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專利名稱：人促血小板生成素變異體、其cDNA克隆表達(dá)及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的人促血小板生成素變異體，其cDNA克隆和表達(dá)，以及其活性檢測(cè)方法和應(yīng)用。
一般認(rèn)為，血小板產(chǎn)生是受譜系特異性體液因子調(diào)節(jié)的，且其中主要因子是稱為促血小板生成素(TPO)的細(xì)胞激活素(Mcdonald，T.P，P.Expl，Hematol，16201～～205(1988))。也已報(bào)導(dǎo)了稱為巨核細(xì)胞集落刺激因子(meg-CSF)或促血小板生成素(TPO)的活性，前者影響巨核細(xì)胞的分化，后者影響巨核細(xì)胞的成熟與血小板的產(chǎn)生(Williams，N.et al，Blood cell，15123-133(1989))。另外，一些研究結(jié)果揭示，原致癌基因C-Mpl的配體可能是與meg-CSF或TPO活性相似的巨核細(xì)胞譜系特異性生長(zhǎng)因子。最近，de Sauvage F.J等人從再生障礙性貧血豬的血漿中純化了Mpl配體(ML)，并利用所得到的氨基酸序列信息分離了人ML互補(bǔ)DNA(cDNA)(Nature，369533-538(1994))。證明ML與促紅細(xì)胞生成素(EPO)有序列同源性，并且具有meg-CSF和促血小板生成素樣活性。Si Lok等人也克隆了由原致癌基因C-Mpl編碼的蛋白的配體的成熟cDNA序列(Nature，369565-568(1994))。結(jié)果揭示C-Mpl的配體即是促血小板生成素。譜系特異性的C-GMpl的配體支持巨核細(xì)胞集落形成，在發(fā)育的晚期階段增大巨核細(xì)胞體積，多倍體化及分化標(biāo)志的表達(dá)。在體內(nèi)，C-Mpl配體通過擴(kuò)充骨髓與脾巨核細(xì)胞及其祖細(xì)胞刺激血小板產(chǎn)生(K.Kaushansky et.al，Nature，369568-571(1994))。另外，F(xiàn).Wendling等人(Nature，369571-574(1994))的實(shí)驗(yàn)顯示，C-Mpl編碼的受體與參予血小板體內(nèi)平衡節(jié)之體液因子的配體(C-Mpl配體)結(jié)合，并提示C-Mpl配體、TPO和meg-CSF是同一種分子。
R.C.Skoda等人(The EMBO J.12(7)2645-2653(1993))曾報(bào)導(dǎo)了一種新的截短形式的Mpl蛋白質(zhì)，并證明可從被轉(zhuǎn)化的COS-1細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物中同時(shí)免疫沉淀出全長(zhǎng)和截短形式的Mpl蛋白質(zhì)，而這種含分泌信號(hào)但無跨模序列的截短形式的Mpl，則不存在于培養(yǎng)液中。最近，在我們的發(fā)明完成之后，Gurney，A.L.等人(Blood，85981～988，1995)進(jìn)一步報(bào)導(dǎo)了稱為TPO2的新的TPO變異體。
已經(jīng)證明，在TPO的生物合成系統(tǒng)中因存在RNA替換剪切(RNAAlternative Splicing)過程，導(dǎo)致全長(zhǎng)TPO序列中四個(gè)連續(xù)的氨基酸序列132LPPQ135丟失，從而得到該變異體。一般認(rèn)為，TPO變異體(TPOV)蛋白質(zhì)參予胚胎早期巨核細(xì)胞干細(xì)胞的分化和增殖，且隨著胚胎發(fā)育過程的進(jìn)展，TPO和TPOV之間形成一個(gè)特有的生理平衡，從而調(diào)整節(jié)TPO表達(dá)水平。任何內(nèi)在和外在干擾因素的影響，打破這種正常平衡狀態(tài)，均可導(dǎo)致血小板細(xì)胞分化和發(fā)育的異常或障礙。因此，這些新的血細(xì)胞生長(zhǎng)因子的發(fā)現(xiàn)及對(duì)其功能的闡述，將有利于進(jìn)一步了解血小板功能異常相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，為這些疾病的診斷、預(yù)防和治療提供依據(jù)。
就下述本發(fā)明TPOV的一級(jí)結(jié)構(gòu)而言，特別值得注意的是，其C末端氨基酸順序和其完整順序中段出現(xiàn)的glu→gln氨基酸突變。雖然目前對(duì)TPO和TPOV的C末端氨基酸順序的功能尚未完全闡明(Nature 369365～568，1994)，但據(jù)信該多肽片段可以用作例如使用核糖核酸酶保護(hù)檢測(cè)法(RNase Protection Assay)和利用特異性單克隆抗體的免疫檢測(cè)法診斷某些血小板生成異常性疾病或其他惡性血液病的標(biāo)記物。另外，盡管TPOV序列中g(shù)lu-gln氨基酸突變的意義尚有待進(jìn)一步研究，但這一突變對(duì)于鑒別TPO和TPOV無疑是十分重要的。
再者，業(yè)已發(fā)現(xiàn)，主要以膜結(jié)合蛋白質(zhì)形式存在的TPOV，在微量條件下即表現(xiàn)出對(duì)骨髓干細(xì)胞的刺激作用，此揭示TPOV也同樣會(huì)影響某些髓樣白血病細(xì)胞或髓樣間變細(xì)胞。因此，對(duì)TPOV的進(jìn)一步深入研究，將有助于了解這些惡性病變的機(jī)理，為尋找進(jìn)行基因治療和蛋白質(zhì)工程治療的途徑提供基礎(chǔ)。
因此，本發(fā)明的目的是基于某些細(xì)胞因子廣泛存在的RNA替換剪選(RNA Alternative Splicing)機(jī)制，而產(chǎn)生多種與細(xì)胞分化過程有關(guān)的細(xì)胞因子變異體這一事實(shí)，利用DNA重組技術(shù)分子克隆可能存在的新的TPO變異體。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是建立檢測(cè)本發(fā)明的TPOV活性的新的檢測(cè)方法，即本說明書下文所述的TF-1細(xì)胞增殖活性檢測(cè)法和CFU-MK(CFU-meg)為基礎(chǔ)的活性檢測(cè)法。
本發(fā)明進(jìn)一步的目的是制備特異性結(jié)合TPO變異體中變異氨基酸或氨基酸片斷的抗體，用以鑒別TPO和TPO變異體；建立一種簡(jiǎn)易準(zhǔn)確的核苷酸分析方法，以區(qū)分TPO和TPO變異體，從而用于血小板及其他血液病的診斷。
因此，本發(fā)明提供了如圖2所示的一種新的促血小板生成素變異體多肽序列及其cDNA編碼序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了以DNA重組技術(shù)制備上述促血小板生成素變異體的方法，該方法包括以下步驟1)提供人胚肝細(xì)胞cDNA庫作為模板，2)以下列合成的寡核苷酸對(duì)為引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增所需的DNA序列，①5′CTAG ATCAAG CTTAAC AGG GAG CCA②5′GAT CCTAGA ATT CTTACC CTT CCT GAG ACA 3′3)將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體連接，4)用所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，5)在適于表達(dá)TPOV多肽的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并回收所需的TPOV多肽產(chǎn)物。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了以TF-1細(xì)胞增殖檢測(cè)法檢測(cè)樣品中TPO活性的方法，特征在于其改進(jìn)包括使用TF-1細(xì)胞作檢測(cè)程序中的效應(yīng)細(xì)胞。
另外，本發(fā)明還提供了以骨髓干細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)法體外檢測(cè)TPO活性的方法，該方法包括以下步驟1)提供適當(dāng)數(shù)目作為效應(yīng)細(xì)胞的小鼠骨髓干細(xì)胞；2)在有絲分裂素激活的脾細(xì)胞懸液存在下，向培養(yǎng)的小鼠骨髓干細(xì)胞中加入待檢TPO或TPOV樣品；3)待半固體凝膠形成后進(jìn)行乙酰膽堿脂酶(AchE)染色；4)基于AchE陽性巨核細(xì)胞數(shù)判斷被檢測(cè)樣品中的TPO或TPOV活性。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的TPOV蛋白質(zhì)在血小板生成異常相關(guān)疾病的診斷中的應(yīng)用，其中所用的診斷方法包括核糖核酸酶保護(hù)檢測(cè)法和使用特異性單克隆抗體的免疫檢測(cè)法。
