專利名稱：一種測定血清蛋白質指紋圖譜的方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及應用血清蛋白質組學的方法測定血清蛋白質指紋圖譜的方法。具體涉及血清蛋白質的表面增強激光解析離子化-飛行時間質譜測定和肝病的特異性蛋白峰比較識別的方法。
背景技術：
蛋白質指紋圖譜技術由蛋白芯片技術和質譜鑒定技術組成，而后者又分為基質輔助的激光解析離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)和電噴霧質譜(ESI-MS)，近來又發展了表面增強的激光解析離子化飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)可直接應用血清等體液樣本，具有需要樣本量少(如血清0.5ul-500ul，細胞約2000個)，可檢測低豐度(1fmol)、低分子量的未知蛋白，由于以上特點，比較適合臨床應用。
SELDI-TOF-MS技術目前已廣泛應用于腫瘤、新藥開發、傳染病、神經、精神疾病等領域。關于腫瘤診斷的研究結果于2002年Lancet上由美國FDA和NCI合作研究的卵巢癌的早期診斷上(Lancet 2002，359(2)590-7)，與傳統的CA125單項指標相比(陽性預測值僅35％)，僅蛋白質指紋圖譜的多項指標診斷模型的敏感度在100％，陽性預測值高達94％，以后的幾年中，該方法已用于如小細胞肺癌(Lancet 2003，362(9382)433-9)、前列腺癌(J Urol 2004，172(4pt)1302-5)、腎癌(Iht J Mol Med 2005。15(2)285-90)、乳腺癌(Breast Cancer ResTreat2004，86(3)281-91)、頭頸部腫瘤(Clin Cancer Res 2004，10(14)4806-12)國內已開展此項技術，如上海華山醫院用于膀胱癌(Clin Biochem 2004，37(9)772-9)和神經膠質瘤研究；瑞金醫院用于胰腺癌和血液病研究，浙江大學用于結腸癌(Clin Cancer Res 2004，10(14)8380-5)等。展現了廣闊的臨床應用前景。
發明內容
本發明的目的是提供一種測定血清蛋白質指紋圖譜特異性的方法。本方法可用于提高鑒別診斷肝病包括乙型肝炎、肝硬化和肝癌的特異性。
本發明的技術方案主要采用表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)，包括血清樣本的采集標準，化學芯片的選擇、處理和閱讀，測定條件的優化；判別模式及驗證。
本方法經對查體各項指標正常的正常健康人，ELISA或HBVDNA核實的慢性肝炎(乙型肝炎)病人，和確診有影像學診斷依據(B超或CT)的肝硬化病人及手術后腫瘤標本均經病理檢驗證實的肝癌病人進行測定，結果表明，本方法能為篩查乙肝病人、肝硬化病人及肝癌病人提供特異性技術手段，且簡易可行，適用于大規模人群如體檢、流行病調查等。亦可用于臨床對病人的鑒別診斷。
表1是篩查乙肝病人、肝硬化病人及肝癌病人的血清蛋白質指紋圖譜總結表。
表1
圖1，血清樣品檢測的重復性分析結果。
圖2，3，4，血清蛋白質指紋圖譜中有判別意義的蛋白質峰，蛋白質峰1M/Z 22842；蛋白質峰2M/Z 2957；蛋白質峰3M/Z 2049其中第1、2行正常人血清；第3、4行HBV病人血清。
圖5，正常人和乙型肝炎病人的血清蛋白質圖譜的判別模式(決策樹模型)。
圖6，7，正常人與原發性肝癌病人血清蛋白質指紋圖譜中有判別意義的蛋白質峰，蛋白質峰1M/Z 23381；蛋白質峰2M/Z 28040；蛋白質峰3M/Z2018其中第1、2行HCC病人血清；第3、4行正常人血清。
圖8.區分正常人和原發性肝癌病人的血清蛋白質圖譜的判別模式(決策樹模型)。
圖9，10，正常人與肝硬化病人血清蛋白質指紋圖譜中有判別意義的蛋白質峰，蛋白質峰1M/Z 2049蛋白質峰2M/Z 3166其中第1、2行肝硬化病人血清；第3、4行血清正常人血清。
圖11，區分正常人和肝硬化病人病人的血清蛋白質圖譜的判別模式(決策樹模型)。
具體實施例方式
