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專(zhuān)利名稱(chēng)：生物組織或細(xì)胞樣品異常與否的紅外光譜探測(cè)法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及經(jīng)防腐處理的自然生長(zhǎng)或人工培養(yǎng)新鮮生物組織或細(xì)胞樣品中異常的紅外光譜探測(cè)法。
為了檢查白血病，E.Benedetti等人在Leukemia Research，PP.1001-1008，(Vol.9，Nov.8，1985)中提出了以下方案i)用化學(xué)手段將淋巴細(xì)胞(lymphocytes)與血液中其它細(xì)胞和成分分離開(kāi)來(lái)；ii)對(duì)分離出的淋巴細(xì)胞(lymphocytes)進(jìn)行真空干燥；iii)將干燥后的淋巴細(xì)胞(lymphocytes)與作為粘合劑的粉狀KBr進(jìn)行混合；iv)將淋巴細(xì)胞(lymphocytes)/KBr研磨成細(xì)末；v)將該細(xì)末在樣品容器中壓成小片；vi)利用紅外光譜分析儀測(cè)量該樣品的紅外光譜。
盡管Benedetti等人的方案是有效的，但它完全破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而失去了可以從中獲得的關(guān)于組織或細(xì)胞異常的重要信息。另外，Benedetti等人未采取防止淋巴細(xì)胞(lympho-cytes)變質(zhì)的措施。這些缺陷嚴(yán)重地限制了Benedetti等人所提出方案的應(yīng)用范圍。
美國(guó)專(zhuān)利5,038,039號(hào)(1991年8月6日，發(fā)明者P.T.T.Wong等)上也提出了利用紅外光譜學(xué)檢查自然和人工培養(yǎng)狀態(tài)下生物組織或細(xì)胞異常的方法。在這種方法中，利用紅外光束對(duì)生物組織或細(xì)胞樣品進(jìn)行照射。該組織或細(xì)胞處于自然狀態(tài)，也可以經(jīng)人工培養(yǎng)，它們擴(kuò)散在水中或被切片，但仍維持其自然形態(tài)。在照射情況下，在至少一段頻率范圍內(nèi)利用光譜分析確定是否由于樣品中至少一個(gè)分子官能團(tuán)的振動(dòng)而產(chǎn)生了對(duì)紅外線的吸收，而這種吸收現(xiàn)象是某種異常特征。
5,038,039號(hào)專(zhuān)利中P.T.T.Wong等人提出的方法，在檢查人體中惡性結(jié)腸上皮細(xì)胞，結(jié)腸腫瘤組織和肝腫瘤組織時(shí)特別有效。
1992年12月1日P.T.T.Wong等人在5,168,162號(hào)美國(guó)專(zhuān)利中將P.T.T.Wong等人在5,038,039號(hào)專(zhuān)利中提出的方法推廣用于檢查脫落細(xì)胞異常，且此時(shí)在檢查利用巴氏染色涂片(Papani-colaousmear)而獲得的宮頸細(xì)胞的惡性與否特別有效。
盡管P.T.T.Wong等人在5,038,039和5,168,162號(hào)專(zhuān)利中所提出的探測(cè)方法已被證明是有效的，但其所用的標(biāo)本必須經(jīng)過(guò)冷凍以防變質(zhì)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在室溫下，即使在很短的時(shí)間內(nèi)，光譜吸收也會(huì)發(fā)生顯著的變化。盡管P.T.T.Wong等人在5,038,039號(hào)專(zhuān)利中揭示了在五小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)胸腺組織中含有支鏈脂肪酸的類(lèi)脂物增加(見(jiàn)該專(zhuān)利第8列第21至32行)，但該專(zhuān)利不會(huì)令熟知該技術(shù)的人相信，室溫下，即便在很短時(shí)間內(nèi)，組織或細(xì)胞中的光譜吸收會(huì)發(fā)生變化，而該光譜吸收變化的幅度在某些情況下足以給出錯(cuò)誤的顯示，導(dǎo)致誤認(rèn)為存在異常。更有意義的是，本發(fā)明申請(qǐng)人意外地發(fā)現(xiàn)，這些光譜吸收的變化可給出類(lèi)似于諸如癌組織或細(xì)胞指示的讀數(shù)。
通常，當(dāng)獲得用于組織檢查的外科標(biāo)本時(shí)，該標(biāo)本在輸送到進(jìn)行組織檢查的病理實(shí)驗(yàn)室的過(guò)程中被進(jìn)行冷凍防腐。到達(dá)該實(shí)驗(yàn)室后，利用冷凍切片技術(shù)對(duì)該標(biāo)本進(jìn)行切片，從而提供用于組織檢查的組織樣品。