最后，本發(fā)明提供了以本發(fā)明的TPOV蛋白質(zhì)為活性成分，并含有醫(yī)藥上可接受的載體及賦形劑的藥物組合物，以及該組合物在治療血小板細(xì)胞分化與發(fā)育異常相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，我們以已建立的人胚肝細(xì)胞cDNA庫為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶—聚合酶鏈反應(yīng)(ET-PCR)技術(shù)，以下列合成的寡核苷酸對(duì)作為引物，經(jīng)30次循環(huán)(95℃1分鐘、52℃1分鐘、72℃2分鐘)擴(kuò)增所說的引物對(duì)①5′CTAG ATCAAGCTTAAC AGG GAGCCA②5′GAT CCT AGA ATT CTT ACC CTT CCT GAG ACA 3′所得PCR反應(yīng)混合物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后，發(fā)現(xiàn)除TPO主帶外，還可見一個(gè)分子量較小的可能的TPO變異體帶，但也不能排除該帶是由混入雜質(zhì)而出現(xiàn)的PCR非特異性反應(yīng)帶。為了區(qū)別這兩種可能性，我們將PCR產(chǎn)物直接連接到一種TA克隆質(zhì)粒pCR II(InVitrogen，CA，USA Cat# K2000-01)上，分別得到重組質(zhì)粒pCRT和pCRTV(見實(shí)施例1)。將這些重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Ecoli)中并培養(yǎng)該重組體大腸桿菌細(xì)胞。然后從中分離并純化質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行DNA序列分析。將所得序列與de Sauvage等人(Nature 369533～538，1994)報(bào)導(dǎo)的原始TPO編碼DNA序列相比較，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的pCRT的PNA序列與已知的TPO編碼序列完全相同，但擴(kuò)增的pCRTV的DNA序列則比原始TPO編碼DNA序列短116個(gè)堿基對(duì)。令人驚奇的是，除存在個(gè)別堿基的改變，導(dǎo)致第113位glu改變?yōu)間ln外，TPOVDNA序列中前159個(gè)密碼子所編碼的氨基酸順序與已公開的原始TPO編碼順序所對(duì)應(yīng)的氨基酸順序完全相同，但自第160個(gè)密碼子之后，卻出現(xiàn)移碼，導(dǎo)致TPOV的C末端氨基酸序列全部發(fā)生變異(盡管核苷酸序列仍相同)(見實(shí)施例2和附圖2)。另外，還發(fā)現(xiàn)在TPOV中第170位上的胱氨酸仍然保留。并在該DNA序列的C末端第273個(gè)密碼子至第286個(gè)密碼子間存在一個(gè)潛在的疏水部分。
DNA序列分析證實(shí)，TPOV是因?yàn)閼?yīng)用了與TPO不同的替換剪接接收位點(diǎn)(alternative splice acceptor sites)而產(chǎn)生的替換剪接變異體，這種變異體的存在很可能是TPO的表達(dá)調(diào)控機(jī)制之一。而且鑒于存在C末端疏水部分，推測(cè)其可能構(gòu)成一個(gè)細(xì)胞膜結(jié)合區(qū)域，進(jìn)而導(dǎo)致TPOV與野生型TPO功能活性上的差異。另外由于仍存在原始TPO序列中的170位胱氨酸，故推測(cè)本發(fā)明TPOV仍保留有與原始(野生型)TPO蛋白質(zhì)相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
為了進(jìn)一步了解已構(gòu)建好的pCDIT1、pCDIT2和pCDIT3轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)差異及特征，并明確其實(shí)際分子量，我們使用TNT免網(wǎng)織紅細(xì)胞體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)(Promega，Cat.USA)，按試劑盒制造商推薦的方法進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄/翻譯實(shí)驗(yàn)。在瓊脂糖凝膠上對(duì)體外翻譯產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，并與分子量標(biāo)志物相比較，測(cè)得TPOV翻譯產(chǎn)物的分子量約為31,500道爾頓和29,100道爾頓(參見實(shí)施例5)。這一結(jié)果與我們使用計(jì)算機(jī)序列分析程序預(yù)測(cè)的分子量(29,172道爾頓)基本相同。而TPO野生型和截短體的分子量分別為62 KDa和16.5 KDa。
下列表1總結(jié)了本發(fā)明的TPOV蛋白質(zhì)與已報(bào)導(dǎo)的原始(野生型)TPO蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)特征的比較。
表1 TPOV與原始TPO蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較
為進(jìn)一步證實(shí)TPOV的活性，本發(fā)明人將pcRT和pcRTv質(zhì)粒分子HindIII和ECOR1切割的插入片段分別克隆到pcDNAI/Amp和pcDNA3(購(gòu)自InVitrogen，CA，USA)真核細(xì)胞表達(dá)載體上(MolecularCloning，F(xiàn)6～F7，2nd，Edition，1989)，從而得到暫短轉(zhuǎn)染載體pCDI/T1和pCDI/T3(TPO)及穩(wěn)定表達(dá)載體pcD3/T1和pcD3/T3(TPOV)。截短體TPO153即由TPO分子N端153個(gè)氨基酸組成，也以相同方法克隆到上述表達(dá)載體中，分別稱為pCDI/T2和pCD3/T2。
應(yīng)用pcDNAI/Amp和pcDNA3為基礎(chǔ)的重組表達(dá)載體pCDI/T1～T3和pCD3/T1～T3，用經(jīng)典的DNA-磷酸鈣沉積轉(zhuǎn)染法(Mol.Cell.Biol.72745～2752，1987)轉(zhuǎn)染COS-1和NIH3T3細(xì)胞(ATCC，LRL1658)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)后，收集上清液、濃縮提純繼而進(jìn)行活性分析。
我們利用以小鼠骨髓細(xì)胞為指示細(xì)胞的外體檢測(cè)系統(tǒng)，在細(xì)胞有絲分裂素刺激的小鼠脾細(xì)胞懸液或其培養(yǎng)物上清液存在下，檢測(cè)上述被轉(zhuǎn)染的COS-1細(xì)胞或NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，只有同時(shí)存在美洲商陸刺激的小鼠脾細(xì)胞PWM-SCM培養(yǎng)物的實(shí)驗(yàn)組才顯示有巨噬核細(xì)胞的分化和增殖，而未加PWM-SCM的對(duì)照組，無論是TPO還是本發(fā)明的TPOV表達(dá)產(chǎn)物，均沒有表現(xiàn)出對(duì)體外小鼠骨髓祖細(xì)胞的增殖/分化刺激作用。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，我們推測(cè)骨髓干/祖細(xì)胞，在其發(fā)育成熟的特定階段可能在細(xì)胞表面上存在特異性受體。而這正與本文前面討論過的，在細(xì)胞發(fā)育的早期階段產(chǎn)生并存在促血小板生成素變異體這一發(fā)現(xiàn)相符合。
如前所述，在經(jīng)DNA序列分析，進(jìn)一步弄清本發(fā)明TPOV序列特征的基礎(chǔ)上，我們可以基于其序列特征，適當(dāng)設(shè)計(jì)包含變異氨基酸的肽片段，并以其作為免疫原材料免疫動(dòng)物(如羊或兔)，按已知的雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.and Milstein，C.，Nature 256495-497，1975)制備對(duì)本發(fā)明TPOV特異的單克隆抗體，為血小板生成與發(fā)育異常性疾病的診斷和治療提供有用的材料和工具。


圖1顯示人促血小板生成素(TPO)的互補(bǔ)DNA序列，以及由該DNA推測(cè)的人促血小板生成素的氨基酸序列。
圖2顯示人促血小板生成素變異體(TPOV)的互補(bǔ)DNA序列，以及由該DNA序列推斷的TPOV氨基酸序列。
圖3顯示以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增人胚肝細(xì)胞cDNA庫的1％瓊脂電泳圖譜。
圖4顯示對(duì)經(jīng)過快速組裝的含PCR片段之重組分子的1％瓊脂電泳圖譜。
圖5顯示對(duì)質(zhì)粒pCRT7和pCRT8所作限制性酶切分析。
圖6顯示對(duì)質(zhì)粒pCRT7和pCRT8中HindIII/EcoRI酶切片段所作1％瓊脂膠電泳分析。
圖7顯示對(duì)三種不同類型TPO重組表達(dá)質(zhì)粒的限制性酶切分析。
圖8顯示重組質(zhì)粒pcD1T1的基因構(gòu)建圖。
圖9顯示重組質(zhì)粒pcD1T2的基因構(gòu)建圖。
圖10顯示重組質(zhì)粒pcD1T3的基因構(gòu)建圖。
圖11顯示重組質(zhì)粒pcD3T1的基因構(gòu)建圖。
圖12顯示重組質(zhì)粒pcD3T2的基因構(gòu)建圖。
圖13顯示重組質(zhì)粒CD3T3的基因構(gòu)建圖。
圖14顯示利用兔綱織紅細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)pcD1T重組質(zhì)粒DNA所作體外翻譯產(chǎn)物的電泳分析。
