhuǎn)錄終止序列及剩余之載體。該等表現(xiàn)載體亦可包括本技術(shù)已知之其它DNA序列，例 如提供表現(xiàn)產(chǎn)物安定性之安定性前導(dǎo)序列、提供表現(xiàn)產(chǎn)物之分泌之分泌前導(dǎo)序列以及允許 調(diào)節(jié)或誘發(fā)融合蛋白質(zhì)表現(xiàn)之序列。表現(xiàn)載體亦可含有允許使用病毒表現(xiàn)系統(tǒng)，諸如本技 術(shù)熟知之桿狀病毒(baculovirus)表現(xiàn)系統(tǒng)，來(lái)表現(xiàn)融合蛋白質(zhì)之病毒序列。可將表現(xiàn)載 體引進(jìn)宿主細(xì)胞，諸如微生物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。可將表現(xiàn)載體以 裸DNA之形式引進(jìn)細(xì)胞中，或者其可被包封在病毒(諸如桿狀病毒)中。可將表現(xiàn)載體保 持在宿主細(xì)胞內(nèi)，或者將表現(xiàn)載體整合入宿主細(xì)胞基因組中。表現(xiàn)載體較佳包含能使分泌前導(dǎo)序列加至融合蛋白質(zhì)上之DNA序列，藉此使得融 合蛋白質(zhì)分泌至環(huán)繞宿主細(xì)胞之培養(yǎng)基中。然后可用本技術(shù)已知之技術(shù)將融合蛋白質(zhì)從培 養(yǎng)基中純化。舉例言之，若融合蛋白質(zhì)包含IgG以做為異源多肽，則蛋白質(zhì)A管柱可用于結(jié) 合融合蛋白質(zhì)，以允許融合蛋白質(zhì)與周圍培養(yǎng)基中之其它蛋白質(zhì)分離。融合蛋白質(zhì)亦可藉由使用試管內(nèi)表現(xiàn)系統(tǒng)諸如爪蟾卵母細(xì)胞表現(xiàn)系統(tǒng)，在試管中 轉(zhuǎn)譯編碼融合蛋白質(zhì)之mRNA而制造。在一具體例中，融合蛋白質(zhì)系分開制造，然后使用本技術(shù)已知之化學(xué)技術(shù)將該等 偶合在一起。舉例言之，可將碳水化合物識(shí)別區(qū)域及異源多肽分開制造，然后藉由使用戊二 醛而將彼此偶合。制造融合蛋白質(zhì)之后，融合蛋白質(zhì)可用可檢測(cè)之標(biāo)記諸如熒光物質(zhì)、放射線標(biāo)記、 酶、酶受質(zhì)、染劑、化學(xué)發(fā)光劑、磁珠、量子點(diǎn)或其它任何能直接或間接產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)之部 分予以標(biāo)幟。本技術(shù)已知許多使此等可檢測(cè)標(biāo)記與蛋白質(zhì)綴合之方法。舉例言之，可將經(jīng) N-羥基琥珀酰亞胺活化之染料，最佳為經(jīng)N-羥基琥珀酰亞胺活化之熒光物質(zhì)，藉由與融合 蛋白質(zhì)上之一級(jí)胺反應(yīng)而與融合蛋白質(zhì)綴合。在一些具體例中，使用本技術(shù)已知之方法將融合蛋白質(zhì)生物素化，以致該融合蛋 白質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)生物素分子，或者一個(gè)或多個(gè)生物素衍生物分子。藉此方式，該融合蛋 白質(zhì)可附接于鏈霉抗生物素蛋白可檢測(cè)部分綴合物，諸如酶-鏈霉抗生物素蛋白綴合物。在一系列之具體例中，本發(fā)明之融合蛋白質(zhì)可被用于測(cè)定在包含多醣體之組合物 中是否存在特異性碳水化合物成分。該方法涉及使多醣體與能和多醣體之特異性碳水化合物成分結(jié)合之融合蛋白質(zhì)接觸，然后測(cè)定融合蛋白質(zhì)是否與組合物中之多醣體結(jié)合。舉例 言之，已知CLEC7A (亦稱為樹狀細(xì)胞凝集素-1)之碳水化合物識(shí)別區(qū)域可與β-1，3- -葡 聚糖交互作用(參見 Brown，G. D. and Gordon, S.，2001，Nature 413，36-7，該文獻(xiàn)全文以 參考數(shù)據(jù)方式納入本文)。所以包含CLEC7A之碳水化合物識(shí)別區(qū)域之融合蛋白質(zhì)結(jié)合至 多醣體組合物表示該多醣體組合物包含β-1，3-D-葡聚糖。同樣地，既然嚿齒動(dòng)物之庫(kù)佛 氏(Kupffer)細(xì)胞受體(KCR ；與人類CLEC4F同源)對(duì)于D-半乳糖及N-乙酰基半乳糖胺 具有高親和性，并能從血清中清除以D-半乳糖及D-巖藻糖為終端之醣蛋白(參見i^adden， A.J.，Holt, O.J. and Drickamer，K. (2003) ；Glycobiology 13，529-37，該文獻(xiàn)全文以參考 數(shù)據(jù)方式納入本文)，包含KCR之碳水化合物識(shí)別區(qū)域之融合蛋白質(zhì)結(jié)合至多醣體組合物 表示該多醣體組合物包含D-半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺或以D-半乳糖為終端之醣蛋白 或以D-巖藻糖為終端之醣蛋白。此外，CD209(亦稱為DC-SIGN及CLEC4L)以及CLEC4M (亦 稱為DC-SIGNR及L-SIGN)皆可結(jié)合至Man9GlcNAc2Asn醣肽，但只有CD209可結(jié)合至具有 終端巖藻糖殘基之聚糖，而CLEC4M則否(參見Guo et al (2004)Nat Struct Mol BiollU 591-8)；所以CD209及CLEC4M之融合蛋白質(zhì)可區(qū)分包含此等碳水化合物成分之多醣體組合 物。所以本發(fā)明之方法及試劑可用于鑒定多醣體組合物之碳水化合物成分以及此等碳水化 合物成分之相對(duì)量，例如，以「指紋辨識(shí)(fingerprint)」多醣體組合物之獨(dú)特細(xì)微特征。舉 例言之，本發(fā)明之方法及試劑可用于測(cè)定具有免疫調(diào)節(jié)活性之多醣體組合物之碳水化合物 成分。此外，若已知表現(xiàn)融合蛋白質(zhì)之碳水化合物識(shí)別區(qū)域所來(lái)自之先天性免疫受體之 細(xì)胞為何種類別，則本發(fā)明之檢定分析(assay)將能顯示在身體內(nèi)與所探討之多醣體結(jié)合 之細(xì)胞之類別。該知識(shí)，例如，有助于揭示特定多醣體組合物(諸如單離自靈芝之多醣體) 對(duì)于與該多醣體接觸之生物施予有利或有害作用之機(jī)制。在該具體例中，非必須知道該碳 水化合物識(shí)別區(qū)域所結(jié)合之碳水化合物成分之類別。本發(fā)明之融合蛋白質(zhì)與其同系(cognate)碳水化合物成分之結(jié)合，可藉由將包含 多醣體之組合物固定于固體支撐物，然后使該固體支撐物與融合蛋白質(zhì)接觸而進(jìn)行。融合 蛋白質(zhì)之結(jié)合可藉由檢測(cè)在固體支撐物之表面是否存在融合蛋白質(zhì)，例如，藉由檢測(cè)固體 支撐物之表面是否存在異源多肽或檢測(cè)固體支撐物之表面是否存在碳水化合物識(shí)別區(qū)域 而檢測(cè)。例如，若異源多肽與熒光物質(zhì)綴合，則沖洗后固體支撐物之表面存在熒光物質(zhì)表示 融合蛋白質(zhì)存在，其最終表示存在包含由融合蛋白質(zhì)之碳水化合物識(shí)別區(qū)域所識(shí)別之特異 性碳水化合物成分之多醣體。在本文中，「固體支撐物」被界定為分子可經(jīng)由共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵附接之任何表 面。該固體支撐物包括，但不限于，膜(例如，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)、塑料(例如微量滴 定平皿)、順磁珠(paramagnetic beads)、帶電紙、尼龍、Langmuir-Bodgett薄膜、官能化玻 璃、鍺、硅、PTFE、聚苯乙烯、砷化鎵、金及銀。