按照5,038,039號(hào)美國(guó)專(zhuān)利進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)時(shí)，樣品的厚度必須小于約20微米，且必須解凍后在室溫下操作。
如果令樣品解凍且在室溫下放置哪怕很短的時(shí)間，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)將產(chǎn)生變質(zhì)，這種變質(zhì)可改變光譜的吸收，且在某些情況下給出事實(shí)上不存在的異常的錯(cuò)誤指示。
W.J.Potts Jr.在《化學(xué)紅外光譜學(xué)》(1963年第一卷技術(shù)，第238～242頁(yè))上已提出了研究化學(xué)材料(例如交聯(lián)聚合物和樹(shù)脂)光學(xué)特性，特別是其紅外輻射強(qiáng)度的方法，即將相應(yīng)材料填滿氯化鈉固態(tài)小晶塊中的空穴，屏蔽該晶塊以便使落在其外表面上的光線只能穿過(guò)該小晶塊體積，并且將該晶塊安放在紅外光束聚焦系統(tǒng)中。紅外光譜可以利用來(lái)自該化學(xué)材料表面輻射的反射(而不是利用穿過(guò)該材料的透射)而獲得，而通常這樣所產(chǎn)生的光譜很弱以至具有很小的量值。然而近來(lái)，在本文擬寫(xiě)時(shí)，人們已設(shè)想出了一種被稱(chēng)為衰減總反射(常縮寫(xiě)為ATR)技術(shù)，因而獲得了質(zhì)量更加令人滿意的反射光譜。
盡管W.J.Potts Jr.所介紹的方法對(duì)實(shí)際上不可破壞的有機(jī)聚合及樹(shù)脂材料是有效的，但卻不會(huì)令熟知該技術(shù)的人使用氯化鈉保存在室溫下會(huì)變質(zhì)的樣品(例如來(lái)源于新鮮生物組織或細(xì)胞的樣品)，用于借助紅外光譜分析探測(cè)其中的異常。另外，這些樣品中的水份會(huì)溶解氯化鈉晶塊從而使其失效。但是，W.J.Potts Jr.確實(shí)指出了至少早在1963年就已經(jīng)知道利用來(lái)自樣品輻射的反射或利用穿過(guò)該樣品的透射獲得紅外光譜。
在“應(yīng)用紅外光譜學(xué)，原理，技術(shù)及分析問(wèn)題求解”一書(shū)(A.Lee Smith，1979年，84～86頁(yè))中，86頁(yè)上指出，ATR光譜的反射輻射可給出非常類(lèi)似于透射光譜的吸收。
需要這樣一種探測(cè)方法，該方法利用紅外光譜分析檢查自然或人工培養(yǎng)的生物組織或細(xì)胞中所存在的異常，其中該組織或細(xì)胞在室溫下的變質(zhì)被推遲到一定的程度，以使得它不會(huì)妨礙異常性的探測(cè)或給出錯(cuò)誤的結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明，它提出了一種利用紅外光譜分析探測(cè)經(jīng)防腐處理的自然或人工培養(yǎng)新鮮生物組織或細(xì)胞樣品中異常的方法，它含有以下步驟a)用紅外光束照射經(jīng)防腐處理的樣品；b)利用光譜分析，至少在一段頻率范圍內(nèi)確定在該處理過(guò)的樣品中是否發(fā)生了明顯區(qū)別于其中源于防腐處理所帶來(lái)的變化的紅外吸收變化，這種吸收變化至少由該處理過(guò)的樣品中的一個(gè)分子的官能團(tuán)的振動(dòng)所產(chǎn)生而且是某種異常的特征。
利用光譜分析進(jìn)行確定可包括將上述至少在一段頻率范圍內(nèi)利用紅外光束照射經(jīng)處理樣品所獲得的紅外光譜以及由此而導(dǎo)出的光譜參數(shù)與通過(guò)經(jīng)相同方式處理并已知來(lái)自新鮮、正常和健康組織或細(xì)胞的類(lèi)似樣品而獲得的類(lèi)似的紅外光譜以及從中導(dǎo)出的光譜參數(shù)相比較。
通過(guò)比較，如果在待測(cè)樣品與控制樣品之間無(wú)明顯的紅外光譜變化或所導(dǎo)出光譜參數(shù)變化，則顯然由光譜分析進(jìn)行確定的工作完成，它說(shuō)明檢測(cè)樣品中不存在異常，該樣品為健康和正常的。
然而，如果待測(cè)樣品與控制樣品之間在紅外光譜或所導(dǎo)出的光譜參數(shù)方面存在明顯的變化，則顯然需要做進(jìn)一步比較以確定究竟是什么樣的異常所引起的這種變化。
另外，根據(jù)本發(fā)明，利用光譜分析進(jìn)行確定還包括將上述至少在一段頻率范圍內(nèi)利用紅外光束照射經(jīng)處理樣品所得到的紅外光譜以及由此而導(dǎo)出的光譜參數(shù)與通過(guò)經(jīng)相同方式處理并具有已知異常特性的至少一種類(lèi)似樣品而獲得的類(lèi)似的紅外光譜以及由此導(dǎo)出的光譜參數(shù)相比較。
下述內(nèi)容包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，即只對(duì)某種經(jīng)處理的樣品進(jìn)行試驗(yàn)以檢測(cè)至少一種特定的異常，而不進(jìn)行該樣品與經(jīng)處理的正常健康的組織或細(xì)胞的比較試驗(yàn)。