圖15顯示對(duì)TPO及其變異體所作體外TF-1細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖16顯示TPO及其變異體對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞的增殖/分化刺激活性。
如前所述，本發(fā)明提供了新的人促血小板生成素變異體互補(bǔ)DNA序列，以及由之編碼的具有促進(jìn)哺乳動(dòng)物骨髓干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化及血小板增殖活性的新的多肽。該多肽全長(zhǎng)度為286個(gè)氨基酸，其去掉前導(dǎo)序列的成熟形式包含265個(gè)氨基酸。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析其cDNA序列的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯產(chǎn)物，證實(shí)分子量約為29.1KDa。另外，相伴隨還有一截短形式的TPO cDNA翻譯產(chǎn)物，其包含153個(gè)氨基酸(并因此稱之為TPO153)，分子量約16.45KDa。
為了得到本發(fā)明的TPOV，我們利用市場(chǎng)上可購(gòu)得的人胚肝細(xì)胞cDNA庫，設(shè)計(jì)并合成適當(dāng)?shù)囊铮跃酆厦告湻磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增得到一大小約1.100bp的PCR產(chǎn)物。進(jìn)一步的序列分析證實(shí)其為編碼人TPO的cDNA，其序列示于圖1中。在該P(yáng)CR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳譜上除了PTO主帶外，還令人驚奇地見有一較小的副帶，經(jīng)反復(fù)檢測(cè)和分析，推測(cè)該帶即是本發(fā)明的TPO cDNA的變異體。經(jīng)DNA序列分析，表明其大小約862bp，編碼含286個(gè)氨基酸的多肽，即本發(fā)明的人促血小板生成素變異體。
從圖1所示的序列可以看出，我們從人胚肝細(xì)胞cDNA庫中經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的cDNA核苷酸序列及由之推測(cè)的氨基酸順序與已報(bào)導(dǎo)的TPO序列完全相同(de Sauvage et al.，Nature 369533-538，1984；Si LOK et al.，Nature 369565-568，1994)。圖1中單線標(biāo)出信號(hào)肽， 號(hào)為成熟分子的第一個(gè)氨基酸；△為四個(gè)胱氨酸位置；*號(hào)為N-聯(lián)糖鏈位點(diǎn)；↓為蛋白酶切點(diǎn)。此位點(diǎn)之前的氨基酸序列即為TPO的153個(gè)氨基酸截短體形式(TPO153，即T2)。RNA替換剪切接收位點(diǎn)(第476～477的AG)已框出，雙底線為TPOV缺失片段。
如圖2所示，本發(fā)明的新型TPO變異體(TPOV)具有21個(gè)氨基酸長(zhǎng)的信號(hào)肽序列，而其成熟多肽分子起始于第22位絲氨酸處。特別令人感興趣的是，TPOV在160位殘基之前與已知的野生型序列完全相同，而自第160位殘基開始其cDNA編碼序列發(fā)生移碼現(xiàn)象，致使下游大約50％的氨基酸序列完全改變，以此構(gòu)成本發(fā)明TPO變異體TPOV的特征性序列。
圖2中，記號(hào)·標(biāo)示為核苷酸突變或變異點(diǎn)，雙底線注明由單一鹼基變化導(dǎo)致的第113位氨基酸Glu突變?yōu)镚ln。C未端的下標(biāo)曲線標(biāo)示可能存在的疏水區(qū)域，即膜結(jié)合區(qū)域。
附圖3顯示以人胚肝細(xì)胞cDNA庫為模板，以已知的TPO序列5′和3′端正反序列為引鏈進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)的結(jié)果。其中第一帶區(qū)出現(xiàn)主帶(大箭頭)和副帶(小箭頭)兩種產(chǎn)物。
第二帶區(qū)為TPO的截短體(153個(gè)氨基酸)的PCR產(chǎn)物。
第三帶區(qū)為鹼基對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物(Φ×174/HaeIII片段)，片段大小自上而下分別為1353、1078、872、603，和310bp。第一帶區(qū)的主帶約1100bp，副帶約1000bp長(zhǎng)。從此圖中可以推測(cè)，主帶是正常TPO，而副帶可能是假PCR產(chǎn)物或一種新的變異體。
為了獲得本發(fā)明TPOV的重組表達(dá)，本發(fā)明人使用TA克隆試劑盒(InVitrogen)以PCR產(chǎn)物直接克隆法，將按上述方法制得的，如圖3所示的PCR擴(kuò)增片段直接克隆到質(zhì)粒載體pCRII(文獻(xiàn))中。用所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，根據(jù)其抗生素(氨芐青霉素)抗性標(biāo)志選擇適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化株，并從中分離所需的TPO及TPOV cDNA。從10個(gè)陽性菌落中分離DNA樣品并分別用HindIII和EcoRI消化，然后對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳分離。圖4標(biāo)出數(shù)字1-10分別指示點(diǎn)樣10份DNA樣品的泳道。圖中，左側(cè)M為λ噬菌體DNA/HindIII的片段標(biāo)記物，分子大小自上而下分別為23，130、9，416、6，557、4，361、2，322和2.027bp。右側(cè)M為Φ×174/HaeIII片段，片段大小自上而下為1，353、1，078、872、603、310、271、234、194、118和72bp。其中泳道2和7為主PCR產(chǎn)物；6和8為副PCR產(chǎn)物。由此2，6，7和8泳道樣品而來的重組質(zhì)粒，即分別命名為pCRT2，pCRT6，pCRT7和pCRT8。其他菌落樣品沒有出現(xiàn)插入片段，故去除之。
為了證實(shí)按下文實(shí)施例1-2中所述方法構(gòu)建的質(zhì)粒pCRT7和pCRT8中分別以正確方向攜帶有TPO和TPOV cDNA編碼序列，我首先用EcoRI、SacI及用于對(duì)照的Ctrl消化已經(jīng)分離并純化的質(zhì)粒pCRT7和pCRT8。然后收集消化反應(yīng)混合物，在1％瓊脂上進(jìn)行電泳分析。電泳結(jié)果如圖5所示。
由圖5中可以看出，pCRT7(主帶)含有Sac I酶切點(diǎn)與TPO序列的616位鹼基處的AacI相同，故可以推測(cè)pCRT7代表TPO序列。與此相反，pCRT8(副帶)則缺少SacI酶點(diǎn)，可以推知其TPO序列可能在616位點(diǎn)前后發(fā)生變化或缺失。這種推測(cè)的確定只能由DNA序列分析證實(shí)。左側(cè)M和右側(cè)M分別代表分子大小標(biāo)記物(同圖4所示)。
為了進(jìn)行大量質(zhì)粒DNA制備，我們進(jìn)一步用1％低熔點(diǎn)瓊脂膠分離重組質(zhì)粒pCRT7和pCRT8的HindIII/EcoRI消化產(chǎn)物，得到如圖6所示的電泳圖譜。在紫外光燈下切下含有所需DNA插入片段的凝膠條。在T4 DNA連接酶的存在下，將其分別與已用HindIII和EcoRI消化過的質(zhì)粒pcDNAI/Amp和pcDNA3連接，然后用所得連接混合物轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以實(shí)現(xiàn)該片段的亞克隆。圖6中以箭頭標(biāo)示電泳后分離出的代表HindIII/EcoRI插入段的帶的位置。
為了實(shí)現(xiàn)真核細(xì)胞表達(dá)，我們首先將按前述方法克隆分離的編碼TPO、TPO153和TBOV的cDNA，經(jīng)用HindIII和EcoRI酶切后分別得到稱為T1，T2和T3的插入片段。將這些片段分別與質(zhì)粒載體pcDNAI/Amp和pcDNA3重組后，得到重組質(zhì)粒pcDNA I T1、pcDNAIT2和pcDNAIT3；以及pcD3T1、pcD3T2和pcD3T3。將這些重組質(zhì)粒分別用HindIII/EcoRI消化后，在1％瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果表明上述克隆是完全成功的。圖7顯示了對(duì)本發(fā)明重組真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒的電泳分析結(jié)果，其中箭頭指示出T1、T2和T3的DNA插入片段在1％瓊脂糖凝膠中展示的電泳帶。