在本技術(shù)中任何已知之在表面能納入胺基、羧 基、硫醇基或羥基之其它材料亦可列入考慮。此包括具有任何拓樸結(jié)構(gòu)之表面，該拓樸結(jié)構(gòu) 包括，但不限于，球表面、有溝槽表面及圓柱形表面，例如管柱。包含多醣體之組合物(在本文中亦稱為多醣體組合物)可非限定地為包括多醣體 之任何組合物，該多醣體包括，例如，醣蛋白(包括蛋白多醣(proteoglycan))、醣脂質(zhì)、肽 醣(peptidoglycan)、微生物細(xì)胞壁、病毒粒子及真菌細(xì)胞壁。在其它具體例中，包含多醣體之組合物為在溶液中之游離多醣體，例如未附接于蛋白質(zhì)或脂質(zhì)之多醣體。在本文中，「多 醣體」意指包含2個(gè)或2個(gè)以上單醣之碳水化合物分子。包含多醣體之組合物在固體支撐物上之固定化例如可藉由將組合物中之多醣體 生物素化，然后將其固定在綴合有鏈霉抗生物素蛋白之固體支撐物上而達(dá)成。此外，可將多 醣體固定在，例如，經(jīng)甲醇活化之PVDF膜上。尤被列入考慮者為以「轉(zhuǎn)漬」之方式進(jìn)行本發(fā) 明之方法，其中使用固定在PVDF膜上之多醣體點(diǎn)。在一些具體例中，融合蛋白質(zhì)與固定之多醣體之結(jié)合可藉由下法檢測(cè)使第二試 劑(secondary reagent)結(jié)合至融合蛋白質(zhì)，較佳結(jié)合至異源多肽，繼而檢測(cè)第二試劑之存 在。舉例言之，可將生物素化融合蛋白質(zhì)附接于綴合有鏈霉抗生物素蛋白之酶，并藉由加入 能得到可檢測(cè)產(chǎn)物之受質(zhì)來(lái)檢測(cè)酶之存在。未生物素化之融合蛋白質(zhì)可用例如可結(jié)合至異 源多肽之抗體(若異源多肽為IgG或IgG Fe，則抗體為諸如抗-IgG抗體)而檢測(cè)，其中二 次抗體與酶綴合。舉例言之，若酶為辣根過(guò)氧化酶(HRP)，則融合蛋白質(zhì)結(jié)合之檢測(cè)可用本 技術(shù)已知之加強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)技術(shù)進(jìn)行。可將第二試劑復(fù)綴合至或改為綴合至可檢測(cè)標(biāo) 記，諸如熒光物質(zhì)或放射性核。在本技術(shù)中尚知道許多可用于檢測(cè)所揭示之融合蛋白質(zhì)與 固體支撐物之結(jié)合之其它技術(shù)。尤被考慮者為上述檢定分析可以多任務(wù)化數(shù)組模式進(jìn)行。例如固體支撐物可被分 隔成復(fù)數(shù)個(gè)空間上分離之地址，在該等地址上可結(jié)合有多個(gè)不同的組合物。然后將該固體 支撐物與融合蛋白質(zhì)接觸并檢測(cè)該融合蛋白質(zhì)之結(jié)合。以此方式可以測(cè)定被固定之多醣體 組合物中何者(若有)包含可與融合蛋白質(zhì)之碳水化合物識(shí)別區(qū)域結(jié)合之特異性碳水化合 物成分。在另一具體例中，單一組合物被固定在固體支撐物上，該固體支撐物被分隔成復(fù) 數(shù)個(gè)在空間上分離之地址。各地址然后與不同的融合蛋白質(zhì)接觸，各不同的融合蛋白質(zhì)包 含不同的碳水化合物識(shí)別區(qū)域。沖洗以移除非特異性結(jié)合之材料后，然后可如上述檢測(cè)融 合蛋白質(zhì)之結(jié)合檢測(cè)到之各結(jié)合反應(yīng)之空間地址揭示所結(jié)合之融合蛋白質(zhì)之類別。以此 方式，可同時(shí)使用許多不同的融合蛋白質(zhì)檢測(cè)組合物。在該具體例中，各融合蛋白質(zhì)可包含 相同的異源多肽，藉此允許使用單一第二試劑同時(shí)檢測(cè)在各地址之結(jié)合。例如，若各融合蛋 白質(zhì)包含IgG Fc以做為異源多肽，則可使用抗-IgG抗體或蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G檢測(cè)融合 蛋白質(zhì)之結(jié)合。本發(fā)明之融合蛋白質(zhì)及方法可用于「指紋辨識(shí)(fingerprint)」任何包含多醣 體之組合物之獨(dú)特細(xì)微特征，該等組合物包括，但不限于得自草藥制劑之多醣體組合物， 諸如單離自真菌靈芝(Ganoderma lucidim)、冬蟲夏草(Cordyc^ps sinensis)及蘑菇 (Lentinus edodes)以及得自植物霍山石斛(Dendrobium huoshanense)之含多醣體部 分。特定而言，尤被考慮者為使用本文所述之方法測(cè)定靈芝多醣體之F3多醣體部分之碳水 化合物成分(參見 Wang，et al (2002) Bioorg Med Chem 10,1057-62 ；Chen, et al (2004) Bioorg Med Chem 12，5595-601 ；Chien, et al (2004) Bioorg Med Chem 12，5603-9.；以及 Hsu et al(2004)J Immunol 173，5989-99，各文獻(xiàn)全文以參考數(shù)據(jù)方式納入本文)。本文提供之方法可被用于指紋辨識(shí)復(fù)合物混合物之獨(dú)特細(xì)微特征，該復(fù)合物混合 物包括許多不同的多醣體組合物，或者可用于只含單一多醣體種類，例如單一醣蛋白或單 一多醣體之制劑。
若已知表現(xiàn)碳水化合物識(shí)別區(qū)域所來(lái)自之先天性免疫受體之細(xì)胞之類別，則上述 檢定分析將可揭示當(dāng)將多醣體組合物引進(jìn)體內(nèi)時(shí)，體內(nèi)會(huì)與多醣體結(jié)合之細(xì)胞。然后亦可 能得到調(diào)節(jié)所鑒定之先天性免疫受體之活性之藥劑。例如，若先天性免疫受體與多醣體之 交互作用在體內(nèi)造成有益之作用，則可以制造擬似該多醣體之結(jié)構(gòu)或加強(qiáng)該多醣體與該先 天性免疫受體間之交互作用之藥劑。參見下文以「調(diào)節(jié)劑」為標(biāo)題之段落。在另一系列具體例中，本發(fā)明之方法及融合蛋白質(zhì)被用于測(cè)定在病原體表面展示 之多醣體之類別(identity)，該等病原體諸如真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞或病毒(諸如具套膜病 毒；且病毒亦非限定性地包括來(lái)自黃熱病毒科之病毒)。適用于本發(fā)明方法之黃熱病毒科 病毒非限定性地包括黃熱病毒屬成員(諸如登革熱病毒(DV)、西尼羅熱病毒(WNV)、日本腦 脊髓炎病毒(JEV)、黃熱病毒(YFV)及蜱傳腦脊髓炎病毒)或肝炎病毒屬成員(諸如C型 肝炎病毒)。在一該具體例中，將融合蛋白質(zhì)固定在固體支撐物上(例如若異源多肽為IgG 或其片段，則使用由蛋白質(zhì)A所衍生之固體支撐物)，然后使固體支撐物與包含所探究病原 體之組合物接觸。沖洗后，使用例如第二試劑檢測(cè)病原體之結(jié)合，該第二試劑可以不會(huì)與融 合蛋白質(zhì)之結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)之方式，與病原體特異性地結(jié)合。舉例言之，可使用對(duì)病原體具特異性 之二次抗體。然后第二試劑之結(jié)合可如上述檢測(cè)(例如使用綴合有HRP之二次抗體)或者 使用與第二試劑結(jié)合之第三試劑進(jìn)行檢測(cè)(舉例言之，若第二試劑為抗-病原體IgG，則使 用與HRP綴合之抗-IgG抗體)。若檢測(cè)到二次試劑之結(jié)合，其顯示該病原體包含多醣體且 該多醣體包含融合蛋白質(zhì)之碳水化合物識(shí)別區(qū)域所識(shí)別之特異性碳水化合物成分。