利用光譜分析進(jìn)行確定，可以在上述至少一段頻率范圍內(nèi)通過(guò)來(lái)自穿過(guò)該經(jīng)處理樣品光束的紅外輻射而獲得。
利用光譜分析進(jìn)行確定，可以在上述至少一段頻率范圍內(nèi)通過(guò)來(lái)自該樣品光束的衰減全反射紅外輻射而獲得。
經(jīng)防腐處理的樣品可以是利用下列一組防腐劑中任一種進(jìn)行處理的樣品，這些防腐劑包括甲醛，酒精，鹽水和無(wú)機(jī)鹽。
甲醛可以是福爾馬林水溶液。
酒精可以是甲醇、乙醇或二者的混合物。
鹽水可以是普通的鹽水，磷酸緩沖液或某種平衡生理鹽水，該鹽水含有氯化鈣，氯化鎂，氯化鉀，醋酸鈉，氯化鈉和檸檬酸鈉。
無(wú)機(jī)鹽可以是硝酸鈉、氯化鈉或溴化鉀。
上述至少一段頻率范圍可以是下列至少一個(gè)頻段內(nèi)的至少一個(gè)頻率，這些頻段包括500cm-1至900cm-1，900cm-1至1500cm-1，900cm-1至1800cm-1和2000cm-1至6000cm-1。
在本技術(shù)要求中，自然或人工培養(yǎng)的新鮮生物組織或細(xì)胞是指，最新得到的生物組織或細(xì)胞、人工培養(yǎng)的組織或細(xì)胞或從新鮮生物組織上脫落的細(xì)胞，且這些組織或細(xì)胞完全避免了室溫環(huán)境曝露而引起的變質(zhì)。
令人驚奇的是，盡管已發(fā)現(xiàn)一些防腐劑會(huì)引起光譜的微小變化，但實(shí)驗(yàn)證明，從自然狀態(tài)或人工培養(yǎng)的新鮮生物組織或細(xì)胞上取得、經(jīng)過(guò)防腐處理的樣品中的異常可以利用紅外光譜分析進(jìn)行檢測(cè)。換句話說(shuō)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些防腐劑不會(huì)屏蔽由于異常物而引起的紅外吸收或給出錯(cuò)誤的指示。其基本原因是對(duì)紅外光譜的分析方式不同。特別重要的是，將來(lái)自樣品的紅外光譜和由此導(dǎo)出的光譜參數(shù)與來(lái)自類(lèi)似樣品(經(jīng)同樣方式處理、已知為正常健康或具有已知的異常特性)的紅外光譜以及由此導(dǎo)出的光譜參數(shù)相比較。
生物組織或細(xì)胞可以從各種人或其它哺乳動(dòng)物的器官或組織上獲得。
上述紅外吸收特性的至少一種變化，可以是特定頻率范圍內(nèi)吸收強(qiáng)度的變化，產(chǎn)生特定吸收頻率的變化，或?qū)μ囟ü倌軋F(tuán)施加不同壓力而引起的產(chǎn)生特定吸收頻率的變化。
正如1992年12月1日5,168,162號(hào)美國(guó)專(zhuān)利所指出的，分子官能團(tuán)可以是在下列分子、碳水化合物、核酸、組織蛋白或細(xì)胞膜脂中的至少一個(gè)。
同樣，正如1992年12月1日5,168,162號(hào)美國(guó)專(zhuān)利所指出的，該官能團(tuán)可以是核酸中的磷酸二酯(phosphodiester)、組織蛋白和碳水化合物中的C-OH基、脂質(zhì)中的CH2基或蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)中的CH3基團(tuán)。
再有，正如1992年12月1日5,168,162號(hào)美國(guó)專(zhuān)利所指出的，該官能團(tuán)可以是從包括碳水化合物中CH2-OH團(tuán)、核酸中磷酸二酯基團(tuán)、組織蛋白和碳水化合物中C-OH團(tuán)、脂質(zhì)中CH2基團(tuán)和蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)中CH3基團(tuán)在內(nèi)的官能團(tuán)中選出的至少一個(gè)官能團(tuán)。
然而，對(duì)某些防腐劑，由于該防腐劑的存在，光譜會(huì)與1992年12月1日5,168,162號(hào)美國(guó)專(zhuān)利上所給出的略有不同。
標(biāo)本可以從a)新鮮活組織切片、b)新鮮穿剌活組織、c)人工培養(yǎng)新鮮細(xì)胞或d)脫落細(xì)胞中制備，其中的例子有i)巴氏染色涂片(Papanicolaou Smears)；ii)宮頸標(biāo)本；iii)內(nèi)宮頸標(biāo)本；iv)外宮頸標(biāo)本；v)陰道標(biāo)本；vi)子宮標(biāo)本；vii)支氣管標(biāo)本。
當(dāng)該標(biāo)本為組織時(shí)，它可能是肝組織，而異常特征便表明該肝組織存在惡性病變。
當(dāng)該標(biāo)本包含細(xì)胞時(shí)，該細(xì)胞可能是人體的卵巢上皮細(xì)胞。
當(dāng)該標(biāo)本為組織時(shí)，該組織可能是宮頸腫瘤組織，而異常特征則表明該組織存在惡性病變。