實施例1表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)實驗1.標本來源正常健康人為查體各項指標正常，且血脂、血糖、肝腎功能，乙肝五項化驗均正常。慢性肝炎(乙型肝炎)病人均經ELISA或HBVDNA核實。
肝硬化病人確診均有影像學診斷依據(B超或CT)。肝癌病人的手術后腫瘤標本均經病理檢驗證實。
2.標本收集空腹靜脈抽血5-10ml，室溫靜置30分鐘左右，6000rpm-1000rpm離心15分鐘，收集上清(血清)分裝，-80℃保存。避免溶血和脂血標本。
3.芯片選擇優先選擇蛋白指紋峰分布和表達均理想的WCX2蛋白芯片對血清的蛋白譜進行檢測。
4.血清樣品前處理(1)從-80℃冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解；(2)以10000rpm，4℃離心2分鐘；(3)每個芯片點需要血清3ul，將血清用2倍體積U9緩沖液(9M urea，2％CHAPS，50mM Tris-Hcl，1％DTT，pH 9.0)稀釋。稀釋時注意不要用取液器反復吹吸，避免產生大量氣泡，用手指輕敲樣品管底部(或振蕩器上)，將樣品充分混勻；(4)將以上樣品冰浴振蕩30分鐘(或每隔5分鐘用手指輕彈混勻一次)；(5)將9ul上述變性后樣品加入108ul相應的結合緩沖液，使得血清的總稀釋倍數達到約40倍。混勻，避免氣泡產生；(6)將處理好的血清樣品上樣到芯片上。
5，實驗操作(1)取出WCX2的芯片，在其背后標記時間，芯片種類，操作者的姓名等資料；(2)將芯片裝入生物芯片處理器(Bioprocessor)，注意不觸碰加樣孔，同時將芯片“A”頭放在外端，密封；(3)每孔加入200ul結合緩沖液(50mM NaAC，pH 4.0，或試劑盒中的bindingbuffer)，置振蕩器(MS1 Minishaker)400-600轉/分震蕩5分鐘，甩掉緩沖液。重復上述操作一次，保持芯片無氣泡及每點的表面濕潤；(4)上樣，在芯片處理器每孔中加入100ul處理好的樣品，置振蕩器(MS1Minishaker)400-600轉/分，4℃震蕩1小時。
(5)甩出樣品，生物樣品(如血液，尿樣，腦脊液，癌細胞液等)甩入預裝消毒劑的容器。
(6)每孔加入200ul的結合緩沖液(50mM NaAc，pH 4.0或試劑盒中的bindingbuffer)，室溫置振蕩器(MS1 Minishaker)400-600轉/分震蕩5分鐘，甩去孔中液體(，再次加入結合緩沖液200ul，重復操作一次。
(7)每孔加入200ul HPLC水，甩出。
(8)拆開芯片處理器，取出芯片，待干后，每加樣孔加SPA 0.5ul，待干后，重復加SPA 0.5ul一次。
(9)待干后，上機測定。
6，設置芯片閱讀參數(1)設定最高質量5000道爾頓，最適范圍2000-20000道爾頓；(2)設定初始激光強度為185；(3)設定檢測敏感度為8；(4)校正聚焦點于孔中央；(5)設定質量檢測器為1000道爾頓；(6)設置數據處理為SELDI位置；(7)設定SELDI參數為22delta至4轉換，終點為82；(8)設定濕熱位置至2，強度為10；(9)置入樣品。
7，血清樣品檢測的重復性分析(SELDI-TOF-MS/WCX2蛋白芯片)，結果表明，組內重復性差異CV＜18％，組間重復性差異CV＜18％。
8，在上述基礎上，建立正常人血清與乙型肝炎病人蛋白指紋圖譜的鑒別模式，1)建模組正常人血清35份，乙型肝炎病人血清41份。
2)獲得的血清蛋白質指紋圖譜中有判別意義的蛋白質峰(圖2，3，4)。
蛋白質峰1M/Z 22842；蛋白質峰2M/Z 2957；蛋白質峰3M/Z 2049。
建立區分正常人和乙型肝炎病人的血清蛋白質圖譜的判別模式(決策樹模型，圖5)，通過血清中M/Z為22842、2957和2049三個蛋白質即可將肝炎病人鑒別出來，其準確率對肝炎而言為95.1％(39/41)，正常人為94.28％(33/35)。
9，驗證(盲篩結果)共72份標本，病理和臨床證實含正常人標本38例，乙肝病人例34例，38例判別為正常人中，32例被證明為正常(真陰性)，6判斷為乙肝病人(假陽性)34例判別為乙肝病人標本中，29列被證明為病人(真陽性)，5判斷為正常人(假陰性)診斷敏感性＝29/(29+5)＝85.29％診斷特異性＝32/(32+6)＝84.21％陽性預期值＝29/(29+6)＝82.86％陰性預期值＝32/(32+5)＝86.49％總有效率＝(29+32)/72＝84.72％。