或者，該檢定分析可藉由將與病原體特異性結(jié)合之試劑固定在固體支撐物上而進(jìn) 行。例如將可與病原體結(jié)合之抗體固定在固體支撐物上，繼而與包含病原體之組合物接觸。 然后使固體支撐物與融合蛋白質(zhì)接觸，并如上述檢測(cè)融合蛋白質(zhì)之結(jié)合(該融合蛋白質(zhì)較 佳不會(huì)和病原體競(jìng)爭(zhēng)與固定試劑之結(jié)合)。舉例言之，若融合蛋白質(zhì)之異源多肽為IgG Fe, 則抗-IgG抗體可檢測(cè)融合蛋白質(zhì)與病原體之結(jié)合；或者若融合蛋白質(zhì)與可檢測(cè)之標(biāo)記綴 合，則該標(biāo)記之檢測(cè)被用于檢測(cè)結(jié)合。被經(jīng)常列入考慮者為上述病原體檢定分析，例如同時(shí)使用復(fù)數(shù)種不同的融合蛋白 質(zhì)以多重方式進(jìn)行。舉例言之，將可與病原體結(jié)合之抗體固定在固體支撐物上之復(fù)數(shù)個(gè)分 開的地址；然后使固體支撐物與包含病原體之組合物接觸；接著使各特異性地址與不同的 融合蛋白質(zhì)接觸，各不同的融合蛋白質(zhì)包含不同的碳水化合物識(shí)別區(qū)域。若各融合蛋白質(zhì) 包含相同的異源多肽，則融合蛋白質(zhì)之結(jié)合可用能與異源多肽結(jié)合之單一試劑檢測(cè)。舉例 言之，若異源多肽為IgG Fe，則抗-IgG抗體可被用于檢測(cè)融合蛋白質(zhì)之結(jié)合。各結(jié)合反應(yīng) 之空間地址即可揭示出融合蛋白質(zhì)之種類。或者，可使用固定在固體支撐物之空間分離地 址上之復(fù)數(shù)種不同融合蛋白質(zhì)進(jìn)行多重檢定分析，其中使固體支撐物與包含病原體之組合 物接觸，繼而使固體支撐物與能和病原體特異性結(jié)合之第二試劑接觸。舉例言之，若病原體 為登革熱病毒，則第二試劑可為對(duì)抗E套膜蛋白質(zhì)之抗體。如在上述所有檢定分析中者，可 進(jìn)行沖洗以從固體支撐物移除非特異性結(jié)合之物質(zhì)。使用本文揭示之方法時(shí)，已發(fā)現(xiàn)登革熱病毒會(huì)與⑶14+巨噬細(xì)胞表面上之DVLRl/ CLEC5A結(jié)合。參見實(shí)施例11。再者，已證明DVLR1/CLEC5A結(jié)合于登革熱病毒造成DAP12之 活化，其最終導(dǎo)致促發(fā)炎性細(xì)胞激素TNF-α、MIP-I α、IFN-α及IL_8從巨噬細(xì)胞之釋放。 參見實(shí)施例12。此等細(xì)胞激素之釋放參與出血性登革熱(DHF)及登革熱休克癥候群(DSS)之發(fā)展。根據(jù)本文揭示方法之具體例，其已明確顯示DVLR1/CLEC5A可與登革熱病毒作用。 參見實(shí)施例16-18。此外，其顯示DVLR1/CLEC5A可調(diào)節(jié)DAP12之磷酸化作用，咸信該磷酸化 作用可至少部分調(diào)節(jié)諸如TNF-α之促發(fā)炎性細(xì)胞激素的釋出。參見實(shí)施例18。當(dāng)經(jīng)登革 熱病毒感染之細(xì)胞中的DVLR1/CLEC5A表現(xiàn)下降(knock down)時(shí)，DAP12之磷酸化作用會(huì)降 低，且包括TNF-α之促發(fā)炎性細(xì)胞激素之分泌會(huì)減少，同時(shí)并不會(huì)影響諸如干擾素-α之 負(fù)責(zé)進(jìn)行病毒清除之細(xì)胞激素的分泌。參見實(shí)施例18-19。根據(jù)具體例，DVLR1/CLEC5A之 下降(knock down)可使用習(xí)知之RNA-干擾技術(shù)完成，包括si-RNA及sh-RNA兩者之使用。 參見實(shí)施例18-19。對(duì)于會(huì)與病原體交互作用之先天性免疫受體之類別(identity)之認(rèn)知，繼而可 被用于開發(fā)能調(diào)節(jié)先天性免疫受體之活性之藥劑。例如，可以獲取能活化所鑒定出之先天 免疫性受體之調(diào)節(jié)劑，以加強(qiáng)對(duì)于特定病原體之免疫反應(yīng)。若先天性免疫受體與特定多醣 體組合物之交互作用對(duì)于身體有害(例如當(dāng)病原體引起過(guò)度發(fā)炎時(shí))，則可獲取能降低先 天性免疫受體之活性之調(diào)節(jié)劑。例如可使用能封阻病原體結(jié)合于先天性免疫受體之藥劑 (諸如抗體)，以防止該病原體感染所造成之不期望促發(fā)炎反應(yīng)之發(fā)生。同樣地，若本發(fā)明 之篩選方法揭示特定病原體(諸如病毒)利用先天性免疫受體而獲取進(jìn)入細(xì)胞之管道，則 封阻該病原體結(jié)合于先天性免疫受體之藥劑將會(huì)防止病原體進(jìn)入細(xì)胞。根據(jù)本文揭示方法之具體例，其顯示投與能夠減少可用DVLR1/CLEC5A結(jié)合位點(diǎn) 之干擾藥劑可增加經(jīng)登革熱病毒感染小鼠之存活率。根據(jù)具體例，其顯示投與能夠干擾 DVLR1/CLEC5A與DVLR1/CLEC5A配體結(jié)合之DVLR1/CLEC5A抗體可增加小鼠之存活率。參見 實(shí)施例25。在另一系列具體例中，本發(fā)明之融合蛋白質(zhì)被用于干擾或防止多醣體與細(xì)胞表面 上之先天性免疫受體間之交互作用。在該系列之具體例中，融合蛋白質(zhì)包含在細(xì)胞表面上 表現(xiàn)之先天性免疫受體之碳水化合物識(shí)別區(qū)域。然后使該表現(xiàn)先天性免疫受體之細(xì)胞與 融合蛋白質(zhì)在活體內(nèi)或試管中接觸，藉此融合蛋白質(zhì)和多醣體競(jìng)爭(zhēng)與先天性免疫受體之結(jié)果 O若多醣體與細(xì)胞表面上之先天性免疫受體間之交互作用對(duì)于生物產(chǎn)生有害的作 用，可將治療有效量之融合蛋白質(zhì)以醫(yī)藥組合物之形式投與至生物，以防止或減輕該交互 作用。所投與之融合蛋白質(zhì)之異源多肽較佳不會(huì)與任何細(xì)胞表面受體結(jié)合。例如，異源多 肽可包含IgG Fc之突變型，該突變型不會(huì)與細(xì)胞表面上之Fc受體結(jié)合。純化在另一系列具體例中，融合蛋白質(zhì)被用于至少部分純化或單離包含融合蛋白質(zhì)之 碳水化合物識(shí)別區(qū)域所識(shí)別之特異性碳水化合物成分之多醣體。舉例言之，可將融合蛋白 質(zhì)固定在固體支撐物上，并使疑似含有或已知含有多醣體組合物之組合物與固體支撐物接 觸。若該組合物包含可與融合蛋白質(zhì)之碳水化合物識(shí)別區(qū)域結(jié)合之多醣體，則該多醣體會(huì) 與融合蛋白質(zhì)結(jié)合。然后可沖洗固體支撐物以移除組合物之非特異性結(jié)合成分，而結(jié)合之 多醣體可藉由解開與融合蛋白質(zhì)之交互作用而溶析，然后將其收集。舉例言之，若融合蛋白 質(zhì)包含凝集素受體之碳水化合物識(shí)別區(qū)域，則可使用EDTA螯合Ca2+以解開交互作用。以此 方式，可以從復(fù)合物混合物純化出特異性多醣體組合物。在較佳具體例中，其使用該方法純化單離自靈芝之多醣體。就上述純化方法而言，該固體支撐物可包含例如結(jié)合有融合蛋白質(zhì)之管柱。適當(dāng) 的管柱包括瓊脂糖(kpharose)蛋白質(zhì)A管柱，其中包含IgG以做為異源多肽之融合蛋白 質(zhì)可經(jīng)由融合蛋白質(zhì)之IgG區(qū)域與蛋白質(zhì)A之交互作用而結(jié)合在該管柱上。或者，可以經(jīng) CNBr活化之管柱介質(zhì)而與融合蛋白質(zhì)結(jié)合。本發(fā)明亦提供可用于上述方法之任一者之套組。