當(dāng)該標(biāo)本為脫落細(xì)胞時(shí)，該標(biāo)本可利用各種器官和組織通過(guò)刮片、沖刷、沖洗、分泌物或滲出物而獲得。
無(wú)論用任何方法所獲得的標(biāo)本，其異常均表示存在諸如癌前損傷、病毒、細(xì)菌、真菌以及其它傳染性或非傳染性疾病。


借助舉例，附圖描述了本發(fā)明的具體方案。
圖1是用于借助紅外光譜分析檢測(cè)經(jīng)防腐處理樣品中異常存在的設(shè)備框圖，該樣品從自然狀態(tài)或人工培養(yǎng)的新鮮生物組織中制備。
圖2給出了2800至3020cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)新鮮、正常、健康的肝組織標(biāo)本而獲得的紅外光譜，該標(biāo)本未經(jīng)防腐處理且在室溫下保存，該紅外光譜的測(cè)量是經(jīng)過(guò)了不同的時(shí)間變化。
圖3給出了與圖2類(lèi)似的紅外光譜，其中的區(qū)別在于是針對(duì)未經(jīng)防腐處理的正常健康組織和惡性病變組織。
圖4給出了900至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)新鮮脫落宮頸細(xì)胞的風(fēng)干標(biāo)本而獲得的紅外光譜和該標(biāo)本在室溫下保存三天后所測(cè)得的紅外光譜，其中該宮頸細(xì)胞已被診斷出高度發(fā)育異常并未經(jīng)防腐處理。
圖5給出了900至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)經(jīng)防腐處理的新鮮、正常、健康的脫落宮頸細(xì)胞的濕標(biāo)本而獲得的紅外光譜和該濕標(biāo)本在帶有單個(gè)紅外光窗的樣品槽中于室溫下風(fēng)干后所測(cè)得的紅外光譜。
圖6給出了900至1800cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)經(jīng)防腐處理的新鮮、正常、健康的脫落宮頸細(xì)胞的風(fēng)干標(biāo)本而獲得的紅外光譜和該標(biāo)本在室溫下保存三個(gè)月后所測(cè)得的紅外光譜。
圖7給出了900至1800cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)經(jīng)防腐處理的、新鮮的、診斷為低度發(fā)育異常(CIN1)的脫落宮頸細(xì)胞風(fēng)干標(biāo)本而獲得的紅外光譜和該標(biāo)本在室溫下保存三個(gè)月后所測(cè)得的紅外光譜。
圖8給出了950至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)經(jīng)防腐處理的、新鮮、正常、健康的脫落宮頸細(xì)胞標(biāo)本而獲得的紅外光譜和該標(biāo)本在室溫下保存15小時(shí)后所測(cè)得的紅外光譜。
圖9給出了950至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)經(jīng)防腐處理的、新鮮的、診斷為中度發(fā)育異常(CINII)的脫落宮頸細(xì)胞標(biāo)本而獲得的紅外光譜和該標(biāo)本在室溫下保存一個(gè)半月后所測(cè)得的紅外光譜。
圖10給出了950至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)兩種經(jīng)防腐處理的宮頸活組織樣品而獲得的紅外光譜，這兩種樣品均從新鮮組織制備，其中之一為正常健康組織，而另一個(gè)以常規(guī)組織學(xué)方式診斷具有惡性病變。
圖11給出了950至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)兩組經(jīng)防腐處理的、來(lái)自新鮮細(xì)胞的脫落宮頸細(xì)胞標(biāo)本樣品而獲得的紅外光譜，其中一組樣品為正常健康細(xì)胞，而另一組樣品被診斷為有炎癥的。
圖12給出了900至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)兩組經(jīng)防腐處理的、來(lái)自新鮮細(xì)胞的脫落宮頸細(xì)胞風(fēng)干標(biāo)本樣品而獲得的紅外光譜，其中一組樣品為正常健康細(xì)胞，而另一組樣品被診斷為受到念珠菌類(lèi)(Candida)感染。
圖13給出了950至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)兩組經(jīng)防腐處理的來(lái)自新鮮脫落宮頸細(xì)胞標(biāo)本樣品而獲得的紅外光譜，其中一組樣品為正常健康細(xì)胞，而另一組樣品被診斷為具有CIN1發(fā)育異常和HPV病毒(human paparoma virus)。