圖8至13分別圖解顯示了本發(fā)明人構(gòu)建的攜帶T1、T2和T3編碼DNA插入段(分別表達(dá)TPO、TPO153和TPOV多肽)的重組質(zhì)粒。圖中使用的縮寫詞或字母的含義如下PCMV是人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子片段；Amp是氨芐青霉素抗性基因；M13 ori是來源于λM13噬菌體的反義單股DNA復(fù)制原點(diǎn)；Co1E7是大腸桿菌內(nèi)復(fù)制原點(diǎn)；SV40 ori是來源于SV40病毒的復(fù)制原點(diǎn)(外顯子復(fù)制原點(diǎn))；Polyoma ori是來源于多瘤病毒的復(fù)制原點(diǎn)(外顯子復(fù)制原點(diǎn))；SV40 intro/pA是來源于SV40病毒的內(nèi)含子終止信號(hào)和RNA合成信號(hào)，用以提高RNA的穩(wěn)定性；Neomycin是指新霉素抗性基因；Psv40 ori是SV40啟動(dòng)子原點(diǎn)；fl ori是正鏈(有意義鏈)單股DNA復(fù)制原點(diǎn)；BGH PA是牛生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺嘌呤合成信號(hào)，用以提高RNA的穩(wěn)定性。實(shí)施例3和4中描述了這些重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
為了證明本發(fā)明已正確地克隆了TPOV cDNA，并證實(shí)其表達(dá)產(chǎn)物的糖基化性質(zhì)，我們使用兔綱織紅細(xì)胞體外翻譯系統(tǒng)，成功地獲得了分子量與計(jì)算值相同的，沒有糖基化的多肽產(chǎn)物。電泳分析結(jié)果如圖14所示。圖中泳道1和6為陽性對(duì)照；泳道2和7為pcD1T1；泳道3和8為pcD1T2；泳道4和9為pcD1T3；泳道5和10為未加DNA樣品的陰性對(duì)照。其中泳道1～5是直接體外翻譯產(chǎn)物；泳道6-10是加入狗胰腺細(xì)胞微粒體膜后的修飾產(chǎn)物。基于各被檢樣品的電泳遷移率，參照分子量標(biāo)準(zhǔn)品估測(cè)出原始TPO翻譯產(chǎn)物分子量約為35KDa(未糖基化的)和62KDa(糖基化的，泳帶7)；TPO153分子量約為18.5KDa和16.5KDa(去除前導(dǎo)序列后的)；而TPOV的分子量則約為31KDa和29KDa(去掉前導(dǎo)序列后的，泳道9)。圖中M列為分子量標(biāo)準(zhǔn)品，它們自上而下是1.肌球蛋白200KDa；2.磷酸酶B97KDa；3.血清白蛋白68KDa；是4.卵白蛋白43KDa；5，碳酸酐酶31KDa；6.胰蛋白酶抑制物21.5KDa；7.溶菌酶14.4KDa。
為了鑒定本發(fā)明TPOV重組表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性，建立一套簡(jiǎn)便可靠的活性檢測(cè)手段是十分重要的。
以往報(bào)道的TPO活性檢驗(yàn)都采用經(jīng)C-mpl(TPO受體)轉(zhuǎn)染的Ba/F3細(xì)胞(稱為Ba/F3-mpl)(de Sauvage et al，Nature 369533～538，1994；Si LOK et al.，Nature 369565～568，1994)。這種Ba/F3-mpl細(xì)胞高度表達(dá)MPL(TPO受體)，故使TPO的活性檢測(cè)比較敏感。然而Ba/F3-mpl并非生理狀態(tài)的TPO受體表達(dá)細(xì)胞，除其表達(dá)穩(wěn)定性可能出現(xiàn)問題外，其MPL分子在細(xì)胞表面的含量和分布上也顯然不同于自然表達(dá)的細(xì)胞。因此，為了更接近正常生理水平檢測(cè)TPO對(duì)其受體含有細(xì)胞的生理效應(yīng)，我們篩選了數(shù)種人或小鼠的紅/白血病細(xì)胞株，其中發(fā)現(xiàn)TF-1細(xì)胞對(duì)人TPO有較好的反應(yīng)。TF-1細(xì)胞株是從紅白血病患者骨髓細(xì)胞中培養(yǎng)和分離出來的(Kitamura，T.，et al.，J.Cell Physiol.(1989)140；323-334)。最初發(fā)現(xiàn)，TF-1對(duì)GM-CSF和IL-3有完全的生長(zhǎng)依賴性，故TF-1被廣泛用于GM-CSF和IL-3的體外活性檢驗(yàn)。晚近，Meth ia，N等人(Blood 1993，82；1395～1401)和Debili，N等人(Blood 1995，85；391-401)分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平上證明TF-1表達(dá)c-Mpl的信使RNA和MPL蛋白質(zhì)。因此應(yīng)用TF-1細(xì)胞，進(jìn)行TPO的活性檢測(cè)具有以下特點(diǎn)1.TF-1細(xì)胞培殖試驗(yàn)的方法簡(jiǎn)便易行，其細(xì)胞培養(yǎng)沒有添加選擇藥物(Drag for Selection)″(如G418等)，因此細(xì)胞生長(zhǎng)多不受額外藥物影響；2.TF-1細(xì)胞表達(dá)MPL(TPO受體)相當(dāng)穩(wěn)定；3.TF-1細(xì)胞表達(dá)MPL的量及其在細(xì)胞表面的分布是自然的；4.可以同時(shí)觀察TF-1對(duì)IL-3、GM-CSF、EPO等其他生長(zhǎng)因子的影響及相互疊加作用；以上所列四點(diǎn)都是以往常用的人工轉(zhuǎn)錄的Ba/F3-mpl細(xì)胞不能實(shí)現(xiàn)的。我們應(yīng)用TF-1細(xì)胞增殖試驗(yàn)測(cè)定TPO及其變異體的活性，在其靈敏度及可重復(fù)性上均獲得了令人滿意的結(jié)果(詳見實(shí)施例6)。
圖15顯示了應(yīng)用Cell Titer 96細(xì)胞增殖/殺傷非放射性核素試驗(yàn)盒(Promega)及TF-1細(xì)胞對(duì)TPO、TPO1 53和TPOV(TPO變異體)三種類型的促血小板生成素的活性檢測(cè)結(jié)果。其中pcD1T1為TPO；pcD1T2為153個(gè)氨基酸TPO截短體TPO153；pcPD1T3為TPOV變異體；而pcD1載體是陰性對(duì)照物。橫座標(biāo)為因子稀釋度，縱座標(biāo)為陽性結(jié)果的吸收光譜讀數(shù)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明TPO和TPO153對(duì)TF-1細(xì)胞有明顯的增殖活性；而TPOV未測(cè)出此活性，說明其對(duì)TF-1細(xì)胞沒有增殖作用，或者其沒有分泌到培養(yǎng)液中，或分子量極低而不足以刺激TF-1增殖。
眾多證據(jù)表明，TPO可在體內(nèi)促進(jìn)血液祖細(xì)胞和干細(xì)胞的擴(kuò)增和分化(Kaushansky，K.et al.，Nature 1994，369568～571)，而且這種作用在聯(lián)合應(yīng)用IL-3、IL-6、IL-11或KL(干細(xì)胞因子)，時(shí)可提高30～70％。Zeigler，F(xiàn).等人(Blood 1994；844045～4052)也報(bào)道了TPO在體外對(duì)小鼠造血干細(xì)胞的巨核細(xì)胞增殖和血小板細(xì)胞增殖活性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合應(yīng)用IL-3和KL等前祖細(xì)胞刺激因子后可使這一活性得以顯著增高。概括這些結(jié)果，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種應(yīng)用半固體干細(xì)胞培養(yǎng)基檢測(cè)TPO對(duì)造血干細(xì)胞巨核細(xì)胞增殖/分化效應(yīng)的方法，并稱之為CFU-Meg為基礎(chǔ)的TPO活性檢測(cè)法。這種體外檢測(cè)TPO對(duì)造血干細(xì)胞活性的方法的基本原理是1.以美洲商陸(PWM)激活的脾細(xì)胞懸液(PWM-SCM)為前祖細(xì)胞或造血干細(xì)胞因子來源，借以提供IL-3、SCF、或″Meg-CSF″等。其中利用PWM-SCM在體外刺激造血干細(xì)胞或祖細(xì)胞增殖或分化。
2.將TPO加入到PWM-SCM處理的小鼠骨髓細(xì)胞中，可以選擇性地刺激已經(jīng)增殖了的巨核細(xì)胞祖細(xì)胞，從而促使巨核細(xì)胞進(jìn)一步增殖和分化。
本發(fā)明的利用祖、干細(xì)胞作為指示細(xì)胞的體外檢測(cè)方法比體內(nèi)試驗(yàn)操作更為簡(jiǎn)便，而且節(jié)約時(shí)間。另外，利用半固體凝膠膜也更易于觀察和計(jì)數(shù)細(xì)胞團(tuán)。經(jīng)乙酰膽鹼脂酶染色，可以特異性地鑒別巨核細(xì)胞。若在1000倍放大的顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)細(xì)胞核多于3個(gè)以上的細(xì)胞，便可以比較準(zhǔn)確地鑒定出普通光學(xué)顯微鏡難以分辨的巨核細(xì)胞。這種方法優(yōu)越于Kaushansky，K.等人的瓊脂半固體法，因?yàn)樵撘阎椒ê茈y在高倍顯微鏡下直接觀察到多核的巨核細(xì)胞。同時(shí)，這種方法也比液相干細(xì)胞培養(yǎng)法(Zeigler，F(xiàn)，等人，同上文)在計(jì)數(shù)和形態(tài)觀察巨核細(xì)胞上改進(jìn)了一步。應(yīng)用這種方法分別檢測(cè)人TPO和其變異體對(duì)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖/分化活性，可以獲得重復(fù)性高而又靈敏的結(jié)果(詳見實(shí)施例7)。