在一具體例中，套組包含本發(fā)明 之融合蛋白質(zhì)，其裝在一個(gè)或多個(gè)容器中。該套組亦可包含第二試劑，諸如與融合蛋白質(zhì) 之異源多肽區(qū)域特異性結(jié)合之抗體，舉例言之，若異源多肽為IgG或其片段，該第二試劑為 抗-IgG抗體。該套組亦可包含檢測(cè)融合蛋白質(zhì)與多醣體結(jié)合用之試劑及緩沖液。例如， 在使用綴合有HRP之二次抗體檢測(cè)融合蛋白質(zhì)與多醣體之結(jié)合之具體例中，該套組可包含 建立增強(qiáng)之化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所需之試劑，例如一個(gè)或一個(gè)以上容器包含魯米諾(Iuminol)、 對(duì)-香豆酸(p-coumaric acid)、Tris緩沖液及過(guò)氧化氫。該套組亦可包含一個(gè)或一個(gè)以 上陽(yáng)性對(duì)照多醣體。該套組亦可包含一個(gè)或一個(gè)以上用于上述方法之固體支撐物，例如，一 個(gè)或一個(gè)以上PVDF膜或者一個(gè)或一個(gè)以上多孔微量滴定平皿。調(diào)節(jié)劑如上述，本發(fā)明之方法鑒定出會(huì)與特定多醣體交互作用之先天性免疫受體。該等 數(shù)據(jù)使吾等得以得到所鑒定出之先天性免疫受體之調(diào)節(jié)劑。調(diào)節(jié)劑可為先天性免疫受體之 催動(dòng)劑、拮抗劑(包括競(jìng)爭(zhēng)性或非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑)或逆向催動(dòng)劑。調(diào)節(jié)劑可(但非限于此) 抑制多醣體與先天性免疫受體之結(jié)合；加強(qiáng)多醣體與先天性免疫受體之結(jié)合；或者做為可 與先天性免疫受體結(jié)合之多醣體之?dāng)M似劑，藉此甚至在缺乏多醣體時(shí)亦可活化先天性免疫 受體。先天性免疫受體之調(diào)節(jié)劑包括抗體。舉例言之，對(duì)抗先天性免疫受體之拮抗性抗 體可防止病原體與先天性免疫受體之結(jié)合。在一些情況，該抗體為中和抗體，因其會(huì)防止 病原體進(jìn)入表現(xiàn)該先天性免疫受體之細(xì)胞。或者，催動(dòng)性抗體可做為對(duì)于細(xì)胞施予有益作 用之多醣體組合物之?dāng)M似物。拮抗性抗體與先天性免疫受體之結(jié)合方式亦可封阻受體于病 原體結(jié)合時(shí)所進(jìn)行之下游信號(hào)傳導(dǎo)。抗體可為(但非限于此)多株抗體、單株抗體、單價(jià) 抗體、雙特異性抗體、雜綴合型抗體、多特異性抗體、人類抗體、人型化抗體或嵌合抗體；單 鏈抗體；Fab片段、F(ab')片段、由Fab表現(xiàn)庫(kù)產(chǎn)生之片段；抗基因型(anti-idiotypic， anti-Id)抗體；以及上述抗體之任一種之抗原決定部位-結(jié)合性片段。本文所用之術(shù)語(yǔ)「抗 體」系指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即含有可與抗原免疫特異 性地結(jié)合之抗原結(jié)合部位之分子。該免疫球蛋白分子可為免疫球蛋白分子之任何類型(例 如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 及 IgY)、類別(例如、IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2)或 亞類。再者，術(shù)語(yǔ)「抗體」(Ab)或「單株抗體」(Mab)意欲包括完整的分子以及能與蛋白質(zhì) 特異性地結(jié)合之抗體片段(諸如Fab及F(ab' )2片段)。Fab及F(ab‘ )2片段缺乏完整 抗體之Fc片段，因而可較快速地從動(dòng)物或植物之循環(huán)清除，且其與完整的抗體相較，具有 較少的非特異性組織結(jié)合性(Wahl et al.、J. Nucl. Med. 24 :316-325 (1983))。制造抗體催 動(dòng)劑之方法例如記載于PCT公開號(hào)WO 96/40281 ；美國(guó)專利第5，811，097號(hào)；Deng et al.， Blood 92(6) :1981-1988(1998) ；Chen et al.，Cancer Res. 58(16) :3668-3678(1998)； Harrop et al.，J. Immunol. 161(4) :1786-1794(1998) ；Zhu et al.，Cancer Res. 58(15)3209-3214(1998) ；Yoon et al. , J. Immunol. 160(7) :3170-3179(1998) ；Prat et al., J. Cell. Sci. Ill (Pt2) :237-247(1998) ；Pitard et al. , J. Immunol. Methods 205(2) 177-190 (1997) ；Liautard et al. > Cytokine 9 (4) :233-241 (1997) ；Carlson et al. , J. Biol. Chem. 272 (17) :11295-11301 (1997) ；Taryman et al. , Neuron 14(4) 755-762(1995) ；Muller et al.，Structure 6(9) :1153-1167(1998) ；Bartunek et al.， Cytokine 8(1) 14-20(1996) ；Harlow et al. , Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed. 1988) ；Hammerling, et al. , in :Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier，N. Y.，1981)(所有文獻(xiàn)全文以參 考數(shù)據(jù)之方式納入本文)。本發(fā)明提供可在DV感染后防止TNF- α從巨噬細(xì)胞釋出之抗-DVLR1/CLEC5A單株 抗體之非限定特異性實(shí)施例。參見實(shí)施例15。此等抗體可用于本文所指定之醫(yī)藥組合物及 治療方法，尤其是用于治療或預(yù)防人類DV感染之組合物及方法。本發(fā)明亦提供可在DV或JEV感染后防止TNF-α從巨噬細(xì)胞釋出之人型化 抗-DVLR1/CLEC5A抗體。參見實(shí)施例20-26。在特定具體例中，該人型化抗體系選自由人型 化抗體9B12、3E12A2、3E12C1、3E12G9、及8H8F5所組成之群。此等抗體可用于本文所指定之 醫(yī)藥組合物及治療方法，尤其是用于治療或預(yù)防人類DV感染之組合物及方法。特定之治療 包括抑制DV-誘發(fā)性血漿滲漏以及皮下及生命器官(vital organ)出血。該等人型化抗體 可作為DV-誘發(fā)性出血休克及敗血癥之治療方法。尤被考慮者，本文所述有關(guān)由病毒所造 成之細(xì)胞激素刺激減輕可應(yīng)用于所有可結(jié)合并調(diào)節(jié)細(xì)胞之刺激性受體的病毒。再者，病毒之發(fā)現(xiàn)及治療原則可以類似方式延伸至細(xì)胞侵入受體以及細(xì)菌、真菌、 及寄生物之作用。本發(fā)明之方法將可使一般精于本技術(shù)者能夠判斷病原體之結(jié)合特性(亦 即，其與何種受體結(jié)合)，判斷與該受體之結(jié)合具有何種作用，并提供諸如抗體之干擾劑以 干擾病原體結(jié)合目標(biāo)受體之能力。