圖14給出了950至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)經(jīng)防腐處理的人工培養(yǎng)惡性卵巢細(xì)胞的風(fēng)干標(biāo)本而獲得的ATR紅外光譜和該標(biāo)本在室溫下保存20小時(shí)后所測(cè)得的ATR紅外光譜。
現(xiàn)參考圖1，其中給出了紅外光源1，紅外光束聚焦鏡2和3，樣品槽與支架4，Michelson干涉儀5，紅外光探測(cè)器6，計(jì)算機(jī)7和數(shù)字顯示裝置8。在下列試驗(yàn)中，該紅外光源1、紅外光束聚焦鏡2和3、樣品槽與支架4的支架、Michelson干涉儀5和紅外光探測(cè)器6是Nicolet Magna IR 550傅利葉變換紅外干涉儀的組成部分，它們可以從加拿大安大略Mississauga的熱電儀器(加拿大)有限公司獲得。用于測(cè)量透射紅外光譜的樣品槽與支架4的樣品槽具有單個(gè)紅外光學(xué)窗，其上存放標(biāo)本，或具有兩個(gè)紅外光學(xué)窗，在其之間放置標(biāo)本。用于測(cè)量ATR紅外光譜的樣品槽與支架4的樣品槽為帶有ZnSe晶體的接觸式SamplerTMATR附件(光譜技術(shù)有限公司)，它由康涅狄格州斯坦福的光譜技術(shù)公司而獲得。
在操作時(shí)，生物組織或細(xì)胞樣品放置于樣品槽與支架4的透射或ATR樣品槽內(nèi)，來(lái)自光源1的紅外光束(已經(jīng)過(guò)聚焦鏡2聚焦)穿過(guò)樣品槽與支架4中的樣品并被聚焦鏡3通過(guò)Michelson干涉儀5聚焦于探測(cè)器6處。任何由標(biāo)本中異常所產(chǎn)生的紅外吸收均被Michelson干涉儀5和探測(cè)器6測(cè)出，而這又經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)7進(jìn)行計(jì)算并在數(shù)字顯示裝置8上給出讀數(shù)顯示。該計(jì)算機(jī)的輸出數(shù)據(jù)可經(jīng)過(guò)編程以使得數(shù)字顯示裝置8能直接指出該樣品是健康的或是包含異常的，而舉例說(shuō)這種異常物可能是良性的、發(fā)音異常的或惡性的。
在下列驗(yàn)證本發(fā)明的試驗(yàn)中，紅外光譜是利用參考圖1所描述的設(shè)備通過(guò)活組織樣品、獲取脫落細(xì)胞的刮擦組織樣品和人工培養(yǎng)細(xì)胞樣品而獲得的。
在圖2中，給出了2800至3020cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)新鮮、正常、健康的肝組織標(biāo)本而獲得的紅外光譜和該標(biāo)本在室溫下經(jīng)過(guò)不同時(shí)間而獲得的紅外光譜。在圖2中，1代表新鮮、正常、健康組織標(biāo)本的紅外光譜，2代表該標(biāo)本在室溫下保存一小時(shí)后的紅外光譜，3代表該標(biāo)本在室溫下保存二小時(shí)后的紅外光譜，4代表該標(biāo)本在室溫下保存三小時(shí)后的紅外光譜，5代表該標(biāo)本在室溫下保存四小時(shí)后的紅外光譜。
圖2說(shuō)明，紅外光譜吸收出現(xiàn)下降現(xiàn)象，其下降幅度依賴于該樣品在室溫下保存時(shí)間的長(zhǎng)短。
圖3給出了與圖2所示類(lèi)似的紅外光譜，它針對(duì)正常健康肝組織(以------表示)和從組織學(xué)上發(fā)現(xiàn)存在惡性病變的肝組織(以——表示)，兩者經(jīng)內(nèi)臟切除術(shù)之后均未按本發(fā)明進(jìn)行防腐處理便馬上進(jìn)行紅外吸收檢查。
比較圖2與圖3將會(huì)發(fā)現(xiàn)，光譜吸收強(qiáng)度在2960cm-1左右的頻率范圍內(nèi)呈下降趨勢(shì)，且圖2中正常健康組織在室溫下放置時(shí)間越長(zhǎng)，圖3中具有惡性病變組織的紅外光譜就越接近圖2中新鮮、正常、健康組織的紅外光譜。事實(shí)上，圖2中5所代表的紅外光譜可能被誤解為圖3中以實(shí)線——表示的病變組織的紅外光譜。
另外，與此相同，對(duì)于室溫下變質(zhì)的、未經(jīng)處理的組織或細(xì)胞，也可能產(chǎn)生其它組織異常的誤解。
圖4給出了900至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)新鮮脫落宮頸細(xì)胞的風(fēng)干標(biāo)本而獲得的紅外光譜，其中該宮頸細(xì)胞已被診斷出高度發(fā)音異常并未經(jīng)防腐處理。
在圖4中，——代表風(fēng)干新鮮脫落宮頸細(xì)胞的紅外光譜，而------代表相同標(biāo)本在室溫下保存三天后所測(cè)得的紅外光譜。從圖4中可以明顯地看出，樣品在室溫下放置三天之后，其整個(gè)光譜范圍內(nèi)各種吸收波段的形狀、頻率和強(qiáng)度發(fā)生了巨大的變化。