圖16顯示TPO(左上)，TPO153(右上)和TPOV(左或右下)對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞CFV-Meg的活性觀察。圖中集落細(xì)胞表現(xiàn)含有巨大和多個(gè)細(xì)胞核，而且AchE染色呈深褐色。其背景為半固體膠狀支持物。放大倍數(shù)為420倍。
本發(fā)明的人促血小板生成素變異體可用于診斷和治療與血小板增多或減少相關(guān)的疾病，例如可以將有效量的本發(fā)明TPOV多肽或其截短形式與醫(yī)藥上可接受的載體與及賦形劑混合制成醫(yī)藥組合物，以各種適當(dāng)?shù)慕o藥方式用于需要進(jìn)行這樣預(yù)防或治療的人或動(dòng)物，以治療血小板分化/增殖異常性疾病及其他相關(guān)疾病。
特別是，由于包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)雜的免疫作用機(jī)制及血細(xì)胞生成與分化過程，故可以在進(jìn)一步認(rèn)識(shí)本發(fā)明的TPOV作用機(jī)理、生物學(xué)活性，結(jié)構(gòu)—功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，按已知方法制備出TPOV與其他細(xì)胞因子，如EPO、IL-3、SCF等的融合蛋白質(zhì)，以提高其應(yīng)用范圍及效果。
以下借助實(shí)施例和相應(yīng)附圖詳細(xì)描述本發(fā)。這些實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例闡述本發(fā)明，而不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求范圍的限制。
實(shí)施例1 cDNA克隆分離TPO及其變異體1.PCR法克隆人TPO cDNA人胚胎肝細(xì)胞cDNA文庫購(gòu)自美國(guó)ClonTech公司(HumanQuick-Clone cDNA，Catlog.NO.7171-1)。PCR反應(yīng)盒購(gòu)自美國(guó)Perkin-Elmer公司。PCR引物鏈1為5′CTAGATCAAGCTTAACAGGGAGCCA3′；引物鏈2為5′GATCCTAGAATTCTTACCCTTCCTGAGACA3′。每100μl反應(yīng)液中加入10μl PCR濃緩沖液、8μl dNTP、5μl 20μM引鏈1和2、2μl人胚肝cDNA、60μl水及10μl 1∶20稀釋的Tag聚合酶，經(jīng)94℃6分鐘預(yù)熱后，進(jìn)行30次PCR循環(huán)(94℃→52℃→72℃各1分鐘)，72℃10分鐘結(jié)束反應(yīng)。去除反應(yīng)管中礦物油，取10μl的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳(80～100V，60分種)，照相記錄結(jié)果，詳見附圖3。凝膠經(jīng)染色后，除出現(xiàn)一條與預(yù)定長(zhǎng)度(1100bp)相符的主帶處，還出現(xiàn)較小的副帶，推測(cè)該副帶很可能是一種變異體，故須將主副兩帶都組建在質(zhì)粒分子上，以便作進(jìn)一步的分析檢驗(yàn)。
2.PCR產(chǎn)物直接組建到PCRII質(zhì)粒分子上應(yīng)用美國(guó)InVitrogen公司新型的TA克隆試劑盒(TA CloningKit，Catalog No.K2000-01)以快速直接組裝技術(shù)將以上所得的PCR產(chǎn)物亞克隆到pCRII載體上。根據(jù)1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果計(jì)算出PCR產(chǎn)物的DNA濃度，以插入體載體約等于1∶1的比例進(jìn)行連接酶反應(yīng)，即1μl濃縮緩沖液，2μl載體，6μl插入體(PCR產(chǎn)物)和1μl T4連接酶混合后，16℃保溫18小時(shí)。隨后取1.5μl連接反應(yīng)物混于50μl″One Shot″大腸桿菌中，再加入2μl的0.5M B-巰基乙醇，先在冰上保溫30分鐘，然后轉(zhuǎn)移到40℃溫水浴中保溫30秒鐘后，立即再次移到冰上保溫2分鐘。然后加入450μl SOC細(xì)菌培養(yǎng)液，于37℃下保溫60分鐘。與此同時(shí)用X-gal處理細(xì)菌瓊脂板(25μl的40mg/ml X-gal涂板，凈干60分鐘)；以165μl劃板后，37℃保溫18小時(shí)。第二日取十個(gè)白色菌落接種于6μl的LB/Amp(LB加100μg/ml氨芐青霉素)中37℃培養(yǎng)10～16小時(shí)。收集細(xì)菌，用Miniprep質(zhì)粒DNA盒(Qiagen Co.)提取質(zhì)粒DNA。
應(yīng)用限定性內(nèi)切酶HindIII和ECORI消化10個(gè)單一菌落的質(zhì)粒DNA樣品。即1.5μl消化酶緩沖液，6μl質(zhì)粒DNA，0.5μl HindIII(20單位/μl)，0.5μl EcoRI(20單位/μl)，6.5μl dH2O混合后于37℃下保溫1小時(shí)。再加入2～3μl DNA加樣液之后，加熱至65℃并保持5分鐘。然后加樣到1％瓊脂糖凝膠中，80伏電泳約1小時(shí)。照相記錄得到如附圖4所示的結(jié)果。僅泳道2、6、7和8的樣品出現(xiàn)插入片段的電泳帶，而且泳道2和7為主帶長(zhǎng)度(1100bp)，6和8為副帶長(zhǎng)度。樣品7和8被用于以下全部試驗(yàn)。其相應(yīng)重組質(zhì)粒稱為pcRT7和pcRT8。
3.大量質(zhì)粒DNA制備和限定性內(nèi)切酶分析為進(jìn)一步研究pcRT7和pcRT8，需有足夠量的質(zhì)粒DNA，為此應(yīng)用Maxiprep質(zhì)粒DNA提純盒(Qiagen)，提純250ml(LB/Amp)過夜培養(yǎng)的含pcRT7和pcRT8質(zhì)粒的大腸桿菌。讀出OD260讀數(shù)求得其DNA濃度。因?yàn)門PO DNA原序第616位有SacI單一酶切點(diǎn)，正好與載體SacI單一切點(diǎn)配合而切割出約625bp的片段。根據(jù)這一特點(diǎn)，以SacI酶為標(biāo)記對(duì)pcRT7和pcRT8質(zhì)粒進(jìn)行內(nèi)切酶分析。取1.5μl10×緩沖液，2μl/0.5μg質(zhì)粒DNA，1μl EcoRI或Sac或dH2O，加6.5μl dH2O后，37℃下酶消化反應(yīng)1小時(shí)。再以1％瓊脂糖凝膠電泳，得出如附圖5所示的結(jié)果。pcRT7的SacI處理出現(xiàn)625bp的片段，故為TPO原型DNA。而pcRT8無SacI酶切點(diǎn)，因此可說明其為污染成份，或一種沒有SacI切點(diǎn)的TPO變異體。為進(jìn)一步證實(shí)該pcRT8質(zhì)粒的本質(zhì)，尚須對(duì)其進(jìn)行DNA序列分析。
實(shí)施例2 DNA序列分析和核苷酸/氨基酸序列比較1，pcRT7和pcRT8的DNA定序分析應(yīng)用Sequenase version 2.0 DNA定序盒(UBS CO.)，35S標(biāo)記的dATP(Amersham)，分別對(duì)pcRT7和pcRT8質(zhì)粒DNA進(jìn)行定序分析。所用的引物對(duì)分別為①CTAGATCAAGCTTAACAGGGAGCCA3′，②GATCCTAGAATTCTTACCCTTCCTGAG ACA3′；③GATCCT AGA ATT CTT AGGGGA CAG CTG TGG3′，④CTT CTG CTGGAGGGA；⑤ATT CCT GGT CTG CTG，⑥CAG CG ACC AGG AAT。
根據(jù)Sanger氏創(chuàng)建的酶學(xué)DNA定序法(Molecular Cloning，2nd Edition，13.42～13.74)對(duì)pcRT7和pcRT8的插入片段進(jìn)行序列分析，經(jīng)過①氫氧化鈉變性分股；②引物鏈粘聯(lián)(退火)；③核苷酸標(biāo)記dATP-S35，④終止反應(yīng)等步驟完成序列測(cè)定。再經(jīng)6％聚丙烯酰胺凝膠電泳(1400伏)，干膠和膠片暴光等處理，得到DNA序列底片。經(jīng)過人工讀片記錄定序結(jié)果，并將所得序列數(shù)據(jù)輸入DNAStrider和gcg軟件包(Genetics Computer Group，Inc.)，進(jìn)一步分析。
2.計(jì)算機(jī)軟件分析pcRT7和pcRT8的插入片段