根據(jù)具體例，藉由融合小鼠脾細(xì)胞及NSl骨髓配對(duì)細(xì)胞而產(chǎn)生之單株抗體(mAbs) 抗-DVLR1/CLEC5A mAb可以噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生，以產(chǎn)生單鏈人類抗_人類DVLR1/CLEC5A mAbs。催動(dòng)性及拮抗性mAbs可根據(jù)實(shí)例19-25所揭示之篩選方法而選擇。為降低現(xiàn)有小鼠抗-人類DVLR1/CLEC5A mAbs之抗原性，根據(jù)具體例，以人類免疫 球蛋白Gl (IgGl)取代野生型Fc部分。為進(jìn)一步廢除Fc與Fc受體之結(jié)合并防止補(bǔ)體活化， 可使用人類IgGl之突變Fc片段(L234A、L235E、G237A、及P331Q取代野生型Fc部分以產(chǎn) 生人型化mAbs。為進(jìn)一步降低抗原性，可以人類序列取代抗體V區(qū)域之框架區(qū)域。先天性免疫受體之調(diào)節(jié)劑亦包括由高通量篩選方法所鑒定出之小分子。該高通量 篩選方法典型地提供含有大量潛在治療化合物(例如配體或調(diào)節(jié)劑化合物)之組合化學(xué)品 或肽庫(kù)。然后在一個(gè)或一個(gè)以上檢定分析中篩選該等組合化學(xué)品庫(kù)或配位體庫(kù)，以鑒定出 此等可與所探究之先天性免疫受體結(jié)合之庫(kù)成員(例如特定的化學(xué)品種類或亞類)。如此 鑒定出之化合物可做為習(xí)知之引導(dǎo)化合物(lead compound)，或者本身可做為潛在的或?qū)?際的治療劑。組合化學(xué)品庫(kù)為藉由化學(xué)合成或生物合成，或者藉由組合許多化學(xué)建構(gòu)基塊(即 試劑，諸如氨基酸)所產(chǎn)生之在化學(xué)上分歧之化合物之集合物。舉例言之，線性組合庫(kù)，例 如多肽或肽庫(kù)，藉由以對(duì)既定化合物長(zhǎng)度(即在多肽或肽化合物中氨基酸之?dāng)?shù)目)而言每種可能的方式，組合一套化學(xué)建構(gòu)基塊而形成。數(shù)以百萬(wàn)計(jì)之化合物可經(jīng)由組混化學(xué)建構(gòu) 基塊而合成。組合化學(xué)品庫(kù)之制備及篩選為精于相關(guān)技術(shù)者所熟知。該組合庫(kù)包括，但非限于 肽庫(kù)(例如美國(guó)專利第 5，010，175 號(hào)；Furka, 1991，Int. J. Pept. Prot. Res. ,37,487-493 ； 以及Houghton et al. ,991, Nature, 354 :84-88) 亦可使用其它產(chǎn)生化學(xué)上分歧之化學(xué) 品庫(kù)之化學(xué)方法。化學(xué)上分歧之化學(xué)品庫(kù)之化學(xué)類別之非限定性例子包括肽(PCT公開 號(hào)TO 91/019735)，經(jīng)編碼之肽(PCT公開號(hào)WO 93/20242)，隨機(jī)生物寡聚物(PCT公開號(hào) W092/00091)，苯并二吖呼類(benzodiazepines)(美國(guó)專利第5，288，514號(hào))，分歧異構(gòu) 物(diversomers)諸如海因類(hydantoins)、苯并二呼類(benzodiaz印ines)及二肽類 (Hobbs et al.，1993，Proc. Natl. Acad. ki. USA，90 :6909-6913)，類乙烯多肽(Hagihara et al.，1992，J. Amer. Chem. Soc.，114 :6568)，具葡萄糖框架(glucose scaffolding)之 非肽類擬肽(Hirschmann et al.，1992，J. Amer. Chem. Soc.，114 :9217-9218)，小型化合 物庫(kù)(Chen et al.，1994，J. Amer. Chem. Soc.，116 J661)，寡聚胺基甲酸酯(Cho et al.， 1993，Science，261 :1303)，及 / 或膦酸肽酯(Campbell et al. , 1994, J. Org. Chem. ,59 658)之類似有機(jī)合成，核酸庫(kù)(例如參見美國(guó)專利第5，270，163號(hào)，其述及核酸配體(亦 稱為“aptamers”)之產(chǎn)生)，肽-核酸庫(kù)(美國(guó)專利第5，539，083號(hào))，抗體庫(kù)(例如 Vaughn et al. ,1996, Nature Biotechnology,14(3) :309-314)及 PCT/US96/10287)， 碳水化合物庫(kù)(例如參見Liang et al.，1996，Science，274-1520-1522)及美國(guó)專利第 5，593，853 號(hào))，小型有機(jī)分子庫(kù)(例如，苯并二呼類，Baum C&EN, Jan. 18，1993，page 33 ； 以及美國(guó)專利第5，288, 514號(hào)；類異戊二烯類，美國(guó)專利第5，569，588號(hào)；噻唑啶酮類 (thiazolidinones)及間全氫噻口井酮類(metathiazanones)，美國(guó)專利第 5，549，974 號(hào)； 吡咯啶類(pyrrolidines)，美國(guó)專利第5，525，735號(hào)及第5，519，134號(hào)；嗎啉類化合物，美 國(guó)專利第5，506，337號(hào)；以及類似者)。制備組合庫(kù)之裝置可從市面購(gòu)得(例如;357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech, Louisville Ky. ；Symphony, Rainin, Woburn, Mass. ；433 AApplied Biosystems, Foster City,Calif. ；9050Plus,Millipore,Bedford,Mass.) 此外，許多組合庫(kù)可從市面購(gòu)得(例 如，ComGenex, Princeton, N. J. ；Asinex, Moscow, Russia ；Tripos, Inc. , St. Louis, Mo.； ChemStar, Ltd. , Moscow, Russia ；3D Pharmaceuticals, Exton, Pa. ；Martek Biosciences, Columbia, Md.，以及類似者)。醫(yī)藥組合物本發(fā)明亦提供醫(yī)藥組合物。在一些具體例中，醫(yī)藥組合物包含本發(fā)明之融合蛋白 質(zhì)。在其它具體例中，醫(yī)藥組合物包含先天性免疫受體之調(diào)節(jié)劑(例如對(duì)抗先天性免疫受 體諸如DVLR1/CLEC5A之抗體，包括實(shí)施例15所例示之抗體)。在該等醫(yī)藥組合物中，融合 蛋白質(zhì)或先天性免疫受體調(diào)節(jié)劑構(gòu)成「活性化合物」。在一些具體例中，其將醫(yī)藥組合物投 與至病患，以治療或預(yù)防以多醣體結(jié)合至病患細(xì)胞表面之先天性免疫受體為特征之疾病或 失調(diào)。在其它具體例中，其系于增加先天性免疫受體之活性對(duì)于病患有幫助之情況，將該等 醫(yī)藥組合物投與至病患以活化該先天性免疫受體。在另一些具體例中，其將醫(yī)藥組合物投 與至病患，以加強(qiáng)多醣體組合物與先天性免疫受體之結(jié)合。醫(yī)藥組合物除了包含活性化合物之外，較佳復(fù)包含至少一種醫(yī)藥上可接受之載劑。本文所用之術(shù)語(yǔ)「醫(yī)藥上可接受之載劑」包括與醫(yī)藥投與相容之溶劑、分散體介質(zhì)、包 衣、抗細(xì)菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑以及類似物。