實施例2 確定正常人與原發性肝癌患者血清蛋白指紋圖譜鑒別模式在實施例1的基礎上，1)建模組正常人血清35份，原發性肝癌病人血清39份。
2)獲得的血清蛋白質指紋圖譜中有判別意義的蛋白質峰蛋白質峰1M/Z 23381蛋白質峰2M/Z 28040蛋白質峰3M/Z 20183)建立區分正常人和原發性肝癌病人的血清蛋白質圖譜的判別模式(決策樹模型)，通過血清中M/Z為23381、28040和2018三個蛋白質即可將肝癌病人鑒別出來，其準確率對原發性肝癌病人而言為94.8％(37/39)，正常人為94.28％(33/35)。
4)驗證(盲篩結果)共89份標本，(病理及臨床證實其中含正常人標本47例，HCC病人例42例)
46例被判別為正常人中，42例被證明為正常(真陰性)，4例HCC病人被判斷為正常人(假陰性)6例被判斷為病人(假陽性)，43例被判別為HCC病人中，38例被證明為病人(真陽性)，5例被判斷為正常人(假陽性)，診斷敏感性＝38/(38+4)＝90.48％診斷特異性＝42/(42+5)＝89.36％陽性預期值＝38/(38+5)＝88.37％陰性預期值＝42/(42+4)＝91.30％總有效率＝(42+38)/89＝89.89％。
實施例3 確定正常人與肝硬化患者血清蛋白指紋圖譜鑒別模式在實施例1的基礎上，1).建模組正常人血清35份，肝硬化病人血清36份。
2)獲得的血清蛋白質指紋圖譜中有判別意義的蛋白質峰蛋白質峰1M/Z 2049蛋白質峰2M/Z 31663)建立區分正常人和肝硬化病人病人的血清蛋白質圖譜的判別模式(決策樹模型)，通過血清中M/Z為2049和3166二個蛋白質即可將肝硬化病人鑒別出來，其準確率對原發性肝硬化病人而言為91.6％(33/36)，正常人為94.28％(33/35)。
權利要求
1.一種測定血清蛋白質指紋圖譜的方法，其特征是采用表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術，包括血清樣本的采集標準，化學芯片的選擇、處理和閱讀，測定條件的優化；判別模式及驗證步驟，所述的芯片閱讀參數設置為1)設定質量范圍2000-20000道爾頓；2)設定初始激光強度為185；3)設定檢測敏感度為8；4)校正聚焦點于孔中央；5)設定質量檢測器為1000道爾頓；6)設置數據處理為SELDI位置；7)設定SELDI參數為22delta至4轉換，終點為82；8)設定濕熱位置至2，強度為10。
2.根據權利要求1的測定血清蛋白質指紋圖譜的方法，其中所述的芯片選擇WCX2蛋白芯片。
3.根據權利要求1的測定血清蛋白質指紋圖譜的方法，其中所述的芯片閱讀參數設置1)，設定最高質量5000道爾頓。
4.根據權利要求1的測定血清蛋白質指紋圖譜的方法，其特征是所述的判別模式是正常人與乙型肝炎病人鑒別的血清蛋白質M/Z22841，2957，2049及決策樹的判別模式，和/或正常人與原發性肝癌病人鑒別的血清蛋白質M/Z23381，28040，2918及決策樹的判別模式，和/或正常人與肝硬化病人鑒別的血清蛋白質M/Z2049，3166及決策樹的判別模式。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，涉及應用血清蛋白質組學的方法測定血清蛋白質指紋圖譜的方法。具體涉及血清蛋白質的表面增強激光解析離子化－飛行時間質譜測定和肝病的特異性蛋白峰比較識別的方法。經對查體各項指標正常的正常健康人，ELISA或HBVDNA核實的慢性肝炎病人，和確診有影像學診斷依據(B超或CT)的肝硬化病人及手術后腫瘤標本均經病理檢驗證實的肝癌病人進行測定，結果表明，本方法能為篩查乙肝病人、肝硬化病人及肝癌病人提供特異性技術手段，且簡易可行，適用于大規模人群如體檢、流行病調查等。亦可用于臨床對病人的鑒別診斷。
文檔編號G01N30/86GK1851454SQ200510025339
公開日2006年10月25日 申請日期2005年4月22日 優先權日2005年4月22日
發明者劉銀坤, 崔杰鋒, 康曉南, 湯釗猷 申請人:復旦大學附屬中山醫院
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