利用GenBank數(shù)據(jù)庫，借助計(jì)算機(jī)分析所得到的pcRT7和pcRT8插入片段序列，表明pcRT7完全相同于已發(fā)表的人促血小板生成素的DNA序列(Nature 369533～538，1994；和Nature 369565～568，1994)，而pcRT8在第160位氨基酸序列前的核苷酸及氨基酸序列幾乎與前者相同，其中僅出現(xiàn)三處鹼基差異和一處氨基酸變異(見圖2)，即第318位鹼基T→C；第333位鹼基G→A；第337位鹼基G→C變化；而第337位鹼基變化導(dǎo)致由Glu變?yōu)镚ln。第160位氨基酸之后的核苷酸序列相同于TPO的相應(yīng)序列，但由于發(fā)生移碼，故其編碼氨基酸序列完全改變，表達(dá)得到一個(gè)全新的多肽，成為本發(fā)明TPO變異體的主要特征。盡管160位氨基酸之后肽鏈變化，但依然出現(xiàn)第四個(gè)胱氨酸(169位)，故整個(gè)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不大。經(jīng)基因序列移碼而產(chǎn)生的新的多肽，缺少了典型的成熟肽序列第153位的精氨酸對(duì)(RR，圖1)，因此可推測(cè)這種TPO變異體可能不發(fā)生蛋白酶切割現(xiàn)象。同時(shí)，TPOV下游新肽鏈僅含有一個(gè)N-聯(lián)糖化位點(diǎn)，故可以推知該蛋白質(zhì)糖化的程度極低，迥異于TPO本身的特點(diǎn)(TPO原序含6個(gè)N-聯(lián)糖化位點(diǎn))。加之，TPOV在第273～286位氨基酸處出現(xiàn)較短的疏水集團(tuán)，推測(cè)有可能是一個(gè)膜結(jié)合區(qū)域。一般認(rèn)為，細(xì)胞膜蛋白和/或分泌蛋白的糖基化是蛋白質(zhì)穩(wěn)定化的一種方式，同時(shí)也與蛋白質(zhì)的抗原性有關(guān)。根據(jù)促紅細(xì)胞生成素(EPO)研究觀察，其糖基化是保持EPO體內(nèi)活性的重要因素，對(duì)于維持其自身穩(wěn)定性和肝細(xì)胞清除率(半衰期)有正向作用(Yamaguchi，K.et al.，JBC 26620434～20439，1991)。另外，根據(jù)無N-聯(lián)糖基化EPO的分泌量低于有N-聯(lián)糖基化EPO的90％這一事實(shí)，可以推測(cè)這種TPO變異體很可能是機(jī)體調(diào)節(jié)糖化TPO因子含量的一種機(jī)制。鑒于N端159個(gè)氨基酸與TPO序列的一致性，我們也推測(cè)TPOV很可能是具有生物活性的因子。特別是在其第4位胱氨酸被保留的情況下，其二級(jí)結(jié)構(gòu)與TPO153截短體應(yīng)當(dāng)是一致或極為相近的。計(jì)算機(jī)理論計(jì)算的TPO，TPO153和TPOV的分子量分別為35，446；16，448和29，172道爾頓。
3.RNA替換剪切導(dǎo)致的TPOV形成DNA序列分析的結(jié)果還進(jìn)一步證實(shí)，本發(fā)明分離并純化的TPO變異體，其產(chǎn)生系由于RNA替換剪切(RNA Alternative Splicing)。眾所周知，RNA分子在剪接過程中可以利用某些替換剪切接受位點(diǎn)(Alternatire Splice Accepter Sites)。其保守的序列為前內(nèi)含子最后“ag”對(duì)后內(nèi)含子最前的“gt”，從而構(gòu)成內(nèi)含子/外顯子聯(lián)合點(diǎn)的 模式。有些情況外顯子的“ag”成為替換剪切的接受位點(diǎn)，結(jié)果就導(dǎo)致外顯子“ag”之后的編碼序理因被剪切而缺失。TPOV的形成正是其TPO編碼DNA第476位的AG提供了這種替換剪切接受位點(diǎn)(圖1，方框內(nèi))所致，從而造成116個(gè)鹼基的缺失，而且下游部分的編碼序列發(fā)生移碼，最終造成下游編碼氨基酸序列的變異。
實(shí)施例3用于暫短型轉(zhuǎn)化的pcDIT1～T3表達(dá)載體的構(gòu)建、COS-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染和表達(dá)產(chǎn)物的分離1.PCD1T1～T3表達(dá)載體的構(gòu)建因在克隆分離TPO、TPO153和TPOV時(shí)將限制性內(nèi)切酶Hind III位點(diǎn)引入其5′端，并將EcoRI位點(diǎn)引入其3′端，故相應(yīng)重酶組質(zhì)粒經(jīng)過HindIII和EcoRI復(fù)合酶切后，即可得到TPO、TPO153和TPOV的插入片段，并分別定名為T1、T2和T3插入片段。真核細(xì)胞表達(dá)中所使用的載體pcDNAI/Amp購(gòu)自InVitrdogen公司，它是一種以巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子帶動(dòng)的表達(dá)載體，專用于暫短型細(xì)胞轉(zhuǎn)染(Transient trangsfection)。在含有大T抗原的細(xì)胞中，其載體可以擴(kuò)增復(fù)制，從而高度表達(dá)其所攜帶的外源基因。
含T1、T2和Ta插入片段質(zhì)粒及pcDNAI/Amp表達(dá)載體經(jīng)用HindIII和EcoRI于37℃聯(lián)合消化2-4小時(shí)后，取1/20等分樣品檢查酶切情況。全部樣品均加樣于制備型1％低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠上，4℃下低壓(50伏)電泳3小時(shí)，即可觀察片段分離情況(見圖6)。在紫外燈下切割含相應(yīng)DNA片段和表達(dá)載體DNA的凝膠。于65℃加熱切下的含DNA瓊脂塊5分鐘。取5μl表達(dá)載體分別與5μlT1、T2或Ta插入片段混合，在加入10μl連接酶溶液(7μl dH2O，2μl連接酶緩沖液，1μlT4連接酶)后16℃保溫16小時(shí)。隨后將50μl 10mM TCM緩沖液(10mM Tris，PH7.4，10mM CaCl2，10mM MgCl2)加入連接混合物內(nèi)，加熱至65℃溶化之。然后用經(jīng)稀釋的連接混合物轉(zhuǎn)化100μl(約108細(xì)胞)感受態(tài)大腸桿菌DB5α菌株。首先在冰上保溫30分鐘，然后于42℃保溫90秒，最后再于冰上保溫2分鐘。加入400μ1 SOC培養(yǎng)液(2％胰蛋白胨，0.5％酵母提取液，0.05％NaCl，50mM葡萄糖，PH7.0)后于37℃溫育1小時(shí)。以166μl/板劃線接種平板，并于37℃培養(yǎng)16小時(shí)。第二日，取單一健康菌落接種于6ml的LB/Amp培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)10小時(shí)。然后收集細(xì)菌，應(yīng)用Qiagenminiprep質(zhì)粒DNA提取盒提取質(zhì)粒DNA。每組選6株進(jìn)行Hind III/EcoRI內(nèi)切酶消化，檢查有無插片段。其結(jié)果詳見附圖7中的pcDIT1～T3。全部選出的菌落均含pcDIT1～T3質(zhì)粒，且都有T11～T3 DNA片段。
為準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染所需DNA，應(yīng)用maxiprep質(zhì)粒DNA提取分離盒(Qiagen)，每組選一株制備約0.5mg左右的質(zhì)粒DNA。提純的DNA也經(jīng)HindIII/EcoRI酶切分析，進(jìn)一步核實(shí)后用于轉(zhuǎn)染目的。重組質(zhì)粒示意圖詳見附圖8，左縱列。
2.轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞COS-1細(xì)胞(ATCC，CRL1650)是最常用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞之一，系由非洲綠猴腎細(xì)胞CV-1經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化而得到的，常規(guī)在DMEM+5～10％FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)。以0.05％胰蛋白酶，0.53mM EDTA，37℃消化10分鐘，分離COS-1細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，并以每盤2.5×105個(gè)細(xì)胞接種之，然后37℃保溫過夜。次日，COS-1達(dá)50％的匯合度時(shí)，加入混合的A液(3μg質(zhì)粒DNA/100μl無血清DMEM)和B液(24μlLipofect AMINE＋76μl無血清DMEM)并于室溫下保溫30分種。Lipofect AMINE是購(gòu)自美國(guó)BRL公司的脂質(zhì)體衍生物。屆時(shí)以5ml PBS清洗盤中COS-1細(xì)胞三次。將2.4ml無血清DMEM加入A/B混合液中，并將此混合溶液鋪敷在單層COS-1細(xì)胞上，于37℃保溫5小時(shí)。然后，再加入2倍營(yíng)養(yǎng)的完全培養(yǎng)液(20％FBS/DMEM)2.6ml，37℃保溫過夜。次日，更換新鮮培養(yǎng)基(10％FBS/DMEM)5ml。37℃保溫1～2日。再更換無血清培養(yǎng)基(DMEM)37℃保溫2日。屆時(shí)收集含有TPO、TPO153和TPOV的上清液。
3.表達(dá)產(chǎn)物的分離收集到的上清液經(jīng)3000×g高速離心，去除細(xì)胞和碎片成分，后收集上清。上清液經(jīng)用CentriCon 30(用于TPO或TPOV)或CentriCon 10(用于TPO153)膜超濾濃縮，0.22μM孔徑濾膜過濾消毒，制成TPO上清濃縮液。此液可進(jìn)一步經(jīng)過離子交換層析或親合層析分離出主要為TPO及其變異體，截短體的主峰。將如此分離和提純的促血小板生成素及其變異形式用于繼后的活性檢測(cè)。