亦可將輔助的活性化合物納入 組合物中。將醫(yī)藥組合物調(diào)配成與其意欲的投與途徑兼容。投與途徑之例子包括腸道外投 與，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、經(jīng)口(例如吸入)、穿皮(外用)、穿黏膜及直腸投與。用于腸 道外、皮內(nèi)或皮下投與之溶液或懸浮液可包括下列成分無(wú)菌稀釋液諸如注射用水、鹽水溶 液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑諸如芐醇或?qū)αu基苯甲酸甲 酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二胺四乙酸；緩沖液諸如乙酸鹽、 檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及等張性調(diào)整劑諸如氯化鈉或葡萄糖。PH值可用酸或堿諸如鹽酸或 氫氧化鈉調(diào)整。腸道外制劑可密封在玻璃或塑料制之安瓿、可拋棄式注射筒或多劑量小瓶 中。本文中所用之術(shù)語(yǔ)「病患」系指人類及非人類靈長(zhǎng)類(例如猩猩、獼猴、狨猴)，家 畜(例如綿羊、牛、馬、驢子、豬)，寵物(例如狗、貓)，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)動(dòng)物(例如小鼠、兔子、大 鼠、天竺鼠、倉(cāng)鼠)，圈養(yǎng)之野生動(dòng)物(例如狐貍、鹿)以及任何可從本發(fā)明藥劑獲益之其它 生物。對(duì)于可從本文所述之藥劑獲益之動(dòng)物類型沒(méi)有限制。在本發(fā)明中最佳之病患為人 類。不論是人類或非人類生物皆可被稱為病患(patient)、個(gè)體(individual)、動(dòng)物、宿主 (host)或接受者(recipient)。適合注射用之醫(yī)藥組合物包括無(wú)菌水溶液(在可溶于水之情況)或分散體以及 無(wú)菌注射溶液或分散液之實(shí)時(shí)調(diào)配制劑用之無(wú)菌粉末。就靜脈內(nèi)投與而言，適當(dāng)?shù)妮d劑包 括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL. TM. (BASF, Parsippany, N. J.)或磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)。在所有情況，組合物必須為無(wú)菌以及具有某種程度之流體性，以易于注射。組合物 在制造及貯存條件下應(yīng)當(dāng)安定且必須對(duì)抗微生物諸如細(xì)菌及真菌之污染作用而進(jìn)行防腐。 載劑可為溶劑或分散體介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙 二醇以及類似物)以及其適當(dāng)?shù)幕旌衔铩＿m當(dāng)?shù)牧黧w性例如可以藉由使用涂膜諸如卵磷脂 而維持，在分散體之情況藉由保持所需之粒度而維持以及藉由使用界面活性劑而維持。防 止微生物之作用可藉由各種抗細(xì)菌劑及抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞 血酸、乙汞硫柳酸鈉(thimerosal)及類似物而達(dá)成。在許多情況，組合物較佳包括等張劑， 例如，糖、多元醇諸如甘露醇及山梨醇、或氯化鈉。可注射組合物之延長(zhǎng)吸收可藉由在組合 物中包括延遲吸收之藥劑例如單硬脂酸鋁及明膠而達(dá)成。無(wú)菌注射溶液可藉由將所需量之活性化合物引進(jìn)適當(dāng)?shù)娜軇┲校曅枰瑫r(shí)引進(jìn) 上文列舉之成分之一種或組合物，繼而過(guò)濾滅菌而制備。一般而言，分散液藉由將活性化合 物引進(jìn)無(wú)菌載劑而制備，該無(wú)菌載劑含有基本分散介質(zhì)及上文列舉者中之所需其它成分。 制備無(wú)菌注射溶液所用之無(wú)菌粉末之情況，較佳之制備方法為真空干燥及冷凍干燥，其可 從先前經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾之溶液得到活性成分加上任何其它期望成分之粉末。口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用之載劑。就口服治療投與之目的而言， 活性化合物可與賦形劑混合并以錠劑、含錠或膠囊劑(例如明膠膠囊劑)之形式使用。口 服組合物亦可用流體載劑制備，以做為漱口水。醫(yī)藥兼容性結(jié)合劑或佐劑物質(zhì)可被納入做 為組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊劑、含錠劑及類似制劑可含有下列成分之任一種或具 有相似性質(zhì)之化合物黏合劑諸如微晶形纖維素、西黃耆膠或明膠；賦形劑諸如淀粉或半 乳糖；崩散劑諸如藻膠酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑諸如硬脂酸鎂或^erotes ；滑劑諸如膠體二氧化硅；甜味劑諸如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑諸如薄荷(P印permint)、水楊酸甲酯 或橙類調(diào)味劑。就藉由吸入之投與而言，化合物以氣溶膠噴霧劑(aerosol spray)之形式從含有 適當(dāng)推進(jìn)劑(例如氣體諸如二氧化碳)之加壓容器或分配器輸出，或由霧化器(nebulizer) 輸出。全身性投與亦可經(jīng)由穿過(guò)黏膜(transmucosal)或穿皮投與。就穿過(guò)黏膜或穿皮 投與而言，在調(diào)配物中使用適于透過(guò)障壁之滲透劑。此等滲透劑在本技術(shù)中為眾所周知，例 如就穿過(guò)黏膜投與而言，包括清潔劑、膽鹽及褐霉酸(fusidic acid)衍生物。穿過(guò)黏膜投 與可經(jīng)由使用鼻噴霧劑或栓劑而達(dá)成。就穿皮投與而言，活性化合物被調(diào)配成本技術(shù)所周 知之軟膏、油膏、凝膠或乳霜。該等化合物亦可被制成供直腸輸送用之栓劑(例如使用習(xí)用之栓劑基劑諸如可 可油脂及其它甘油酯)或滯留性灌腸劑。在一具體例中，活性化合物藉由使用能保護(hù)該化合物使其免于從身體快速清除之 載劑，而制備成例如控制釋放調(diào)配物，該控制釋放調(diào)配物包括植入物、顯微包膠輸送系統(tǒng)。 可以使用生物可降解、生物兼容性聚合物諸如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酸酐、聚羥乙 酸、膠原、聚原酯(polyortho-ester)及聚乳酸。該等調(diào)配物之制法對(duì)精于本技術(shù)者而言為 顯而易知。該等物質(zhì)亦可從Alza公司及Nova藥品公司獲得。微脂粒懸浮液(包括具有針對(duì) 細(xì)胞-特異性抗原之單株抗體而可標(biāo)定于感染細(xì)胞之微脂粒)亦可被用做醫(yī)藥上可接受之 載劑。此等微脂粒懸浮液可依照精于本技術(shù)者已知之方法制備，例如美國(guó)專利第4，522，811 號(hào)所述者。將口服或腸道外組合物調(diào)配成單位劑型系為有利，因?yàn)楸阌谕杜c及劑量均勻。本 文所稱之「單位劑型」系指適于做為待治療病人之單位劑量之物理上分離之單位；各單位 含有經(jīng)計(jì)算能產(chǎn)生期望治療作用之預(yù)定量活性化合物以及所需之醫(yī)藥載劑。