圖5給出了900至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)經(jīng)防腐處理的新鮮、正常、健康的脫落宮頸細(xì)胞樣品而獲得的紅外光譜。該防腐處理過(guò)程包括將樣品浸入平衡生理鹽水，用離心機(jī)除去多余溶液，再將該樣品放置于樣品支架上。
在圖5中，——代表經(jīng)防腐處理的、新鮮、正常、健康的脫落宮頸細(xì)胞濕樣品的紅外光譜，而------代表同樣的樣品在裝于樣品槽上的紅外光窗上風(fēng)干之后所測(cè)得的紅外光譜。從圖5可明顯地看出，對(duì)于經(jīng)防腐處理的標(biāo)本，其在室溫下風(fēng)干前后的紅外光譜基本未發(fā)生變化。特別令人感興趣的是，經(jīng)防腐處理的濕和干標(biāo)本的紅外光譜與相應(yīng)未經(jīng)處理的正常健康細(xì)胞的紅外光譜相似(參見(jiàn)1992年12月1日5,168,162號(hào)美國(guó)專(zhuān)利第4列45至57行)。
圖6給出了900至1800cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)經(jīng)防腐處理的新鮮、正常、健康的脫落宮頸細(xì)胞的風(fēng)干標(biāo)本而獲得的紅外光譜和該標(biāo)本在室溫下保存三個(gè)月后所測(cè)得的紅外光譜。該防腐處理過(guò)程包括將該樣品浸入以重量算為1％的氯化鈉水溶液，用離心機(jī)除去多余溶液，然后將該樣品放置于樣品支架上。光譜在樣品于室溫下風(fēng)干后再進(jìn)行測(cè)量。從圖6可明顯地看出，防腐處理后的標(biāo)本經(jīng)室溫下三個(gè)月的保存，其光譜吸收基本未發(fā)生變化。
圖7給出了900至1800cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)經(jīng)防腐處理的、新鮮的、診斷為低度發(fā)音異常(CINI)的脫落宮頸細(xì)胞標(biāo)本而獲得的紅外光譜和該標(biāo)本在室溫下保存三個(gè)月后所測(cè)得的紅外光譜。細(xì)胞防腐處理的方式與圖6中細(xì)胞的處理方式相同。從圖7可明顯地看出，對(duì)于經(jīng)過(guò)處理的標(biāo)本，其光譜在室溫下三個(gè)月的時(shí)間內(nèi)基本未發(fā)生變化。
圖8給出了900至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)經(jīng)防腐處理的、新鮮、正常、健康的脫落宮頸細(xì)胞標(biāo)本而獲得的紅外光譜和該標(biāo)本在室溫下保存15小時(shí)后所測(cè)得的紅外光譜。該防腐處理過(guò)程包括將樣品浸入以重量算1％的福爾馬林水溶液，用離心機(jī)除去多余的溶液，然后將該樣品放入樣品槽中。
在圖8中，——代表新鮮、正常、健康細(xì)胞的紅外光譜吸收，而------代表將該樣品在室溫下保存15小時(shí)后所測(cè)得的紅外光譜吸收。可以看出，防腐處理后的標(biāo)本經(jīng)15小時(shí)后，其光譜吸收基本未發(fā)生變化。特別令人感興趣的是，經(jīng)防腐處理標(biāo)本的紅外光譜與相應(yīng)未經(jīng)處理的、正常、健康的細(xì)胞的紅外光譜相似(參見(jiàn)1992年12月1日5,168,162號(hào)美國(guó)專(zhuān)利第4列45至57行)。
在圖9中，——代表經(jīng)防腐處理的、新鮮的、診斷為中度發(fā)育異常(CINII)的脫落宮頸細(xì)胞標(biāo)本的紅外光譜吸收，而------代表該標(biāo)本在室溫下保存一個(gè)半月后所測(cè)得的紅外光譜吸收。該防腐處理過(guò)程包括將新鮮濕標(biāo)本放置在裝于樣品支架上的結(jié)晶溴化鉀窗的表面上。在該樣品于室溫下風(fēng)干后進(jìn)行光譜測(cè)量。從圖9可明顯地看出，經(jīng)防腐處理的標(biāo)本在室溫下放置一個(gè)半月后，其紅外光譜基本未發(fā)生變化。
圖10給出了950至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)兩組經(jīng)防腐處理的、新鮮宮頸活組織樣品而獲得的紅外光譜，其中------代表經(jīng)處理的、正常、健康組織的紅外光譜，而——代表以常規(guī)組織學(xué)方式診斷為具有惡性病變的組織的紅外光譜。該樣品的防腐處理過(guò)程包括將樣品浸入磷酸緩沖鹽水、除去多余鹽水，然后將該濕樣品放進(jìn)樣品支架。