實(shí)施例4穩(wěn)定型轉(zhuǎn)染用pcD3T1～T3表達(dá)載體的構(gòu)建NIH3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)產(chǎn)物的分離1.pcD3T1～T3表達(dá)載體的構(gòu)建暫短型真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)TPO及其變異體雖然表達(dá)量較高，但不能持續(xù)表達(dá)，其COS-1細(xì)胞在轉(zhuǎn)染第5天之后即接近死亡。因此，為進(jìn)一步研究TPO及其變異體的生物學(xué)活性與結(jié)構(gòu)，建立穩(wěn)定持久的真核細(xì)胞表系統(tǒng)是十分必要的。持久表達(dá)外來蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞表達(dá)載體的類型有多種，所用宿主細(xì)胞很廣泛。其中比較常用的是新霉素抗性選擇，以及二氫葉酸還原酶(CHFR)或胸腺嘧啶激酶等可選擇標(biāo)志。所用的選擇基因編碼的某些蛋白質(zhì)是經(jīng)載體轉(zhuǎn)后的特定宿主細(xì)胞生長(zhǎng)或存活所必須的，同時(shí)在這種選擇壓力下，表達(dá)載體可持續(xù)擴(kuò)增復(fù)制，而使其攜帶的外來基因不斷提高表達(dá)水平。
本發(fā)明例舉以G418(新霉素)為選擇壓力，建立TPO、TPO153和TPOV高表達(dá)的N1H3T3(ATCC，CRL1658)細(xì)胞株的實(shí)例。pcDNA3是一種商業(yè)化的攜帶新霉素抗性基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體，經(jīng)HindIII/EcoRI復(fù)合酶切之后，即可應(yīng)用實(shí)施例3-1中所述的快速克隆組建法，將其與TPO、TPO153和TPOV的cDNA片段連接起來，從而構(gòu)建成pcD3T1，pcD3T2和pcD3T3的重組表達(dá)載體(詳見實(shí)施例3-1)。這三種表達(dá)載體經(jīng)HindIII/EcoR1酶切譜分析，證明均含有相應(yīng)大小的插入體片段(參見附圖7)。三種表達(dá)載體各選一株進(jìn)行大量質(zhì)粒DNA提取，以備轉(zhuǎn)染細(xì)胞之用。pcD3T1～T3的表達(dá)載體示意圖詳見附圖8。
2.轉(zhuǎn)化N1H3T3細(xì)胞應(yīng)用傳統(tǒng)的磷酸鈣/DNA沉淀法(Chen，C.et al.，Mol.Cell.Biol.72745～2752，1987)轉(zhuǎn)化N1H3T3細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前日分離和清洗N1H3T3細(xì)胞，以每平皿2.5×106細(xì)胞接種培養(yǎng)皿，并于37℃保溫過夜。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日清晨預(yù)先更換新鮮DMEM/10％FBS培養(yǎng)液，37℃溫育至少3小時(shí)。在此期間準(zhǔn)備DNA-磷酸鈣沉淀液。取10μg/20μlpcD3T1或T2，或T3，向其中加30μl 2M CaCl2，再加入250μldH2O。混均后加入300μl 2×HBS液(280mM NaCl、10mM KCl、1.5mM Na2HPO4·2H2O、12mM Dextrose，50mM HEPES，PH7.4)室溫混合30分鐘。然后將此混合液均勻地分散于半層細(xì)胞表面上。37℃保溫18小時(shí)之后用PBS液洗細(xì)胞3次，換以新鮮DMEM/10％FBS液，繼續(xù)溫育3天。第四天加入0.8mg/ml的Geniticin-G418(BRL)到新鮮培養(yǎng)液內(nèi)進(jìn)行選擇培養(yǎng)。當(dāng)G418抗性集落直徑達(dá)3-5毫米時(shí)，即可將集落轉(zhuǎn)移到96孔盤上進(jìn)行單集落培養(yǎng)。經(jīng)35mm盤擴(kuò)增培養(yǎng)后，離心收集上清并經(jīng)TF-1細(xì)胞增殖試驗(yàn)篩選出表達(dá)TPO的被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株。該轉(zhuǎn)化株再經(jīng)單細(xì)胞分離，從而克隆出表達(dá)TPO及其截短體、變異體的細(xì)胞株。
將所得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株分別定名為3T3t1、3T3t2和3T3t3。這些細(xì)胞株可在含0.8mg/ml G418、10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。
3.表達(dá)產(chǎn)物的分離3T3t1，3T3t2和3T3t3細(xì)胞株經(jīng)過向無血清培養(yǎng)液過渡培養(yǎng)后，收集無血清的上清液。經(jīng)過5000×g離心去除細(xì)胞及顆粒成分，這種無血清上清即經(jīng)過Centricon 30或CentriCon 10進(jìn)一步10倍濃縮。濃縮的上清液即可經(jīng)親和層析或離子交換層析進(jìn)一步分離與純化。
實(shí)施例5體外轉(zhuǎn)錄/翻譯/修飾的TPO及其變異體計(jì)算機(jī)計(jì)算的TPO、TPO153和TPOV成熟多肽分子(經(jīng)轉(zhuǎn)譯后加工去除信號(hào)肽之后)分子量分別是35，446、16，448和29，172道爾頓。為進(jìn)一步核實(shí)本發(fā)明分離和制備的各種TPO cDNA所編碼之蛋白質(zhì)的真正分子量，我們應(yīng)用TNT網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解產(chǎn)物系統(tǒng)(TNTReticulocyte Lysate System，Promega)及pcD1T1，pcD1T2和pcD1T3質(zhì)粒DNA進(jìn)行快速一步法體外轉(zhuǎn)錄/翻譯/修飾實(shí)驗(yàn)。將27.5μl TNT兔網(wǎng)織紅細(xì)胞溶解液、2μl TNT反應(yīng)緩沖液、1μlRNA(T7)聚合酶，1μl無亮氨酸的氨基酸混合液、6μl 5mCi/ml的HaH標(biāo)記的亮氨酸、2μl RNAsin，4μl質(zhì)粒DNA模板和6.5μl無核酸酶水以50μl總體積混合均勻，若為修飾實(shí)驗(yàn)尚需在反應(yīng)混合物中再加2.5 μl狗胰腺細(xì)胞微粒體膜。反應(yīng)在37℃下進(jìn)行1.5小時(shí)。然后加入15μl SDS-PAGE樣品緩沖液，加熱煮沸5分種。取5～10μl點(diǎn)樣進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。其中陽性和陰性對(duì)照也用相同方法處理。結(jié)果詳見附圖14。泳道1和6代表陽性對(duì)照；5和10為陰性對(duì)照。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明體外翻譯表達(dá)的TPO及其變異體的分子量與計(jì)算分子量一致，并且間接證實(shí)了T1，T2和T3 cDNA核苷酸序列的正確。同時(shí)也在體外證明TPO發(fā)生明顯糖基化，而TPO153和TPOV則沒有糖基化，反而因信號(hào)肽的切除，而減少了分子量(附圖9，泳道8和9的下方帶)。相反，TPO在加入微粒體膜之后出現(xiàn)糖基化產(chǎn)物，其分子量約為62KDa(泳道7的上方帶)。
實(shí)施例6 TF-1細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測(cè)TPO活性使用細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Cell Titer 96，Promega)，以非放射性染色沉積法，并用TF-1細(xì)胞檢測(cè)TPO及其變異體的體外生物學(xué)活性。
將用于這一檢測(cè)法中的TF-1指示細(xì)胞培養(yǎng)在含有10％滅活胎牛血清、5ng/ml重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)標(biāo)準(zhǔn)品的RPMI1640培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基一般每2-3日更換一次。測(cè)定前日，換培養(yǎng)基一次，并以1∶2比例接種微滴定板。先在96孔微量滴定板的每孔內(nèi)加入50μl不完全培養(yǎng)基(10％FBS/RPMI1640)。從第一縱列孔開始，分別加入50μl的濃縮或提純的TPO、TPO153或TPOV，每種因子占三孔，同時(shí)設(shè)其中只加入50μl細(xì)胞上清液的陰性對(duì)照孔。從第一排開始每孔取出依50μl樣品，依次向右進(jìn)行等倍稀釋，直至第11縱列為止，第12縱列為無因子對(duì)照孔(空白孔)。將96孔板放置37℃溫箱內(nèi)平衡。同時(shí)準(zhǔn)備TF-1細(xì)胞。請(qǐng)洗TF-1細(xì)胞兩次，去除殘留的GM-CSF，即以不完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至105細(xì)胞/ml，然后每孔加入50μl單細(xì)胞懸液(5000個(gè)細(xì)胞/孔)。此時(shí)每孔液體達(dá)100μl，被測(cè)因子濃度由1/4稀釋度至1/4896倍稀釋(第11縱列)。96孔板于37℃5％ CO2大氣環(huán)境中保溫4～5天。向各孔內(nèi)加入15μl溴酚蘭染料，37℃溫育4小時(shí)以著染存活細(xì)胞。然后即加100μl穩(wěn)定/終止液，并用塑料薄膜包裹96孔板，置入濕盤中避光室溫保存16～24小時(shí)。在吸收波長(zhǎng)570nm范圍內(nèi)讀出其吸光率讀數(shù)，計(jì)算平均值，將此值與稀釋倍數(shù)～同輸入Macintosh的Criket軟件進(jìn)行制圖(圖10)。