該等化合物之毒性及治療效力可在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中藉由標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥方法 測(cè)定，例如測(cè)定LD50 (使群體之50%死亡之劑量)以及ED50 (在50%群體中治療有效之劑 量)。毒性作用與治療作用間之劑量比稱為治療指數(shù)且系以LD50/ED50比表示。以顯示高 治療指數(shù)之化合物為較佳。雖然可以使用顯示毒性副作用之化合物，但應(yīng)小心設(shè)計(jì)將該等 化合物標(biāo)定于受犯組織部位之輸送系統(tǒng)，以使對(duì)于未感染細(xì)胞之潛在傷害減至最低，藉此 減少副作用。從細(xì)胞培養(yǎng)物檢定分析及動(dòng)物研究得到之?dāng)?shù)據(jù)可用于調(diào)配某范圍之劑量以供病 患使用。該等化合物之劑量較佳在包括ED50且引起極微或未引起毒性之循環(huán)濃度范圍 內(nèi)。劑量可在該范圍內(nèi)，視所用劑型及投與途徑而變化。對(duì)于本發(fā)明方法所用之任何化合 物而言，治療有效劑量初始可從細(xì)胞培養(yǎng)物檢定分析評(píng)估。在動(dòng)物模型中調(diào)制能達(dá)到包括 IC50(即受試化合物達(dá)到癥狀之最大抑制之一半之濃度，該IC50如在細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)得 者)之循環(huán)血漿濃度范圍的劑量。該數(shù)據(jù)可被用于更精確地測(cè)定在病患中之有用劑量。血 漿濃度例如可藉由高效液相層析測(cè)量。如在本文中所定義，本發(fā)明之活性化合物之治療有效量可為約0. 001至30毫克/ 公斤體重，較佳約0. 01至25毫克/公斤體重，更佳約0. 1至20毫克/公斤體重，甚至更佳 約1至10毫克/公斤，2至9毫克/公斤，3至8毫克/公斤，4至7毫克/公斤，或者5至6毫克/公斤體重。活性化合物可以每星期1次至每天3次或3次以上之頻率投與，總計(jì)投 與約1至10星期，較佳2至8星期，更佳約3至7星期，甚至更佳約4、5或6星期，但非限 于此。精于本技術(shù)人士當(dāng)了解某些因子會(huì)影響有效治療病患所需之劑量及給藥時(shí)間，該等 因子包括，但不限于，疾病或失調(diào)之嚴(yán)重度、先前之治療、病患之一般健康狀況或年齡以及 其它存在之疾病。再者，病患以治療有效量之本發(fā)明醫(yī)藥組合物之治療可包括單一治療或 較佳包括一系列之治療。基因治療及RNAi編碼本發(fā)明之融合蛋白質(zhì)之構(gòu)筑體可被用作基因治療規(guī)程之一部分，以將治療有 效劑量之受體融合蛋白質(zhì)輸送至病患。在活體中將核酸引進(jìn)細(xì)胞之較佳途徑為藉由使用含 有編碼本發(fā)明之融合蛋白質(zhì)之核酸之病毒載體。以病毒載體感染細(xì)胞具有下述優(yōu)點(diǎn)高比 例之標(biāo)定細(xì)胞可接受核酸。此外，病毒載體中所編碼之分子，例如藉由病毒載體所含之cDNA 所編碼之分子，在攝入病毒載體核酸之細(xì)胞中能有效率地表現(xiàn)。反錄病毒(retrovirus vectors)及腺病毒相關(guān)性病毒載體可做為在活體中移轉(zhuǎn) 編碼融合蛋白質(zhì)之外源核酸分子之重組基因輸送系統(tǒng)。此等載體將核酸有效率地輸送入 細(xì)胞中且所移轉(zhuǎn)之核酸被安定地整合入宿主之染色體DNA中。只制造復(fù)制-缺陷型反錄 病毒之特異化細(xì)胞系(稱為「套裝細(xì)胞」)之開發(fā)使反錄病毒在基因治療之利用性上更為 增加，且缺陷型反錄病毒經(jīng)特征定性而應(yīng)用于基因治療目的之基因轉(zhuǎn)移中(該法之評(píng)介可 參考Miller，A.D. (1990)Blood 76:271)。復(fù)制用缺陷型病毒可被組裝入病毒粒子中，該 病毒粒子可藉由標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)及使用輔助病毒感染標(biāo)定細(xì)胞。產(chǎn)生重組反錄病毒之規(guī)程以及 在試管中或活體中用該等病毒感染細(xì)胞之規(guī)程可記載于分子生物學(xué)之現(xiàn)有規(guī)程(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. Μ. et al. , (eds. )Greene Publishing Associates, (1989)，Sections 9. 10-9. 14)以及其它標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中。另一有用的病毒基因輸送系統(tǒng)系使用衍生自腺病毒之載體。可將腺病毒之基因組 加以處理，以致其編碼及表現(xiàn)所探討之基因產(chǎn)物，但在正常溶裂病毒生命循環(huán)中之復(fù)制能 力則喪失。例如參見 Berkner et al.，BioTechniques 6 :616(1988) ；Rosenfeld et al.， Science 252:431-434(1991)；以及 Rosenfeld et al.，Cell 68:143-155(1992)。衍生自 腺病毒Ad株5型dl3M或腺病毒之其它株之適當(dāng)腺病毒載體(例如Ad2，Ad3，Ad7等)為 精于本技術(shù)者所已知。重組腺病毒在某些情況下為有利，因其不會(huì)感染未分裂細(xì)胞且可被 用于感染廣泛種類之細(xì)胞類型，包括上皮細(xì)胞(Rosenfeld et al. , (1992)，如上文所引用 者)。再者，該病毒粒子相對(duì)安定及可進(jìn)行純化及濃縮，且如上述可加以修改，以影響感染力 之范圍。此外，引進(jìn)之腺病毒DNA(以及其所含之外來(lái)DNA)未被整合入宿主細(xì)胞之基因組而 保持為游離基因體(印isomal)，藉此可避免引進(jìn)之DNA整合入宿主基因組(例如反錄DNA) 時(shí)于整合位置發(fā)生插入性突變所引起之潛在問(wèn)題。再者，腺病毒基因組攜帶外來(lái)DNA之能 力比其它基因輸送用載體大(高達(dá)8仟堿基)(Berkner et al.，上文所引用者；Haj-Ahmand et al.，J. Virol. 57 :267 (1986))。在另一具體例中，本發(fā)明之非病毒基因輸送系統(tǒng)依賴細(xì)胞吞噬途徑(endocytic pathways)而使標(biāo)定細(xì)胞攝入目標(biāo)核苷酸分子。例示之此型基因輸送系統(tǒng)包括衍生自微脂 粒之系統(tǒng)、聚離胺酸綴合物及人造病毒套膜。在代表性具體例中，編碼本發(fā)明之融合蛋白質(zhì) 之核酸分子可封入表面帶正電之微脂粒[例如親脂質(zhì)(lipofectins)]中且(視需要)核酸分子可用對(duì)抗目標(biāo)組織之細(xì)胞表面抗原之抗體加以標(biāo)記(Mizuno et al. (1992) No Shinkei Geka20 :547-551 ；PCT公開W091/06309 ；日本專利申請(qǐng)案第1047381號(hào)；以及歐洲專利公開 EP-A43075)。編碼本發(fā)明融合蛋白質(zhì)之基因所用之基因輸送系統(tǒng)可藉由許多方法之任一者引 進(jìn)病患中。舉例言之，基因輸送系統(tǒng)之醫(yī)藥制劑可全身性地，例如藉由靜脈注射引進(jìn)，而在 目標(biāo)細(xì)胞中蛋白質(zhì)之特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)主要系基于基因輸送載體所提供之特異性轉(zhuǎn)染、由轉(zhuǎn)錄調(diào) 節(jié)序列控制之受體基因表現(xiàn)所造成之細(xì)胞型或組織型表現(xiàn)、或其組合。