最為顯著的光譜吸收差別包括下列在惡性病變組織方面的研究結(jié)果a)在970cm-1、1025cm-1、1047cm-1、1080cm-1、1160cm-1、1240cm-1、1400cm-1和1460cm-1波段附近吸收強(qiáng)度將發(fā)生顯著變化；b)在1080cm-1和1160cm-1波段附近吸收光譜將發(fā)生明顯偏移；圖11給出了950至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)兩組經(jīng)防腐處理的、來(lái)自新鮮刮脫脫落宮頸細(xì)胞標(biāo)本樣品而獲得的紅外光譜，其中------代表正常健康細(xì)胞的光譜，而——代表被診斷為具有炎癥的細(xì)胞的光譜。該細(xì)胞的防腐處理與圖5中對(duì)濕細(xì)胞的處理方式相同。
最為顯著的光譜吸收差別包括下列在具有炎癥的細(xì)胞方面的研究結(jié)果a)在970cm-1、1025cm-1、1047cm-1、1080cm-1、1160cm-1、1300cm-1、1400cm-1和1460cm-1波段附近吸收強(qiáng)度將發(fā)生顯著變化；b)在1080cm-1和1240cm-1波段附近吸收光譜將發(fā)生明顯偏移；圖12給出了900至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)兩組經(jīng)防腐處理的、新鮮的脫落宮頸細(xì)胞風(fēng)干標(biāo)本樣品而獲得的紅外光譜，其中------代表正常健康細(xì)胞的光譜，而——代表經(jīng)診斷受到念珠菌感染的細(xì)胞的光譜。該細(xì)胞的防腐處理方式與圖6中描述的方式相同。
最為顯著的光譜吸收差別包括在930cm-1、1160cm-1和1240cm-1波段附近受念珠菌感染細(xì)胞吸收強(qiáng)度的變化，以及1025cm-1附近強(qiáng)吸收波段范圍的展寬。
圖13給出了950至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)兩組經(jīng)防腐處理的新鮮脫落宮頸細(xì)胞樣品而獲得的紅外光譜，其中------代表正常健康細(xì)胞的光譜，而——代表經(jīng)診斷具有CINI發(fā)育異常和HPV病毒(human paparoma virus)的細(xì)胞吸收強(qiáng)度的變化。
在圖14中，——代表在950至1500cm-1頻率范圍內(nèi)通過(guò)經(jīng)防腐處理的人工培養(yǎng)惡性卵巢細(xì)胞的風(fēng)干標(biāo)本而獲得的ATR紅外光譜，而------代表該風(fēng)干標(biāo)本保存20小時(shí)后所測(cè)得的ATR紅外光譜。該細(xì)胞的防腐處理方式與圖5中所描述的方法相同。從圖14可明顯地看出，對(duì)于該經(jīng)防腐處理的標(biāo)本，在室溫下三天期間內(nèi)，其光譜吸收基本未發(fā)生變化，只不過(guò)該吸收光譜的基線發(fā)生了微小改變，而這并不影響檢測(cè)異常的存在。
其它可以利用的防腐劑例舉如下，即乙醇、甲醇、乙醚、乙二醇或它們的混合的水溶液，并且，使用其它鹽水而非磷酸緩沖鹽水和平衡生理鹽水作為防腐劑，以及使用其它無(wú)機(jī)鹽而非氯化鈉和溴化鉀作為防腐劑，這些均在本發(fā)明所包含的范圍之內(nèi)。防腐劑可以為水溶液，或呈固態(tài)、或?yàn)闅鈶B(tài)甲醛。
舉例來(lái)說(shuō)，可根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)出的組織或細(xì)胞異常包括癌前損傷、病毒、細(xì)菌、真菌以及其它傳染和非傳染性疾病，此時(shí)至少在一個(gè)頻率范圍內(nèi)由于樣品中的至少一個(gè)分子官能團(tuán)的振動(dòng)而在該樣品中發(fā)生紅外吸收，而這種吸收即是該組織或細(xì)胞異常的特征。這可通過(guò)常規(guī)試驗(yàn)而確定，且所檢測(cè)的分子官能團(tuán)可從諸如細(xì)胞碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或核酸中獲得。
典型非傳染性疾病有癌癥、糖尿病、肝硬化和關(guān)節(jié)炎。
根據(jù)本發(fā)明能夠檢測(cè)出存在異常(例如惡性病變)并可進(jìn)行試驗(yàn)的各種瘤組織或細(xì)胞的例子包括結(jié)腸直腸腫瘤(用于檢查結(jié)腸癌)、肝腫瘤(用于檢查肝癌)、皮膚癌、腦瘤、卵巢癌、胃癌、食道癌、子宮癌、宮頸癌和其它血液中的癌細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種利用紅外光譜分析探測(cè)經(jīng)防腐處理的、自然或人工培養(yǎng)的、包括脫落細(xì)胞在內(nèi)的新鮮生物組織或細(xì)胞樣品中異常的方法，該方法包括a)用紅外光束照射經(jīng)防腐處理的樣品；b)利用光譜分析，至少在一段頻率范圍內(nèi)確定在該經(jīng)處理的樣品中是否發(fā)生了明顯區(qū)別于其中源于防腐處理所帶來(lái)的變化的紅外吸收變化，這種吸收變化至少由該經(jīng)處理的樣品中的一個(gè)分子官能團(tuán)的振動(dòng)所產(chǎn)生而且是某種異常的特征。