實(shí)施例7 CFV-Meg為基礎(chǔ)的小鼠骨髓細(xì)胞增殖/分化檢測(cè)雖然TPO對(duì)骨髓細(xì)胞在體內(nèi)的增殖/分化活性已有報(bào)道，但TPO在體外對(duì)骨髓細(xì)胞增殖/分化活性尚未見報(bào)道。本發(fā)明將分離提取的TPO及其變異體在體外刺激小鼠骨髓細(xì)胞，觀察TPO對(duì)造血干/祖細(xì)胞的促進(jìn)增殖/分化活性。
選用Balb/c或C57BL/6小鼠(8～16周令)，經(jīng)股骨針抽吸及沖洗后收集骨髓細(xì)胞，并以IMDM培養(yǎng)液加5％胎牛血清調(diào)細(xì)胞濃度為5×105細(xì)胞/ml。在35mm直徑盤中分別加入0.2ml 5×105細(xì)胞/ml的小鼠骨髓細(xì)胞、0.2mlIMDM、0.2ml FBS、0.1ml PWM-SCM(美洲商陸激活的脾細(xì)胞懸液)、0.2ml纖維蛋白原和0.1ml凝血酶原。然后分別按不同的組在各盤內(nèi)加入0.1、0.2或0.4ml的TPO、TPO153或TPOV。37℃ 5％ CO2環(huán)境下培養(yǎng)10～15天，半固體凝膠形成后進(jìn)行乙酰膽鹼脂酶染色(Burstein，S.A.et al.J.Cell.Physiol.122159～165，1985)。先用5％戊二醛室溫固定10分鐘，然后加入0.5ml酯酶染色液(1.73ml碘化乙酰硫膽鹼，5mM醋酸鈉，0.5mM氰鐵化鉀，0.1M碳酸鈉，PH6.0)室溫下保溫5～6小時(shí)。經(jīng)Harris蘇木精復(fù)染后，以圓型蓋玻片封蓋。在緩沖甘油下觀察著染的細(xì)胞。放大倍數(shù)為100、或250，或1000倍，計(jì)數(shù)多核(3個(gè)核以上)的胞漿為黃或黃褐色的細(xì)胞群，即為AchE陽性細(xì)胞。每組實(shí)驗(yàn)兩個(gè)盤，除計(jì)數(shù)CFV-meg數(shù)外，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察選出AchE細(xì)胞作為最后比較指標(biāo)。
本實(shí)驗(yàn)重要的發(fā)現(xiàn)是無論TPO，還是TPO153，還是變異體TPOV單獨(dú)應(yīng)用對(duì)體外小鼠骨髓細(xì)胞增殖/分化都沒有刺激作用，這些因子只有在附加了刺激早期祖細(xì)胞的因子(如IL-3和KL，都存在于PWM-SCM之中)之后，方能出現(xiàn)刺激效果。TPOV對(duì)體外小鼠骨髓細(xì)胞的刺激作用特別令人驚奇，因?yàn)檫@種作用在TF-1細(xì)胞增殖試驗(yàn)上沒有表現(xiàn)出來。很可能骨髓干/祖細(xì)胞膜表面上存在有對(duì)TPOV較特異的受體，故在極微量表達(dá)的上清提取液也出現(xiàn)中等強(qiáng)度的刺激骨髓細(xì)胞增殖效應(yīng)。
表1 100×低倍鏡5視野AchE計(jì)數(shù)及1000×高倍鏡觀察結(jié)果
<p>由上表可以看出，本發(fā)明的促血小板生成素在體外活性實(shí)驗(yàn)中，與已知的野生型TPO相同，對(duì)小鼠骨髓干/祖細(xì)胞具有相似的剌激作用，表現(xiàn)出促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的生物學(xué)活性，另外，實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明TPOV和TPO153的上述生物學(xué)活性只有存在美洲商陸刺激的脾細(xì)胞懸液或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液時(shí)，即存在其他由脾細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子時(shí)才能表現(xiàn)出來。因此，設(shè)計(jì)本發(fā)明TPOV的特異性抗原決定基片段，并制備適用的抗TPOV單克隆抗體，對(duì)于進(jìn)一步研究TPOV及其受體和相關(guān)細(xì)胞的行為，研究血小板異常性疾病的發(fā)病機(jī)理及尋找其診斷和治療方法，將具有重要的意義。
權(quán)利要求
1，編碼具有血小板增殖和/或分化促進(jìn)活性的多肽的核苷酸序列，特征在于其具有核苷酸序列或及其部分，或其功能等同物。
2，根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，其為互補(bǔ)DNA序列。
3，根據(jù)權(quán)利要求1的核苷酸序列，其來源于人胚肝細(xì)胞cDNA文庫。
4，由權(quán)利要求1或2或3的DNA序列編碼的具有血小板增殖和/或分化促進(jìn)活性的多肽，特征在于其具有氨基酸序列或其部分，或其功能等同物。
5，根據(jù)權(quán)利要求4的生物學(xué)活性多肽，其與野生型促血小板生成素多肽不同在于第113位氨基酸由glu變?yōu)間ln。
6，根據(jù)權(quán)利要求4的生物學(xué)活性多肽，其與野生型促血小板生成素多肽不同在于自160位氨基酸之后有完全不同的氨基酸序列。
7，根據(jù)權(quán)利要求4的生物學(xué)活性多肽，其與野生型促血小板生成素多肽不同在于其為截短形式的。
8，根據(jù)權(quán)利要求7的生物學(xué)活性多肽，其中所說的截短形式的多肽包含150～158個(gè)氨基酸。
9，制備根據(jù)權(quán)利要求4至8中任一項(xiàng)的生物學(xué)活性多肽的方法，該方法包括以下步驟1)提供人胚肝細(xì)胞cDNA庫作為模板，2)以下列合成的寡核苷酸對(duì)為引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增所需的DNA序列，5′CTAG ATCAAG CTTAAC AGG GAG CCA5′GAT CCTAGA ATT CTTACC CTT CCT GAG ACA 3′3)將所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物與適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體連接，4)用所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，5)在適于表達(dá)TPOV多肽的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞并回收所需的TPOV多肽產(chǎn)物。
10，以TF-1細(xì)胞增殖檢測(cè)法檢測(cè)樣品中促血小板生成素活性的方法，特征在于其改進(jìn)包括使用TF-1細(xì)胞作為檢測(cè)程序中的指示細(xì)胞。
11，以骨髓干細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)法體外檢測(cè)促血小板生成素活性的方法，該方法包括以下步驟1)提供適當(dāng)數(shù)目的作為指示細(xì)胞的小鼠骨髓干細(xì)胞，2)在有絲分裂素激活的脾細(xì)胞存在下，向培養(yǎng)基的小鼠骨髓干細(xì)胞中加入待檢樣品，3)待半固體凝膠形成后進(jìn)行乙酰膽堿酯酶染色，4)基于染色陽性的巨核細(xì)胞數(shù)判定被檢樣品中的促血小板增殖/分化活性。
12，根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的核苷酸序列在診斷和治序與血小板減小或增多相關(guān)的疾病中應(yīng)用。
13，一種醫(yī)藥組合物，該組合物含有作為活性成分的根據(jù)權(quán)利要求4至8中任一項(xiàng)的多肽以及醫(yī)藥上可接受的載體和/或賦形劑。
14，根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其用于血小板增殖/分化異常性相關(guān)疾病的診斷和治療。
全文摘要
本發(fā)明公開了人促血小板生成素(TPO)變異體，其互補(bǔ)DNA克隆和表達(dá)，以及其活性檢測(cè)方法及應(yīng)用。本發(fā)明的人促血小板生成素變異體與天然TPO具有至少50％的同源性，其保留原始氨基酸序列第170位的胱氨酸，但第113位氨基酸由glu變異為gln。本發(fā)明TPO變異體的發(fā)現(xiàn)、成功地克隆和真核細(xì)胞表達(dá)為血小板增殖/分化異常性疾病及其他相關(guān)疾病的診斷和治療提供了新的工具。本發(fā)明使用TF-1細(xì)胞株和小鼠骨髓干細(xì)胞作為體外活性檢測(cè)的反應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)一步提高了TPO活性檢測(cè)的再現(xiàn)性和靈敏性，而且操作更為簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1129805SQ9511541
公開日1996年8月28日 申請(qǐng)日期1995年9月8日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月8日
發(fā)明者王楠, 張旋 申請(qǐng)人:濟(jì)南金魯生物工程有限公司