在其它具體例中，重 組基因之初始輸送較為局限，在動(dòng)物中之引進(jìn)十分局部化。舉例言之，基因輸送載體可經(jīng) 由導(dǎo)管(參見美國(guó)專利第5，3 ，470號(hào))或經(jīng)由立體定向注射(例如Chen et al. (1994) PNAS 91 :3(^4-3057)引進(jìn)。基因治療構(gòu)筑體之醫(yī)藥制劑可主要由在可接受稀釋劑中之基 因輸送系統(tǒng)組成，或者可包含包埋有基因輸送載劑之緩釋基質(zhì)。在融合蛋白質(zhì)可由重組細(xì) 胞例如反錄病毒載體完整產(chǎn)生之情況，醫(yī)藥組合物可包含一種或一種以上會(huì)產(chǎn)生融合蛋白 質(zhì)之細(xì)胞。在另一具體例中，使用RNA干擾(RNAi)降低或完全抑制先天性免疫受體之表 現(xiàn)，其中該先天性免疫受體依照本文揭示之方法被鑒定為參與致病過(guò)程。RNAi為本技術(shù) 所熟知且可藉由使用小型干擾性RNA(siRNA)達(dá)成。依照本發(fā)明之siRNAs具有達(dá)^bps、 25bps、22bps、21bps、20bps、15bps、10bps、5bps或在上述數(shù)值附近或之間之任何整數(shù)。該 等siRNAs可以例如載體(例如編碼小型發(fā)夾狀RNA(shRNA)之載體)所編碼之形式或以 微脂粒核酸復(fù)合物投與。脂質(zhì)核酸復(fù)合物(包括標(biāo)定之微脂粒諸如免疫脂質(zhì)復(fù)合物) 之制備為精于本技術(shù)者所熟知(例如參見Crystal，Science270 :404-410 (1995) ；Blaese et al. , Cancer Gene Ther. 2 :291-297 (1995) ；Behr et al. , Bioconjugate Chem. 5 382-389(1994) ；Remy et al.，Bioconjugate Chem. 5 :647-654(1994) ；Gao et al.，Gene Therapy 2:710-722(1995) ；Ahmad et al.，Cancer Res. 52 :4817-4820 (1992)；美國(guó)專利 第 4，186，183 號(hào)、第 4，217，344 號(hào)、第 4，235，871 號(hào)、第 4，261，975 號(hào)、第 4，485，054 號(hào)、第 4，501，728號(hào)、第4，774，085號(hào)、第4，837，028號(hào)及第4，946，787號(hào))。所以，本發(fā)明亦提供 包含RNA分子之醫(yī)藥組合物，該RNA當(dāng)投與至病患時(shí)，能媒介先天性免疫受體之RNA干擾。根據(jù)具體例，本文提供在巨噬細(xì)胞中由RNAi所媒介之DVLR1/CLEC5A基因表現(xiàn)下 降(knock down)的非限定性實(shí)例。以此方式產(chǎn)生之DVLR1/CLEC5A減活(attenuation)顯 著降低感染登革熱病毒(DV)之巨噬細(xì)胞中促發(fā)炎性細(xì)胞激素之分泌，因而表示RNAi所媒 介之DVLR1/CLEC5A減活在治療登革熱病毒上有用。 減少DVLR1/CLEC5A表現(xiàn)之siRNA或shRNA被特別考慮用于登革熱患者之RNAi-媒 介治療。設(shè)計(jì)、合成及投與shRNA及siRNA以減少特異性基因表現(xiàn)之方法為本技術(shù)所熟知 且記載于，例如，美國(guó)專利第7，022，828號(hào)。適于與本發(fā)明之shRNA構(gòu)筑體及siRNA分子 一起調(diào)配之藥劑之非限定性例子包括與PEG綴合之核酸、與磷脂綴合之核酸、含有親脂部 分之核酸、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、P-醣蛋白抑制劑(諸如Pluronic P85)[其 可促進(jìn)藥物進(jìn)入各種組織，例如 CNSCJolliet-Riant and Tillement，1999，F(xiàn)undam. Clin. Pharmacol. ,13,1626)]；生物可降解聚合物，諸如植入后持續(xù)釋放輸送用之聚(DL-丙交 酯-乙交酯)微球囊(Emerich，DF et al, 1999, Cell Transplant，8，4758)Alkermes， Inc. Cambridge, Mass.；以及有負(fù)載之奈米粒子諸如由聚氰基丙烯酸丁酯制成者，其可將藥物輸送通過(guò)血腦障壁且可改變神經(jīng)元攝取機(jī)制(Prog Neuropsychopharmacol Biol I^sychiatry，23，941949，1999)。輸送手段(包括本發(fā)明之核酸分子之CNS輸送)之其 它非限定性例子包括下列文獻(xiàn)所述之材料=Boado et al.，1998，J. Pharm. Sci.，87，1308 1315 ；Tyler et al，1999，F(xiàn)EBS Lett.，421，280 284 ；Pardridge et al.，1995，PNAS USA.， 92,55925596 ；Boado,1995, Adv. Drug Delivery Rev. ,15,73107 ；Aldrian-Herrada et al. ，1998， Nucleic Acids Res. ，26，49104916 ；及 Tyler et al. ，1999， PNAS USA·，96， 70537058。所有此等文獻(xiàn)以參考數(shù)據(jù)方式納入本文。此外，包含表面經(jīng)修改之微脂粒之組合 物，其中該表面經(jīng)修改之微脂粒含有聚(乙二醇)脂質(zhì)，即經(jīng)PEG修改或長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)之微脂 粒或長(zhǎng)命微脂粒(stealth liposomes)，亦可與本發(fā)明之核酸合用。本發(fā)明之核酸分子亦包 含共價(jià)連接之具有各種分子量之PEG分子。此等調(diào)配物提供在目標(biāo)組織中增加藥物蓄積之 方法。該類藥物載劑可阻止藥物被單核吞食系統(tǒng)(MPS或REQ調(diào)理(opsonization)及清 除，藉此使得經(jīng)包納之藥物在血液循環(huán)中之時(shí)間增長(zhǎng)及組織暴露增加(Lasic et al. Chem. Rev.1995，95，2601 2627 ；Ishiwata et al.，Chem. Pharm. Bull. 1995，43，10051011)。已 證明該等微脂粒會(huì)選擇性地蓄積在腫瘤中，此可能系經(jīng)由在血管新生化目標(biāo)組織中之血 管外滲及擷取而產(chǎn)生(Lasic et al.，Science 1995,267,12751276 ；Oku et al.，1995， Biochim. Biophys. Acta, 1238,8690)。長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)微脂粒，尤其當(dāng)與已知會(huì)蓄積在MPS組 織中之習(xí)知陽(yáng)離子性微脂粒相較時(shí)，會(huì)促進(jìn)DNA及RNA之藥品動(dòng)力及藥品靜力性質(zhì)(Liu et al. , J.Biol. Chem. 1995,42,2486424870 ；Choi et al.，國(guó)際 PCT
發(fā)明者徐翠玲, 翁啟惠, 謝世良, 陳斯婷 申請(qǐng)人:中央研究院