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中利用光譜分析進(jìn)行確定包括將上述至少在一段頻率范圍內(nèi)利用紅外光束照射經(jīng)處理樣品所獲得的紅外光譜以及由此而導(dǎo)出的光譜參數(shù)與通過(guò)經(jīng)相同方式處理并已知來(lái)自新鮮、正常和健康組織或細(xì)胞的類(lèi)似受控樣品而獲得的類(lèi)似的紅外光譜以及從中導(dǎo)出的光譜參數(shù)相比較。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中上述利用光譜分析進(jìn)行確定包括將上述至少在一段頻率范圍內(nèi)利用紅外光束照射經(jīng)處理樣品所得到的紅外光譜以及由此而導(dǎo)出的光譜參數(shù)與通過(guò)經(jīng)相同方式處理并具有已知異常特性的至少一種類(lèi)似樣品而獲得的類(lèi)似的紅外光譜以及由此導(dǎo)出的光譜參數(shù)相比較。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中上述利用光譜分析進(jìn)行確定是在上述至少一段頻率范圍內(nèi)通過(guò)來(lái)自穿過(guò)該經(jīng)處理樣品光束的紅外輻射而獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中上述利用光譜分析進(jìn)行確定是在上述至少一段頻率范圍內(nèi)通過(guò)來(lái)自該樣品光束的衰減全反射紅外輻射而獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中經(jīng)防腐處理的樣品是利用下列一組防腐劑中的至少一種進(jìn)行處理的樣品，這些防腐劑包括甲醛、酒精、鹽水和無(wú)機(jī)鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中甲醛為福爾馬林水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中酒精是乙醇水溶液、甲醇水溶液和乙醇與甲醇混合物的水溶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中防腐劑為鹽水，該鹽水選自普通鹽水、磷酸緩沖鹽水和平衡生理鹽水。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中防腐劑為選自硝酸鈉、氯化鈉和溴化鉀之中的一種物質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1和6的方法，其中經(jīng)防腐處理的樣品可以為濕或干狀態(tài)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1和6的方法，其中經(jīng)防腐處理的樣品包括濕生物組織或細(xì)胞，該組織或細(xì)胞被放置于作為固態(tài)防腐劑的結(jié)晶無(wú)機(jī)鹽的表面上。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該頻率范圍是下列頻段中的至少一個(gè)頻段，這些頻段包括500cm-1至900cm-1、900cm-1至1500cm-1、900cm-1至1800cm-1和2000cm-1至6000cm-1。
全文摘要
自然或人工培養(yǎng)的生物組織和細(xì)胞(如癌變組織或細(xì)胞)中異常存在利用紅外光束照射經(jīng)防腐處理的樣品而檢測(cè)出，該樣品由新鮮生物組織或細(xì)胞制備，測(cè)量為透射或衰減全反射(ATR)模式。然后，異常由紅外光譜吸收是否發(fā)生變化而定，該吸收變化由樣品中至少一個(gè)分子官能團(tuán)的振動(dòng)引起且是異常存在的特征。防腐劑可以是福爾馬林、乙醇或無(wú)機(jī)鹽的水溶液。防腐處理防止室溫下樣品的變質(zhì)，而已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該變質(zhì)會(huì)改變紅外吸收特性從而可能導(dǎo)致誤解。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1115851SQ9510661
公開(kāi)日1996年1月31日 申請(qǐng)日期1995年6月28日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月28日
發(fā)明者博特烈黃, 磊達(dá)黃 申請(qǐng)人:賽托斯康醫(yī)療技術(shù)有限公司